CN104650609A

CN104650609A - 噻唑橙衍生物及其制备方法和作为双螺旋核酸荧光分子探针的应用

Info

Publication number: CN104650609A
Application number: CN201310595094.7A
Authority: CN
Inventors: 杨鹏; 周雪; 陈俭辉; 简勇; 李刚; 邓拓
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2033-11-22
Also published as: CN104650609B

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及噻唑橙衍生物及其制备方法和作为双螺旋核酸荧光分子探针的应用。本发明在不改变噻唑橙（ThiazolOrangeTO）的母体结构前提下，在其喹啉环N原子上引入不同的取代基，制备了一系列衍生结构，其结构通式如下，其中X：O、S，Y：卤素，R₁：氢、C₁-C₄烷基、二甲胺基C₁-C₄烷基，R₂：氢、C₁-C₄烷基、氨基、C₁-C₄烷基胺基、二（C₁-C₄烷基）胺基。结果表明，改造后的分子与双螺旋DNA的结合性能得到了提高，其荧光响应的灵敏度也获得了增强。

Description

噻唑橙衍生物及其制备方法和作为双螺旋核酸荧光分子探针的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及噻唑橙衍生物及其制备方法和作为双螺旋核酸荧光分子探针的应用。

背景技术

噻唑橙类（Thiazol Orange TO）菁染料，具有摩尔消光系数大、荧光性能良好、与核酸结合后荧光效率增大、最大吸收波长可调谐范围大、易于合成等优点，其主体部分是由噻唑和喹啉通过甲川基而连接在一起。在没有核酸的情况下，桥链两端的苯并噻唑环和喹啉环之间自由转动，故无荧光。而当有核酸存在时，TO分子与核酸的大沟槽结合后，其自由转动受到限制，导致荧光强烈增强。

噻唑橙类菁染料在与双螺旋核酸结合前后荧光的明显差异，提高了检测的灵敏度，减少了标记过程中除去游离染料的复杂步骤。这种荧光探针染料由于其标记速度快、接近生理pH条件、对生物分子的功能活性影响小。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种噻唑橙衍生物，通过改进噻唑橙菁染料的结构、优化其制备方法，使得到的衍生物具有明显提高响应的灵敏度的优点。本发明不改变菁染料的母体结构，对喹啉环N上取代基进行改造，增大了探针与双螺旋核酸的结合能力，

本发明所述的噻唑橙衍生物，其化学结构通式为：

式中X：O、S

Y：卤素

R₁：氢、C₁-C₄烷基、二甲胺基C₁-C₄烷基

R₂：氢、C₁-C₄烷基、氨基、C₁-C₄烷基胺基、二（C₁-C₄烷基）胺基

优选地：X：S

Y：Cl、Br、I，更优选Br

R₁：氢、C₁-C₄烷基、二甲胺基C₁-C₄烷基，更优选：氢、甲基、二甲胺基乙基、二甲胺基丙基、二甲胺基丁基

R₂：氢、C₁-C₄烷基、氨基、C₁-C₄烷基胺基、二（C₁-C₄烷基）胺基，更优选：氢、甲基、胺基、二甲胺基、二乙胺基

本发明的噻唑橙衍生物制备方法合成路线如下：

具体步骤如下：

（1）化合物D（TODN）1-（2-（N,N-双取代（3-（二甲基氨基）丙基）氨基）氧代乙基）-4-（3-甲基-苯并噻唑-2-甲川基）-喹啉碘盐的制备

1.1溴乙酸和4-甲基喹啉在乙酸乙酯中反应，室温下搅拌，再过滤，用乙醚洗涤滤饼后置于通风橱内自然干燥，得到化合物A。

1.2取2-巯基苯并噻唑于DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶液中，再加入碘甲烷，上述混合体系于90℃下反应，反应完毕，冷却，抽滤，用乙腈洗涤滤饼数次后干燥。得化合物B。

1.3取化合物A和化合物B，摩尔比6：5，置于圆底烧瓶中，向其中加入甲醇、DMF和三乙胺，室温下反应，反应完毕，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后置于通风处内干燥，得化合物C（1-（羧甲基）-4-（（3-甲基苯并噻唑-2-甲川基）甲基）喹啉溴盐）。

1.4取化合物C于鸡心瓶中，再取HBTU（2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯）和DIEA（N,N-二异丙基乙胺），于室温下搅拌，再将另一原料（N¹-（3-（二甲基氨基）丙基）-N³，N³-二甲基丙烷-1,3-二胺）加入上述体系中，搅拌反应。将该反应体系倒入乙醚中，收集不溶物。将不溶物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯（其中氯仿／甲醇=5／5,V／V）。得化合物D。

（2）化合物E（TOMN）1-（2-（（3-（二甲基氨基）丙基）氨基）氧代乙基）-4-（3-甲基-苯并噻唑-2-甲川基）-喹啉溴盐的制备

取DMF和化合物C，并加入HBTU和DIEA，取化合物C、HBTU与DIEA的摩尔比为4：8：9,于室温下搅拌，然后把N,N-二甲基丙二胺加入上述体系中，继续在室温下搅拌反应。将反应液倒入乙醚中，收集不溶物，将不溶物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯（其中氯仿／甲醇=5／5,V／V）。得化合物E。

（3）化合物F（TOBO）1-（2-（3-（叔丁氧羰基）胍基）-2-氧乙基）-4-（3-甲基苯并噻唑-2-甲川基）甲基）喹啉碘盐的制备

取DMF鸡形瓶中，再加入化合物C、Py-Bop（六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷）和DIEA，该体系于室温下搅拌，然后称取Boc-胍加入上述混合体系中，然后继续在室温下搅拌反应，TLC跟踪至反应结束。将反应液倒入水中，会有沉淀析出，过滤收集不容物，将不容物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯（氯仿／甲醇=40／4,V／V）。得化合物F。

本发明中噻唑橙衍生物用于检测核酸，包括以下步骤：

（1）紫外检测

向溶于化合物的缓冲液中逐渐加入DNA溶液，得350nm-650nm的紫外吸收值，将其数据做scatchard方程，求得结合能K和结合位点n。

（2）荧光检测

设定波谱范围在515nm-650nm，激发波长为508nm，向溶于化合物的缓冲液中逐渐加入DNA溶液，得到其荧光吸收的谱图。以[C_DNA/C_化合物]为横坐标，以F-Fo为纵坐标作图，在图的两端做切线，可得交点坐标。

本发明的噻唑橙衍生物能够明显提高对双螺旋核酸响应的灵敏度，如TO衍生物TODN（如下图），其与核酸结合的荧光强度是TO同等条件下的两倍，且TODN在10nM浓度时仍有响应，所检测核酸的极限浓度为3.175μg/μL(5nM)。对双螺旋核酸表现出较高的灵敏度，减少了标记过程中除去游离染料的复杂步骤。表明TODN可作为一种定量检测DNA的高灵敏探针。

附图说明

图1为TO紫外全谱图：化合物浓度为10μM，[C_DNA/C_化合物]从0开始以每0.2个当量增加到3.8，再以每0.4个当量增加到6.6，后以每1.4个当量增加到9.4；随DNA增加，峰值先降低（0.2个当量最低）后升高。

图2为TOMN紫外全谱图：化合物浓度为10μM，[C_DNA/C_化合物]从0开始以每0.2个当量增加到3.8，再以每0.4个当量增加到6.6，后以每1.4个当量增加到9.4；随DNA增加，峰值先降低（0.6个当量最低）后升高。

图3为TODN紫外全谱图：化合物浓度为10μM，[C_DNA/C_化合物]从0开始以每0.2个当量增加到3.8，再以每0.4个当量增加到6.6，后以每1.4个当量增加到9.4；随DNA增加，峰值先降低（0.6个当量最低）后升高。

图4为TOBA紫外全谱图：化合物浓度为10μM，[C_DNA/C_化合物]依次从0开始逐渐增加到10.9；随DNA增加，峰值先降低（0.6个当量最低）后升高。

图5为TO紫外scatchard方程图

图6为TOMN（化合物E）紫外scatchard方程图

图7为TODN（化合物D）紫外scatchard方程图

图8为TOBA紫外scatchard方程图

图9为TO荧光：固定化合物浓度0.2μM，Fo是未加DNA时在515nm-650nm范围的峰面积值，F是不同DNA浓度下在同波长区域的峰面积值。

图10为TOMN荧光：固定化合物浓度0.2μM，Fo是未加DNA时在515nm-650nm范围的峰面积值，F是不同DNA浓度下在同波长区域的峰面积值。

图11为TODN荧光：固定化合物浓度0.2μM，Fo是未加DNA时在515nm-650nm范围的峰面积值，F是不同DNA浓度下在同波长区域的峰面积值。

图12为TODN荧光：固定化合物浓度0.01μM，Fo是未加DNA时在515nm-650nm范围的峰面积值，F是不同DNA浓度下在同波长区域的峰面积值。

具体实施方式

实施例1

化合物A的合成

取100mL的圆底烧瓶，向该烧瓶中加入乙酸乙酯45mL，称取4.48g（32.24mmol)溴乙酸和5.12g(35.76mmol)的4-甲基喹啉置于前述圆底烧瓶中，于室温下搅拌三天，反应完毕，过滤，用乙醚洗涤滤饼数次后置于通风橱内自然干燥。得到产品（化合物A）3.21g，收率35.3%。

实施例2

化合物B的合成

取100mL圆底烧瓶，向其中加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF)25mL，称取2-巯基苯并噻唑5.22g(31.21mmol)与上述DMF溶液中，再向DMF的2-巯基苯并噻唑溶液加入碘甲烷6.00mL，上述混合体系于90℃下反应10小时，反应完毕，冷却，抽滤，用乙腈洗涤滤饼数次后干燥。得产品（化合物B）5.95g收率53.3%。

实施例3

化合物C的合成

取25mL的圆底烧瓶，称取1.01g(3.58mmol)化合物1和0.95g(2.94mmol)化合物2，将两原料置于圆底烧瓶中，向其中加入11mL甲醇和0.5mL的DMF，再向该混合体系中加入三乙胺0.25mL(1.80mmol)，室温下反应4天，反应完毕，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤数次后置于通风处内干燥。得产品（化合物C）0.197g，收率15.6%。

¹H-NMR(DMSO-d₆,600MHz),δ(ppm):1.15(s,1H),4.00(s,3H),4.86(s,2H),6.92(s,1H),7.41(m,2H),7.60(dd,J₁=6.0MHz,J₂=12.0MHz,1H),7.74(t,J=6.0MHz,2H),7.87(d,J=6.0MHz,1H),7.95(dd,J₁=6.0MHz,J=12.0MHz,1H),8.01(d,J=12.0MHz,1H),8.57(d,J=6.0MHz,1H),8.76(d,J=12.0MHz,1H).

实施例4

目标化合物D（TODN）的合成

量取10.5mL DMF于25mL的鸡形瓶中，称取0.394g(0.92mmol)的化合物3，再称取0.622g(1.64mmol)的HBTU和0.24g(1.86mmol)的DIEA，先将上述体系于室温下搅拌4小时，再将0.229g(1.26mmol)另一原料加入上述体系中，室温下搅拌反应，TLC跟踪至反应结束。将该反应体系倒入乙醚中，会有不容物洗出，收集不容物。将不容物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯（氯仿／甲醇=5／5,V／V）。得产品（化合物D）0.503g，收率92.6%。

¹H-NMR(DMSO-d₆,600MHz),δ(ppm):1.23(s,2H),1.62(m,2H),1.86(m,2H),2.11(s,6H),2.19(m,2H),2.23(s,6H),2.35(t,J=6.0MHz,2H),4.05(s,3H),5.70(s,2H),6.98(s,1H),7.45(m,2H),7.64(dd,J₁=6.0MHz,J₂=12.0MHz,1H),7.71(m,2H),7.82(d,J=6.0MHz,2H),7.93(dd,J₁=J₂=6.0Hz,1H),8.08(d,J=6.0MHz,1H),8.46(d,J=6.0MHz,1H),8.78(d,J=12.0MHz,1H).

实施例5

目标化合物E（TOMN）的合成

E

取5mL的鸡心瓶，量取DMF为2.5mL于鸡心瓶中，称取取化合物3为0.136g(0.32mmol)，HBTU为0.201g(0.53mmol)，DIEA为0.047g(0.36mmol)，该体系于室温下搅拌4小时，然后称取0.042g(0.41mmol)N,N-二甲基丙二胺加入上述混合体系中，加毕后，继续在室温下搅拌反应，TLC跟踪至反应结束。将反应液倒入乙醚中，会有沉淀析出，收集不容物，将不容物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯（氯仿／甲醇=5／5,V／V）。得产品（化合物E）0.064g。收率39.0%.

¹H-NMR(DMSO-d₆,600MHz),δ(ppm):2.09(s,6H),2.89(br,s,3H),3.16(t,J=6.0MHz,3H),4.05(s,3H),5.30(s,2H),6.98(s,1H),7.40(d,J=6.0MHz,1H),7.45(t,J=6.0MHz,1H),7.64(t,J=6.0MHz,1H),7.74(dd,J₁=6.0MHz,J₂=12.0MHz,1H),7.78(d,J=12.0MHz,1H),7.82(d,J=6.0MHz,1H),7.95(dd,J₁=6.0MHz,J₂=12.0MHz,1H),8.07(d,J=6.0MHz,1H),8.52(d,J=6.0MHz,1H),8.68(br,s,1H),8.80(d,J=12.0MHz,1H).

实施例6

目标化合物F（TOBO）的合成

取25mL的鸡心瓶一只，量取DMF为10mL于鸡形瓶中，称取取化合物C为0.136g(0.32mmol)，Py-Bop（六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷）为0.198g(0.38mmol)，DIEA为0.049g(0.38mmol)，该体系于室温下搅拌4小时，然后称取0.055g(0.35mmol)Boc-胍加入上述混合体系中，加毕后，继续在室温下搅拌反应，TLC跟踪至反应结束。将反应液倒入水中，会有沉淀析出，过滤收集不容物，将不容物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯（氯仿／甲醇=40／4,V／V）。得产品（化合物F）0.291g。收率62.0%。

¹H-NMR(DMSO-d₆,600MHz),δ(ppm):1.47(s,9H),4.03(s,3H),5.57(s,2H),6.94(s,1H),7.36(d,J=6.0MHz,1H),7.42(dd,J₁=6.0MHz,J₂=12.0MHz,1H),7.61(dd,J₁=6.0MHz,J₂=12.0MHz,1H),7.73(m,2H),7.78(d,J=12.0MHz,1H),7.92(t,J=6.0MHz,1H),8.05(d,J=12.0MHz,1H),8.52(d,J=12.0MHz,1H),8.67(br,s,1H),8.76(d,J=6.0MHz,1H),9.32(br,s,1H),10.92(br,s,1H).

实施例7

紫外检测用于比较探针与核酸结合的结合能K和结合位点n

设定波谱范围在350–650nm，向比色皿中加入3300μl的缓冲溶液溶液（pH=7.25-7.35），分别加入浓度为10mM的化合物TO、TOMN、TODN、TOBA（DMSO为溶剂）3.3μl，使其终浓度达10μM，逐渐加入DNA，[C_DNA/C_化合物]依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4.2、4.6、5、5.4、5.8、6.2、6.6、8、9.4，随DNA加入，峰值先降低后升高，得到其紫外吸收值变化图（见附图1、2、3、4）。

利用数值做scatchard方程（见附图5、6、7、8），TO：K=4.47×10⁵，n=2.6；TOMN：K=6.83×10⁵，n=2.3；TODN：K=7.30×10⁵，n=2.4；TOBA：K=1.99×10⁵，n=3.1，比较可得TOMN与核酸的结合能力与TO相近；TODN与核酸的结合能力强于TO；TOBA与核酸的结合能力弱于TO。

实施例8

荧光检测

设定波谱范围在515-650nm，激发波长为508nm，向比色皿中加入3600μl的缓冲溶液（pH=7.25-7.35），再加入化合物，使其终浓度达0.2μM，随DNA（开始以一个当量加入）加入量的增加，得到其荧光吸收值的全谱图，以[C_DNA/C_化合物]为横坐标，以F-Fo为纵坐标作图（见附图9、10、11），在图的两端做切线，交点坐标分别为TO：x=2.83，y=1795.75；TOMN：x=2.43，y=1487.58；TODN：x=2.99，y=4098.31；TOMN与核酸结合的荧光强度与TO相近；TODN和核酸结合的荧光强度是相同条件TO的两倍多。

实施例9

荧光检测

在实例7相同检测条件下，TODN在终浓度达0.01μM时（见附图12），得到交点坐标：x=2.43，y=78.81，而此浓度下的TO没有明显效果，表明TODN作为荧光探针的灵敏度高于商品化的TO。

Claims

1.噻唑橙衍生物，其化学结构通式为：

式中X：O、S

Y：卤素

R ₁ ：氢、C₁-C₄烷基、二甲胺基C₁-C₄烷基

R ₂ ：氢、C₁-C₄烷基、氨基、C₁-C₄烷基胺基、二（C₁-C₄烷基）胺基。

2.权利要求1的噻唑橙衍生物，其中：

Y为Cl、Br、I。

3.权利要求1或2的噻唑橙衍生物，其中，

R₁为氢、C₁-C₄烷基、二甲胺基C₁-C₄烷基，优选氢、甲基、二甲胺基乙基、二甲胺基丙基、二甲胺基丁基。

4.权利要求1、2或3的噻唑橙衍生物，其中，

R ₂为氢、C₁-C₄烷基、氨基、C₁-C₄烷基胺基、二（C₁-C₄烷基）胺基、，优选氢、甲基、胺基、二甲胺基、二乙胺基。

5.权利要求1-4任何一项所述的噻唑橙衍生物，其中：

X为S。

6.权利要求1的噻唑橙衍生物，选自：

。

7.如权利要求6所述噻唑橙衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）溴乙酸和4-甲基喹啉在乙酸乙酯中反应，搅拌，再过滤，用乙醚洗涤滤饼后干燥，得到化合物A: ;

（2）取2-巯基苯并噻唑于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入碘甲烷，上述混合体系于90℃下反应，反应完毕，冷却，抽滤，用乙腈洗涤后干燥得化合物B:;

取化合物A和化合物B，置于圆底烧瓶中，向其中加入甲醇、DMF和三乙胺，反应，反应完毕，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤后干燥，得化合物C:;

（4）取 DMF于鸡形瓶中，加入化合物C、HBTU与DIEA，先将上述体系于室温下搅拌，再向上述体系中加入胺基取代物，室温下搅拌反应，TLC跟踪至反应结束，将该反应体系倒入乙醚中，收集不溶物，将不溶物加适量甲醇溶解，硅胶柱层析提纯，其中氯仿／甲醇 = 5／5,得TO衍生物TOMN、TODN、TOBA，其中氯仿／甲醇 40：4（V／V）得TO衍生物 TOBO。

8.权利要求1-6任何一项所述的噻唑橙衍生物在制备荧光分子探针中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的荧光分子探针与双螺旋核酸选择性结合。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，荧光分子探针的最小检测浓度为0.01μM。