CN104987862B - 具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗光漂白、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法，本发明首先在稍高的温度下将柠檬酸热解缩合成较小的碳点骨架，然后再在稍低温度下与L‑半胱氨酸缩合形成碳点。该碳点表面有大量的半胱氨酸残基，呈现蓝色荧光强度较高且具有持续高尔基体靶向能力的碳点，避免了常规方法繁冗的后续修饰步骤。通过本发明所述方法获得的蓝色碳点的绝对量子产率高达68％，并且该碳点具有良好的抗光漂白性和生物相容性，为检测细胞生理过程与疾病诊断等提供了更精确的帮助。

Description

具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法

技术领域

本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种抗光漂白、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法。

背景技术

高尔基体(Golgi apparatus,Golgi complex)是真核细胞的细胞器之一，既是蛋白质修饰、分选、水解加工的场所，又是分泌物质的转运站。高尔基体的荧光成像对研究细胞内生理活动及与高尔基体相关疾病的生理过程都有重要作用。自1985年Lipsky等将NBDC₆-ceramide用于高尔基体荧光成像后，神经酰胺类似物便成为高尔基体荧光靶向定位的常用染料。但是这种神经酰胺类似物随着细胞的代谢也会出现在线粒体与细胞质膜上，且实际应用表明该类物质具有细胞毒性。因此，非常有必要发展一种生物相容性好，具有长时间高尔基体靶向性能的荧光探针。

碳量子点(carbon quantum dots，简称碳点)，是继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一。碳点不仅呈现出优良的光学活性与较小尺寸的特性，且生物相容性良好。从2004年碳点首次报道以来，许多研究者通过改变碳源及合成方法制备出了一系列不同荧光颜色与量子产率的碳点。目前，碳点已广泛应用于生物成像，但是其在单个细胞中的分布较为分散，并不能对细胞中的某个细胞器进行精确定位。

因此制备一种具有良好生物相容性，且同时具有良好高尔基体靶向与成像能力的碳点是一项非常有挑战性且应用前景极好的工作。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点及其制备方法，所述碳点能够精确对细胞中高尔基体进行定位，且具有良好的抗光漂白性和生物相容性。

本发明通过下述技术方案达到所述目的:

1、具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，制备方法包括如下步骤:

1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25～1:1的比例，取柠檬酸并在150～250℃条件下加热0～20min，获得产物A；

2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和产物A混合，140～250℃加热3～60min，获得固体产物B；

3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6～8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500～1000Da的透析袋透析12～48h，冷冻干燥即得碳点。

优选的，所述步骤1)中所述柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:1。

优选的，所述步骤1)中所述加热温度为200℃，加热时间为20min。

优选的，所述步骤2)中所述加热温度为150℃，加热时间为50min。

优选的，所述步骤3)中先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至7。

2、制备具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点的方法，包括如下步骤:

1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25～1:1的比例，取柠檬酸并在150～250℃条件下加热0～20min，获得产物A；

2)、取一定配比量的L-半胱氨酸和产物A混合，140～250℃加热3～60min，获得固体产物B；

3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6～8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500～1000Da的透析袋透析12～48h，冷冻干燥即得碳点。

本发明研究发现，L-半胱氨酸的量相对太少或者加入半胱氨酸后的温度太高都会使碳点的靶向成像能力减弱，因此，本发明通过实验研究最终获得柠檬酸与L-半胱氨酸的最佳质量比范围，以及加热的温度范围。

另外，在本发明中，步骤2)中会产生硫化氢气体，所以需要注意废气的处理以免对人体造成伤害，在加热的过程中需要用玻璃棒将两种物质搅拌均匀。

本发明的有益效果在于:本发明首先在稍高的温度下将柠檬酸热解缩合成较小的碳点骨架，然后再在稍低温度下与L-半胱氨酸缩合，在最终形成碳点的同时也使碳点表面带上大量半胱氨酸残基，最终获得蓝色荧光强度高且具有持续高尔基体靶向能力的碳点，避免了常规方法繁冗的后续修饰步骤。通过本发明所述方法获得的蓝色碳点的绝对量子产率高达68％，且该碳点具有良好的抗光漂白性和生物相容性，为检测细胞生理过程与疾病诊断等提供了更精确的帮助。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:

图1碳点的高分辨透射电镜图片，其中a图为在较低放大倍数下大量碳点的宏观图片，b图为较高放大倍数下碳点面内晶格图，c图为较高放大倍数下碳点面间晶格图。

图2碳点的X射线光电子能谱图，其中a图为碳点总体的X射线光电子能谱，b图为C1s的X射线光电子能谱，c图为N 1s的X射线光电子能谱，d图为S 2p的X射线光电子能谱；a图中位于285eV左右的峰归属于碳元素，399eV左右的峰归属于氮元素，531eV左右的峰归属于氧元素，163eV左右的峰归属于硫元素；b图中键能为288.0eV的峰归属于羰基碳，键能为285.2eV的峰归属于与氮氧硫等以单键相连的碳，键能为284.6eV的峰归属于与其他碳原子单键相连的碳；c图中键能为399.3eV的峰为吡啶型N的峰，400.1eV的峰为吡咯型N的峰；d图中可分别得到S 2p1/2与S 2p3/2的电子结合能，它们分别位于164.5eV与162.8eV；

另图中符号代表如下：C：碳元素；N：氮元素；O：氧元素；S：硫元素；1,2：主量子数；s,p：原子轨道；1/2,3/2：磁量子数和自旋量子数的和，其中自旋量子数取得是1/2和-1/2。

图3碳点的傅立叶转换红外吸收光谱，图中符号代表如下:

-OH：羟基；-NH：氨基；-SH：巯基；C＝O：羰基；COO-：酯；-CH(1)：烷基；-CH(2):烷基；

3430cm^-1、3240cm^-1、2978cm^-1、2526cm^-1、1708cm^-1、1581cm^-1、1388cm^-1分别表示碳点中羟基、氨基、烷基(1)、巯基、羰基、酯、烷基(2)的红外特征吸收峰。

图4碳点的荧光光谱与紫外可见吸收光谱及其在自然光和紫外光下的图片；碳点的荧光最大发射位于420nm处，最大激发位于350nm处；碳点在350nm处有良好的紫外吸收，在245nm左右有良好的紫外吸收肩峰；a图为自然光下图片，b图为紫外光下图片。

图5碳点的细胞毒性实验结果。

图6碳点靶向高尔基体在转盘共聚焦显微成像系统下的照片；其中，a图为共聚焦显微镜下与碳点共同孵育的喉癌细胞(HEp2)明场图，b图为共聚焦荧光显微镜下碳点的荧光图片(蓝色)，c图为共聚焦荧光显微镜下高尔基体特异性荧光染料NBD C6-ceramide的荧光图，d图为明场与荧光通道下图片的重合图。

图7以D-半胱氨酸、硫代乙酰胺、L-丙氨酸、s-甲基-L-半胱氨酸为碳源获得的碳点的细胞成像图；其中，图a₁-a₃依次为D-半胱氨酸碳点的细胞成像图，图b₁-b₃依次为硫代乙酰胺碳点的细胞成像图，图c₁-c₃依次为L-丙氨酸碳点的细胞成像图，图d₁-d₃依次为s-甲基-L-半胱氨酸碳点的细胞成像图，其中，1为细胞的明场图，2为荧光成像图，3为明场图和荧光图的叠加图，标尺为20μm。

图8碳点长时间靶向高尔基体的转盘共聚焦显微成像系统拍摄图片；图a₁-d₁为不同时间下碳点在荧光通道下的图片，a₂-d₂为细胞在明场通道与荧光通道下的叠加图。

图9碳点抗光漂白性能研究结果；a₁-d₁为碳点在荧光显微镜激光下连续激发60min的图片，a₂-d₂为高尔基体荧光染料NBD C6-ceramide在荧光显微镜激光下连续激发60min的图片，a₃-d₃为激发不同时间点明场与荧光通道重合后的图片。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

所用试剂包括:柠檬酸(上海晶纯生化科技股份有限公司，上海)，氢氧化钾(重庆川东化工(集团)有限公司，重庆)，实验中所用试剂均为分析纯，所用水均为超纯水(18.2M，Mili-Q)。

所用仪器包括:MILIPORE(美国)超纯水机；QL-901型漩涡混匀器(海门市其林贝尔器材制造有限公司)；DF-101S即热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；95-2定时双向磁力加热搅拌器(金坛市友联仪器研究所)；KXH2-02-1AB恒温干燥箱(中国上海科析试验仪器厂，成都科析试验成套公司)；透析袋MD31(500-1000)(上海易佰聚经贸有限公司)；0.22μm滤头(重庆市钛新化工有限公司)；FTIR-8400S傅立叶转换红外光谱仪(日立，日本)；高倍透射电镜(Tecnai G2F20S-TWIN microscopy)；ESCALAB250X-rayphotoelectron spectrometer；紫外可见分光光度计(Shimadzu,Japan)；荧光分光光度计(Hitachi,Japan)；Absolute PL Quantum yield Spectrum C11347(HAMAMATSU,Japan)；奥林巴斯转盘共聚焦显微成像系统(奥林巴斯，日本)。

本发明所述碳点的制备方法包括如下步骤:

1)、柠檬酸热解:按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25～1的比例，取柠檬酸加入圆底烧瓶，在150～250℃加热0～20min；

2)、混合物热解:步骤1)完毕后，向圆底烧瓶中继续加入配比量的L-半胱氨酸，140～250℃继续加热3～60min，获得固体产物；

3)、酸碱中和:向步骤2)获得的固体产物中加入氢氧化钠或氢氧化钾溶液，至整个溶液pH呈6-8为止；

4)、纯化:将步骤3)得到的中性溶液用0.22μm的滤膜过滤，然后用截留分子量为500～1000Da的透析袋透析12～48小时，透析后冷冻干燥即得碳点。

实施例1碳点的制备

碳点的制备方法如下:

1)、柠檬酸热解:将2g柠檬酸加入100mL圆底烧瓶中，并在油浴锅中于200℃下反应20min；

2)、混合物热解:步骤1)反应完毕后加入2g L-半胱氨酸，并于150℃下反应50min；

3)、酸碱中和:将步骤2)获得的反应产物用氢氧化钾溶液调至pH为6-8；

4)、将中和后的溶液先用0.22μm的滤头过滤后再放入截留分子量为500-1000Da的透析袋中透析24小时，透析完毕后冷冻干燥即得碳点。

实施例2碳点的制备

碳点的制备方法如下:

1)、柠檬酸热解:将2g柠檬酸加入100mL圆底烧瓶中，并在油浴锅中于220℃下反应20min；

2)、混合物热解:步骤1)反应完毕后加入0.5g L-半胱氨酸，并于200℃下反应10min；

3)、酸碱中和:将步骤2)获得的反应产物用氢氧化钠溶液调至pH为6-8；

4)、将中和后的溶液先用0.22μm的滤头过滤后再放入截留分子量为500-1000Da的透析袋中透析24小时，透析完毕后冷冻干燥即得碳点。

实施例3碳点形貌及光学性质测定

(1)形貌表征:取少许制备好的碳点溶于水，然后滴于透射电镜专用铜网上，干燥后用高分辨透射电镜观察其形貌，结果如图1所示。通过高分辨透射电镜可以看出本发明制备的碳点大小约5-12nm。

(2)使用ESCALAB250X-ray photoelectron spectrometer测定得到XPS图谱，以此来确定碳点中所含的元素及其相应价态，如图2所示。图2中a图中位于285eV左右的峰归属于碳元素，399eV左右的峰归属于氮元素，531eV左右的峰归属于氧元素，163eV左右的峰归属于硫元素。图2中b图键能为288.0eV的峰归属于羰基碳，键能为285.2eV的峰归属于与氮氧硫等以单键相连的碳，键能为284.6eV的峰归属于与其他碳原子单键相连的碳。图2中c图键能为399.3eV的峰为吡啶型N的峰，400.1eV的峰为吡咯型N的峰。图2中d图可分别得到S2p1/2与S 2p3/2的电子结合能，它们分别位于164.5eV与162.8eV。

(3)取少量碳点，KBr压片，测定样品的红外吸收曲线，结果见图3。在波数为2526cm^-1处的红外吸收峰说明原料半胱氨酸的巯基保留在了碳点中。

(4)吸收性质:利用3600UV-Vis-NIR紫外可见分光光度计测得碳点的吸收光谱图，如图4所示，可知碳点在350nm处有明显的吸收峰，245nm处有明显的肩峰。而原料半胱氨酸与柠檬酸的吸收位于220nm左右，说明半胱氨酸与柠檬酸在生成点的过程中形成了新的结构。

(5)荧光性质:利用F-2500荧光光谱仪测得碳点的激发与发射光谱图，如图4所示，可知碳点的激发发射光谱有两个激发峰，分别位于250nm、350nm波长处，其中350nm激发波长下的荧光强度最大，最大的发射峰在420nm处。

(6)取少量碳点溶于水后，用数码相机分别测定其自然光与365nm紫外光下的图片，结果见图4。

上述图谱说明碳点表面富含半胱氨酸残基，并具有良好的紫外激发，可见发射的荧光性质，这为碳点的细胞成像奠定了良好基础。

(7)量子产率:

使用Absolute PL Quantum yield Spectrum C11347(HAMAMATSU,Japan)测定碳点的绝对荧光量子产率，测定得到该碳点的绝对荧光量子产率为67.8％。相较现有的其他碳点，该碳点的量子产率较高。

实施例4碳点的生物相容性、抗光漂白、持续高尔基体靶向成像能力测试

(1)细胞培养:选取人呼吸道上皮细胞(HEp2)进行实验，细胞培养基为含有10％牛血清的RPMI1640，细胞培养条件为5％CO₂培养箱中37℃培养。

(2)毒性实验:将不同质量浓度的碳点分别于96孔板中，在37℃、5％CO₂条件下孵育Hep-2细胞24h和48h。孵育完毕后弃去培养介质，分别加入10μLCCK-8，然后用PBS缓冲液洗涤两次并加入90μL PBS缓冲作为维持液，继续孵育1h。用酶标仪在450nm波长下测定吸收度，计算细胞存活率，结果见图5。由图5可知，碳点浓度在1.5mg/mL及其以下对细胞几乎没有毒性，细胞存活率均高于95％，说明碳点具有较高的生物相容性，将其用于细胞成像具有可行性的。

(3)高尔基体定位:加入碳点前1天将细胞接于荧光成像培养皿中。然后将碳点(1mg/mL)用含有2％牛血清的RPMI1640细胞培养液稀释后用于细胞培养。36h之后将碳点与培养液吸出，并用PBS缓冲液冲洗细胞3次。然后用高尔基体荧光染NBD C₆-ceramide对细胞进行荧光染色。步骤为:将BSA溶解的NBD C₆-ceramide(5μM)与细胞在4℃下孵育30min，然后用PBS冲洗3次，再将细胞于2％BSA溶液中孵育90min，PBS冲洗3次，最后将加有少量PBS的细胞放于共聚焦显微镜下进行成像，结果见图6，其中蓝色为碳点的荧光，绿色为NBD C₆-ceramide的荧光。用软件Image-Pro Plus软件计算碳点荧光与高尔基体特异性荧光染料荧光的相关性系数，该系数为0.87，实验结果显示，碳点与C₆-ceramide的荧光能够较好的重合，说明该碳点能较好地对高尔基体进行定位，证明该碳点具有良好的高尔基体靶向性。

分别以D-半胱氨酸、硫代乙酰胺、L-丙氨酸、s-甲基-L-半胱氨酸为碳源，采用本发明所述合成碳点的方法进行碳点的制备，并将获得的碳点应用于细胞成像，结果见图7，用软件Image-Pro Plus软件计算高尔基体特异性荧光染料荧光的相关性系数，该系数为较低，证明其他碳源合成的碳点不具备高尔基体靶向的功能，即使是柠檬酸与D-半胱氨酸合成的碳点也表现出较弱的高尔基体靶向能力，而其他物质与柠檬酸合成的碳点在细胞内的其他亚细胞器中广泛存在，对高尔基体没有识别能力。

(4)碳点持续高尔基体靶向成像性能:将碳点(1mg/mL)用含有2％牛血清的RPMI1640细胞培养液稀释后用于细胞培养，连续检测四个细胞的生长与碳点对这些细胞的高尔基体靶向性能。实验结果显示在4天内细胞由4个分裂为17个，且在此过程中均可观察到碳点对高尔基体的明显的靶向能力(图8)，说明该碳点具有良好的生物相容性及持续高尔基体靶向性能。

(5)碳点耐光漂白性能:将碳点与NBD C₆-ceramide对高尔基体进行定位后，用共聚焦显微镜激光对高尔基体进行连续激发，并在不同时间监测碳点与NBD C₆-ceramide荧光强度的变化。实验结果显示NBD C₆-ceramide在持续激发2min后荧光基本消失，而碳点的荧光在持续激发60min后荧光强度仍然保持80％以上(图9)。说明该碳点具有良好的抗光漂白性能。

综上，本发明制备的碳点具有强蓝色荧光发射、无生物毒性、耐光漂白与持续的高尔基体靶向性能。该碳点具有的独特性质使其既可以用于常规的高尔基体定位，也可以将其应用于研究长时间尺度上单个细胞高尔基体的动态变化，除此之外，还可以将该碳点用于细胞在外部侵染过程中高尔基体的动态变化研究等方面。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，制备方法包括如下步骤:

1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25 ~ 1：1的比例，取柠檬酸并在150~250 ^oC条件下加热0~20 min，获得产物A；

2)、取L-半胱氨酸和产物A混合，140~250^oC加热3~60 min，获得固体产物B；

3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6~8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500~1000Da的透析袋透析12~48h，冷冻干燥即得碳点。

2.根据权利要求1所述具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，所述步骤1)中所述柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:1。

3.根据权利要求1所述具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，所述步骤1)中所述加热温度为200^oC，加热时间为20min。

4.根据权利要求1所述具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，所述步骤2)中所述加热温度为150^oC，加热时间为50min。

5.根据权利要求1所述具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点，其特征在于，所述步骤3)中先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至7。

6.制备具有持续高尔基体靶向成像能力的碳点的方法，其特征在于，包括如下步骤:

1)、按柠檬酸与L-半胱氨酸的质量比为1:0.25 ~ 1:1的比例，取柠檬酸并在150~250 ^oC条件下加热0~20 min，获得产物A；

2)、取L-半胱氨酸和产物A混合，140~250^oC加热3~60 min，获得固体产物B；

3)、先用氢氧化钾或氢氧化钠溶液将步骤2)所获固体产物B的pH调至6~8，然后用0.22μm的滤膜进行过滤，再用截留分子量500~1000Da的透析袋透析12~48h，冷冻干燥即得碳点。