CN107840319A - 一种含氮碳点及其合成方法和其在细胞标记成像方面的应用 - Google Patents
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Abstract
一种含氮碳点及其合成方法和其在细胞标记成像方面的应用。本发明采用水热合成法一步合成荧光含氮碳点的方法。本方法采用柠檬酸作为碳源，聚乙烯亚胺作为含氮的钝化剂一步合成了一种高荧光量子产率的荧光碳点。与其他制备方法相比，本申请方法反应简单快速，无需苛刻的反应条件，原材料结构简单，便宜且方便易得，所得碳点的量子产率高，已成功地将其应用于细胞荧光标记，此碳点并可穿越血脑屏障。本发明的含氮荧光碳点可应用于化学、材料和生物医药科学等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种含氮碳点的合成方法及其在生物细胞标记成像方面的应用，属于化学、材料及生物医药科学领域。
背景技术
碳点是一种可发光的含聚合物外壳的碳纳米粒子，其形状类似于球型单分散的荧光碳质纳米材料（粒径一般低于10 nm）。碳点不仅具有一些传统半导体量子点的特点，如发射波长可调控，耐光漂白，易于生物标记，而且还有以下优点：生物相容性好，生物毒性低，表面易于功能化修饰、制备材料来源广泛、价廉易得等。作为一种新兴的含氮碳纳米材料，其在生物医学的光学影像、肿瘤诊断和靶向治疗的生物标记和传感器等方面拥有良好的应用前景和发展潜力。
发明内容
本发明的目的是利用水热合成法一步合成一种具有较高量子产率的含氮碳点，并采用293T细胞进行荧光标记。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是将柠檬酸和聚乙烯亚胺混合，水热合成法加热一定时间制得所需碳点，然后采用透析方法纯化样品，除去反应体系中残留的柠檬酸，离心，干燥，得到最终产物。所得含氮碳点的量子产率高，发光性能优异，已成功用于标记293T细胞，且可穿越血脑屏障，可用于生物细胞标记和光学成像，潜在可用于药物载体和脑部疾病的诊疗。
本发明的方法具体包括如下步骤：
①称取适量柠檬酸，加入一定体积的聚乙烯亚胺，置于均相反应仪中加热，此水热合成法加热时间为2~5 hour，冷却至室温。
②将反应得到的碳点装入透析袋中透析一段时间，透析时长为24~72h。袋外加蒸馏水，期间不断换水。离心转速为1000~15000g。将透析后的碳点放入真空干燥箱中，真空干燥温度为20~100℃，干燥过夜。得到最终产物。
③将293T细胞以适宜的密度培养于激光共聚焦专用皿中，培养一段时间，然后将培养基换为含有碳点的新鲜培养基，继续培养一段时间，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况。
具体实施方法
本发明的一个目的是提供一种制备发光碳点的方法，包括以下步骤：将柠檬酸、聚乙烯亚胺（不同分子量）采用水热合成法，得到一种含氮发光碳点。
具体的，所述柠檬酸为一水合柠檬酸；
具体的，所述聚乙烯亚胺为不同分子量支链的聚合物，分子量为1800-2500的浓度为50%的聚乙烯亚胺。
具体的，所述柠檬酸酸与所述聚乙烯亚胺配比为1mol柠檬酸，聚乙烯亚胺：30-900mol；
具体的，所述柠檬酸与所述聚乙烯亚胺的配比为1mol柠檬酸与聚乙烯亚胺的摩尔比为1 : 30 - 1 : 900；优选1 : 30。
具体的，所述合成的时间为2 hour；所述加热的温度为100℃。
具体的，所述方法中，在所述水热合成法还包括如下步骤：将所述合成的产物进行透析，然后真空干燥；即得到最终产物。
具体的，所述透析的透析袋采用的是截留分子量为500 Da的透析袋；所述透析的透析时间为24-48 h；所述真空干燥的温度为20-50℃；所述离心的转速为8000-15000 g。
本发明的另一个目的是提供所述方法制备得到的发光碳点。
具体的，所述含氮发光碳点的粒径范围为1.80-3.42 nm；优选2.60-3.0 nm；
所述含氮碳点的激发波长范围300-420 nm；
最大激发波长的范围为340-380 nm；优选351-365 nm；再优选355、 358或360nm；
发射波长范围360-520 nm；优选390-460 nm；再优选390-430 nm、450-460 nm；
最大发射波长的范围为440-460 nm；再优选440、448或452nm。
所述发光含氮碳点的荧光量子产率为43.7-63.2%；优选55.4-63.2%；再优选55.4%、56.1% 或63.2%。
含氮碳点量子产率的测量
在测量中，采用硫酸奎宁作为参照标准（其量子产率为54%）。首先，分别检测荧光碳点水溶液和硫酸奎宁溶液在激发波长下的吸光度。然后，分别检测二者的荧光发射峰，并积分得到荧光峰面积。再按照以下公式计算荧光量子产率：
ΦX（样品）和ΦST（参比物质）分别是待测物质和参比物质的量子产率，Grad X（样品）和Grad ST（参比物质）是二者荧光发射峰面积与激发波长下吸光度的比值，ηX（样品）和ηST（参比物质）是二者的溶剂的折射率。最后计算得出，制备得到的含氮碳点量子产率为63%（柠檬酸1.26 g, 聚乙烯亚胺40 mg）。
本发明的再一个目的是提供所述的碳点在生物细胞标记中的应用，或在制备生物分子标记物、细胞标记物中的应用。
本发明采用柠檬酸作为碳源，聚乙烯亚胺作为掺氮钝化剂合成碳点。实现合成与钝化步骤同步完成，方法简便、迅速，成本低廉，在一般实验室均能完成，易于推广，所得的含氮碳点的量子产率高，并成功应用于293T细胞的标记，并实现可穿越血脑屏障。本发明可更广泛地应用于化学、材料和生物医药科学等领域。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。
实施例1
称取1.26 g柠檬酸，加入10 ml聚乙烯亚胺水溶液（MW：1800-2500，4 mg/ml），于均相反应仪的反应釜中加热2 h，设定温度100℃，转速为30r/min。反应完成后自然冷却至室温，将反应得到的含氮碳点装入透析袋中透析48 h，袋外加蒸馏水，期间不断换水。透析后放入真空干燥箱中，50℃抽真空干燥得到最终产物。
将293T细胞以2*105个/ml的密度培养于激光共聚焦专用小皿中，培养12 h，然后将培养基换为含有1.0 mg/ml 碳点的新鲜培养基，继续培养24 h，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况。
实施例2
称取1.26 g柠檬酸，加入10 ml聚乙烯亚胺水溶液（MW：20000，2 mg/ml），于均相反应仪的反应釜中加热3 h，设定温度180℃，转速为30 r/min。反应完成后自然冷却至室温，将反应得到的碳点装入透析袋中透析48 h，袋外加蒸馏水，期间不断换水。透析后放入真空干燥箱中，50℃抽真空干燥得到最终产物。
将293T细胞以2*105个/ml的密度培养于激光共聚焦专用小皿中，培养12 h，然后将培养基换为含有2.5 mg/ml 碳点的新鲜培养基，继续培养24 h，在激光共聚焦显微镜下实时观察并记录碳点对细胞的标记情况。
【附图说明】
图1为实施例1合成得到的碳点的透射电镜图。
图2为实施例1合成碳点的紫外-可见光吸收光谱图和荧光发射光谱图。
图3为实施例1合成得到的碳点对293T细胞的实时标记情况。
图4为实施例2合成得到的碳点的透射电镜图。
图5为实施例2合成碳点的紫外-可见光吸收光谱图和荧光发射光谱图。
图6 为实施例2合成的碳点对293T细胞的标记情况。
实施例1碳点的表征
1、透射电镜扫描
如图1所示。制得碳点为球形，分布均匀，粒径范围为1.8-3.4 nm, 格晶间距0.22 nm.
2、碳点的吸收波长和发射波长
如图2所示。左侧曲线为制得碳点的紫外吸收光谱，在240 nm有一吸收峰，在300-410nm有一吸收带。右侧曲线为制得碳点的荧光发射光谱，激发波长范围320-460 nm，最大激发波长为360 nm；发射波长范围390-510 nm，最大发射波长为452 nm。
碳点的生物学用途
将大鼠293T细胞以2×105个/ml的密度培养于激光共聚焦专用皿中，培养12 h，然后将培养基换为含有1.5 mg/ml 碳点的新鲜培养基，继续培养24 h，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况，结果见图3。图3中为激光共聚焦显微镜下，波长为360 nm的紫外光激发下发出蓝色荧光，碳点标记的细胞在不同时间点下的实时细胞影像。该实验表明，碳点在细胞内发出蓝色荧光，并成功对293T细胞不同时间点进行了标记。
实施例2碳点的表征
1、透射电镜扫描
如图4所示。制得碳点为球形，分布均匀。
2、碳点的吸收波长和发射波长
如图5所示。左侧曲线为制得碳点的紫外吸收光谱，在300-410 nm有一吸收带。右侧曲线为制得碳点的荧光发射光谱，激发波长范围320-460 nm，最大激发波长为360 nm；发射波长范围390-510 nm，最大发射波长为452 nm。
碳点的生物学用途
将大鼠293T细胞以2×105个/ml的密度培养于激光共聚焦专用皿中，培养12 h，然后将培养基换为含有1.5 mg/ml 碳点的新鲜培养基，继续培养24 h，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况，结果见图6。图6中，A、B、C图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在波长为360 nm的紫外光激发下发出蓝色荧光，D、E、F图片为激光共聚焦显微镜下没有被碳点标记后细胞的成像。该实验表明，合成的碳点在细胞内发出蓝色荧光，并成功对293T细胞进行了标记。
对比例1
按照专利《一种高荧光量子产率碳点的制备方法》（庞代文赵巧玲张志凌）制备碳点，所得碳点的荧光量子产率为5.5%-7.1%。
1．一种含氮碳点的合成方法及其在生物细胞标记方面的应用。其特征在于，包括如下步骤：
①柠檬酸、聚乙烯亚胺作为反应物，充分混合后进行水热法合成，冷却至室温。
②将反应得到的碳点装入透析袋（截留分子量500 Da）中透析48h。将透析后的碳点放入真空干燥箱中，干燥，得到最终产物。
③将293T细胞培养于激光共聚焦专用皿中，培养一段时间，然后将培养基换为含有碳点的新鲜培养基，继续培养一段时间，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，聚乙烯亚胺包分子量在1800-2500及20000左右；柠檬酸作为碳源等。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，柠檬酸、和聚乙烯亚胺之间的摩尔比具有一定的范围。例如，柠檬酸与聚乙烯亚胺的摩尔比范围是1 : 30～1 : 9000。
4. 根据权利要求1~3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应物采用水热合成法，加热时间为2~5 hour。
5. 根据权利要求1~4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，透析的时间长度为24~72h。
6. 根据权利要求1~5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，真空干燥温度为20~100℃。
7. 根据权利要求1~6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，离心采用的转速为1000~15000 g。
8. 根据权利要求1~7所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，将制备的含氮碳点作为药物载体，加入到293T细胞中，利用激光共聚焦显微镜观察并记录碳点对细胞的标记情况。
本发明采用水热合成法一步合成荧光含氮碳点的方法。本方法采用柠檬酸作为碳源，聚乙烯亚胺作为含氮的钝化剂一步合成了一种高荧光量子产率的荧光碳点。与其他制备方法相比，本申请方法反应简单快速，无需苛刻的反应条件，原材料结构简单，便宜且方便易得，所得碳点的量子产率高，已成功地将其应用于细胞荧光标记，此碳点并可穿越血脑屏障。本发明的含氮荧光碳点可应用于化学、材料和生物医药科学等领域。
Claims (8)
1.一种含氮碳点的合成方法及其在生物细胞标记方面的应用，其特征在于，包括如下步骤：
① 柠檬酸、聚乙烯亚胺作为反应物，充分混合后进行水热法合成，冷却至室温；
② 将反应得到的碳点装入透析袋（截留分子量500 Da）中透析48h；将透析后的碳点放入真空干燥箱中，干燥，得到最终产物；
③ 将293T细胞培养于激光共聚焦专用皿中，培养一段时间，然后将培养基换为含有碳点的新鲜培养基，继续培养一段时间，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，聚乙烯亚胺包分子量在1800-2500及20000左右；柠檬酸作为碳源等。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，柠檬酸、和聚乙烯亚胺之间的摩尔比具有一定的范围，例如，柠檬酸与聚乙烯亚胺的摩尔比范围是1 : 30 ～1 :9000。
4.根据权利要求1~3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应物采用水热合成法，加热时间为2~5 hour。
5.根据权利要求1~4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，透析的时间长度为24~72h。
6.根据权利要求1~5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，真空干燥温度为20~100℃。
7.根据权利要求1~6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，离心采用的转速为1000~15000 g。
8.根据权利要求1~7所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，将制备的含氮碳点作为药物载体，加入到293T细胞中，利用激光共聚焦显微镜观察并记录碳点对细胞的标记情况。
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