CN112461807B - 碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于荧光成像技术领域，提供一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用。以间苯二胺和对氨基苯甲酸为碳源和氮源，通过一步水热法制得棕黄色碳量子点N‑CDs，旋蒸去除乙醇溶剂，得到棕色的粘稠物；再将所得棕色粘稠物溶于二次水中，离心去除不溶物，透析去除未反应的反应前体小分子，冷冻干燥得棕色N‑CDs固体粉末，即为靶向细胞核仁免洗成像的碳量子点；用激光共聚焦得到HeLa和PC12的高分辨细胞成像图，表明N‑CDs可以成功地靶向细胞核仁进行免洗成像，是一种优良的细胞核仁成像试剂。制备方法简单，无需修饰即可靶向细胞核仁，对仪器设备要求低，操作简便，免冲洗核仁成像，既节省时间，又可避免细胞损伤。

Description

碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用。
背景技术
核仁是细胞内最重要的亚核结构，其主要功能是进行核糖体以及rRNA的合成。核仁的大小、形状随生物的种类、细胞类型和细胞代谢状态而变化。研究表明，核仁数量或形状的改变可能与癌症有关，可作为靶标用于诊断和治疗癌症，所以了解核仁的状态是诊断和治疗癌症的关键。
目前用于细胞核仁成像的材料主要包括：金纳米团簇、金属螯合物、有机小分子、配位量子点和石墨烯等。这些材料可以成功定位于细胞核仁，但是它们的制备过程较为复杂，比如部分纳米粒子表面需要连接靶向基团，部分纳米粒子需要表面修饰亲水基团来改善其生物相容性，部分纳米粒子光漂白严重，不利于实际应用。这些材料在进行活细胞内核仁成像时，需要对细胞进行反复多次地冲洗，不仅步骤繁琐，而且极易对细胞造成损伤。所以，目前报道的细胞核仁成像的方法仍需要进一步完善，探索一种简单快捷的核仁成像方法迫在眉睫。
碳量子点，又称为碳纳米粒子，是粒径小于10 nm的纳米粒子。碳量子点作为碳纳米家族中的新成员，由于其具有良好的生物相容性、优异的水溶性、光致发光性能、低细胞毒性等特性，受到研究者的广泛关注。碳量子点被广泛应用于生物成像，但是，目前报道的碳量子点多用于细胞质成像，无需修饰即可靶向细胞核仁成像的碳量子点极少。因此，以碳量子点为基础，发展一种可以快速靶向细胞核仁，最终实现免洗核仁成像的方法具有重要的意义以及广阔的应用前景。
发明内容
本发明为了解决目前用于细胞核仁成像的材料制备方法复杂，操作复杂，需要多次冲洗，容易对细胞造成损伤等问题，提供了一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用。
本发明由如下技术方案实现：一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用，所述碳量子点为：以间苯二胺和对氨基苯甲酸为碳源和氮源，通过一步水热法制得棕黄色碳量子点N-CDs，旋蒸去除乙醇溶剂，得到棕色的粘稠物；再将所得棕色粘稠物溶于二次水中，离心去除不溶物，透析去除未反应的反应前体小分子，冷冻干燥得棕色N-CDs固体粉末，即为靶向细胞核仁免洗成像的碳量子点。
利用碳量子点靶向细胞核仁免洗成像的步骤为：
（1）N-CDs储备液的制备：0.01 g N-CDs固体粉末完全溶解于10 mL二次水中，得到浓度为1 mg/mL的N-CDs储备液；
（2）人宫颈癌（HeLa）细胞核仁成像：将HeLa细胞培养在富含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃、5% CO2环境中孵育48 h；用步骤（1）所制备的1.0 mg/mL的 N-CDs储备液750 μL和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5% CO2环境中孵育2 h，在高分辨激光共聚焦扫描显微镜下观察HeLa细胞形态和荧光；
（3）大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤（PC12）细胞核仁成像：将PC12细胞培养在富含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃、5 % CO2环境中孵育48 h；用步骤（1）所制备的1.0 mg/mL的 N-CDs储备液750 μL和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2h，在高分辨激光共聚焦扫描显微镜下观察PC12细胞形态和荧光。
所述碳量子点的制备方法为：
（1）准确称量0.05 g间苯二胺和0.05 g对氨基苯甲酸，完全溶解于10 mL无水乙醇中，将所得溶液加入聚四氟乙烯内胆中，在180℃下加热12 h，待反应釜自然冷却到室温后，从内胆中取出棕色溶液；
（2）在40℃、40 rpm下旋蒸去除棕色溶液中的乙醇溶剂，得到棕色的粘稠物，加入二次水进行溶解，于10000 rpm下离心5 min，获得棕黄色的上清液；
（3）棕黄色上清液用500-1000 Da的透析袋处理2天，期间每隔6 h换一次水，透析后的溶液-40℃冷冻干燥48 h，得到棕色N-CDs固体粉末。
根据权利要求4所述的一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用，其特征在于：步骤（2）中棕色粘稠物加入30 mL的二次水溶解。
本发明的优点在于：碳源间苯二胺和对氨基苯甲酸均为普通试剂，容易采购。碳量子点制备方法简易，易于广泛应用。碳量子点进行核仁成像时，孵育时间短，无需冲洗细胞，既节省时间，又可避免细胞损伤。本发明与其他细胞核仁成像方法相比，该方法具有制备简易、操作过程简单、可快速靶向细胞核仁进行免洗成像等优点，是一种全新的细胞核仁成像方法。
附图说明
图1为实施例1中所制备的N-CDs的紫外可见吸收光谱图以及荧光光谱图；
图2为实施例1中所制备的N-CDs的激发波长依赖性光谱图；
图3为实施例1中所制备的N-CDs的X射线光电子能谱图；
图4为实施例1中所制备的N-CDs的红外光谱图（上）和zeta电势图（下）；
图5为实施例1中所制备的N-CDs的透射电镜图（左）和粒径分布图（右）；
图6为实施例1中所制备的N-CDs的原子力显微镜图（左）和高度分布图（右）；
图7为实施例3中N-CDs对HeLa细胞的毒性测试结果；
图8为实施例4中N-CDs对PC12细胞的毒性测试结果；
图9为实施例5中N-CDs在HeLa细胞中的成像图；
图10为实施例6中N-CDs在PC12细胞中的成像图；
图11为实施例7中N-CDs在HeLa细胞（经过和未经过RNase处理）中的成像图以及利用Image-J软件对代表性细胞处理后的结果图；图中：A为未经RNase处理的HeLa细胞成像暗场图；B和C分别为A中标记的Cell(I)和Cell(II)经Image-J软件处理后荧光强度图；D为经过RNase处理的HeLa细胞成像暗场图；E和F分别为B中标记的Cell(III)和Cell(IV)经Image-J软件处理后荧光强度图；图中&代表核仁，#代表核膜，*代表细胞质；
图12为实施例7中N-CDs靶向核仁成像的机理图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：N-CDs的制备
步骤一，准确称量0.05 g间苯二胺和0.05 g对氨基苯甲酸，完全溶解于10 mL无水乙醇中，将所得溶液加入聚四氟乙烯内胆中，在180℃下加热12 h，待反应釜自然冷却到室温后，从内胆中取出棕色溶液。
步骤二，旋蒸去除棕色溶液中的乙醇溶剂，得到棕色的粘稠物，加入二次水进行溶解，于10000 rpm下离心5 min，获得棕黄色的上清液。
步骤三，棕黄色的上清液用500-1000 Da的透析袋处理2天，期间每隔6 h换一次水，透析后的溶液冷冻干燥，得到棕色N-CDs固体粉末。
步骤四，称量0.01 g N-CDs固体粉末于烧杯中，向其中加入10 mL二次水，搅拌使其充分溶解，得到浓度为1 mg/mL的N-CDs储备液。
实施例2：N-CDs的表征：性质表征见图1-6。图1在N-CDs的紫外吸收光谱图中，有一个强烈的吸收峰位于283 nm，由C=O的n→π*跃迁引起；图1中N-CDs的最佳激发和发射峰分别位于456 nm和503 nm。
图2是N-CDs在不同激发波长下的发射光谱图，当激发波长从340 nm变化到470 nm时，发射波长没有发生移动，表明N-CDs具有激发波长独立性。
图3是N-CDs的X射线光电子能谱图，表明N-CDs主要由C、N、O三种元素组成。
图4是N-CDs红外光谱图，表明N-CDs富含O-H/N-H、C-H、C=N、C-N、C-O等官能团，保证N-CDs具有良好的水溶性，同时N-CDs具有正电位（25.2 mV），使其与具有负电位的RNAs具有良好的结合作用。
图5为N-CDs的透射电镜图（左）和粒径分布图（右），表明N-CDs的粒径范围为2.25-6.75 nm，平均粒径为4.35 ± 0.5 nm，晶格尺寸为0.19 nm，与石墨烯的平面晶格间距相匹配。
图6为N-CDs的原子力显微镜图（左）和高度分布图（右），表明N-CDs在云母片上均匀分布，所划线上N-CDs的高度范围为1.76~2.18 nm。结合图5可以得出所制备的N-CDs是具有石墨烯晶格结构的类球形纳米粒子。
实施例3：N-CDs对HeLa细胞的毒性测试
HeLa细胞生长在富含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2环境中培养。将处于对数生长期的细胞以8×104/mL的数量接种于96孔培养板（每个孔100 μL培养液）中，并于37℃、5％CO2环境中培养24 h。待细胞完全贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，每组中有6个重复孔，实验组加入N-CDs的终浓度分别为0.05, 0.5, 5, 25, 50 µg/mL。细胞继续孵育24 h后，将孔中的液体吸出，并向每个孔中添加100 μL含MTT（0.5 mg/mL）的DMEM培养基。细胞继续孵育4 h后，吸出上清液，在每个孔中加入100 μL DMSO，以溶解沉淀物。微孔板振荡器振荡10 min使其混合均匀，在570 nm下测试吸光度（OD）值，利用下面的公式计算细胞的存活率：
细胞活力（％）=（OD实验组/OD对照组）×100％；式中：OD对照组是指未经N-CD处理的HeLa细胞的吸光度值，OD实验组是指经不同浓度的N-CDs处理的HeLa细胞的吸光度值。
图7为N-CDs对HeLa细胞的毒性测试结果图，表明当N-CDs浓度为50 µg/mL时，HeLa细胞的存活率仍高于90 %，证明N-CDs对HeLa细胞几乎没有任何毒性。
实施例4：N-CDs对PC12的毒性测试
PC12细胞生长在富含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2环境中培养。将处于对数生长期的细胞以8×104/mL的数量接种于96孔培养板（每个孔100 μL培养液）中，并于37℃、5％CO2环境中培养24 h。待细胞完全贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，每组中有6个重复孔，实验组加入N-CDs的终浓度分别为0.05, 0.5, 5, 25, 50 µg/mL。细胞继续孵育24 h后，将孔中的液体吸出，并向每个孔中添加100 μL含MTT（0.5 mg/mL）的DMEM培养基。细胞继续孵育4 h后，吸出上清液，在每个孔中加入100 μL DMSO，以溶解沉淀物。微孔板振荡器振荡10 min使其混合均匀，在570 nm下测试吸光度（OD）值，利用下面的公式计算细胞的存活率：
细胞活力（％）=（OD实验组/OD对照组）×100％；式中：OD对照组是指未经N-CD处理的PC12细胞的吸光度值，OD实验组是指经不同浓度的N-CDs处理的PC12细胞的吸光度值。
图8为N-CDs对PC12细胞的毒性测试结果图，表明当N-CDs浓度为50 µg/mL时，PC12细胞的存活率仍高于85 %，证明N-CDs对PC12细胞具有很低的毒性，可忽略不计。
实施例5：HeLa细胞核仁成像
步骤一，HeLa细胞生长在富含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2环境中培养48 h。
步骤二，用N-CDs（750 μL, 1.0 mg/mL）和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2 h。
步骤三，无需清洗，将含有HeLa细胞激光共聚焦皿直接置于高分辨激光共聚焦扫描显微镜下，在488 nm激光器下，检测波长为489-570 nm，观察HeLa细胞的形态和荧光。
图9为HeLa细胞成像结果图，HeLa细胞核仁发出明亮的绿色荧光，其他部分几乎无荧光，可清晰地看到核仁的数量以及形态，表明N-CDs可靶向细胞核仁进行成像，是一种优良的细胞核仁成像试剂。
实施例6：PC12细胞核仁成像
步骤一，PC12细胞生长在富含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2环境中培养48 h。
步骤二，用N-CDs（750 μL, 1.0 mg/mL）和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2 h。
步骤三，无需清洗，将含有PC12细胞激光共聚焦皿直接置于高分辨激光共聚焦扫描显微镜下，在488 nm激光器下，检测波长为489-570 nm，观察PC12细胞的形态和荧光。
图10为PC12细胞成像结果图，PC12细胞核仁发出明亮的绿色荧光，其他部分几乎无荧光，可清晰地看到核仁的数量以及形态，表明N-CDs可靶向细胞核仁进行成像，是一种优良的细胞核仁成像试剂。
实施例7：RNase分析和机理探讨
步骤一，HeLa细胞生长在富含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2环境中培养48 h。
步骤二，第一组HeLa细胞用N-CDs（750 μL, 1.0 mg/mL）和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2 h。第二组HeLa细胞用RNase (50 μL,1.0 mg/mL) 和1450 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2h，2 h后用N-CDs（750 μL, 1.0 mg/mL）和750 μL DMEM混合液代替上述培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2 h。
步骤三，无需清洗，将含有HeLa细胞激光共聚焦皿直接置于高分辨激光共聚焦扫描显微镜下，在488 nm激光器下，检测波长为489-570 nm，观察HeLa细胞的形态和荧光。
步骤四，使用Image-J软件分析步骤三所得图片的荧光强度。“&”标记核仁，“#”标记核膜，“*”标记细胞质。
图11为HeLa细胞成像结果图。当RNase不存在时，HeLa细胞核仁区域相比细胞其他区域发出更亮的绿色荧光。使用Image-J软件对两个代表性细胞的荧光强度进行分析，结果表明核仁区域荧光强度是核膜荧光强度的2倍，是细胞质荧光强度的5倍。当RNase存在时，RNAs会被RNase降解，导致RNAs无法与N-CDs很好地结合，核仁不发出任何荧光。图12为N-CDs靶向核仁成像的机理图。核仁内富含RNAs，N-CDs与RNAs结合后，核仁发出明亮的绿色荧光；经RNase处理后的核仁，与N-CDs的结合作用减弱甚至消失，核仁不发出任何荧光；说明N-CDs可靶向细胞核仁进行免洗成像，是一种优良的细胞核仁成像试剂。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用，其特征在于：所述碳量子点为：以间苯二胺和对氨基苯甲酸为碳源和氮源，通过一步水热法制得棕黄色碳量子点N-CDs，旋蒸去除乙醇溶剂，得到棕色的粘稠物；再将所得棕色粘稠物溶于二次水中，离心去除不溶物，透析去除未反应的反应前体小分子，冷冻干燥得棕色N-CDs固体粉末，即为靶向细胞核仁免洗成像的碳量子点；
具体制备方法为：
（1）准确称量0.05 g间苯二胺和0.05 g对氨基苯甲酸，完全溶解于10 mL无水乙醇中，将所得溶液加入聚四氟乙烯内胆中，在180℃下加热12 h，待反应釜自然冷却到室温后，从内胆中取出棕色溶液；
（2）在40℃、40 rpm下旋蒸去除棕色溶液中的乙醇溶剂，得到棕色的粘稠物，加入二次水进行溶解，于10000 rpm下离心5 min，获得棕黄色的上清液；
（3）棕黄色上清液用500-1000 Da的透析袋处理2天，期间每隔6 h换一次水，透析后的溶液-40℃冷冻干燥48 h，得到棕色N-CDs固体粉末。
2.根据权利要求1所述的一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用，其特征在于：利用碳量子点靶向细胞核仁免洗成像的步骤为：
（1）N-CDs储备液的制备：0.01 g N-CDs固体粉末完全溶解于10 mL二次水中，得到浓度为1 mg/mL的N-CDs储备液；
（2）人宫颈癌HeLa细胞核仁成像：将HeLa细胞培养在富含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃、5% CO2环境中孵育48 h；用步骤（1）所制备的1.0 mg/mL的 N-CDs储备液750 μL和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5% CO2环境中孵育2 h，在高分辨激光共聚焦扫描显微镜下观察HeLa细胞的形态和荧光；
（3）大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤PC12细胞核仁成像：将PC12细胞培养在富含10%胎牛血清的DMEM中，于37℃、5 % CO2环境中孵育48 h；用步骤（1）所制备的1.0 mg/mL的 N-CDs储备液750 μL和750 μL DMEM混合液代替旧DMEM培养液，继续于37℃、5 % CO2环境中孵育2 h，在高分辨激光共聚焦扫描显微镜下观察PC12细胞形态和荧光。
3.根据权利要求1所述的一种碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用，其特征在于：步骤（2）中棕色粘稠物加入30 mL的二次水溶解。
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