CN102127055B

CN102127055B - 一种单、双光子半胱氨酸荧光探针及其应用

Info

Publication number: CN102127055B
Application number: CN 201010558433
Authority: CN
Inventors: 于晓强; 孙渝明
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2010-11-25
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2030-11-25
Also published as: CN102127055A

Abstract

本发明公开了一种单、双光子半胱氨酸荧光探针，所述荧光探针是咔唑吡啶醛类化合物，其通式如(I)所示，其中所述R表示烷基或羟烷基。本发明还公开了所述荧光探针在观测半胱氨酸在活细胞中表达与分布的应用。本发明的探针具有适用范围广，价格低，能在活性细胞中专一荧光成像半胱氨酸的特点。

Description

一种单、双光子半胱氨酸荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种单、双光子荧光探针及其应用，尤其涉及一种咔唑吡啶醛类化合物的单、双光子半胱氨酸荧光探针及其应用。

背景技术

作为构成蛋白质的二十种氨基酸之一，含有巯基的半胱氨酸在细胞的生理过程中起着不可替代的作用。例如，半胱氨酸是细胞和组织生长的必备分子，半胱氨酸缺乏与水肿、幼儿发育不良、肝脏损伤等许多疾病相关。因此，实现细胞内半胱氨酸的荧光成像，并给出细胞内半胱氨酸表达与分布的信息，有着重要的生命科学与医学价值。

一般来说，观测细胞内分子荧光成像的仪器有激光扫描共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜，其中双光子荧光显微镜在成像活细胞方面的优势较为明显。但目前适合这两种显微镜使用的、在活细胞内对半胱氨酸具有专一性识别能力的荧光探针十分缺乏。同时，随着激光扫描共聚焦显微镜和双光子显微镜技术的不断升级和完善，各种生物荧光探针的研究与开发也在不断创新，并且，从分子水平上设计、开发对活性生物体系(如完整活细胞)中的生理、病理学标记物具有特异性、专一性识别能力的荧光探针分子，始终是生命科学研究中的重要课题。

尤其是近几年来，双光子荧光三维成像技术发展迅速，而专用的双光子荧光探针的开发却未及时跟上，特别是在细胞内专一性识别半胱氨酸的双光子荧光探针国际上未见报道。这在很大程度上制约了利用双光子三维成像技术进行细胞内半胱氨酸的成像与观测。因而开发、研制具有实际应用价值单、双光子半胱氨酸荧光探针是当务之急。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种咔唑吡啶醛类化合物的单、双光子半胱氨酸荧光探针及其应用。

本发明所述单、双光子半胱氨酸荧光探针，其特征在于所述荧光探针是咔唑吡啶醛类化合物，其通式如(I)所示：

其中：上述R表示烷基或羟烷基。

上述的荧光探针中，所述R进一步优选为C_1-6的烷基。

上述的荧光探针中，所述R最优选是乙基。

本发明所述咔唑吡啶醛类化合物制备方法概述如下：

为了增加分子在生理环境下的适应性，发明人首先在咔唑氮上引入乙基、丁基或羟乙基，然后利用Vilsmeier反应合成了相应咔唑的单醛，然后将咔唑单醛溴化，最后利用Hack反应得到最终产物咔唑吡啶醛类化合物。

上述咔唑吡啶醛类化合物的制备反应式如下：

本发明所述荧光探针在观测半胱氨酸在活细胞中表达与分布的应用。

其中，所述活细胞为HeLa细胞。

试验结果证实，本发明所述荧光探针能够在活细胞中专一性的成像半胱氨酸，荧光显微图像说明半胱氨酸主要富集在细胞的核周区域，这为半胱氨酸相关的病理学研究提供了简捷、直观的生物检测试剂。也预示本发明所述咔唑吡啶醛类化合物作为单、双光子半胱氨酸荧光探针具有广泛的应用。

大量的实验证明：本发明的咔唑吡啶醛化合物是一类新型的半胱氨酸选择性识别荧光探针分子，与其功能相近的单光子半胱氨酸荧光探针比，本发明所述咔唑吡啶醛类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。本发明的咔唑吡啶醛化合物是首次发明的双光子半胱氨酸荧光探针，并具有双光子荧光活性吸收截面大的特点。在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。

其中：上述咔唑吡啶醛类化合物优选3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑。

附图说明

图1：3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性Hela细胞进行染色在488纳米激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。

图2：3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。

图3：在Hela活细胞经N-乙基顺丁酸酐(NEM)处理后，3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性Hela细胞进行染色在488纳米激光辐照下得到的单光子荧光显微照片。

图4：在Hela活细胞经N-乙基顺丁酸酐(NEM)处理后，3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。

其中：上述图1～图4中的左图为用3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑染色得到的单或双光子荧光显微照片；中图为明场激光扫描的微分显微照片；右图为左中两图的合并图。

具体实施方式

实施例1

9-乙基咔唑(1a)的合成

将28g(500mmol)的KOH溶于60mL的丙酮溶液中，室温搅拌得到黄色溶液。向上述溶液中加入咔唑(13.2g，80mmol)，室温搅拌4h，得到咖啡色浑浊液。逐渐加入含有1-溴乙烷(9mL，120mmol)的丙酮溶液，反应过夜。将反应液倾入到1000mL水中，有黄色沉淀生成，过滤得到黄色固体。固体用乙醇重结晶，得到白色固体，产率：83％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：8.10(d，J＝7.8Hz，2H)，7.39-7.49(m，4H)，7.20-7.25(m，2H)，4.36(q，J＝7.2Hz，2H)，1.43(t，J＝7.2Hz，3H)。

9-丁基咔唑(1b)的合成

工艺同上，可合成9-丁基咔唑，产率：82％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：8.11(d，J＝7.9Hz，2H)，7.39-7.47(m，4H)，7.21-7.25(m，2H)，4.50(t，J＝7.0Hz，2H，methylene-H)，1.77-1.84(m，2H，methylene-H)，1.30-1.40(m，2H，methylene-H)，0.91(t，J＝7.4Hz，3H，methyl-H)。

9-羟乙基咔唑(1c)的合成

工艺同上，可合成9-羟乙基咔唑，产率：81％。：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：8.79(d，J＝7.8Hz，2H)，7.39-7.49(m，4H)，7.22-7.25(m，2H)，5.26(s，1H，hydroxyl-H)，4.58(t，J＝4.4Hz，2H，methylene-H)，3.89(t，2H，methylene-H)。

实施例2

3-甲酰基-9-乙基咔唑(2a)的合成

将1.86mL DMF加入干燥的圆底烧瓶中，冰水冷却至0℃，逐滴加入2.3mL重蒸的POCl₃，得到白色固体。并将含有4.87g(25mmol)化合物1a的CHCl₃(15mL)溶液加入上述反应瓶中。撤去冰水浴，将反应瓶移至油浴，加热回流16h。将CHCl₃尽量蒸出，将反应液倒入大量冰水中，用NaHCO₃调节pH到7-8。用CH₂Cl₂萃取，有机层用水洗涤，无水MgSO₄干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，得到淡黄色固体，产率：87％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：10.10(s，1H)，8.61(s，1H)，8.16(d，J＝7.8Hz，1H)，8.01(dd，J₁＝8.4Hz，J₂＝1.5Hz，1H)，7.47-7.57(m，3H)，7.26-7.35(m，1H)，4.40(q，J＝7.2Hz，2H)，1.47(t，J＝7.4Hz，3H)。

3-甲酰基-9-丁基咔唑(2b)的合成

工艺同上，可3-甲酰基-9-丁基咔唑，产率：81％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：10.11(s，1H)，8.61(s，1H)，8.16(d，J＝7.7Hz，1H)，8.01(dd，J₁＝8.5Hz，J₂＝1.5Hz，1H)，7.47-7.57(m，3H)，7.26-7.35(m，1H)，4.50(t，J＝7.0Hz，2H，methylene-H)，1.77-1.84(m，2H，methylene-H)，1.30-1.40(m，2H，methylene-H)，0.91(t，J＝7.4Hz，3H，methyl-H)。

3-甲酰基-9-羟乙基咔唑(2c)的合成

工艺同上，可合成3-甲酰基-9-羟乙基咔唑，产率：85％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：10.11(s，1H)，8.61(s，1H)，8.16(d，J＝7.7Hz，1H)，8.01(dd，J₁＝8.5Hz，J₂＝1.5Hz，1H)，7.47-7.57(m，3H)，7.26-7.35(m，1H)，5.26(s，1H，hydroxyl-H)，4.58(t，J＝4.4Hz，2H，methylene-H)，3.87(t，2H，methylene-H)。

实施例3

3-甲酰基-6-溴-9-乙基咔唑(3a)的合成

氩气保护下，将化合物2(2.2g，9.85mmol)和NBS(1.9g，10.67mmol)加入到60mL的氯仿/冰醋酸混合溶液(1∶1，v/v)中，室温条件下反应15h。反应完全后，将反应液倒入500mL水中，用CH₂Cl₂萃取。有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO₄干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，得到白色絮状固体，产率：81％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：10.10(s，1H)，8.56(d，J＝1.2Hz，1H)，8.27(d，J＝1.8Hz，1H)，8.05(dd，J₁＝8.4Hz，J₂＝1.2Hz，1H)，7.62(dd，J₁＝8.7Hz，J₂＝1.8Hz，1H)，7.49(d，J＝8.4Hz，1H)，7.35(d，J＝8.7Hz，1H)，4.4(q，J＝7.3Hz，2H)，1.47(t，J＝7.4Hz，3H)。

3-甲酰基-6-溴-9-丁基咔唑(3b)的合成

工艺同上，可合成3-甲酰基-6-溴-9-丁基咔唑，产率：82％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：10.10(s，1H)，8.56(d，J＝1.2Hz，1H)，8.27(d，J＝1.8Hz，1H)，8.05(dd，J₁＝8.4Hz，J₂＝1.2Hz，1H)，7.62(dd，J₁＝8.7Hz，J₂＝1.8Hz，1H)，7.49(d，J＝8.4Hz，1H)，7.35(d，J＝8.7Hz，1H)，4.49t，J＝7.0Hz，2H，methylene-H)，1.75-1.84(m，2H，methylene-H)，1.32-1.40(m，2H，methylene-H)，0.91(t，J＝7.4Hz，3H，methyl-H)。

3-甲酰基-6-溴-9-羟乙基咔唑(3c)的合成

工艺同上，可合成3-甲酰基-6-溴-9-羟乙基咔唑，产率：84％。¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：10.09(s，1H)，8.58(d，J＝1.2Hz，1H)，8.27(d，J＝1.8Hz，1H)，8.05(dd，J₁＝8.4Hz，J₂＝1.2Hz，1H)，7.62(dd，J₁＝8.7Hz，J₂＝1.8Hz，1H)，7.49(d，J＝8.4Hz，1H)，7.35(d，J＝8.7Hz，1H)，5.29(s，1H，hydroxyl-H)，4.58(t，J＝4.5Hz，2H，methylene-H)，3.89(t，2H，methylene-H)。

实施例4

3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(4a)的合成

将0.61g(2mmol)化合物3，44.9mg(0.2mmol)醋酸钯，182.62mg(0.6mmol)三邻甲苯基膦，2.2g(16mmol)K₂CO₃加入到35mL的NMP中。该反应体系用氩气鼓泡30min后加入0.43mL(4mmol)4-乙烯吡啶，升温至130℃，反应36h。反应完毕后，将反应液倾入水中，用CH₂Cl₂萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品经过柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(2∶1)作淋洗液，得到黄色固体，产率：52％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)，δ(ppm)：10.09(s，1H)，8.80(d，J＝1.6Hz，1H)，8.65(s，1H)，8.55-8.57(m，2H)，8.03(dd，J₁＝8.4Hz，J＝0.6Hz，1H)，7.71-7.89(m，4H)，7.58(d，J＝6.0Hz，2H)，7.34(d，J＝16.5Hz，1H)，4.54(q，J＝7.0Hz，2H)，1.37(t，J＝7.1Hz，3H)。

3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-丁基咔唑(4b)的合成

工艺同上，可合成3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-丁基咔唑，产率：55％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)，δ(ppm)：10.09(s，1H)，8.80(d，J＝1.6Hz，1H)，8.65(s，1H)，8.55-8.57(m，2H)，8.03(dd，J₁＝8.4Hz，J＝0.6Hz，1H)，7.71-7.89(m，4H)，7.58(d，J＝6.0Hz，2H)，7.34(d，J＝16.5Hz，1H)，4.50(t，J＝7.0Hz，2H，methylene-H)，1.77-1.84(m，2H，methylene-H)，1.30-1.40(m，2H，methylene-H)，0.91(t，J＝7.6Hz，3H，methyl-H).

3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-羟乙基咔唑(4c)的合成

工艺同上，可合成3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-羟乙基咔唑，产率：55％。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)，δ(ppm)：10.09(s，1H)，8.80(d，J＝1.6Hz，1H)，8.65(s，1H)，8.55-8.57(m，2H)，8.03(dd，J₁＝8.4Hz，J＝0.6Hz，1H)，7.71-7.89(m，4H)，7.58(d，J＝6.0Hz，2H)，7.34(d，J＝16.5Hz，1H)，5.27(s，1H，hydroxyl-H)，4.60(t，J＝4.5Hz，2H，methylene-H)，3.89(t，2H，methylene-H).

实施例5

Hela细胞培养

HeLa细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每2～3d换液传代1次。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100ml细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1ml 0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1x10⁵)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO₂培养箱中培养，使细胞爬片生长。

实施例6

3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(4a)染色HeLa细胞

将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO∶PBS(1∶100)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO₂培养箱中染色细胞30min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在单、双光子荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等。

其中

实施例7

3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(4a)染色HeLa细胞，并染色NEM(N-乙基顺丁酸酐)处理后的HeLa细胞(对比试验)：

将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，分别用血清配置的5mM NEM溶液和DMSO∶PBS(1∶100)混合溶液配置的5mM的NEM溶液在CO₂培养箱中处理细胞30min。洗去NEM后，分别用血清稀释和DMSO∶PBS(1∶100)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO₂培养箱中染色细胞30min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在单、双光子荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，NEM处理后，显微镜中不显示荧光，即使显示荧光，其亦分布无特异性。鉴于NEM是公认的巯基化合物反应剂，因此，从对比角度证实了3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑(4a)专一性的成像半胱氨酸。

其中

Claims

1.一种单、双光子半胱氨酸荧光探针，其特征在于所述荧光探针是咔唑吡啶醛类化合物，其通式如（I）所示：

其中：上述R表示C_1-6的烷基。

2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于所述R表示乙基。