CN111892588A - 一种吲哚-苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种吲哚‑苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用，所述吲哚‑苯并噻唑衍生物为式(Ⅰ)所示的化合物。本发明通过改造通用型荧光探针噻唑橙的结构，得到吲哚‑苯并噻唑衍生物，该吲哚‑苯并噻唑衍生物具有较大的电子共轭体系和平面，分子内的电荷转移效应可以影响分子的荧光发射强度，作为荧光探针使用，在体外实验中能够特异性识别线粒体G‑四链体DNA，细胞实验中则能够通过对细胞中的线粒体G四链体DNA进行染色，进而达到检测线粒体和线粒体G‑四链体DNA的目的；并且本发明提供的吲哚‑苯并噻唑衍生物具有荧光强度高、特异性强的优点。

Description

一种吲哚-苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明具体涉及一种吲哚-苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
核酸不但是一切生物细胞的基本成分，还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起重要作用。核酸大分子分为两类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的核酸二级结构，在人类基因组中广泛存在于富含鸟嘌呤区域，包括染色体端粒末端、启动子区域以及线粒体DNA。研究表明，G-四链体的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用，比如信号传导，细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。
线粒体是细胞中的重要细胞器，几乎存在于每一类型的细胞中，作为细胞中的能量工厂，线粒体能够产生机体正常活动所需要的能量和信号，当线粒体无法正常发挥作用时就会诱发机体产生多种疾病，同时，线粒体还控制着多种细胞死亡机制，并在癌症中扮演者复杂的角色，但其作用机制至今还没有阐明。线粒体DNA是双链环状的结构，外面那条链富含鸟嘌呤，称为重链，易形成G-四链体，内链富含胞嘧啶，称为轻链。研究表明，线粒体中钾离子浓度达到150mM，同时通过G4-hunter，线粒体DNA序列中可形成G-四链体的片段很多，这都有利于线粒体DNA形成G-四链体的结构。由于缺乏可靠的检测手段，线粒体G-四链体与生命活动的关系尚未被探索清楚，线粒体G-四链体在体内的动态折叠过程也尚未明确。鉴于线粒体及线粒体G-四链体DNA具有以上的重要性，探索新型的方法来检测线粒体和线粒体G-四链体DNA显得尤为重要，而荧光探针作为一种可靠的检测手段，近年来越来越受到关注。因此设计和开发靶向线粒体和线粒体G-四链体DNA的荧光探针是一种检测线粒体和线粒体G-四链体DNA的可靠手段。
随着生物技术的发展，以往通过同位素效应来进行DNA分子测序的方法已经无法满足要求；而荧光标记作为一种具有检测速度快，重复性好，进样量少，无辐射等优点的标记技术受到广泛重视，并取得迅速发展。噻唑橙(TO)是一种通用型核酸染料，其优点是对双链DNA(ssDNA)以及G-四链体DNA都有很好的染色效果，并且荧光响应强，缺点是特异性差，不能特异性地区分ssDNA以及G4-DNA，这限制了噻唑橙的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种吲哚-苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用，本发明通过对噻唑橙结构的改造，得到吲哚-苯并噻唑衍生物，该吲哚-苯并噻唑衍生物作为荧光探针使用，能够特异性结合线粒体G-四链体DNA，该吲哚-苯并噻唑衍生物通过靶向线粒体G-四链体DNA，进而达到检测线粒体和线粒体G-四链体DNA的目的。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种吲哚-苯并噻唑衍生物，所述吲哚-苯并噻唑衍生物为式(Ⅰ)所示的化合物，所述式(Ⅰ)所示的化合物的结构式如下：
Figure BDA0002582085160000021
其中，R1为H、苯环、卤素、羟基、C1～C6的烷氧基、C2～C5的亚胺基或C1～C6的烷基；R2、R3分别独自为C1～C6的烷基。
优选地，R1为苯环，R2，R3均为-CH3，所述吲哚-苯并噻唑衍生物为式(Ⅱ)所示的化合物，所述式(Ⅱ)所示的化合物的结构式如下：
Figure BDA0002582085160000022
优选地，R1为H，R2，R3均为-CH3，所述吲哚-苯并噻唑衍生物为式(Ⅲ)所示的化合物，所述式(Ⅲ)所示的化合物的结构式如下：
Figure BDA0002582085160000031
本发明提供了上述所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将2-甲硫基苯并噻唑和碘甲烷溶于第一有机溶剂后反应，反应结束后加入乙酸乙酯析出固体，收集析出的固体，得到式(Ⅴ)所示的化合物；
(2)将式(Ⅵ)所示的化合物和碘甲烷溶于第二有机溶剂后反应，反应结束后加入乙酸乙酯析出固体，收集析出的固体，得到式(Ⅶ)所示的化合物；
(3)将步骤(1)中式(Ⅴ)所示的化合物和步骤(2)中式(Ⅶ)所示的化合物溶解于第三有机溶剂中，在催化剂的存在下反应，反应结束后加入乙酸乙酯析出固体，收集析出的固体后进行重结晶，得到式(Ⅰ)所示的化合物；
所述式(Ⅴ)所示的化合物的结构式如下：
Figure BDA0002582085160000032
所述式(Ⅵ)所示的化合物的结构式如下：
Figure BDA0002582085160000033
所述式(Ⅶ)所示的化合物的结构式如下：
Figure BDA0002582085160000041
其中，R1为H、苯环、卤素、羟基、C1～C6的烷氧基、C2～C5的亚胺基或C1～C6的烷基；R2、R3分别独自为C1～C6的烷基。
优选地，所述步骤(1)中反应温度为80～110℃，反应时间为8～15h；所述步骤(2)中反应温度为80～110℃，反应时间为8～15h；所述步骤(3)中反应温度为70～90℃，反应时间为8～15h。更优选地，所述步骤(1)中反应温度为90℃，反应时间为8h；所述步骤(2)中反应温度为90℃，反应时间为8h；所述步骤(3)中反应温度为75℃，反应时间为8h。
优选地，所述步骤(1)中2-甲硫基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1:1.2-1:3；所述步骤(2)中式(Ⅵ)所示的化合物和碘甲烷的摩尔比为1:1.2-1:3；更优选地，所述步骤(1)中2-甲硫基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1:2；所述步骤(2)中式(Ⅵ)所示的化合物和碘甲烷的摩尔比为1:2。
优选地，所述步骤(3)中式(Ⅴ)所示的化合物和式(Ⅶ)所示的化合物的摩尔比为1:1-2:1；更优选地，所述步骤(3)中式(Ⅴ)所示的化合物和式(Ⅶ)所示的化合物的摩尔比为1:1。
优选地，所述步骤(3)中催化剂与式(Ⅴ)所示的化合物的摩尔比为1:1-1:3；更优选地，所述步骤(3)中催化剂与式(Ⅴ)所示的化合物的摩尔比为1:3。
优选地，所述步骤(1)中第一有机溶剂为乙腈、环丁砜、甲苯中的至少一种；所述步骤(2)中第二有机溶剂为乙腈、环丁砜、甲苯中的至少一种；所述步骤(3)中第三有机溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺中的至少一种；所述步骤(3)中催化剂为三乙胺。
本发明提供了上述所述的吲哚-苯并噻唑衍生物作为荧光探针在体外或者细胞成像中检测线粒体或者线粒体G-四链体DNA的应用。
有益效果：
噻唑橙是一类通用型荧光探针，本发明通过改造其结构，得到吲哚-苯并噻唑衍生物，该吲哚-苯并噻唑衍生物具有较大的电子共轭体系和平面，分子内的电荷转移效应可以影响分子的荧光发射强度，作为荧光探针使用，在体外实验中能够特异性识别线粒体G-四链体DNA，细胞实验中则能够通过对细胞中的线粒体G四链体DNA进行染色，进而达到检测线粒体和线粒体G-四链体DNA的目的；并且本发明提供的吲哚-苯并噻唑衍生物具有荧光强度高、特异性强的优点。
附图说明
图1为化合物BYB的氢谱。
图2为化合物BYB的高分辨质谱。
图3为化合物YB的氢谱。
图4为化合物YB的高分辨质谱。
图5为化合物BYB滴定不同类型核酸的荧光柱状图。
图6为化合物YB滴定不同类型核酸的荧光柱状图。
图7为化合物BYB在脑胶质瘤细胞(U87)成像实验图。
图8为化合物BYB在人前列腺癌细胞(PC3)成像实验图。
图9为化合物BYB在脑胶质瘤细胞(U87)和线粒体特异性染料Mito-blue共定位成像实验图。
图10为化合物BYB在脑胶质瘤细胞(U87)中DNase酶解成像实验图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：式(Ⅴ)所示化合物的合成
称取1.0g(1.103mM)的2-甲硫基苯并噻唑(Ⅳ)置于防爆瓶中，8mL乙腈作为溶剂，超声振荡使两者混合均匀；通风橱条件下加入两倍摩尔量(2.206mM)的碘甲烷，将反应体系置于油浴锅中并打开磁力搅拌，反应温度为90℃，反应时间为8h；待反应结束后将反应体系冷却至室温后，加10mL乙酸乙酯充分振荡，静置15min，析出固体，真空过滤，并用5mL乙酸乙酯冲洗滤饼，烘干得到1.07g白色固体(Ⅴ)，薄板层析显示无副产物，粗产率为60％。反应方程式如下：
Figure BDA0002582085160000061
实施例2：式(Ⅸ)所示化合物的合成
称取0.2g(0.956mM)的1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚(Ⅷ)置于防爆瓶中，2mL乙腈作为溶剂，超声3min使两者混合均匀，在风橱条件下加入两倍摩尔量(1.912mM)的碘甲烷，将反应体系置于由于锅中并打开磁力搅拌，反应温度为90℃，反应时间为8h；待反应结束后将反应体系冷却至室温后，加5mL乙酸乙酯充分振荡，静置15min，析出固体，真空过滤，并用3mL乙酸乙酯冲洗滤饼，烘干得到0.29g淡黄色固体(Ⅸ)，薄板层析显示无副产物，粗产率为86％。反应方程式如下：
Figure BDA0002582085160000062
实施例3：式(Ⅺ)所示化合物的合成
称取0.2g(1.240mM)的2,3,3-三甲基-3H-吲哚(Ⅹ)置于防爆瓶中，2mL乙腈作为溶剂，超声3min使两者混合均匀，在通风橱条件下加入两倍摩尔量(2.48mM)的碘甲烷，将反应体系置于由于锅中并打开磁力搅拌，反应温度为90℃，反应时间为8h；待反应结束后将反应体系冷却至室温后，加5mL乙酸乙酯充分振荡，静置15min，析出固体，真空过滤，并用3mL乙酸乙酯冲洗滤饼，烘干得到0.26g粉红色固体(Ⅺ)，薄板层析显示无副产物，粗产率为70％。反应方程式如下：
Figure BDA0002582085160000071
实施例4：化合物BYB(Ⅱ)的合成
称取和0.2g(0.618mM)式(Ⅴ)所示化合物和0.217g(0.618mM)式(Ⅸ)所示化合物于防爆瓶中，加入30uL(0.206mM)三乙胺(TEA)和3ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解，超声3min使之混合均匀，将反应体系置于油浴锅中并打开磁力搅拌，反应温度为75℃，反应时间为8h；待反应结束后将反应体系冷却至室温后，加入5mL乙酸乙酯充分振荡，静置15min，析出固体，真空过滤，并用3mL乙酸乙酯冲洗滤饼，将得到的固体进行重结晶，得到0.21g红棕色固体(Ⅱ)，粗产率为74％。氢谱数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.24(d,J＝8.5Hz,1H),8.17(d,J＝7.9Hz,1H),8.10(dd,J＝15.0,8.5Hz,2H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.71(ddd,J＝20.1,15.2,8.2Hz,3H),7.59–7.49(m,2H),6.21(s,1H),4.06(s,3H),3.72(s,3H),1.92(s,6H).高分辨质谱数据：371.15718[M+H]+。反应方程式如下：
Figure BDA0002582085160000072
实施例5：化合物YB(Ⅲ)的合成
称取0.2g(0.618mM)式(Ⅴ)所示化合物和0.186g(0.618mM)式(Ⅺ)所示化合物于防爆瓶中，加入30uL(0.206mM)三乙胺(TEA)和3ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解，超声3min使之混合均匀，将反应体系置于油浴锅中加热并打开磁力搅拌，反应温度为75℃，反应8h。待反应结束后将反应体系冷却至室温后，加5mL乙酸乙酯充分振荡，静置15min，析出固体，真空过滤，并用3mL乙酸乙酯冲洗滤饼，将得到的固体进行重结晶，得到0.23g红色固体(Ⅲ)，粗产率为77％。氢谱数据为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.17(d,J＝7.4Hz,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.74–7.68(m,1H),7.60–7.54(m,2H),7.42(dt,J＝11.1,7.0Hz,2H),7.26(td,J＝7.3,1.3Hz,1H),6.08(s,1H),4.05(s,3H),3.60(s,3H),1.69(s,6H).高分辨质谱为：321.14168[M+H]+。反应方程式如下：
Figure BDA0002582085160000081
实施例6：化合物BYB与化合物YB荧光探针对不同核酸选择性的荧光光谱实验
将本发明制备的化合物BYB与化合物YB分别稀释成0.25μM的浓度，再加入不同种类的核酸用荧光分光光度计(狭缝宽度＝10，扫描速度＝200nm，化合物BYB：Ex＝457nm；化合物YB：Ex＝434nm)测出其各自的荧光强度，图5、图6分别为化合物BYB与化合物YB两种荧光探针滴定RNA、dt21、4at、mt9438、mt714、mt377、mt10252、mt8095、mt12086、mt6363、mt1015、mt16250等16种不同类型核酸(如表1)的荧光数据的柱状图，从图5、图6可以看出，在体外条件下，将TO经过改造获得的化合物BYB与YB，在体外实验中对线粒体G-四链体DNA的选择性大大提高，具有很好的核酸区分性，尤其是化合物BYB。
表1核酸序列
Figure BDA0002582085160000082
Figure BDA0002582085160000091
实施例10：化合物BYB细胞成像实验
将脑胶质瘤细胞(U87)细胞和人前列腺癌细胞(PC3)分别接种在6孔板中的细胞培养液，使细胞的密度约为5000个/mL，然后在37℃、5％CO2环境下培养70h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×PBS洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5mL常温避光放置5min。弃去上步6孔板中的溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1mL 5uM的化合物BYB然后放置30min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入5uM的DAPI溶液1mL并37℃放置5min，然后再用预冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min，最后在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况。
将脑胶质瘤细胞(U87)细胞接种在6孔板中的细胞培养液，使细胞的密度约为5000个/mL，然后在37℃、5％CO2环境下培养70h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用1×PBS洗3次，然后再加入1mL 5uM的化合物BYB，其中BYB溶解于DMEM完全培养基，在37℃、5％CO2环境下培养15min。弃去上步6孔板中的溶液，用1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1mL 5uM的线粒体染料Mito-blue，线粒体染料Mito-blue溶解于DMEM完全培养基，在37℃、5％CO2环境下培养15min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用1×PBS洗3次，每次5分钟，最后在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况。
将脑胶质瘤细胞(U87)细胞接种在6孔板中的细胞培养液，使细胞的密度约为5000个/mL，然后在37℃、5％CO2环境下培养70h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×PBS洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5mL常温避光放置5min。弃去上步6孔板中的溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1mL 5uM的化合物BYB然后放置30min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入5uM的DAPI溶液1mL并37℃放置5min，然后再用预冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。弃去上步6孔板中的DAPI溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入DAase溶液1mL并37℃放置1h。弃去上步6孔板中的溶液，用1×PBS洗3次，每次5分钟，最后在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况最后在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况。
图7和图8为化合物BYB分别在U87癌细胞和PC3癌细胞中与细胞核染料DAPI复染，通过图7和图8可知，该化合物BYB作为荧光探针作用于细胞质内。
图9为化合物BYB在U87癌细胞中与线粒体特异性染料Mito-blue复染，通过图9可知，化合物BYB的染色位置与Mito-blue高度重叠，证明了染料染的位置为细胞质中的线粒体。
图10为化合物BYB在U87癌细胞中与细胞核染料DAPI复染，再经过DNase酶解的结果，通过图10，当加入DNase酶解之后，细胞的荧光消失了，这证明了化合物BYB染色的是DNA。
综上图7-图10的结果，可以得出化合物BYB染的位置为细胞质中的线粒体G-四链体DNA。因此该化合物BYB作为荧光探针可以通过对线粒体G-四链体DNA进行染色，达到检测线粒体和线粒体G-四链体DNA的目的。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广东工业大学
<120> 一种吲哚-苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt tttttttttt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 3
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
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Claims (10)

1.一种吲哚-苯并噻唑衍生物，其特征在于，所述吲哚-苯并噻唑衍生物为式(Ⅰ)所示的化合物，所述式(Ⅰ)所示的化合物的结构式如下：
Figure FDA0002582085150000011
其中，R1为H、苯环、卤素、羟基、C1～C6的烷氧基、C2～C5的亚胺基或C1～C6的烷基；R2、R3分别独自为C1～C6的烷基。
2.根据权利要求1所述的吲哚-苯并噻唑衍生物，其特征在于，R1为苯环，R2，R3均为-CH3，所述吲哚-苯并噻唑衍生物为式(Ⅱ)所示的化合物，所述式(Ⅱ)所示的化合物的结构式如下：
Figure FDA0002582085150000012
3.根据权利要求1所述的吲哚-苯并噻唑衍生物，其特征在于，R1为H，R2，R3均为-CH3，所述吲哚-苯并噻唑衍生物为式(Ⅲ)所示的化合物，所述式(Ⅲ)所示的化合物的结构式如下：
Figure FDA0002582085150000013
4.一种如权利要求1-3任一所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将2-甲硫基苯并噻唑和碘甲烷溶于第一有机溶剂后反应，反应结束后加入乙酸乙酯析出固体，收集析出的固体，得到式(Ⅴ)所示的化合物；
(2)将式(Ⅵ)所示的化合物和碘甲烷溶于第二有机溶剂后反应，反应结束后加入乙酸乙酯析出固体，收集析出的固体，得到式(Ⅶ)所示的化合物；
(3)将步骤(1)中式(Ⅴ)所示的化合物和步骤(2)中式(Ⅶ)所示的化合物溶解于第三有机溶剂中，在催化剂的存在下反应，反应结束后加入乙酸乙酯析出固体，收集析出的固体后进行重结晶，得到式(Ⅰ)所示的化合物；
所述式(Ⅴ)所示的化合物的结构式如下：
Figure FDA0002582085150000021
所述式(Ⅵ)所示的化合物的结构式如下：
Figure FDA0002582085150000022
所述式(Ⅶ)所示的化合物的结构式如下：
Figure FDA0002582085150000023
其中，R1为H、苯环、卤素、羟基、C1～C6的烷氧基、C2～C5的亚胺基或C1～C6的烷基；R2、R3分别独自为C1～C6的烷基。
5.根据权利要求4所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应温度为80～110℃，反应时间为8～15h；所述步骤(2)中反应温度为80～110℃，反应时间为8～15h；所述步骤(3)中反应温度为70～90℃，反应时间为8～15h。
6.根据权利要求4所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中2-甲硫基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1:1.2-1:3；所述步骤(2)中式(Ⅵ)所示的化合物和碘甲烷的摩尔比为1:1.2-1:3；优选地，所述步骤(1)中2-甲硫基苯并噻唑和碘甲烷的摩尔比为1:2；所述步骤(2)中式(Ⅵ)所示的化合物和碘甲烷的摩尔比为1:2。
7.根据权利要求4所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中式(Ⅴ)所示的化合物和式(Ⅶ)所示的化合物的摩尔比为1:1-2:1；优选地，所述步骤(3)中式(Ⅴ)所示的化合物和式(Ⅶ)所示的化合物的摩尔比为1:1。
8.根据权利要求4所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中催化剂与式(Ⅴ)所示的化合物的摩尔比为1:1-1:3；优选地，所述步骤(3)中催化剂与式(Ⅴ)所示的化合物的摩尔比为1:3。
9.根据权利要求4所述的吲哚-苯并噻唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中第一有机溶剂为乙腈、环丁砜、甲苯中的至少一种；所述步骤(2)中第二有机溶剂为乙腈、环丁砜、甲苯中的至少一种；所述步骤(3)中第三有机溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺中的至少一种；所述步骤(3)中催化剂为三乙胺、哌啶、4-甲基哌啶、吡啶中的一种。
10.根据权利要求1～3任一所述的吲哚-苯并噻唑衍生物作为荧光探针在体外或者细胞成像中检测线粒体或者线粒体G-四链体DNA的应用。
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