CN105018082A - 丝素蛋白提取细胞显影用碳量子点标记探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种丝素蛋白提取细胞显影用碳量子点标记探针的制备方法，为碳量子点医用显影材料的新型制备方法，涉及一种碳化方法制备纳米荧光量子点材料，是荧光技术与纳米技术的交叉应用，包括丝素蛋白粗品的制备和碳点的制备。从普通蚕丝中去除杂质成分，除去丝胶等大分子量成分，提取丝素成分，通过水热裂解及碳化的方式合成碳量子点型材料。提供一种具有稳定性好、生物相容性高、荧光效率高的制备方法。
Description
技术领域
本发明是生物材料的制备和应用，具体是由丝素蛋白为原料制备纳米荧光显影材料，是材料学技术与荧光技术的交叉应用。
背景技术
荧光标记技术是分子影像技术中重要分支, 通过化学反应、修饰或覆盖等方法将拟检测的对象(分子、细胞、组织等)在特定光线波长激发下产生荧光而自我显示的过程，在基础生物学、医疗科学及生物医药领域具有重要意义。其发明及应用极大的推动诸如癌症早期诊断，诱导干细胞疗法，药物传输，病原体检测，基因治疗，影像引导手术，癌症分期等新兴医疗技术的发展。纳米荧光材料，与传统有机荧光分子相比，有着独特的光学特点：第一、激发光谱宽且连续，发射光谱可通过半导体颗粒的大小、组分调节。第二、光化学性质稳定,不易因化学和生物代谢作用降解,可持续数周或更长时间。第三、纳米尺度粒径,表面积大,可与多种化学基团如单克隆抗体、寡聚核苷酸等通过共价键连接。碳量子点材料由于共轭π结构的量子尺寸效应，表面态和边缘态效应，碳核态和分子态效应，本征态和缺陷态效应，sp2局域化的电子空穴对效应，激子辐射复合和杂原子到碳的电荷转移效应等，成为一种新型的荧光材料。碳量子点的传统合成方法可分为化学法和物理法两大类，化学法包括电化学法[1]、氧化法[2]、微波法[3]和模板法等； 物理法包括电弧放电法[4]和激光烧蚀法[5]等。以多种材料为碳源，如用燃烧蜡烛煤烟的方法制备了量子产率为2. 0%的碳量子点[6]; 柠檬酸单元作为碳源，通过热解不同的柠檬酸铵盐来合成碳量子点[7]；采用糖类作为碳源，先将糖类通过浓硫酸脱水制得含碳的前体，再使用硝酸将这些含碳的前体破裂成单个的碳粒子得到发荧光的碳量子点[8];使用活性炭作为碳源也可合成光致发光碳量子点的方法，合成的碳量子点量子产率达12. 6%[9]。
本发明解决的技术问题是显影用碳量子点的合成制备问题，提供一种具有稳定性好、生物相容性高、荧光效率高的制备方法, 同时工艺简单、成本低、易重复的优点。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种由丝素制备水溶性碳量子点材料的新型方法。
一种丝素蛋白提取细胞显影用碳量子点标记探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）丝素蛋白粗品的制备：
茧壳乙醚中浸泡两天，以除去家表面的蜡质物，干燥后再浸泡在无水乙醇两天除去茧壳张的碳水化合物和灰分，洗净干燥后备用；配置0.4%的碳酸钠溶液，将处理过的丝素放入碳酸钠溶液中蒸煮约0.5h, 煮好后再用蒸馏水清洗，重复三次，以保证丝素中已经没有碳酸钠存在，再次过滤后清洗至无滑腻感觉，以完全去除丝素中的残留丝胶，得到的纤维状丝素用去离子水洗涤后干燥备用；配置CaCl2/C2H5OH/H2O=1:2:8混合溶液，将干燥后的丝素放入该盐溶液中加热至80℃，保持此温度使丝素溶解，得到透明的丝素溶液，并将溶液置入蒸馏水中透析，得到透明的丝素水溶液，真空干燥后得到丝素蛋白水溶液粗产品；
（2）碳点的制备：
将上述方法得到的丝素水溶液pH调节为中性，并置入50ml四氟内衬水热釜中，烘箱中高温反应4小时，得到含有黑色固体的淡黄色溶液；将上述含有黑色固体的谈黄色液体经12000rpm高速离心分离后得到澄清的淡黄色液体并置于安瓿中保存，由所得淡黄色真空干燥后得到蓬松状的碳量子点固体颗粒。
所述细胞显影用碳量子点，此种碳点结构可以克服普通化学荧光标记材料毒性大，荧光效率低，易淬灭问题。
本发明提供的碳量子点的荧光量子产率采用常规的参比法测定，即在相同激发条件下，分别测定待测荧光试样、已知量子产率的参比荧光标准物质的积分荧光强度和同一激发波长的入射光的吸收度，再将这些值代人下列公式：
，和 分别为待测物质和参比物质的荧光量子产率；和分别为待测物质和参比物质的荧光积分强度；和为待测物质和参比物质在该激发波长的入射光的吸收度；和分别为待测样品和标准样品的折射率。以硫酸奎宁作为参比物，经测定本发明提供的碳量子点荧光为15%~30%, 可满足于生物监测用途。
本发明解决的技术问题是显影用碳量子点的合成制备问题，提供一种具有稳定性好、生物相容性高、荧光效率高的制备方法, 同时工艺简单、成本低、易重复的优点。
本发明有如下优势：该方法使用丝素为碳量子点原料，原料简单易得，以水热法为高温碳化方法制备水溶性的碳点荧光材料。操作简便，容易工业化实现；生物相容性高，安全性好，应用于细胞及组织荧光成像。
附图说明
图1为实施例的制备方法流程。
图2为实施例制备所得碳量子点的TEM照片。
图3为实施例所得碳量子的荧光光谱。
图4为碳量子点显影所得的HEK293、U87mg细胞激光共聚焦照片。
图5为碳量子点的HEK293及U87mg细胞毒性曲线。
具体实施方式
碳点材料的制备过程如图1所示，以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1：
将丝素蛋白0.1g 溶解于50ml 去离子水溶液中，加入氢氧化钠将PH调节至10，置于100ml四氟乙烯反应釜中置换至氮气气氛后至160摄氏度烘箱中放置4个小时。冷却至室温，2000rpm离心10min 后置于1000Da透析袋中除去游离小分子，得到碳量子点溶液，测得荧光产率为12.4%。TEM照片如图2所示，制备的碳量子点弥散分布，尺寸大小在5-10nm范围。荧光光谱如图3所示，
实施例2：
将丝素蛋白0.1g 溶解于50ml 去离子水溶液中，加入氢氧化钠将PH调节至10，置于100ml四氟乙烯反应釜中加热至200摄氏度烘箱中放置4个小时。冷却至室温，2000rpm离心10min 后置于1000Da透析袋中除去游离小分子，得到碳量子点溶液。将碳量子点溶液真空干燥后，定量重新分散得到已知浓度的碳量子点溶液，测得荧光产率为15.6%。
实施例3：
将丝素蛋白0.1g 溶解于50ml 去离子水溶液中，加入氢氧化钠将PH调节至10，置于100ml四氟乙烯反应釜中加热至220摄氏度烘箱中放置4个小时。冷却至室温，2000rpm离心10min 后置于1000Da透析袋中除去游离小分子，得到碳量子点溶液，测得荧光产率为14.7%。
实施例4：
将丝素蛋白0.1g 溶解于50ml 去离子水溶液中，加入氢氧化钠将PH调节至10，置于100ml四氟乙烯反应釜中加热至240摄氏度烘箱中放置4个小时。冷却至室温，2000rpm离心10min 后置于1000Da透析袋中除去游离小分子，得到碳量子点溶液，测得荧光产率为13.6%
碳量子点纳米粒子的荧光性能考察：将实施例2中制得的碳量子点置于分光皿中。分别改变激发波长检验荧光激发波长检测波长从370nm到570nm，检测到的激发波长为450nm 到 544nm，如图3 所示。可以看出在紫外光370nm波长激发时，最强的荧光激发波长为450nm。
细胞对于碳量子点纳米粒子吞噬的显影观察：
将HEK293和U87mg细胞，以2×104 个细胞/ 孔的浓度接种于平底四分皿中( 每孔100μL 培基)，加入10μL 不同浓度的碳量子点材料混合入血清培基中在37℃、5％的CO2 条件下孵育2小时；共孵育后加入多聚甲醛进行细胞固定；在共聚焦显微镜下观测成像效果，如图4所示。
碳量子点细胞毒性的评价：参照实施例1,2,3 的步骤制备碳量子点。为考察其生物相容性，分别选取HEK293和U87mg细胞，以2×104 个细胞/ 孔的浓度接种于96 孔细胞培养板内( 每孔100μL 培基)，加入10μL 不同浓度的药物材料，在无血清培基中37℃、5％的CO2 条件下孵育32小时；共孵育后75μL 无血清培养基溶液去除，补充含10％血清的新鲜培基至100μL，继续培养4h ；10μL Cell Counting Kit 单溶液细胞增殖检测试剂盒加入每孔，孵育4h ；直接在酶标仪490nm 处读数据，计算出细胞在不同浓度作用下的存活率。碳量子点在10 ～ 160mg/mL 的浓度范围内HEK293和U87Mg细胞的影响。随着碳量子带你浓度增大，细胞的存活率略呈下降趋势， 32小时后HEK293细胞存活率为93.8%和95.8%。
Claims (2)
1.一种丝素蛋白提取细胞显影用碳量子点标记探针的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）丝素蛋白粗品的制备：
茧壳乙醚中浸泡两天，以除去家表面的蜡质物，干燥后再浸泡在无水乙醇两天除去茧壳张的碳水化合物和灰分，洗净干燥后备用；配置0.4%的碳酸钠溶液，将处理过的丝素放入碳酸钠溶液中蒸煮约0.5h, 煮好后再用蒸馏水清洗，重复三次，以保证丝素中已经没有碳酸钠存在，再次过滤后清洗至无滑腻感觉，以完全去除丝素中的残留丝胶，得到的纤维状丝素用去离子水洗涤后干燥备用；配置CaCl2/C2H5OH/H2O=1:2:8混合溶液，将干燥后的丝素放入该盐溶液中加热至80℃，保持此温度使丝素溶解，得到透明的丝素溶液，并将溶液置入蒸馏水中透析，得到透明的丝素水溶液，真空干燥后得到丝素蛋白水溶液粗产品；
（2）碳点的制备：
将上述方法得到的丝素水溶液pH调节为中性，并置入50ml四氟内衬水热釜中，烘箱中高温反应4小时，得到含有黑色固体的淡黄色溶液；将上述含有黑色固体的谈黄色液体经12000rpm高速离心分离后得到澄清的淡黄色液体并置于安瓿中保存，由所得淡黄色真空干燥后得到蓬松状的碳量子点固体颗粒。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白提取细胞显影用碳量子点标记探针的制备方法，其特征在于，所述细胞显影用碳量子点，此种碳点结构可以克服普通化学荧光标记材料毒性大，荧光效率低，易淬灭问题。
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