CN104130777A - 一种荧光碳点及其合成方法和其在细胞标记方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用微波加热法一步合成荧光碳点的方法。本方法采用叶酸作为碳源，通过微波加热法一步合成了一种荧光碳点。与其他制备方法相比，本申请方法反应简单快速，无需苛刻的反应条件，原材料结构简单，便宜且方便易得，所得碳点量子的产率高，并已成功地将其应用于细胞荧光标记。本发明的荧光碳点可应用于化学、生物和材料科学等领域。

Description

一种荧光碳点及其合成方法和其在细胞标记方面的应用

技术领域

本发明涉及一种荧光碳点及其合成方法和其在细胞标记方面的应用。

背景技术

碳点的粒径一般小于或者接近激子波尔半径，经过表面钝化后，不仅具有一些传统半导体量子点的特点，如发射波长可调控，耐光漂白，易于生物标记，而且还有以下优点：量子点发光不稳定，有光闪烁现象；而荧光碳点发光稳定。量子点通常由II-VI族或III-V族元素组成，重金属离子会影响细胞的增殖和发育能力，对环境也会造成污染；而碳点不含重金属元素，生物毒性低，对细胞的正常结构和功能无明显影响。综上所述，碳点在细胞成像、生物活体标记和癌症诊断等领域具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备发光碳点的方法，包括以下步骤：将叶酸、多元醇和无机酸混合后进行微波加热，得到发光碳点。

具体的，所述多元醇为二元醇或三元醇中的一种或其组合；所述二元醇具体为一缩二乙二醇或平均分子量为200的聚乙二醇，所述三元醇具体为甘油；所述无机酸为一元无机酸或二元无机酸中的一种或其组合；所述一元无机酸为盐酸或硝酸；所述二元酸具体为硫酸。

具体的，所述无机酸为浓酸；再具体的，所述浓酸为浓度为36.5％以上的盐酸、98％以上的硫酸或68％以上的硝酸。

具体的，所述叶酸与所述多元醇的配比为1mol叶酸：1000-3000mol羟基；具体为所述叶酸与所述二元醇的摩尔比为1∶500-1∶1500，优选1∶500-1∶1000；再优选1∶500或1∶1000；叶酸与三元醇的摩尔比为1∶333-1∶1000；优选1∶1000。

具体的，所述叶酸与所述无机酸的配比为1mol叶酸∶10-100mol氢离子；具体为叶酸与一元酸的摩尔比为1∶10-1∶100；优选1∶10-1∶55；再优选1∶10或1∶55；叶酸与二元酸的摩尔比为1∶5-1∶50；优选1∶50。

具体的，所述微波加热的时间为0.5-10min；所述微波加热的功率为500W-900W。

具体的，所述方法中，在所述微波加热后还包括如下步骤：将所述微波加热的产物进行透析，然后真空干燥；干燥样品经无水乙醇磨洗，离心，弃去上清液，将获得的沉淀真空干燥，得到最终产物。

具体的，所述透析的透析袋采用的是截留分子量为500Da的透析袋；所述透析的透析时间为24-120h；所述真空干燥的温度为20℃-100℃；所述离心的转速为8000-15300g。

本发明的另一个目的是提供所述方法制备得到的发光碳点。

具体的，所述发光碳点的粒径范围为3.62-5.62nm；优选3.71-5.61nm；再优选3.73-5.56nm、3.92-5.61nm或3.71-5.56nm；

所述碳点的激发波长范围320nm-460nm；

最大激发波长的范围为340-380nm；优选351-356nm；再优选351nm、354nm或356nm；

发射波长范围330-640nm；优选390-602nm；再优选390nm-599nm、394nm-601nm或394nm-602nm；

最大发射波长的范围为440-480nm；优选456-459nm；再优选456nm、457nm或459nm

所述发光碳点的荧光量子产率为12.7％-18.9％；优选15.4％-18.9％；再优选15.4％、17.1％或18.9％。

本发明的再一个目的是提供所述的碳点在生物分子标记或细胞标记中的应用，或在制备生物分子标记物、细胞标记物中的应用。

本发明所述多元醇指分子式中含有2个以上羟基基团的化合物。

本发明所述的二元醇指分子式中含有2个羟基基团的化合物。

本发明所述的三元醇指分子式中含有3个羟基基团的化合物。

本发明所述一元酸指一个酸分子中只能电离出1个H⁺离子的酸。

本发明所述二元酸指一个酸分子中只能电离出2个H⁺离子的酸。

本发明采用叶酸作为碳源，实现碳点的制备与钝化步骤同步完成，方法简便、迅速，成本低廉，在一般实验室均能完成，易于推广，得到的碳点量子产率高高于目前其他采用微波加热法合成的碳点的荧光产率，并成功应用于大鼠脑胶质瘤细胞的标记。本发明可更广泛地应用于化学、生物和材料科学等领域。

附图说明

图1为实施例1合成得到的碳点的透射电镜图。

图2为实施例1合成得到的碳点的紫外-可见光吸收光谱图和荧光发射光谱图。

图3为实施例1合成得到的碳点对大鼠脑胶质瘤细胞的标记情况。

图4为实施例2合成得到的碳点的透射电镜图。

图5为实施例2合成得到的碳点的紫外-可见光吸收光谱图和荧光发射光谱图。

图6为实施例2合成得到的碳点对大鼠脑胶质瘤细胞的标记情况。

图7为实施例3合成得到的碳点的透射电镜图。

图8为实施例3合成得到的碳点的紫外-可见光吸收光谱图和荧光发射光谱图。

图9为实施例3合成得到的碳点对大鼠脑胶质瘤细胞的标记情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面通过具体实例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于此。

实施例1

一、碳点的制备

称取15.00mg叶酸(纯度97％)，加入1.60ml一缩二乙二醇(纯度98％)，27.50μl浓盐酸(浓度为36.5％)，三者摩尔比为1∶500∶10，超声溶解。置于微波炉中加热30s，加热功率900W，自然冷却至室温，将反应得到的碳点装入截留分子量为500Da透析袋中透析72h，袋外加蒸馏水，期间不断换水。透析后放入真空干燥箱中，60℃抽真空干燥过夜。第二天向干燥后的样品中加入15ml无水乙醇，充分磨洗，15300g离心10min。离心后弃去上清液，将获得的沉淀37℃抽真空干燥，得到最终产物。

二、碳点的表征

1、透射电镜扫描

如图1所示。制得碳点为球形，分布均匀，粒径范围为3.73-5.56nm。

2、碳点的吸收波长和发射波长

如图2所示。左侧曲线为制得碳点的紫外吸收光谱，在277nm有一吸收峰，在320nm-360nm有一吸收带。右侧曲线为制得碳点的荧光发射光谱，激发波长范围320-460nm，最大激发波长为356nm；发射波长范围390nm-599nm，最大发射波长为456nm。

3、荧光量子产率

检测方法：

在测量中，采用硫酸奎宁作为参照标准(其量子产率为54％)。首先，分别检测荧光碳点水溶液和硫酸奎宁水溶液在相同激发波长下的吸光度。然后，分别检测此激发光波长下所得到的二者的荧光发射峰，并积分得到荧光峰面积。再按照以下公式计算荧光量子产率：

${\mathrm{\Φ}}_X={\mathrm{\Φ}}_{\mathrm{ST}}\left(\frac{{\mathrm{Grad}}_X}{{\mathrm{Grad}}_{\mathrm{ST}}}\right)\left(\frac{{\mathrm{\η}}_X^2}{{\mathrm{\η}}_{\mathrm{ST}}^2}\right)$

Φ_X(样品)和Φ_ST(参比物质)分别是待测物质和参比物质硫酸奎宁的量子产率，其中Φ_X为0.54；Grad_X(样品)和Grad_ST(参比物质)是二者荧光发射峰面积与激发波长下吸光度的比值；η_X(样品)和η_ST(参比物质)是二者的溶剂的折射率。

结果量子产率为18.9％。

三、碳点的生物学用途

将大鼠脑胶质瘤细胞以1×10⁵个/ml的密度培养于激光共聚焦专用小皿中，培养12h，然后将培养基换为含有0.2mg/ml碳点的新鲜培养基，继续培养24h，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况，结果见图3。图3中，左侧图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在明场下的成像；右侧图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在波长为405nm的紫外光激发下发出蓝色荧光。该实验表明，制得碳点在细胞内发出蓝色荧光，并成功对大鼠脑胶质瘤细胞进行了标记。

实施例2

一、碳点的制备

称取40mg叶酸(纯度97％)，加入6.52ml甘油(纯度99％)，240.07μl浓硫酸(浓度为98％)，三者摩尔比为1∶1000∶50，超声溶解。置于微波炉中加热5.25min(加热功率500W)，冷却至室温，将反应得到的碳点装入截留分子量为500Da透析袋中透析24h，袋外加蒸馏水，期间不断换水。透析后放入真空干燥箱中，100℃干燥过夜。第二天向干燥后的样品中加入15ml无水乙醇，充分磨洗，8000g离心10min。离心后弃去上清液，将获得的沉淀干燥，得到最终产物。

二、碳点的表征

1、透射电镜扫描

如图4所示。制得碳点为球形，分布均匀，粒径范围为3.92-5.61nm。

2、碳点的吸收波长和发射波长

如图5所示。左侧曲线为制得碳点的紫外吸收光谱，在278nm有一吸收峰，在300nm-340nm有一吸收带。右侧曲线为制得碳点的荧光发射光谱，激发波长范围320-460nm，最大激发波长为351nm；发射波长范围394nm-602nm，最大发射波长为457nm。

3、荧光量子产率

检测方法与实施例1相同，测得量子产率为15.4％。

三、碳点的生物学用途

将大鼠脑胶质瘤细胞以8×10⁴个/ml的密度培养于激光共聚焦专用小皿中，培养15h，然后将培养基换为含有0.5mg/ml碳点的新鲜培养基，继续培养12h，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况，结果见图6。图6中，左侧图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在明场下的成像；右侧图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在波长为405nm的紫外光激发下发出蓝色荧光。该实验表明，制得碳点在细胞内发出蓝色荧光，并成功对大鼠脑胶质瘤细胞进行了标记。

实施例3

一、碳点的制备

称取20.00mg叶酸(纯度97％)，加入7.91ml PEG200(纯度99％)，159.6μl浓硝酸(浓度为68％)，三者摩尔比为1∶1000∶55，超声溶解。置于微波炉中加热10min(加热功率700W)，冷却至室温，将反应得到的碳点装入截留分子量为500Da透析袋中透析120h，袋外加蒸馏水，期间不断换水。透析后放入真空干燥箱中，20℃干燥过夜。第二天向干燥后的样品中加入15ml无水乙醇，充分磨洗，11650g离心10min。离心后弃去上清液，将获得的沉淀干燥，得到最终产物。

二、碳点的表征

1、透射电镜扫描

如图7所示。制得碳点为球形，分布均匀，粒径范围为3.71-5.56nm。

2、碳点的吸收波长和发射波长

如图8所示。左侧曲线为制得碳点的紫外吸收光谱，在276nm有一吸收峰，在320nm-350nm有一吸收带。右侧曲线为制得碳点的荧光发射光谱，激发波长范围320-460nm，最大激发波长为354nm；发射波长范围394nm-601nm，最大发射波长为459nm。

3、荧光量子产率

检测方法与实施例1相同，测得量子产率为17.1％。

三、碳点的生物学用途

将大鼠脑胶质瘤细胞以8×10⁴个/ml的密度培养于激光共聚焦专用小皿中，培养15h，然后将培养基换为含有0.5mg/ml碳点的新鲜培养基，继续培养12h，在激光共聚焦显微镜下观察并记录碳点对细胞的标记情况，结果见图9。图9中，左侧图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在明场下的成像；右侧图片为激光共聚焦显微镜下被碳点标记后细胞在波长为405nm的紫外光激发下发出蓝色荧光。该实验表明，制得碳点在细胞内发出蓝色荧光，并成功对大鼠脑胶质瘤细胞进行了标记。

对比例1

按照专利《一种高荧光量子产率碳点的制备方法》(庞代文赵巧玲张志凌)制备碳点，所得碳点的荧光量子产率为5.5％-7.1％。

Claims (10)

1.一种制备发光碳点的方法，包括以下步骤：将叶酸、多元醇和无机酸混合后进行微波加热，得到发光碳点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多元醇为二元醇或三元醇中的一种或其组合；所述无机酸为一元无机酸或二元无机酸中的一种或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述二元醇具体为一缩二乙二醇或平均分子量为200的聚乙二醇，所述三元醇具体为甘油；所述一元无机酸为盐酸或硝酸；所述二元无机酸为硫酸。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述叶酸与所述多元醇的配比为1mol叶酸∶1000-3000mol羟基；所述叶酸与所述无机酸的配比为1mol叶酸∶10-100mol氢离子。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述微波加热的时间为0.5-10min。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述微波加热的功率为500W-900W。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述微波加热后还包括如下步骤：将所述微波加热的产物进行透析，然后真空干燥；干燥样品经无水乙醇磨洗，离心，弃去上清液，将获得的沉淀真空干燥，得到最终产物。

8.由权利要求1-7任一所述方法制备得到的发光碳点。

9.根据权利要求8所述的发光碳点，其特征在于：所述发光碳点的粒径范围为3.62-5.62nm；所述碳点的激发波长范围320nm-460nm，最大激发波长350-360nm；发射波长范围330-640nm，最大发射波长440-480nm。

10.权利要求1-7任一所述方法制备得到的发光碳点或权利要求8-9任一所述的发光碳点在生物分子标记或细胞标记中的应用，或在制备生物分子标记物、细胞标记物中的应用。