CN103275699B - 一种用于活细胞中rna和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针 - Google Patents
一种用于活细胞中rna和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针,该荧光探针结构通式如(Ⅰ)所示,其中R1、R2表示烷基、羟烷基或醚基。本发明还公开了所述荧光探针在标记或显示RNA和核仁在活细胞中分布及鉴别细胞死活状态中的应用。本发明的探针具有适用范围广,膜通透性好,细胞毒性低,能在活性细胞中专一荧光成像RNA的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光探针,尤其涉及一种用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针。
背景技术
核酸不但是一切生物细胞的基本成分,还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。如核酸氧化分解物--嘌呤是导致人类尿酸增高和痛风的主要原因。核酸大分子分为两类:脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础,RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用,其中转移RNA(tRNA)携带和转移活化氨基酸;信使RNA(mRNA)是合成蛋白质的模板;核糖体RNA(rRNA),是细胞合成蛋白质的主要场所。
细胞中的核仁已经发现了100多年,但是它的生物功能并没有得到完全阐明。人们普遍认为,核仁是核中核糖体RNA转录、加工、装配的场所。通常在细胞分裂的早期核仁开始消失,中期和后期完全消失,分裂末期在一定的染色体上的特殊部位——核仁组织者(rRNA基因存在的地方)再次形成核仁结构,并逐渐增大,融合成一个或几个核仁,在间期细胞中核仁持续存在,核仁的结构和功能与细胞的代谢活动、增殖和分化相关,不同细胞的核仁类型、数目和大小都各不相同。引起各种核仁成分粘连的机制仍在研究中。核仁也有很多其他的功能,例如,信号识别、粒子RNA成熟,一个生长因子和生长因子相关蛋白的潜在功能,研究者也提出了核仁与肿瘤、衰老的潜在联系。
核仁和细胞质中的RNA的荧光成像对生物化学和生物医药是非常有意义的。相比众多的商业DNA探针,RNA探针非常少,因为现有核酸探针一般与双链DNA有较大的亲和性,且小分子与RNA的作用机理尚不清楚,所以RNA探针的研究是比较困难的。
检索表明分子探针公司(Molecular Probes Co.)只能提供一个可用于RNA成像的典型的商业RNA探针“SYTO RNA-Select”,但是它的化学结构仍在保密中。目前RNA可视探针的缺乏已经限制了病理学研究和药物的开发。所以,发展新型结构和功能的RNA或核仁荧光探针迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明要解决的问题是提供一种用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针。
本发明所述用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针,其特征在于:所述荧光探针结构通式如(Ⅰ)所示:
其中:上述R1、R2表示烷基、羟烷基或醚基。
上述用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针中:所述R1优选氢、C1-6的烷基、羟烷基或乙醚基,R2优选C1-4的烷基或羟烷基。
上述用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针中:所述R1最优选甲基,R2最优选羟乙基。最优选的荧光探针是(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(简称为1c)。
上述用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针化合物制备方法概述如下:
为了增加分子在生理环境下的适应性,发明人首先在吡咯氮上引入乙基、丁基或乙醚基,然后利用Vilsmeier反应合成了相应的单醛,最后利用Knoevenagel反应得到最终产物吡咯吡啶盐类化合物。
具体的,上述(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐化合物的制备反应式如下:
本发明所述用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针在标记或显示RNA和核仁在活细胞中分布的应用。
本发明所述用于活细胞中RNA和核仁成像的吡咯吡啶盐类荧光探针在鉴别细胞死活状态中的应用。
其中:所述细胞为HeLa、SiHa或H17702细胞。
实验结果证实,利用本发明所述荧光探针标记后的荧光图像显示,在细胞质和核仁区有明显的绿光分布,明确提示所述探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的RNA,并且在与传统核仁荧光探针或与经RNase A消化实验后的细胞进行对比试验后也得到进一步的证实。碘化丙啶(PI)是一种传统的成像凋亡或坏死细胞核的发红光的荧光染料,在利用本发明所述荧光探针与碘化丙啶(PI)进行对比试验后,发现凡是PI标记的有红色荧光的细胞核仁没有本发明所述荧光探针发出的与PI荧光有明显区别的绿色荧光,提示本发明所述荧光探针能选择性的成像活细胞的核仁和RNA,这也为本发明所述荧光探针用于鉴别细胞死活状态提供了又一途径。
本发明提供的吡咯吡啶盐类荧光探针是一类新型的RNA选择性识别荧光探针分子,与其功能相近的核仁荧光探针比,本发明所述探针具有膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点,预示其作为RNA和核仁荧光探针具有广泛的应用,有望开发为RNA和核仁相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测试剂。
附图说明
图1:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)对活HeLa、SiHa和H17702细胞进行染色在460-495纳米汞灯辐照下得到的荧光显微照片。
图2:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)对活性H17702细胞进行染色在488纳米激光辐照下得到的共聚焦荧光显微照片。左图为激光扫描共聚焦镜荧光显微照片;中图为明场激光扫描的微分干涉显微照片;右图为左中两图的合并图(共定位图)。
图3:对固定的HeLa细胞经核糖核酸酶(RNase)处理后,用(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)对HeLa细胞进行染色,在460-495纳米汞灯辐照下得到的荧光显微照片。其中:左1、左2图:用-20℃甲醇固定;左3、左4图:用多聚甲醛溶液固定。
图4:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)与碘化丙啶(PI)对HeLa、SiHa和H17702细胞进行共染色在汞灯辐照下得到的荧光显微照片。
图5:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)与传统核酸染料Hoechst33342、线粒体荧光探针线粒体红(MTR)对活性H17702细胞进行复染色在汞灯辐照下得到的荧光显微照片。其中:绿光来自(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)(左1),蓝光来自Hoechst33342(左2),红光来自粒体红(MTR)(左3),(左4)为前三张图的叠加图。
具体实施方式
实施例1:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)的合成
将N-甲基-2-甲酰基吡咯与N-羟乙基-4-甲基吡啶溶于甲醇,得淡黄色透明溶液,加3~4滴哌啶,溶液迅速变红色。回流反应4h,有紫红色沉淀析出。冷却,过滤,二氯甲烷洗涤,得紫红色小晶粒,产率90%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.70(d,J=6.9Hz,2H),8.12(d,J=6.9Hz,2H),8.40(d,J=15.9Hz,1H),7.08(d,J=16.0Hz,2H),6.89(dd,J=3.96,1.44Hz,1H),6.22(dd,J=3.84,2.56Hz,1H),5.21(t,J=5.24Hz,1H),4.47(t,J=5.04Hz,2H),3.84(t,J=6.0Hz,2H),3.81(s,3H).13C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):154.23,144.31,130.98,130.11,129.20,122.53,117.94,112.97,110.39,61.99,60.53,34.59.HRMS(m/z):[M-I]+.Calcd for C14H17IN2O,229.13;found,229.14。
实施例2:HeLa,SiHa和H17702细胞培养
将HeLa,SiHa和H17702细胞分别贴壁培养于内含10%胎牛血清培养液中,在37℃,5%CO2的饱和湿度孵箱中培养,每2~3d换液传代1次。
待细胞生长到对数期,接片培养:①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min,酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中,备用;②将100mL细胞瓶中长满的细胞用PBS洗三遍,用1mL0.25%胰酶消化3-5分钟,小心地倒出胰酶,加入新鲜培养液吹打均匀并细胞计数,以培养液的添加量控制细胞密度,使细胞终浓度为1x105,然后接种至内上述含盖玻片的培养皿中,放入5%CO2培养箱中培养,使细胞爬片生长。
待细胞爬片生长并长满盖玻片后,用于实验。
实施例3:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)对HeLa,SiHa和H17702细胞的染色观察
将实施例2制备的分别长满HeLa,SiHa和H17702细胞的盖玻片(爬片)用PBS洗三遍,然后用以培养液稀释的浓度为20μM的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中,分别对各种细胞染色30min。
将染色后的爬片取出,洗去未结合的多余染液,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果见图1、图2。荧光图像显示在细胞质和核仁区有明显的绿光分布,明确提示本发明的探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的RNA。
实施例4:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐荧光探针对HeLa细胞、和经核糖核酸酶(RNase A)处理后的HeLa细胞(RNase A消化实验)的染色观察
固定细胞制备:首先将实施例2制备的长满HeLa细胞的盖玻片(爬片)浸泡于4%多聚甲醛溶液30min,或者用-20°C甲醇固定15min,然后用0.5%Triton X-100室温通透2min,得待染色固定细胞。
取上述两组固定细胞,其中一组中加入25mg/mL DNase-Free RNase(GE)在培养箱中消化2h;然后对两组固定细胞用PBS清洗3遍,并同时都用浓度为20μM的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中孵化染色30min。
将染色后的爬片取出,洗去未结合的多余染液,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在宽场荧光显微镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果见图3,发现经GE处理后的细胞组显微镜下的荧光较对照组(未经GE处理组)减弱,并且荧光仅集中到了细胞核区域,而在核仁和细胞质上基本看不到荧光。由于RNase能水解掉细胞中的RNA,因此,从此角度可以证实并验证本发明的探针能够选择性成像细胞中的RNA。
实施例5:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)与碘化丙啶(PI)对HeLa,SiHa和H17702细胞的共染色观察
将实施例2制备的分别长满HeLa,SiHa和H17702细胞的盖玻片(爬片)用PBS洗三遍,然后用以培养液稀释的浓度为20μM的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中,分别对各种细胞染色30min。然后再用PBS对染色后的各种细胞洗三遍,用以PBS稀释的浓度为0.5μM的PI在CO2培养箱中,分别对各种细胞染色15min。
将染色后的爬片取出,洗去未结合的多余染液,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在荧光显微镜或激光扫描共聚焦镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果见图4,碘化丙啶(PI)是一种传统的成像凋亡或坏死细胞核的发红光的荧光染料,在利用本发明所述荧光探针与碘化丙啶(PI)进行对比试验后,发现凡是PI标记的有红色荧光的细胞核仁没有本发明所述荧光探针发出的与PI荧光有明显区别的绿色荧光(即没有红色荧光的细胞核仁发出明亮的绿色荧光),提示本发明所述荧光探针能选择性的成像活细胞的核仁和RNA。
实施例6:(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐(1c)与传统核酸染料Hoechst、线粒体红(MTR)对H17702细胞的共染色观察
将实施例2制备的长满H17702细胞的盖玻片(爬片)用PBS洗三遍,然后用以培养液稀释的浓度为20μM的(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中,对细胞染色30min。然后再用PBS对染色后的细胞洗三遍,用以PBS稀释的浓度为5μM的Hoechst33342在CO2培养箱中对细胞染色30min。然后再用PBS对染色后的细胞洗三遍,用以PBS稀释的浓度为0.5μM的MTR在CO2培养箱中对细胞染色30min。
将染色后的爬片取出,洗去未结合的多余染液,细胞生长面朝下盖在载玻片上,在荧光显微镜或激光扫描共聚焦镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果见图5,发现本发明所述荧光探针与Hoechst33342、MTR共染色时互不干扰,有良好的复染兼容性。
Claims (1)
1.(E)-1-(2-羟乙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吡咯-2-)乙烯基)吡啶碘盐在标记或显示活细胞内RNA和核仁分布中的应用。
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