CN106610376A - 荧光碳点在活细胞核仁成像或rna标记或显示中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光碳点在活细胞核仁成像或RNA标记或显示中的应用。所述荧光碳点采用具有上下转化功能的红光发射荧光碳点，特别是CN104263366A中公开的荧光碳点。在一些实施例中，可以通过培养细胞、配制染料溶液、染色、成像，完成使用荧光碳点对活细胞的核仁成像。藉由本发明，可实现对活细胞核仁的成像或对活细胞中RNA的标记或显示，且对核仁成像的选择性高、成像分辨率高，同时具有简单快速、成本低，对生物毒性低等特点，具有很高的实用价值。

Description

荧光碳点在活细胞核仁成像或RNA标记或显示中的应用

技术领域

本发明涉及一种荧光碳点，特别涉及一种具有上下转化功能的红光发射荧光碳点在细胞核仁成像或者标记或显示活细胞内RNA中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

核仁是细胞核中的一个重要的结构。核仁是细胞核内的生产核糖体的机器，所有真核生物的核糖体RNA(rRNA)的转录都是在核仁中完成的，其过程是由rDNA转录成rRNA，rRNA再与来自细胞质的蛋白质结合，进而加工、改造成核糖体的前体，然后输出到细胞质。在细胞周期过程中，核仁是一个高度动态的结构，在有丝分裂期间表现出周期性的消失与重建。真核细胞的核仁具有重要功能，它是rRNA合成、加工和核糖体亚单位的装配场所。因此对核仁结构、动态和功能的研究一直受到各相关领域研究者的高度重视。活细胞核仁成像技术的发展有助于我们实时地研究细胞的生命活动，获取更具价值的细胞信息。用于核仁成像的荧光物质必须满足一定的条件。首先，由于核仁位于细胞核内，荧光物质必须穿过核孔。因此，荧光物质必须具有小的粒径。另外，荧光物质对核仁的染色要有选择性，可以与核仁产生特异性相互作用(富集或者荧光增强效应)，从而实现对核仁选择性成像。目前，人们也发现了一些可以用于细胞核仁成像的荧光物质，但大部分为有机荧光染料。这些荧光染料存在斯托克斯位移小、荧光稳定性差等缺点，而且很多染料只能用于死细胞的核仁成像。也有人用三唑类配体修饰的CdS量子点实现了对细胞核仁的成像，但是其潜在的生物毒性限制了它的应用。因此，需要寻找新的荧光物质来对活细胞的核仁成像。

荧光碳量子点(简称碳点)是具有荧光性能的新型碳纳米材料。由于其稳定性强、毒性小、水溶性好、成本低和原材料丰富等优点，碳点逐渐成为碳纳米材料家族中的一颗新星，并广泛应用于生物成像、荧光打印、传感等研究领域。与传统半导体量子点相类似，碳点具有荧光发射可调、光稳定性较高、激发光谱宽以及尺寸小等优势。此外碳点的毒性低、生物相容性好、原料来源广泛并且易于功能化，这些优点更是弥补了半导体量子点和传统有机染料的不足，在分析检测、催化、光电器件和生物医学等领域具有广泛的应用前景。

碳点在细胞成像领域的应用也取得了一定的进展，人们制备了多种荧光碳点并应将其用于细胞成像，但其充其量只能实现细胞或细胞核的成像。例如，CN 104403664 A公开了一种利用花瓣粉末制备绿色荧光碳点的方法，并将其应用于细胞成像；CN 104130777 A也公开了一种以叶酸为碳源制备蓝色荧光碳点的方法及其在细胞成像领域的应用。由于具有较小的尺寸，碳点也进入细胞核，实现对细胞核的成像。例如，CN104555980A也涉及了碳点在细胞核成像的应用。截至目前，尚未有任何关于碳点具有对核仁选择性成像效果的报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种荧光碳点在活细胞核仁成像或RNA标记或显示中的应用。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

在一些实施例中提供了一种荧光碳点在活细胞核仁成像中的应用，所述荧光碳点采用具有上下转化功能的红光发射荧光碳点。

在一些实施例中所记载的一种应用方法包括：将细胞接种于细胞培养液中进行培养，之后加入所述荧光碳点，并使所述荧光碳点于形成的原细胞-碳点混合液中均匀分散，再在适合孵育细胞的环境中孵育而将细胞核仁染色，然后分离出细胞，经清洗后，再置入能使细胞保持活性的环境中进行成像，成像所用激发光波长可以为500～600nm。

在一些较为具体的实施例中，所述的应用方法具体可以包括：

1)细胞培养：将细胞接种于细胞培养液中，在37℃、5(v/v)％CO₂、饱和湿度的环境中培养12～48h；

2)提供浓度为100～1000μg/ml的荧光碳点分散液；

3)细胞染色：向步骤1)最终所获原细胞培养液中加入所述荧光碳点分散液，均匀混合形成原细胞-碳点混合液，在37℃、5(v/v)％CO₂、饱和湿度的环境中孵育30min以上，从而将细胞核仁染色；

4)细胞成像：自步骤3)最终所获混合液中分离出细胞，用磷酸盐缓冲溶液充分洗涤后，加入新鲜的细胞培养液，并在37℃、5(v/v)％CO₂、饱和湿度的环境中进行拍摄成像，成像所用激发光波长可以为500～600nm。

在一些实施例中，所述细胞培养液可包含相应的培养基、10v/v％胎牛血清、1wt％青霉素和1wt％链霉素。

在一些实施例中，所述荧光碳点分散液中采用的溶剂为二甲亚砜水溶液，其中二甲亚砜浓度为0.2～20(v/v)％。

在一些实施例中，所述荧光碳点于所述原细胞-碳点混合液中的终浓度为10～100μg/ml。

在一些实施例中提供了一种荧光碳点在标记或显示活细胞内RNA中的应用，所述荧光碳点采用具有上下转化功能的红光发射荧光碳点。

在一些实施例中提供了一种活细胞核仁成像试剂，其包含具有上下转化功能的红光发射荧光碳点。

在一些实施例中提供了一种应用于标记或显示活细胞内RNA的试剂，其包含具有上下转化功能的红光发射荧光碳点。

在一些实施例中，在波长为360～600nm或750～1100nm的激发光照射下，所述荧光碳点的荧光发射峰位置在600～670nm之间，并且荧光量子产率大于40％。

在一些实施例中，所述荧光碳点的粒径在10～50nm之间。

在一些较为优选的实施例中，所述荧光碳点采用公布号为CN104263366A的专利文献中公开的具有上下转换功能的红光发射荧光碳点。其具有上下转换红光发射、荧光量子产率高、斯托克斯位移较大，可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底等特点，同时还兼具低生物毒性的优点。

本案发明人在长期研究碳点在细胞成像中的应用时，非常意外的发现，具有上下转换功能的红光发射荧光碳点，特别是CN104263366.A中公开的荧光碳点可以进入细胞核，并对活细胞的核仁具有选择性成像效果，而经更为深入研究的大量实践表明，所述荧光碳点对活细胞核仁的选择性成像是因所述荧光碳点对RNA具有选择性吸附效应，所述荧光碳点在进入活细胞的细胞核后，会在RNA含量高的核仁部位富集，从而实现对核仁的选择性成像。

与现有技术相比，本发明的优点至少在于：对核仁成像的选择性高、成像分辨率高、可以用于活细胞的核仁成像，同时具有简单快速、成本低等特点，具有很高的实用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中荧光碳点将Hela细胞染色后的共聚焦显微照片；

图2为实施例2中荧光碳点将MCF-7细胞染色后的共聚焦显微照片；

图3为实施例3中Hela细胞以荧光碳点和Hochest共染色后的共聚焦显微照片；

图4为实施例4中MCF-7细胞以荧光碳点和Hochest共染色后的共聚焦显微照片；

图5为实施例5中Hela细胞以荧光碳点和Hochest共染色后的共聚焦显微照片以及用RNA消解酶对核仁消解后的Hela细胞以荧光碳点和Hochest共染色后的共聚焦显微照片；

图6为实施例5中MCF-7细胞以荧光碳点和Hochest共染色后的共聚焦显微照片以及用RNA消解酶对核仁消解后的MCF-7细胞以荧光碳点和Hochest共染色后的共聚焦显微照片；

图7为对照例中采用专利CN 103525402 A方法制备的碳点将MCF-7细胞染色后的共聚焦显微照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在如下实施例1-6及对照例中，利用碳点进行活细胞核仁成像的相关实验操作方法可以包括以下步骤：

1)细胞培养

将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5(v/v)％CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养12～48h；

其中，细胞培养液中含相应的培养基、10％体积百分数的胎牛血清、1wt％青霉素和1wt％链霉素；

2)碳点分散液的配制

将荧光碳点用二甲亚砜水溶液配成100～1000μg/ml的分散液，其中二甲亚砜浓度为0.2～20％；

3)细胞染色

向原细胞培养液中加入步骤2)得到的碳点分散液，摇匀，使近碳点的终浓度为10-100μg/ml，得到原细胞培养液和碳点分散液的混合液，在37℃、5(v/v)％CO₂、饱和湿度中孵育细胞30分钟以上，将细胞核仁染色；

4)细胞成像

移去步骤3)的混合液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞1-3次，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37℃、5(v/v)％CO₂、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为532nm。

实施例1使用公布号为CN104263366A的专利文献公开的方法制备的荧光碳点染色Hela细胞。参阅图1所示，可以看出在细胞中存在亮点，推断亮点位于细胞核内。

实施例2使用公布号为CN104263366A的专利文献公开的方法制备的荧光碳点染色MCF-7细胞。参阅图2所示，可以看出在细胞中存在亮点，推断亮点位于细胞核内。

实施例3为了证明碳点染色区域位于细胞核内，使用公布号为CN104263366A的专利文献公开的方法制备的荧光碳点和Hoechst(细胞核特异性染料)共同染色Hela细胞。参阅图3所示，蓝色的Hoechst染料位于细胞核的位置，叠加的图片可以看出红色的亮点位于蓝色区域，可以证明红色亮点位于细胞核内。

实施例4为了证明荧光碳点染色区域位于细胞核内，使用公布号为CN104263366A的专利文献公开的方法制备的荧光碳点和Hoechst(细胞核特异性染料)共同染色MCF-7细胞。参阅图4所示，蓝色的Hoechst染料位于细胞核的位置，叠加的图片可以看出红色的亮点位于蓝色区域，可以证明红色亮点位于细胞核内。

实施例5为了证明荧光碳点选择性染色区域是核仁，先用RNA消解酶将细胞中的RNA消解，破坏细胞中的核仁，然后再使用公布号为CN104263366A的专利文献公开的方法制备的荧光碳点和Hoechst(细胞核特异性染料)共同染色Hela细胞。请参阅图5所示，用RNA消解酶处理后的细胞染色后，细胞核中的局部亮点消失，可以证明使用的荧光碳点可以实现核仁选择性成像。

实施例6为了证明荧光碳点选择性染色区域是核仁，先用RNA消解酶将细胞中的RNA消解，破坏细胞中的核仁，然后再使用公布号为CN104263366A的专利文献公开的方法制备的荧光碳点和Hoechst(细胞核特异性染料)共同染色MCF-7细胞。请参阅图6所示，用RNA消解酶处理后的细胞染色后，细胞核中的局部亮点消失，可以证明使用的荧光碳点可以实现核仁选择性成像。

对照例参照实施例1-6的方式，以CN103525402A所公开的三种碳点进试验，但结果显示，其均无法实现对细胞核仁的成像(请参阅图7)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种荧光碳点在活细胞核仁成像中的应用，所述荧光碳点采用具有上下转化功能的红光发射荧光碳点。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，应用方法包括：将细胞接种于细胞培养液中进行培养，之后加入所述荧光碳点，并使所述荧光碳点于形成的原细胞-碳点混合液中均匀分散，再在适合孵育细胞的环境中孵育而将细胞核仁染色，然后分离出细胞，经清洗后，再置入能使细胞保持活性的环境中进行成像，成像所用激发光波长为500～600nm。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，应用方法包括：

1)细胞培养：将细胞接种于细胞培养液中，在37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度的环境中培养12～48h；

2)提供浓度为100-1000μg/ml的荧光碳点分散液；

3)细胞染色：向步骤1)最终所获原细胞培养液中加入所述荧光碳点分散液，均匀混合形成原细胞-碳点混合液，在37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度的环境中孵育30min以上，从而将细胞核仁染色；

4)细胞成像：自步骤3)最终所获混合液中分离出细胞，用磷酸盐缓冲溶液充分洗涤后，加入新鲜的细胞培养液，并在37℃、5v/v％CO₂、饱和湿度的环境中进行拍摄成像，成像所用激发光波长为500～600nm。

4.根据权利要求2-3中任一项所述的应用，其特征在于：

所述细胞培养液包含相应的培养基、10v/v％胎牛血清、1wt％青霉素和1wt％链霉素；

和/或，所述荧光碳点分散液中采用的溶剂为二甲亚砜水溶液，其中二甲亚砜浓度为0.2～20v/v％；

和/或，所述荧光碳点于所述原细胞-碳点混合液中的终浓度为10～100μg/ml。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：

在波长为360～600nm或750～1100nm的激发光照射下，所述荧光碳点的荧光发射峰位置在600～670nm之间，并且荧光量子产率大于40％；

优选的，所述荧光碳点的粒径在10～50nm之间；

优选的，所述荧光碳点采用公布号为CN104263366A的专利文献中公开的具有上下转换功能的红光发射荧光碳点。

6.一种荧光碳点在标记或显示活细胞内RNA中的应用，所述荧光碳点采用具有上下转化功能的红光发射荧光碳点；

其中，在波长为360～600nm或750～1100nm的激发光照射下，所述荧光碳点的荧光发射峰位置在600～670nm之间，并且荧光量子产率大于40％；

优选的，所述荧光碳点的粒径在10～50nm之间；

优选的，所述荧光碳点采用公布号为CN104263366A的专利文献中公开的具有上下转换功能的红光发射荧光碳点。

7.一种活细胞核仁成像试剂，其特征在于包含具有上下转化功能的红光发射荧光碳点；

优选的，在波长为360～600nm或750～1100nm的激发光照射下，所述荧光碳点的荧光发射峰位置在600～670nm之间，并且荧光量子产率大于40％；

优选的，所述荧光碳点的粒径在10～50nm之间；

优选的，所述荧光碳点采用公布号为CN104263366A的专利文献中公开的具有上下转换功能的红光发射荧光碳点。

8.一种应用于标记或显示活细胞内RNA的试剂，其特征在于包含具有上下转化功能的红光发射荧光碳点；

其中，在波长为360～600nm或750～1100nm的激发光照射下，所述荧光碳点的荧光发射峰位置在600～670nm之间，并且荧光量子产率大于40％；

优选的，所述荧光碳点的粒径在10～50nm之间；

优选的，所述荧光碳点采用公布号为CN104263366A的专利文献中公开的具有上下转换功能的红光发射荧光碳点。