CN103725758B - 一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用；通过培养细胞、配制染料溶液、染色、成像，完成使用近红外生物荧光染料将活细胞成像；本发明使用近红外生物荧光染料染色可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底；本发明使用的近红外荧光染料对线粒体或RNA染色具有特异性。

Description

一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用
技术领域
本发明涉及活细胞与成像，提供一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用。
背景技术
随着生命科学研究的快速发展，生物荧光染料在细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学等方面应用越来越广泛，已经成为生命科学研究的重要工具之一。
RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。常用的RNA成像方法有;带有荧光标记的RNA微注射，RNA原位荧光杂交，通过绿色荧光蛋白（GFP）或其衍生物YFP标记与RNA结合的蛋白或是有机染料小分子对RNA进行染色成像。目前商用的用于RNA染色的染料只有SYTO RNASelect一种，且其结构尚未公布。有机小分子荧光染料具有分子体积小，细胞通透性好，光稳定性好等特点。用于DNA染色的有机染料报道很多，但是RNA的却很少，这是由于有机染料对DNA双链结构的选择性要高于RNA的单链结构，所以RNA选择性染料的开发具有重要的应用价值。
线粒体是有氧呼吸产生能量的主要场所，能将细胞中的一些有机物当燃料，使这些与氧结合，经过复杂的过程，转变为二氧化碳和水，同时将有机物中的化学能释放出来，供细胞利用。由于线粒体的作用，生物组织内有机物能在氧的参与下转变成无机物，如二氧化碳和水，并为生物组织和细胞提供进行生命活动所需的能量或ATP。目前线粒体的荧光探针主要有：Mitotracker系列，JC-1,Rhodanmine 123,Rhodanmine 6G,DiOC7(3),Acridne orange-10nonylbromide,DASPMI和DASPEI。
活细胞成像技术的发展有助于我们实时地研究细胞的生命活动，获取更具价值的细胞信息。用于活细胞成像的生物荧光染料很多，但是大部分这些荧光染料的吸收和发射都在400nm-600nm，发射在近红外区域（650nm~900nm）的染料很少。现有的染料在进行染色时，受背景荧光的干扰大。因此，需要对染料和染色过程进行改进，以便减弱背景荧光的干扰，使染色更彻底。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有荧光染料在进行染色时，受背景荧光的干扰大，染色不彻底等。本发明通过细胞培养、配制染料溶液、染色步骤，用近红外生物荧光染料将活细胞成像；本发明染色可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底；本发明使用的一些近红外荧光染料对线粒体或者RNA染色具有特异性。
本发明提供一种近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，应用方法包括以下步骤：
1）细胞培养
将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12~24h；其中，细胞培养液中含相应的培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素；
2）染料溶液的配制
将近红外生物荧光染料用二甲亚砜（DMSO）配成5mM~10mM的染料溶液；
3）染色
直接向原细胞培养液中加入步骤2）得到的染料溶液，摇匀，使近红外生物荧光染料的最终浓度为500nM~5μM，得到原细胞培养液和染料溶液的混合液，在37℃、5%CO2、饱和湿度中孵育细胞10分钟以上，将线粒体或RNA染色；
4）成像
移去步骤3）的混合液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）冲洗细胞2次以上，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37℃、5%CO2、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为640nm；
其中，所述近红外生物荧光染料具有式（I）结构：
式中，Y、Y1分别独立的为O、S或NR11；Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11分别独立的为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立的为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基、芳基或卤素；为阴离子。
本发明可用于各种类型活细胞的染色成像。其中，对各种不同的细胞，可根据现有技术采用其相应的细胞培养基。例如，对Hela细胞为DMEM培养基。对A549细胞为cCoy's 5A培养基。对L929细胞为RPM1640培养基。
根据所需拍摄的细胞状态选择合适的孵育时间。
进一步地，当R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基或卤素时，所述近红外生物荧光染料对RNA染色成像。
进一步地，当R4为芳基时，所述近红外生物荧光染料对线粒体染色成像。
进一步地，所述近红外生物荧光染料中，R1与R3、R1与R13、R2与R3、R2与R13、R7与R6、R7与R10、R8与R6、R8与R10、R1与R2或R7与R8可形成如下Ia-In结构：
其中，R为氢或者低级烷基；Y2为O、S或者NR11。除以上列举的几种外，还有其他形式，例如R2与R13同时R6与R7结合、R1与R2同时R6与R7结合、R1与R2同时R6与R7同时R8与R10结合等等。
进一步地，所述R1、R2、R7、R8、R9、R11的烃基为直链、支链或环状烃基；所述烃基为1-20个碳原子烃基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的醚基中碳原子数为4~20，氧原子数≤8；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的取代烷基为直链或支链；所述取代烷基为苄基、ω-甲酸基取代1-20个碳原子烷基、ω-甲酸盐基取代1-20个碳原子烷基、ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基、ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基、ω-磺酸基取代1-20个碳原子烷基、ω-磺酸盐基取代1-20个碳原子烷基、ω-卤素取代1-20个碳原子烷基、ω-羟基取代1-20个碳原子烷基、ω-氰基取代1-20个碳原子烷基、ω-氨基取代1-20个碳原子烷基、ω-巯基取代1-20个碳原子烷基或ω-马来酰亚胺取代1-20个碳原子烷基；其中，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子烃基酯基、甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基或苄酯基；所述的ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基或2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的酰基为2-6个碳原子烷基酰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的芳基为苯基、低级烷基取代苯基、低级烷氧基取代苯基、卤素取代苯基、硝基取代苯基、甲酸基取代苯基、甲酸盐基取代苯基、甲酸酯基取代苯基、甲酰胺基取代苯基、磺酸基取代苯基、磺酸盐基取代苯基、磺酰氯基取代苯基、羟基取代苯基、氨基取代苯基、胺基取代苯基、氰基取代苯基；其中，所述甲酸酯基取代苯基中酯基为2-20个碳原子烃基酯基、2-20个碳原子取代烷基酯基或苄酯基，所述甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基或2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基，所述胺基取代苯基中的胺基为NR7R8；
所述R3、R4、R5、R6、R10、R12、R13的低级烃基为甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基或己基；
所述R3、R4、R5、R6、R10、R12、R13的低级烷氧基为甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、环丙氧基、烯丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基或己氧基；
所述R3、R4、R5、R6、R10、R12、R13的卤素为氟、氯、溴或碘；
所述为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。
进一步地，所述R1、R2、R7、R8、R9、R11的直链、支链或环状的包含1-20个碳原子的烃基为甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、2-甲基戊基、环己基、庚基、2-甲基己基、辛基、2—甲基庚基、壬基、葵基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中碳原子数为4~20，氧原子数≤8的醚基为CH2CH2OCH2CH3、CH2CH2OCH2CH2OH、CH2CH2(OCH2CH2)2CH2CH3、CH2CH2(OCH2CH2)2CH2CH2OH、CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH3、CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH2OH、CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH3或CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH2OH；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCOOH，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸盐基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCOOM，其中m为1-18，M为平衡电荷的阳离子；
当R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子烃基酯基时，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCOO(CH2)nCH3、（CH2）mCOOC(CH3)3或（CH2）mCOOCH2CH=CH2，其中m为1-18，n为0-18；当R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基时，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCOO(CH2)nCH2COOH、（CH2）mCOO(CH2)nCH2COOM、（CH2）mCOO(CH2)nCH2SO3H或（CH2）mCOO(CH2)nCH2SO3M，其中m为1-18，n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸苄酯基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCOOCH2C6H5，其中m为1-18；
当所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中的甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基时，ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCONH(CH2)nCH3、（CH2）mCON[(CH2)nCH3]2，其中m为1-18，n为0-18；所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中的甲酰胺基为2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基时，ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCONH(CH2)nCH2COOH、（CH2）mCON[(CH2)nCH2COOH]2、（CH2）mCONH(CH2)nCH2COOM、（CH2）mCON[(CH2)nCH2COOM]2、（CH2）mCONH(CH2)nCH2SO3H、（CH2）mCON[(CH2)nCH2SO3H]2、（CH2）mCONH(CH2)nCH2SO3M或（CH2）mCON[(CH2)nCH2SO3M]2，其中m为1-18，n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-磺酸基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mSO3H，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-磺酸盐基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mSO3M，其中m为1-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-卤素取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCl，（CH2）mBr，（CH2）mI，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-羟基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mOH，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-氰基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mCN，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-氨基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mNH2，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-巯基取代1-20个碳原子烷基为（CH2）mSH，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中2-6个碳原子烷基酰基为乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中1-6个碳原子取代苯甲酰基为甲基取代苯甲酰基、乙基取代苯甲酰基、丙基取代苯甲酰基、丁基取代苯甲酰基或叔丁基取代苯甲酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中卤素取代苯甲酰基为氯取代苯甲酰基、溴取代苯甲酰基或碘取代苯甲酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中低级烷基取代苯基为甲基取代苯基、乙基取代苯基、丙基取代苯基、异丙基取代苯基、丁基取代苯基、异丁基取代苯基、戊基取代苯基、叔丁基取代苯基或己基取代苯基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中低级烷氧基取代苯基为甲氧基取代苯基、乙氧基取代苯基、丙氧基取代苯基、丁氧基取代苯基、戊氧基取代苯基、叔丁氧基取代苯基或己氧基取代苯基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中卤素取代苯基为氟取代苯基、氯取代苯基、溴取代苯基或碘取代苯基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的甲酸2-20个碳原子烃基酯基取代苯基为C6H4COO(CH2)nCH3或C6H4COOCH2CH=CH2，其中n为0-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基取代苯基为C6H4COO(CH2)n CH2COOH、C6H4COO(CH2)n CH2COOM、C6H4COO(CH2)nCH2SO3H或C6H4COO(CH2)nCH2SO3M，其中n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的2-40个碳原子烃基甲酰胺基取代苯基为C6H4CONH(CH2)nCH3或C6H4CON[(CH2)nCH3]2，其中n为0-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基取代苯基为C6H4CONH(CH2)n CH2COOH、C6H4CON[(CH2)nCH2COOH]2、C6H4CONH(CH2)n CH2COOM、C6H4CON[(CH2)nCH2COOM]2、C6H4CONH(CH2)nCH2SO3H、C6H4CON[(CH2)nCH2SO3H]2、C6H4CONH(CH2)n CH2SO3M、C6H4CON[(CH2)nCH2SO3M]2，其中n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的胺基取代苯基为C6H4NH(CH2)nCH3、C6H4N[(CH2)nCH3]2、C6H4NH(CH2)nCH2COOH、C6H4N[(CH2)nCH2COOH]2、C6H4NH(CH2)nCH2COOM、C6H4N[(CH2)nCH2COOM]2、C6H4NH(CH2)nCH2SO3H、C6H4N[(CH2)nCH2SO3H]2C6H4NH(CH2)nCH2SO3M、C6H4N[(CH2)nCH2SO3M]2、乙酰基胺基取代苯基、叔丁氧羰基胺基取代苯基、苯甲酰基胺基取代苯基、甲基取代苯甲酰基胺基取代苯基、乙基取代苯甲酰基胺基取代苯基、氯取代苯甲酰基胺基取代苯基、溴取代苯甲酰基胺基取代苯基或马来酰亚胺基取代苯基，其中n为0-18。
具有式（I）结构的所述近红外生物荧光染料的制备方法
一、当Y为O、S或NR11，Y1为O或S，Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11分别独立的为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立的为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基或卤素；为阴离子，化合物（I）的制备方法如下：
将1毫摩尔化合物（II）与1毫摩尔化合物（III）混合在5-20毫升溶剂中形成混合溶液，加入体积占混合溶液0.01-1的浓酸，在加热条件下反应1-8小时，冷却后再加入0.01-1倍体积的质量百分浓度为70%的高氯酸，然后慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析分离得产物I；所述的溶剂是甲醇、乙醇或者乙酸；所述的浓酸是浓硫酸、浓盐酸或者70%高氯酸；所述的加热温度为60-150℃；
所述化合物（II）和（III）的结构式如下：
其中，X’为卤素；Y’为羟基、巯基或者NHR11。
二、当Y为O、S或NR11，Y1为O或S，Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11分别独立的为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立的为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为三氟甲基、氰基或芳基；为阴离子，化合物（I）的制备方法如下：
将物质的量为1:1的化合物（IV）与化合物（V）与四氯乙烷混合；所述化合物（IV）与四氯乙烷的比值为1mol:10L；分批加入五氧化二磷；所述五氧化二磷与化合物（IV）的物质的量的比值为5~10:1；得到混合溶液；在回流条件下反应2-8小时，冷却后加水，萃取；去除氯仿相的溶剂，将所得产物溶于乙醇或甲醇中，加入质量百分浓度为70%的高氯酸，慢慢滴加蒸馏水，析出固体，过滤、真空干燥，柱层析纯化分离得到产物（I）；所述乙醇和高氯酸的体积比为5:1；
所述化合物（IV）和（V）的结构式如下：
其中，Y’为羟基或巯基。
当R4为三氟甲基或氰基时，可任选以上两种制备方法中的一种来制备。
三、当Y为O、S或NR11，Y1为NR11，Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11分别独立的为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立的为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基、芳基或卤素；为阴离子，化合物（I）的制备方法参照专利US6,737,280B1。
本发明的有益效果:
1、本发明首次将这种结构的近红外荧光染料通过非共价作用来定位线粒体或RNA；
2、本发明的染色步骤简单，且可以减少光源对细胞及组织的损伤，降低自发荧光的干扰，染色更彻底；
3、本发明使用的一些近红外荧光染料对线粒体或RNA染色具有特异性；
4、本发明的染料具有有较低的细胞毒性与光毒性，及较好的光稳定性，可用于研究活细胞中RNA或线粒体的动态变化过程。
附图说明
图1为本发明实例1荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图2为本发明实例2荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图3为本发明实例3化合物与RNA作用的荧光图；
图4为本发明实例3化合物与RNA作用的圆二色谱图；
图5为本发明实例3加DNA酶与RNA酶消化并与市售的DNA、RNA染料对比图；
图6为本发明实例3与市售RNA染料SYTO RNASelect的细胞染色效果对比图；
图7为本发明实例3荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图8为本发明实例4荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图9为本发明实例5荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图10为本发明实例6荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图11为本发明实例7荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图12为本发明实例8荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图13为本发明实例9荧光染料将L929细胞染色后的图；
图14为本发明实例10荧光染料将L929细胞染色后的图；
图15为本发明实例11荧光染料将L929细胞染色后的图；
图16为本发明实例12荧光染料将L929细胞染色后的图；
图17为本发明实例13荧光染料将A549细胞染色后的图；
图18为本发明实例14荧光染料将A549细胞染色后的图；
图19为本发明实例15荧光染料将A549细胞染色后的图；
图20为本发明实例16荧光染料将A549细胞染色后的图；
图21为本发明实例17荧光染料将A549细胞染色后的图；
图22为本发明实例18荧光染料将A549细胞染色后的图；
图23为本发明实例19荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图24为本发明实例20荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图25为本发明实例21荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图26为本发明实例22荧光染料将Hela细胞染色后的图；
图27为本发明实例23荧光染料将A549细胞染色后的图；
图28为本发明实例23与市售线粒体染料对比图；
图29为本发明实例24荧光染料将A549细胞染色后的图；
图30为本发明实例25荧光染料将A549细胞染色后的图。
具体实施方式
下面结合实施方式和附图对本发明进行进一步说明。
一种近红外生物荧光染料在活细胞成像中的应用，应用方法包括以下步骤：
1）细胞培养
将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12~24h；其中，细胞培养液中含相应的培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素；
2）染料溶液的配制
将近红外生物荧光染料用二甲亚砜（DMSO）配成5mM~10mM的染料溶液；
3）染色
直接向原细胞培养液中加入步骤2）得到的染料溶液，摇匀，使近红外生物荧光染料的最终浓度为500nM~5μM，得到原细胞培养液和染料溶液的混合液，在37℃、5%CO2、饱和湿度中孵育细胞10分钟以上，将线粒体或RNA染色；
4）成像
移去步骤3）的混合液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）冲洗细胞2次以上，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37℃、5%CO2、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为640nm；
其中，所述近红外生物荧光染料具有式（I）结构：
式中，Y、Y1分别独立的为O、S或NR11；Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11分别独立的为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立的为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基、芳基或卤素；为阴离子。
实例1
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图1中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例2
使用的近红外生物荧光染料Hela细胞，荧光染料结构为：
图2中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例3
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图3为实例3化合物与RNA作用的荧光图；可以看出，随着RNA的加入（200μg/mL），实例3的荧光增强。
图4为实例3化合物与RNA作用的圆二色谱图；RNA溶液中随着化合物浓度的增大圆二色谱的变化情况，由此可以推出RNA与实例3结构的作用模式为半嵌入。
图5为实例3加DNA酶与RNA酶消化并与市售的DNA、RNA染料对比图，证明实例3中化合物进入细胞核中所染的为RNA。（control是用作对照，就是空白，CR是本发明的染料，实例3）
图6为实例3与市售RNA染料对比染色效果图，从图中可以明显看出本发明的红色可以覆盖住市售染料的绿色，说明本发明的染料具有比RNASelect染料更清晰、选择性更强的染色效果（图中，6A为本发明，6B为RNASelect染色，6C为叠加图）。
图7中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例4
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图8中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例5
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图9中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例6
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图10中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例7
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图11中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例8
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图12中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例9
使用近红外生物荧光染料染色L929细胞，荧光染料结构为：
图13中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例10
使用近红外生物荧光染料染色L929细胞，荧光染料结构为：
图14中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例11
使用近红外生物荧光染料染色L929细胞，荧光染料结构为：
图15中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例12
使用近红外生物荧光染料染色L929细胞，荧光染料结构为：
图16中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例13
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图17中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例14
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图18中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例15
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图19中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例16
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图20中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例17
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图21中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例18
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图22中所示，可以看出染色位置：细胞核内为核仁中RNA。
实例19
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图23中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
实例20
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图24中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
实例21
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图25中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
实例22
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图26中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
实例23
使用近红外生物荧光染料染色Hela细胞，荧光染料结构为：
图27中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
图28为实例23与市售线粒体染料对比图，证明实例23中化合物进入细胞质中所染的为线粒体，且实例23的染料染色效果更强（市售染料为绿色，本发明染料为红色，叠加后绿色被红色完全覆盖）。
实例24
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图29中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
实例25
使用近红外生物荧光染料染色A549细胞，荧光染料结构为：
图30中所示，可以看出染色位置：细胞质内为线粒体。
实例26
使用近红外生物荧光染料染色细胞，荧光染料结构（I）中，Y和Y1为S；Z为NR7R8；R1为CH2CH2OCH2CH3、R2为CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH2OH、R3为氟、R4为叔戊氧基、R5为三氟甲氧基、R6为溴、R7为（CH2）18COOH、R8为（CH2）5COOM、R10为烯丙基、R12为环丙氧基、R13为异丙基。
实例27
使用近红外生物荧光染料染色细胞，荧光染料结构（I）中，Y和Y1为S；Z为NR7R8；R1为（CH2）2COO(CH2)2CH3、R2为（CH2）8COOCH2CH=CH2、R3为丙氧基、R4为（CH2）2COO(CH2)4CH2SO3H、R5为溴、R6为溴、R7为（CH2）3CONH(CH2)6CH3、R8为CH2CONHCH2CH2COOH、R10为己氧基、R12为乙氧基、R13为碘。
实例28
使用近红外生物荧光染料染色细胞，荧光染料结构（I）中，Y和Y1为NR11；Z为NR7R8；R1为CH2CONH(CH2)6CH2SO3H、R2为（CH2）5SO3M、R3为氯、R4为（CH2）6OH、R5为烯丙氧基、R6为戊氧基、R7为CH2CN、R8为（CH2）3NH2、R10为碘、R11为叔丁酰基、R12为氯、R13为氯。
实例29
使用近红外生物荧光染料染色细胞，荧光染料结构（I）中，Y和Y1为NR11；Z为OR9；R1为CH2SH、R2为乙基取代苯甲酰基、R3为甲氧基、R4为溴取代苯甲酰基、R5为丁氧基、R6为氯、R9为C6H4COOCH2CH=CH2、R10为氯、R11为C6H4COOCH2CH3、R12为戊基、R13为三氟甲基。
实例30
使用近红外生物荧光染料染色细胞，荧光染料结构（I）中，Y和Y1为O；Z为OR9；R1为、R2为、R3为2-甲基己基、R4为C6H4CON[CH2CH3]2、R5为丙基、R6为丁基、R9为C6H4CON[(CH2)3CH2SO3H]2、R10为氢、R12为氰基、R13为氯。
实例31
使用近红外生物荧光染料染色细胞，荧光染料结构（I）中，Y和Y1为NR11；Z为OR9；R1C6H4CONHCH2COOH、R2为C6H4NHCH2CH2COOH、R3为甲氧基、R4为乙基取代苯甲酰基胺基取代苯基、R5为丁基、R6为氯、R9为C6H4NHCH2SO3H、R10为氯、R11为C6H4NHCH2CH3、R12为戊基、R13为三氟甲基。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，并非对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.一种近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：
1)细胞培养
将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12～24h；其中，细胞培养液中含相应的培养基、10％体积百分数的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素；
2)染料溶液的配制
将近红外生物荧光染料用二甲亚砜配成5mM～10mM的染料溶液；
3)染色
向原细胞培养液中加入步骤2)得到的染料溶液，摇匀，使近红外生物荧光染料的最终浓度为500nM～5μM，得到原细胞培养液和染料溶液的混合液，在37℃、5％CO2、饱和湿度中孵育细胞10分钟以上，将线粒体或RNA染色；
4)成像
移去步骤3)的混合液，用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞，之后加入新鲜的细胞培养液，在活细胞工作站中保持37℃、5％CO2、饱和湿度，用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像，激发波长为640nm；
其中，所述近红外生物荧光染料具有式(I)结构：
式中，Y、Y1分别独立的为O、S或NR11；Z为NR7R8或OR9；R1、R2、R7、R8、R9、R11分别独立的为氢、烃基、醚基、取代烷基、酰基或芳基；R3、R5、R6、R10、R12、R13分别独立的为氢、低级烃基、低级烷氧基、氰基或卤素；R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基、芳基或卤素；X为阴离子；
当R4为氢、低级烃基、醚基、低级烷氧基、取代烷基、酰基、氰基或卤素时，所述近红外生物荧光染料对RNA染色成像；
当R4为芳基时，所述近红外生物荧光染料对线粒体染色成像。
2.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，所述近红外生物荧光染料中，R1与R3、R1与R13、R2与R3、R2与R13、R7与R6、R7与R10、R8与R6、R8与R10、R1与R2或R7与R8可形成如下Ia-In结构：
其中，R为氢或者低级烷基；Y2为O、S或者NR11。
3.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，所述R1、R2、R7、R8、R9、R11的烃基为直链、支链或环状烃基；所述烃基为1-20个碳原子烃基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的醚基中碳原子数为4～20，氧原子数≤8；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的取代烷基为直链或支链；所述取代烷基为苄基、ω-甲酸基取代1-20个碳原子烷基、ω-甲酸盐基取代1-20个碳原子烷基、ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基、ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基、ω-磺酸基取代1-20个碳原子烷基、ω-磺酸盐基取代1-20个碳原子烷基、ω-卤素取代1-20个碳原子烷基、ω-羟基取代1-20个碳原子烷基、ω-氰基取代1-20个碳原子烷基、ω-氨基取代1-20个碳原子烷基、ω-巯基取代1-20个碳原子烷基或ω-马来酰亚胺取代1-20个碳原子烷基；其中，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子烃基酯基、甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基或苄酯基；所述的ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基或2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的酰基为2-6个碳原子烷基酰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、1-6个碳原子取代苯甲酰基或卤素取代苯甲酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11的芳基为苯基、低级烷基取代苯基、低级烷氧基取代苯基、卤素取代苯基、硝基取代苯基、甲酸基取代苯基、甲酸盐基取代苯基、甲酸酯基取代苯基、甲酰胺基取代苯基、磺酸基取代苯基、磺酸盐基取代苯基、磺酰氯基取代苯基、羟基取代苯基、氨基取代苯基、胺基取代苯基、氰基取代苯基；其中，所述甲酸酯基取代苯基中酯基为2-20个碳原子烃基酯基、2-20个碳原子取代烷基酯基或苄酯基，所述甲酰胺基取代苯基中甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基或2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基，所述胺基取代苯基中的胺基为NR7R8；
所述R3、R4、R5、R6、R10、R12、R13的低级烃基为甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基或己基；
所述R3、R4、R5、R6、R10、R12、R13的低级烷氧基为甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、环丙氧基、烯丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、叔戊氧基或己氧基；
所述R3、R4、R5、R6、R10、R12、R13的卤素为氟、氯、溴或碘；
所述X为平衡电荷的任意有机或无机阴离子。
4.根据权利要求1所述的，近红外生物荧光染料在活细胞成像的应用，其特征在于，所述R1、R2、R7、R8、R9、R11的直链、支链或环状的包含1-20个碳原子的烃基为甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、己基、2-甲基戊基、环己基、庚基、2-甲基己基、辛基、2—甲基庚基、壬基、葵基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中碳原子数为4～20，氧原子数≤8的醚基为CH2CH2OCH2CH3、CH2CH2OCH2CH2OH、CH2CH2(OCH2CH2)2CH2CH3、CH2CH2(OCH2CH2)2CH2CH2OH、CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH3、CH2CH2(OCH2CH2)3CH2CH2OH、CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH3或CH2CH2(OCH2CH2)4CH2CH2OH；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOOH，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸盐基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOOM，其中m为1-18，M为平衡电荷的阳离子；
当R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子烃基酯基时，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOO(CH2)nCH3、(CH2)mCOOC(CH3)3或(CH2)mCOOCH2CH＝CH2，其中m为1-18，n为0-18；当R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基中甲酸酯基为甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基时，所述ω-甲酸酯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOO(CH2)n CH2COOH、(CH2)mCOO(CH2)n CH2COOM、(CH2)mCOO(CH2)nCH2SO3H或(CH2)mCOO(CH2)nCH2SO3M，其中m为1-18，n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-甲酸苄酯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCOOCH2C6H5，其中m为1-18；
当所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中的甲酰胺基为2-40个碳原子烃基甲酰胺基时，ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCONH(CH2)nCH3、(CH2)mCON[(CH2)nCH3]2，其中m为1-18，n为0-18；所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基中的甲酰胺基为2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基时，ω-甲酰胺基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCONH(CH2)n CH2COOH、(CH2)mCON[(CH2)nCH2COOH]2、(CH2)mCONH(CH2)n CH2COOM、(CH2)mCON[(CH2)nCH2COOM]2、(CH2)mCONH(CH2)nCH2SO3H、(CH2)mCON[(CH2)nCH2SO3H]2、(CH2)mCONH(CH2)nCH2SO3M或(CH2)mCON[(CH2)nCH2SO3M]2，其中m为1-18，n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-磺酸基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mSO3H，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-磺酸盐基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mSO3M，其中m为1-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-卤素取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCl，(CH2)mBr，(CH2)mI，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-羟基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mOH，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-氰基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mCN，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-氨基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mNH2，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的ω-巯基取代1-20个碳原子烷基为(CH2)mSH，其中m为1-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中2-6个碳原子烷基酰基为乙酰基、丙酰基、丁酰基或叔丁酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中1-6个碳原子取代苯甲酰基为甲基取代苯甲酰基、乙基取代苯甲酰基、丙基取代苯甲酰基、丁基取代苯甲酰基或叔丁基取代苯甲酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中卤素取代苯甲酰基为氯取代苯甲酰基、溴取代苯甲酰基或碘取代苯甲酰基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中低级烷基取代苯基为甲基取代苯基、乙基取代苯基、丙基取代苯基、异丙基取代苯基、丁基取代苯基、异丁基取代苯基、戊基取代苯基、叔丁基取代苯基或己基取代苯基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中低级烷氧基取代苯基为甲氧基取代苯基、乙氧基取代苯基、丙氧基取代苯基、丁氧基取代苯基、戊氧基取代苯基、叔丁氧基取代苯基或己氧基取代苯基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中卤素取代苯基为氟取代苯基、氯取代苯基、溴取代苯基或碘取代苯基；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的甲酸2-20个碳原子烃基酯基取代苯基为C6H4COO(CH2)nCH3或C6H4COOCH2CH＝CH2，其中n为0-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的甲酸2-20个碳原子取代烷基酯基取代苯基为C6H4COO(CH2)n CH2COOH、C6H4COO(CH2)n CH2COOM、C6H4COO(CH2)nCH2SO3H或C6H4COO(CH2)nCH2SO3M，其中n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的2-40个碳原子烃基甲酰胺基取代苯基为C6H4CONH(CH2)nCH3或C6H4CON[(CH2)nCH3]2，其中n为0-18；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的2-40个碳原子取代烷基甲酰胺基取代苯基为C6H4CONH(CH2)n CH2COOH、C6H4CON[(CH2)nCH2COOH]2、C6H4CONH(CH2)n CH2COOM、C6H4CON[(CH2)nCH2COOM]2、C6H4CONH(CH2)nCH2SO3H、C6H4CON[(CH2)nCH2SO3H]2、C6H4CONH(CH2)n CH2SO3M、C6H4CON[(CH2)n CH2SO3M]2，其中n为0-18，M为平衡电荷的阳离子；
所述R1、R2、R4、R7、R8、R9、R11中的胺基取代苯基为C6H4NH(CH2)nCH3、C6H4N[(CH2)nCH3]2、C6H4NH(CH2)nCH2COOH、C6H4N[(CH2)nCH2COOH]2、C6H4NH(CH2)nCH2COOM、C6H4N[(CH2)nCH2COOM]2、C6H4NH(CH2)nCH2SO3H、C6H4N[(CH2)nCH2SO3H]2C6H4NH(CH2)nCH2SO3M、C6H4N[(CH2)nCH2SO3M]2、乙酰基胺基取代苯基、叔丁氧羰基胺基取代苯基、苯甲酰基胺基取代苯基、甲基取代苯甲酰基胺基取代苯基、乙基取代苯甲酰基胺基取代苯基、氯取代苯甲酰基胺基取代苯基、溴取代苯甲酰基胺基取代苯基或马来酰亚胺基取代苯基，其中n为0-18。
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