CN108152261A - 一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法 - Google Patents

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李海东
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Abstract

本发明公开了一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法，以柠檬酸和乙二胺为碳源制备碳点；通过调节碳点表面从负电荷转变到接近中性，以提高碳点对细胞核仁定向成像能力。本发明以常见的无机盐为碳源，经简单处理制备得到了碳点。通过改变所得碳点表面的电荷，改善其对核仁成像的效果，表面处于中性电荷的碳点对核仁具有更加优异的定向成像效果。

Description

一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法
技术领域
本发明涉及的是一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法。
背景技术
碳点(CDs)是最近10年迅速发展的一种新型发光纳米粒子。碳点是指粒径在1-10nm具有荧光性质的碳颗粒。碳源种类繁多，小到实验室常用的化学试剂，大到自然界的花草树木等均可以作为碳源合成荧光碳点。最近几年来，关于碳点的研究，在实验和理论方面均已取得了较大的进展，在化学传感、光电器件、光催化等领域展现出了广阔的应用前景。同时由于其成本低廉、易于制备、发光稳定、安全无毒而受到广泛的关注，特别在生物成像、生物标记、生物荧光探针领域表现出优异的潜在应用价值。
核仁是细胞核内的最重要的细胞器，它负责生产核糖体前体，所有真核生物的核糖体RNA(rRNA)的转录都是在核仁中完成的，其过程是由rDNA转录成rRNA，rRNA再与来自细胞质的蛋白质结合，进而加工、改造成核糖体的前体，然后输出到细胞质。核仁组成成分包括rRNA，rDNA和核糖核蛋白。核仁是rRNA基因存储，rRNA合成加工以及核糖体亚单位的装配场所。然而，目前的核仁定向成像商业化试剂和技术主要集中在少数厂家，且这些试剂价格昂贵、有效期短，荧光易漂白。因此，发展简单快速低成本的核仁定向成像方法势在必行。
碳点具有独特的性质，如良好的生物相容性、稳定的光学性质、发射光波长可调、荧光稳定、特别是其尺寸小，可以相对容易的在细胞体内迁移，这些特点使碳点成为核仁定向成像潜在试剂的不二选择。
发明内容
本发明的目的是提供了一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法。
一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法，以柠檬酸和乙二胺为碳源制备碳点；通过调节碳点表面从负电荷转变到接近中性，以提高碳点对细胞核仁定向成像能力。
所述的方法，通过提高乙二胺用量比例调节碳点表面从负电荷转变到接近中性。
所述的方法，将柠檬酸溶于水中，待全部溶解后，加入一定量的乙二胺，搅拌均匀，装反应釜；将反应釜置于高温炉，以一定的升温速率升至180℃，恒温6-12h，得到碳点，并纯化干燥；柠檬酸和乙二胺的物质的量比为1:3到8:3之间，随着乙二胺比例的增加，其表面从负电荷转变到接近中性。
所述的方法，柠檬酸和乙二胺的物质的量比为1:3或1:2或2:1或8:3。
所述的方法，所制备的碳点粒径在2-2.8nm，表面电荷约为-15mV到中性。
所述的方法，将柠檬酸溶于水中，待全部溶解后，加入一定量的乙二胺，将该溶液转移到聚四氟乙烯的反应釜，并置于180摄氏度的烘箱中，反应12h；待其冷却到室温，打开反应釜，得到黑色溶液；将所得到的黑色溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中，并将透析袋置于1L烧杯中，不断搅拌并换水，以除去未参加反应的小分子和生成的超小纳米颗粒；待换水后10分钟透析袋外溶液不再加深，且透析袋外溶液在紫外灯下没有明显荧光时，表明透析基本完毕；将透析袋内碳点溶液收集，冷冻干燥，最终得到棕色粉末。
所述的方法，碳点表面电荷越正(越接近中性)，其对细胞核仁的成像选择性越好。
所述的方法，实验中所选择的细胞为HeLa细胞。
本发明的效果在于：本发明提供了一种核仁定向染色的方法，以常见的无机盐为碳源，经简单处理制备得到了碳点。通过改变所得碳点表面的电荷，改善其对核仁成像的效果，表面处于中性电荷的碳点对核仁具有更加优异的定向成像效果。
附图说明
图1为5μg/mL的碳点在360nm激发下的荧光光谱图像，冻干后的碳点照片(A)以及紫外灯下的成像照片(B)。
图2为HeLa细胞经CD3培养的暗场荧光图像(A)，明场图像(B)和叠加图像(C)。
图3为CD3培养的HeLa细胞的荧光图像(A)，细胞核染色剂Hoechst染色后的荧光图像(B)和叠加图(C)。图B箭头为Hoechst染色后的空心区域，即核仁区域。
图4为HeLa细胞分别与4种CDs培养相同条件下的荧光图像，A到D分别为CD1，CD2，CD3和CD4。
图5为HeLa细胞与对照组(A)和CD4(B)培养后的荧光图像。对照组为相同条件下用柠檬酸和尿素制备的碳点。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1：
CD1制备：
取1.6g柠檬酸溶于10mL水中，向其中加入0.21mL乙二胺并混合均匀使形成均一溶液(柠檬酸和乙二胺的物质的量比为1:3)。将该溶液转移到50mL聚四氟乙烯的反应釜，并置于180摄氏度的烘箱中，反应12h。待其冷却到室温，打开反应釜，得到黑色溶液。
将所得到的黑色溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中，并将透析袋置于1L烧杯中，不断搅拌并换水，以除去未参加反应的小分子和生成的超小纳米颗粒。
待换水后10分钟透析袋外溶液不再加深，且透析袋外溶液在紫外灯下没有明显荧光时，表明透析基本完毕。
将透析袋内碳点溶液收集，冷冻干燥，最终得到棕色粉末。
将粉末溶于PBS，配置为5mg/mL的溶液。
实施例2：
CD2制备：
取1.6g柠檬酸溶于10mL水中，向其中加入0.42mL乙二胺并混合均匀使形成均一溶液(柠檬酸和乙二胺的物质的量比为1:2)。将该溶液转移到50mL聚四氟乙烯的反应釜，并置于180摄氏度的烘箱中，反应12h。待其冷却到室温，打开反应釜，得到黑色溶液。
将所得到的黑色溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中，并将透析袋置于1L烧杯中，不断搅拌并换水，以除去未参加反应的小分子和生成的超小纳米颗粒。
待换水后10分钟透析袋外溶液不再加深，且透析袋外溶液在紫外灯下没有明显荧光时，表明透析基本完毕。
将透析袋内碳点溶液收集，冷冻干燥，最终得到黑色粉末。
将粉末溶于PBS，配置为5mg/mL的溶液。
实施例3：
CD3制备：
取1.6g柠檬酸溶于10mL水中，向其中加入0.83mL乙二胺并混合均匀使形成均一溶液(柠檬酸和乙二胺的物质的量比为2:1)。将该溶液转移到50mL聚四氟乙烯的反应釜，并置于180摄氏度的烘箱中，反应12h。待其冷却到室温，打开反应釜，得到黑色溶液。
将所得到的黑色溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中，并将透析袋置于1L烧杯中，不断搅拌并换水，以除去未参加反应的小分子和生成的超小纳米颗粒。
待换水后10分钟透析袋外溶液不再加深，且透析袋外溶液在紫外灯下没有明显荧光时，表明透析基本完毕。
将透析袋内碳点溶液收集，冷冻干燥，最终得到黑色粉末。
将粉末溶于PBS，配置为5mg/mL的溶液。
实施例4：
CD4制备：
取1.6g柠檬酸溶于10mL水中，向其中加入1.66mL乙二胺并混合均匀使形成均一溶液(柠檬酸和乙二胺的物质的量比8:3)。将该溶液转移到50mL聚四氟乙烯的反应釜，并置于180摄氏度的烘箱中，反应12h。待其冷却到室温，打开反应釜，得到黑色溶液。
将所得到的黑色溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中，并将透析袋置于1L烧杯中，不断搅拌并换水，以除去未参加反应的小分子和生成的超小纳米颗粒。
待换水后10分钟透析袋外溶液不再加深，且透析袋外溶液在紫外灯下没有明显荧光时，表明透析基本完毕。
将透析袋内碳点溶液收集，冷冻干燥，最终得到黑色粉末。
如图1：几种碳点的水溶液在紫外灯下均有明亮的蓝色荧光，其最大发射峰位于440nm左右。
将黑色粉末溶于PBS，配置为5mg/mL的溶液。
实施例5
细胞成像，采用上述实施例1-4制备的碳点进行细胞成像实验，步骤如下：
向12孔板中接种10万个细胞，培养箱中过夜贴壁。
向细胞中加入400μg/mL的碳点，培养4小时后，用PBS清洗。
用倒置荧光显微镜观察细胞。
图2可以看出：对比明场和暗场图片，CD染的是细胞核仁。
图3可以看出：Hoechst对细胞核特异性染色后，在核仁处出现空洞(为染色的区域)，该空洞与CD染色的核仁重叠，进一步确认了CD对核仁的特异性染色。
图4可以看出：随着表面电位逐渐接近中性(CD1到CD4，其表面电位分别为-15mV，-10.8mV，-7.6mV，-2mV)，CD对核仁的成像效果愈加显著。
图5可以看出：与相同比例的柠檬酸和尿素制备的碳点相比，该发明中的碳点对细胞核仁有显著的特异性成像效果。
本发明的优点在于：
本发明中提供的用于细胞核仁成像的碳点具备生产成本低、制备简单、原料易得，便于工业化生产。
本发明中提供的用于细胞核仁成像的碳点具备粒径小(约2-2.8纳米)、表面电荷可调、可对细胞核仁定向成像，具有良好的应用前景。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种提高碳点对细胞核仁定向成像能力的方法，其特征在于：以柠檬酸和乙二胺为碳源制备碳点；通过调节碳点表面从负电荷转变到接近中性，以提高碳点对细胞核仁定向成像能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过提高乙二胺用量比例调节碳点表面从负电荷转变到接近中性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将柠檬酸溶于水中，待全部溶解后，加入一定量的乙二胺，搅拌均匀，装反应釜；将反应釜置于高温炉，以一定的升温速率升至180℃，恒温6-12h，得到碳点，并纯化干燥；柠檬酸和乙二胺的物质的量比为1:3到8:3之间，随着乙二胺比例的增加，其表面从负电荷转变到接近中性。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：柠檬酸和乙二胺的物质的量比为1:3或1:2或2:1或8:3。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所制备的碳点粒径在2-2.8nm，表面电荷约为-15mV到中性。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：将柠檬酸溶于水中，待全部溶解后，加入一定量的乙二胺，将该溶液转移到聚四氟乙烯的反应釜，并置于180摄氏度的烘箱中，反应12h；待其冷却到室温，打开反应釜，得到黑色溶液；将所得到的黑色溶液转移至截留分子量为1000的透析袋中，并将透析袋置于1L烧杯中，不断搅拌并换水，以除去未参加反应的小分子和生成的超小纳米颗粒；待换水后10分钟透析袋外溶液不再加深，且透析袋外溶液在紫外灯下没有明显荧光时，表明透析基本完毕；将透析袋内碳点溶液收集，冷冻干燥，最终得到棕色粉末。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：碳点表面电荷越正(越接近中性)，其对细胞核仁的成像选择性越好。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：实验中所选择的细胞为HeLa细胞。
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