CN108587613A - 一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法及其在选择性识别铜离子中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法及其在选择性识别铜离子中的应用，属于铜离子荧光探针技术领域。本发明的技术方案要点为：一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法，首先通过异硫氰酸丁酯和水合肼发生反应一步合成丁基氨基硫脲，然后以丁基氨基硫脲作为识别分子对碳量子点表面进行修饰最终制得丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针，该荧光探针对Cu2+具有特殊选择性，通过对实际样品进行测试证实了该方法具有一定的可行性及准确性，并且修饰碳量子点还可以用于细胞内多色生物成像及生物分析。

Description

一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法及其在 选择性识别铜离子中的应用
技术领域
本发明属于铜离子荧光探针技术领域，具体涉及一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法及其在选择性识别铜离子中的应用。
背景技术
铜离子是仅次于锌、铁，在人体内位居第三位的过渡金属离子，它在人体生理过程中扮演着非常重要的角色：如细胞质和线粒体中大量的氧化还原反应需要铜酶催化。然而，过多的铜离子往往导致产生过量的活性氧而导致人体的蛋白质、核酸和脂肪的氧化损伤。同时，铜代谢异常也能引起许多神经系统疾病，如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和威尔逊病。因此，高选择性的检测和监视生物体和环境样品中铜离子的含量对人类健康和环境保护是非常有意义的。传统测量Cu2+的方法有比色法、毛细管电泳法、原子吸收分光光度法、电感耦合等离子体质谱法、极谱法、化学发光法和电化学法等，然而这些方法往往需要耗费大量的时间对样品进行预处理，检测过程繁琐，使用有机试剂，设备复杂和昂贵等。金、银纳米材料荧光探针，半导体量子点由于其分析速度快、灵敏度高和选择性好已被用来测量Cu2+。但是由于它们成本高、合成过程复杂、水溶性及生物相容性差而限制了它们在常规分析中的应用。而碳量子点作为一种新型碳质的荧光纳米材料，由于其原材料来源丰富、合成方法简单、量子产率高、光学性能和化学稳定性稳定、表面易于功能化、毒性小、水溶性和生物相容性好而备受关注，目前已被应用于检测许多物质，如6-巯基嘌呤、抗坏血酸、次氯酸盐、超氧化物阴离子、pH值、硫化氢和金属离子等。然而，由于原始碳量子点对目标物没有特殊选择性、灵敏度和选择性较差，使大部分分析受到限制，为了进一步拓宽其应用领域，将纳米材料上修饰具有高度选择性的识别分子，已被证实是进行定量检测、高效荧光成像、实时跟踪Cu2+的有效方法。现在，基于碳量子点修饰的Cu2+传感器报道的已有许多，Qu等通过共价键用TPEA修饰水溶性碳量子点得到细胞内Cu2+传感器，并用于成像。用1,4,8,11-取代四氮杂环十四烷修饰碳量子点人们研发出了活细胞内高选择性和敏感性检测Cu2+和S2–的碳纳米传感器，且该传感器可以可逆检测Cu2+和S2–。Rao等将表面覆盖有二氧化硅的碳量子点和CdTe进行整合设计出了比率型Cu2+传感器，并测定了蔬菜和水果样品中的Cu2+，实验表明该传感器具有较好的选择性和较低的检测限。Wang等用β-氨基醇功能化荧光碳量子点得到了一个新型的高选择性的铜离子传感器。Zhu等合成了AE-TPEA(N-(2-氨乙基)-N,N,N-三(吡啶-2-亚甲基)乙烷-1,2-二胺)并将其作为Cu2+离子特异受体，共轭键合到CdSe和碳点的纳米复合材料上构建了基于碳量子点的荧光探针
(CdSe@CDs-TPEA探针)并将其用于成像和活细胞中Cu2+离子的测定，检测限约1.0μM等。但是在这些方法中，有的需要长时间的原料合成，有的修饰过程复杂，有的使用有毒金属和有机物，有的检测限较大(＞5nm)等等。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法及其在选择性识别铜离子中的应用，该方法首先通过异硫氰酸丁酯和水合肼发生反应一步合成丁基氨基硫脲，然后以丁基氨基硫脲作为识别分子对碳量子点表面进行修饰最终制得丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针，该荧光探针对Cu2+具有特殊选择性，通过对实际样品进行测试证实了该方法具有一定的可行性及准确性，并且修饰碳量子点还可以用于细胞内多色生物成像及生物分析。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤为；
(1)碳量子点的制备，在30mL超纯水中加入3.00g EDTA，充分溶解后转入50mL的聚四氟乙烯高压反应釜中，于180℃反应10h，反应产物在15000rpm的转速下离心20min，上清液用0.22μm的过滤膜过滤，将滤液在真空干燥箱中干燥24h得到碳量子点；
(2)丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备，将10.00mL摩尔浓度为20.0mmol/L的EDC和5.0mL摩尔浓度为20.0mmol/L的NHS加入到20mL含有0.20g碳量子点的分散液中，在转速为50rpm、37℃油浴锅中反应30min，再加入5.0mL质量浓度为50.0g L-1的丁基氨基硫脲溶液，反应3h，将反应产物于4℃过夜，然后用纤维膜透析24h，将透析后的产品干燥得到丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针并于4℃储存。
进一步优选，所述丁基氨基硫脲的具体合成过程为：将15mmol异硫氰酸丁盐和10mL无水乙醇溶液加入到50mL圆底烧瓶中，冰浴下搅拌，待完全溶解后逐滴加入2.3mL水合肼，滴完水合肼，撤去冰浴，于10℃继续搅拌反应，TLC跟踪反应，1h反应完全，用旋转蒸发仪蒸出溶剂得到油状液体，将此油状液体于4℃过夜得到粗品白色固体；将粗品用二氯甲烷溶解，然后倒入多倍体积的石油醚中，于40-60℃持续搅拌析出白色晶体，抽滤，水洗，石油醚洗，重复多次后真空干燥得到纯产品丁基氨基硫脲。
本发明所述的丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针在选择性识别铜离子中的应用。
进一步优选，丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针在选择性识别铜离子的过程中，设定激发波长为360nm，发射波长为450nm。
本发明所述的丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针在细胞内多色生物成像及生物分析中的应用。
进一步优选，所述细胞为KYSE410细胞和HeLa细胞。
本发明利用丁基硫代氨基脲成功构建了一种新型的Cu2+荧光纳米传感器。相对于其它金属离子，该传感器对Cu2+具有极好的选择性。当Cu2+浓度在0-0.1μΜ和4-50μΜ范围内时，荧光强度和其浓度均有良好的线性关系。其Stern-Volmer方程分别为F0/F＝1.0005-0.6710[Cu2+](R2＝0.9994)及F0/F＝0.6671-0.094[Cu2+](R2＝0.9982)。该荧光探针还表现出极好的水溶性、低细胞毒性、优良的生物相容性及细胞膜通透性，可用于KYSE410细胞和HeLa细胞的多色生物成像。我们对方法的作用机理进行推测，认为可能是由于丁基硫代氨基脲和Cu2+之间发生络合反应引起内滤效应，导致了探针荧光猝灭，将该方法用于实际样品中Cu2+的测定，回收率可达95.0％-103.7％，方法具有一定的准确性和可行性。
附图说明
图1是丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的设计方案图；
图2是不同碳量子点的TEM图和粒径分布图，其中透射电镜图谱：a-原始碳量子点，b-修饰碳量子点；粒径分布图谱：c-原始碳量子点，d-修饰碳量子点；
图3是不同物质的红外光谱图，其中a-丁基氨基硫脲，b-原始碳量子点，c-修饰碳量子点；
图4是修饰碳量子点XPS的全谱图及高分辨能谱图，其中a-C1s，b-N1s，c-O1s，d-S2p；
图5是氨基硫脲、原始碳量子点和修饰碳量子点紫外-可见光谱图(插图：修饰碳量子点在365nm紫外灯照射下的图片)
图6中a不同激发波长下修饰碳量子点的发射光谱和b发射波长与激发波长的依赖性曲线；
图7是碳量子点水溶液的最佳激发光谱与发射光谱；
图8是pH、缓冲体系及NaCl对修饰碳量子点发光性能的影响；
图9是同样浓度Cu2+加入原始碳量子点a和修饰碳量子点b后的荧光猝灭曲线；
图10中a碳量子点用量及b反应时间对荧光响应的影响；
图11中a加入不同浓度铜离子(从低到高浓度)探针的响应；b荧光强度与Cu2+的依赖性(插图为[Cu2+]在0-0.1μM时F/F0与Cu2+线性关系)；c[Cu2+]在4-50μM时F/F0与Cu2+线性关系；
图12中a加入30μM不同金属离子探针的响应；b同样条件下Cu2+未存在和存在时干扰离子对探针的影响；
图13是修饰碳量子点细胞毒性实验；
图14是KYSE410细胞(a-d)的共聚焦荧光成像，其中b-对照组，a-明场及c-405nm和d-488nm激发波长下的荧光成像；
图15是HeLa细胞(e-h)的共聚焦荧光成像，其中f-对照组，e-明场及g-405nm和h-488nm激发波长下的荧光成像。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
1.1设计思路
本发明首先通过异硫氰酸丁酯和水合肼发生反应一步合成丁基氨基硫脲，然后以丁基氨基硫脲作为识别分子对碳量子点表面进行修饰，通过对修饰碳量子点进行透射电镜、红外、紫外及XPS表征，证实了丁基氨基硫脲被成功修饰到了碳量子点表面，且修饰碳量子点相对于其它金属离子，对Cu2+具有特殊选择性。该修饰碳量子点还可以用于细胞内生物成像及生物分析(设计方案如图1所示)。另外，通过对实际样品进行测试，证实了该方法具有一定的可行性及准确性。
1.2材料和方法
1.2.1材料
异硫氰酸丁酯(99wt％)购于上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于阿拉丁实业公司(上海，中国)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)购于安耐吉化学技术有限公司(上海)；石油醚购于天津市光复科技发展有限公司；水合肼(85wt％)、无水乙醇、冰醋酸、EDTA、KCl、NaCl、AgNO3、ZnCl2、Mg(NO3)2、BaCl2、FeSO4、Cu(NO3)2、MnCl2、Ni(NO3)2、Co(NO3)2、Pb(NO3)2、Cd(NO3)2、Hg(NO3)2、AlCl3和Fe(NO3)3均购于国药控股化学试剂有限公司(上海，中国)。本发明所用试剂均为分析纯。实验用水为实验室自制超纯水，缓冲体系为Tris-HCl缓冲体系(pH＝7.4)。
1.2.2仪器
高分辨透射电子显微镜(TEM，JEOL，Japan)(加速电压为200Kv)；X射线衍射仪(XRD，Bruker，German)(Cu靶，Kа激发)，傅里叶中远红外光谱仪(FT-IR，400F，PerkinElmer，USA)；X-射线光电子能谱仪(XPS，PHI Quantera)，紫外-可见分光光度计(TU-1810，北京普析分析仪器有限公司)；Cary Eclipse荧光光谱仪(VARIAN，USA)；Leica激光共聚焦荧光显微镜(TCSSP5，德国)；600兆核磁共振波谱仪(AVANCE III HD600，Bruker，瑞士)，TMS为内标，DMSO-d6为溶剂。
1.2.3试验方法
(1)碳量子点的制备
在30mL超纯水中加入3.00g EDTA，充分溶解后转入50mL的聚四氟乙烯高压反应釜内，于180℃反应10h，冷却，产物在15000rpm转速下离心20min，上清液用0.22μm的过滤膜过滤，滤液在真空干燥箱里干燥24h得到碳量子点。
(2)4-丁基氨基硫脲合成
室温下以无水乙醇为溶剂，利用硫氰酸盐与水合肼的反应，合成丁基氨基硫脲。
实验步骤：
第一步：将15mmol异硫氰酸丁盐和10mL无水乙醇溶液加入到50mL圆底烧瓶中，冰浴下搅拌，待完全溶解后逐滴加入2.3mL水合肼，滴完水合肼，撤去冰浴，于10℃继续搅拌反应，TLC跟踪反应，1h反应完全，用旋转蒸发仪蒸出溶剂得到油状液体，将此油状液体放入冰箱(4℃)过夜，得到白色固体，此为粗产物。
第二步：将粗产品用二氯甲烷溶解，然后倒入多倍体积的石油醚里，于40-60℃持续搅拌析出白色晶体，抽滤，水洗，石油醚洗。再重复几次，然后真空干燥，得到纯产品，打谱。
4-Butylthiosemicarbazide
whrite solide,mp 74-74.5℃；1H NMR(600MHz,DMSO):δ8.53(s,1H),7.77(s,1H),4.42(s,2H),3.45-3.42(dd,J＝12.0Hz,6.42Hz,2H),1.50-1.45(m,J＝6.0Hz,2H),8.45(s,1H),1.31-1.24(m,2H),0.90-0.87(t,J＝12.0Hz,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO):δ181.12,42.54,31.24,19.50,13.76。
(3)丁基氨基硫脲修饰碳量子点的制备
将10.0mL 20.0mM EDC和5.0mL 20.0mM NHS加入到20mL含有0.20mg碳量子点的分散液中，在转速为50rpm、37℃油浴锅里反应30min，再加入5.0mL 50.0g L-1丁基氨基硫脲溶液，反应3h，将反应物置于4℃的冰箱里过夜，然后用纤维膜透析24h，将透析后的产品干燥并于4℃储存。
(4)铜离子检测
将200μL 0.01g L-1修饰碳量子点溶液加入1.5mL的离心管中，随后加入不同浓度的Cu2+溶液，用Tris-HAc缓冲溶液定容至1.0mL，混匀，反应5min。在370nm激发波长下测定荧光强度。
(5)毒性试验
将HeLa细胞接种在96孔板上，细胞浓度为每孔5×104cells，然后加入DMEM培养基，5％CO2的培养箱于37℃培养24h，接着加入不同浓度的丁基氨基硫脲修饰的碳量子点溶液，再培养24h。再加入20μL 5g L-1MTT，培养4h，洗去培养介质，最后加入150μL DMSO，室温下避光震荡5min，570nm波长处测定吸光度。
(6)生物成像
以HeLa细胞和KYSE410细胞为例来讨论生物成像。
对照组：HeLa细胞和KYSE410细胞在37℃的培养基里培养8h，PBS缓冲溶液冲洗3遍，共聚焦荧光显微镜下成像。
测定组：在培养好的HeLa细胞和KYSE410细胞里加入一定量的丁基氨基硫脲修饰的碳量子点溶液，于37℃继续培养8h，PBS溶液冲洗3遍，共聚焦荧光显微镜下成像。
(7)实际样品测定
选用矿泉水和头发作为研究对象，矿泉水购于河南师范大学超市，头发取自本市医院正常体检幼儿。测定前先进行样品处理，采集幼儿枕后接近发根处发样1g，剪成碎段，混匀，放入50mL烧杯中用自来水漂洗几次，用中性洗涤剂浸泡1h，再用自来水反复清洗直至无泡沫，再用蒸馏水、去离子水洗，于60℃烘箱中烘干。准确称取0.50g放入消化瓶中，加混酸(HClO4:浓HNO3＝1:6，v/v)14mL，加热消化至白色粉末，用超纯水溶解，用氢氧化钠将pH调为7.4，在50mL的容量瓶中定容，得到10g L-1溶液。然后在200μL 0.01g L-1修饰碳量子点溶液中加入一定体积的矿泉水和头发溶液用Tris-HAc缓冲溶液定容，充分混匀后反应5min，360nm波长下测荧光强度。
1.2.4修饰碳量子点的表征
(1)高分辨透射电子显微镜(TEM)
将10μL一定浓度的碳量子点溶液滴加在300目超薄碳膜铜网上，红外灯下干燥，然后在透射电镜下观察其形貌、粒径。
(2)XPS
Al Kα作激发源，XPS仪表征修饰碳量子点的元素组成及各元素存在形式。
(3)FT-IR
将一定量的KBr和修饰的碳量子点放在研钵里充分混合、研细，压片，然后用中远红外光谱仪扫描红外光谱。
(4)荧光光谱
设置激发和发射的狭缝宽度为5nm，用荧光光谱仪扫描修饰碳量子点的发射和激发荧光光谱图，通过分析得到最佳发射和激发波长。
(5)紫外吸收图谱
以超纯水作空白，扫描原始碳量子点、丁基氨基硫脲及丁基氨基硫脲修饰碳量子点溶液在220-600nm范围内的紫外吸收光谱。
1.3结果与讨论
1.3.1修饰碳量子点的表征
由于EDTA分子富含氨基、羧基，用它作碳源通过水热法合成出了表面富含羧基的原始碳量子点(这一结论被后面的红外结果所证实)，然后通过原始碳量子点表面的羧基和丁基氨基硫脲中的氨基发生化学反应将丁基氨基硫脲修饰到原始碳量子点上，从而得到了表面功能化的碳量子点。修饰碳量子点水溶性极好，用透射电镜观察其微观形貌，发现该碳量子点具有很好的分散性，在溶液里呈球形(图2b)。粒径主要分布在1.82-4.21nm的范围内，平均粒径为2.89nm(图2d)。原始碳量子点的平均粒径为2.38nm(图2c)，修饰碳量子点粒径增大了0.51nm，这表明丁基氨基硫脲被成功修饰到了碳量子点表面。
为了确定其表面组成及表面状态进行检测，用红外对其表征，结果见图3，由图可以看出，在3426cm-1和1622cm-1处出现的吸收峰为N-H和C＝O的伸缩振动峰(图3b)。3055cm-1和1324cm-1处的吸收峰为O-H的伸缩振动峰和变形峰，这证实在原始碳量子点表面富含氨基、羟基和羧基。而修饰碳量子点(图3c)3426cm-1和1622cm-1处的吸收峰仍存在，但是3055cm-1处(υO-H)的吸收峰消失，表明原始碳点上的羧基转换成了酰胺基，这一结果被1298cm-1(υ-NHC＝O)处的吸收峰证实。此外，氨基硫脲(图3a)的3309cm-1和1636cm-1处的N-H吸收峰在修饰碳量子点内仍存在，只是位置稍有变动，出现在3426cm-1和1622cm-1处。而1493cm-1、1230cm-1处的吸收峰为C＝S的弯曲振动峰和伸缩振动峰，801cm-1处的C-S伸缩振动峰在修饰碳量子点中仍存在。这进一步证实了丁基氨基硫脲被修饰到碳量子点的表面。
XPS可以用来表征修饰碳量子点的表面组成，结果显示在修饰碳量子点的XPS全谱图(图4)里有四个峰，分别位于285.5eV、399.9eV、531.7eV、223.0eV和157.1eV，分别对应于C1s、N1s、O1s、S2s和S2p。C1s的高分辨(图4a)结果显示在288.4eV、288.1eV、287.6eV、286.1eV和284.9eV处出现的五个峰，应分别对应于C＝O/C＝S、C-S、C-O、C-N和C-C/C＝C。而图4b在400.8eV和399.5eV处的峰则归属于C-N和N-H。O1s高分辨图谱(图4c)在531.0eV和532.0eV处的两个峰应则对应于C＝O和O-H。而图4d在163.0eV和161.8eV处的两个峰应则属于-C-S的2p3/2和2p1/2，结果与红外结果相一致。修饰碳量子点里C、N、O、S元素的含量分别为62.8％、14.8％、20.2％、2.0％，表明丁基氨基硫脲已修饰在碳量子点表面。
而丁基氨基硫脲、原始碳量子点及修饰碳量子点的紫外结果(图5)显示修饰碳量子点在242nm处出现了一个不同于丁基硫脲及原始碳量子点的新的吸收峰，这说明氨基硫脲和原始碳量子点成功地键合在一起。
我们又用荧光光谱仪扫描了修饰量子点发射光谱图(图6a)用于分析修饰碳量子点的光致发光特性。通过发射光谱可以观察到修饰碳量子点在激发波长为320-450nm范围内具有明显的波长依赖性。当激发波长320-380-450nm时，最大发射波长由418-456-512nm，随着激发波长的增加发射波长红移且荧光强度在320-360nm时随激发波长增加而上升，由616.069上升到996.600。然后下降，由996.600下降到420.355再下降到236.037，其激发波长与发射波长及荧光强度的关系见表1。由表可以发现修饰碳量子点的发射光谱与激发波长的红移并不是均匀的，但是红移现象还是比较显著的。这可能是因为材料表面上不同官能团导致的能量陷阱引起的修饰碳量子点波长依赖性的原因。通过扫描碳量子点的激发光谱(图6b)，得到其最佳激发波长为360nm，发射波长为450nm(图7)，且该修饰碳量子点在365nm的紫外灯照射下发出强烈的蓝色荧光(图5插图)。
表1修饰碳量子点的激发波长、发射波长与荧光强度对比
1.3.2 pH值、缓冲体系及离子强度对碳量子点发光性能的影响
pH值不同碳量子点的表面状态不同，从而影响碳量子点的光学特性，为此我们考察了pH在3-10范围内对修饰碳量子点荧光强度的影响，结果如图8a，当pH值由3到7时碳量子点的荧光强度是随着pH的增加而增加，当pH＝7时，荧光强度最大，然后再增加pH值，荧光强度反而减小，当pH＝10时，荧光强度最小，这可能是由于碳量子点表面的官能团在酸性或碱性条件下易质子化或去质子化引起的。但是pH值过高铜离子又容易水解，也考虑后续的生物成像因素，我们选择7.4作为最佳反应pH。为了检测的灵敏度，我们在同一pH(pH＝7.4)下又考察了四种缓冲体系：Tris-HCl缓冲体系、PBS缓冲体系、Tris-HAc缓冲体系及柠檬酸-柠檬酸钠(CA-SC)和BR缓冲体系对荧光强度的影响。结果(图8b)发现碳量子点在PBS缓冲体系时荧光强度最大。此外碳量子点在不同浓度的NaCl溶液里(0-1.0M)荧光强度几乎保持不变，稳定性好(图8c)。这些稳定性对于修饰碳量子点在实际样品检测与生物成像十分有益。
1.3.3机理探讨
在未修饰碳量子点溶液里加入铜离子，360nm激发波长下检测其荧光强度，发现碳量子点的荧光强度变化很小(图9a)，而在修饰碳量子点溶液里时加入同样浓度的铜离子，荧光强度降低显著(图9b)。氮原子和铜离子之间有很强的亲和力，C＝S/C＝O也可以和重金属键合。将丁基氨基脲修饰在碳量子点表面在铜离子检测中可能起着关键作用，他们之间发生的络合作用导致了碳量子点荧光强度的猝灭(内滤效应)。这一结果也被图4的探针与铜离子发生反应后得到的紫外光谱图所证实，在261cm-1处出现的新吸收峰证实有新物质的产生，说明二者发生了反应。
1.3.4优化反应条件
为了获取最佳反应条件，我们对修饰碳量子点的用量、反应时间进行考察。我们首先考察了同样浓度(0.01g/L)不同用量的修饰碳量子点对荧光响应的影响，结果如图10a，加入100μL修饰碳量子点时，探针荧光强度改变减小，随着加入修饰碳量子点量的增加，荧光响应增加，但是在200-600μL时荧光响应几乎不变，然后当加入800-1000μL的修饰碳量子点时荧光响应略增加，这可能是由于加入修饰碳量子点量的增加导致溶液浓度过高，修饰碳量子点凝聚自猝灭增加。但是修饰碳量子点用量小时探针的荧光强度减弱，考虑到方法的灵敏度，本专利选修饰碳量子点的用量为200μL。而比较反应时间在1-15min荧光强度的变化(图10b)，我们发现该探针荧光响应速度很快，反应1min和15min荧光强度几乎不变，选择反应时间为5min。
1.3.5灵敏度与选择性
在最佳反应条件下来考察探针的灵敏度。将不同浓度的Cu2+(0-50.0μΜ)加入修饰碳量子点溶液里，设激发波长为360nm，检测体系在450nm处的荧光强度，结果如图11a。由图我们观察到，随着加入Cu2+浓度的增加，碳量子点的荧光信号逐渐减弱，猝灭效率达到63％。而且我们发现当Cu2+浓度在0-0.1μΜ和4-50μΜ(图11b和图11c)范围内时，荧光强度和其浓度均有良好的线性关系。其Stern–Volmer方程分别为F0/F＝1.0005-0.6710[Cu2+](R2＝0.9994)及F0/F＝0.6671-0.094[Cu2+](R2＝0.9982)。对空白样品进行检测得到其检测限为5.05nM，此结果远远低于美国环境保护部分关于饮用水中Cu2+的最大允许浓度(20μM)。
接着我们又在碳量子点溶液里分别加入相同浓度(30.0μM)的金属离子Na+、K+、Ca2 +、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Mn2+、Pb2+、Ag+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Ni2+和Hg2+，分析结果(图12a)得到，加入铜离子后体系的荧光强度显著降低，减低了63％。而同等条件下，除了加入Ag+探针的荧光强度降低了14.3％，Fe3+降低了10.6％，Hg2+降低了11.7％外，其它金属离子对探针荧光强度的影响很小，均小于5.0％，表明探针对Cu2+具有高度选择性。将上述干扰离子加入含有Cu2+探针溶液里，共存离子对于Cu2+的猝灭影响较小。说明该探针具有高度灵敏度和选择性。
1.3.6毒性实验与生物成像
为了进行细胞成像，我们希望荧光标识物除了光学特性好还要毒性小。为此我们对修饰碳量子点进行毒性实验，以Hela细胞为代表细胞，用MTT法实验分析。发现将浓度为0.1-0.5mg mL-1修饰碳量子点加到Hela细胞里培养24h，细胞的存活率高达91.8％。增加碳量子点的浓度，当修饰碳量子点的浓度为1.0、1.5、2.0mg mL-1时，细胞的存活率分别为87.5％、87.2％和86.7％(图13和14)，绝大多数细胞存活，证明修饰碳量子点细胞毒性小且生物相容性好。
将修饰碳量子点加入到KYSE410细胞和HeLa细胞里来研究其作为荧光细胞标记物的可行性。将修饰碳量子点加入细胞里培养8h，发现加入了修饰碳量子点培养的KYSE410细胞和HeLa细胞在405nm和488nm激发波长下发出强烈的蓝色(图14d和图15h)和绿色荧光(图14c和图15g)。未加入修饰碳量子点的KYSE410细胞和HeLa细胞却没有荧光信号发出(图14b和图15f)。表明修饰碳量子点易穿过细胞膜进入到HeLa细胞和KYSE410细胞里，生物相容性好，这也表明修饰碳量子点可以用于多色成像。
1.3.7实际样品测定
我们选择矿泉水、头发作为研究对象，分别采用本方法和原子吸收分光光度法测定样品中的Cu2+含量并进行加标回收实验来评估方法的可行性。结果见表2，由表分析发现用本方法测定的矿泉水中不含有Cu2+，而头发中Cu2+的含量为0.040μM，这和原子吸收分光光度法测得的结果相一致。而在样品中加入不同浓度的Cu2+后得到Cu2+回收率为95.0％-103.7％(RSD＜2.5％，n＝5)，说明该方法可以用于实际样品检测。
表2不同样品中Cu2+的测定及加标回收实验结果
*:平均值±SD(95％的置信区间，n＝5)
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (6)

1.一种丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于具体步骤为；
（1）碳量子点的制备，在30mL超纯水中加入3.00g EDTA，充分溶解后转入50mL的聚四氟乙烯高压反应釜中，于180℃反应10h，反应产物在15000rpm的转速下离心20min，上清液用0.22μm的过滤膜过滤，将滤液在真空干燥箱中干燥24h得到碳量子点；
（2）丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备，将10.00mL摩尔浓度为20.0mmol/L的EDC和5.0mL摩尔浓度为20.0mmol/L的NHS加入到20mL含有0.20g碳量子点的分散液中，在转速为50rpm、37℃油浴锅中反应30min，再加入5.0mL质量浓度为50.0g L-1的丁基氨基硫脲溶液，反应3h，将反应产物于4℃过夜，然后用纤维膜透析24h，将透析后的产品干燥得到丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针并于4℃储存。
2.根据权利要求1所述的丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于所述丁基氨基硫脲的具体合成过程为：将15mmol异硫氰酸丁盐和10mL无水乙醇溶液加入到50mL圆底烧瓶中，冰浴下搅拌，待完全溶解后逐滴加入2.3mL水合肼，滴完水合肼，撤去冰浴，于10℃继续搅拌反应，TLC跟踪反应，1h反应完全，用旋转蒸发仪蒸出溶剂得到油状液体，将此油状液体于4℃过夜得到粗品白色固体；将粗品用二氯甲烷溶解，然后倒入多倍体积的石油醚中，于40-60℃持续搅拌析出白色晶体，抽滤，水洗，石油醚洗，重复多次后真空干燥得到纯产品丁基氨基硫脲。
3.如权利要求1或2所述的方法制得的丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针在选择性识别铜离子中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针在选择性识别铜离子的过程中，设定激发波长为360nm，发射波长为450nm。
5.如权利要求1或2所述的方法制得的丁基氨基硫脲修饰碳量子点荧光探针在细胞内多色生物成像及生物分析中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述细胞为KYSE410细胞和HeLa细胞。
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