CN105367566A - 取代的香豆素-噻唑橙衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学领域，具体涉及取代的香豆素-噻唑橙衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种取代的香豆素-噻唑橙衍生物，其结构式如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法和其对G四链体的荧光识别用途。本发明提供的取代的香豆素-噻唑橙衍生物具有毒副性小、选择性好、灵敏度高、原料简单易得、整条合成路线可操作性强、反应条件也比较温和、总体成本较低等优势，与现有低效的G-四链体荧光探针相比，无疑更有市场竞争力。

Description

取代的香豆素-噻唑橙衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及取代的香豆素-噻唑橙衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
G四链体是一种非典型的核酸结构。四个鸟嘌呤碱基通过氢键作用力可以组成G四聚体平面，而多层的G四聚体平面又可以形成G四链体。G四链体可以在生理条件下由富G的DNA或RNA单链形成，并且可以在生物体内稳定存在。2013年，G四链体在哺乳动物细胞内存在的直接证据被提出，共聚交成像系统显示G四链体在人类染色体的端粒区域富集。[参见:G.Biffi,D.Tannahill,J.McCaffertyandS.Balasubramanian,Nat.Chem.,2013,5,182-186.]随后的研究证实，G四链体可能与癌症有关，通过稳定G四链体可以减慢细胞的复制速率。[参见：(a)H.Xu,S.Gao,Q.Yang,D.Pan,L.WangandC.Fan,ACSAppl.Mater.Interfaces,2010,2,3211-3216；(b)S.Ghosh,O.Mendoza,L.Cubo,F.Rosu,V.Gabelica,A.J.WhiteandR.Vilar,Chem.Eur.J.,2014,20,4772-4779；(c)D.Zhao,X.Dong,N.Jiang,D.ZhangandC.Liu,Nucl.AcidsRes.,2014,42,11612-11621.]也就是说，G四链体的稳定剂可能就是潜在的抗癌药物。因此，开发基于小分子的荧光探针用于识别G四链体，引起了科研工作者越来越浓厚的兴趣。
噻唑橙是一类经典的染料，被用于核酸的显色。然而它对于G四链体与双链DNA有相似的结合能力，低选择性限制了噻唑橙作为荧光探针的进一步应用。[参见：(a)Y.P.Xing,C.Liu,X.H.ZhouandH.C.Shi,Sci.Rep.,2015,5,8125；(b)I.Lubitz,D.ZikichandA.Kotlyar,Biochemistry,2010,49,3567-3574.]科研工作者们希望在保留噻唑橙良好荧光性质的同时，提高其对于G四链体的选择性。为此，几个噻唑橙的衍生物也被开发出来用于G四链体的荧光识别。[参见：(a)P.Yang,A.DeCian,M.P.Teulade-Fichou,J.L.MergnyandD.Monchaud,Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,2188-2191；(b)Y.J.Lu,S.C.Yan,F.Y.Chan,L.Zou,W.H.Chung,W.L.Wong,B.Qiu,N.Sun,P.H.Chan,Z.S.Huang,L.Q.GuandK.Y.Wong,Chem.Commun.,2011,47,4971-4973.]这两个探针都可以高效选择性地与G四链体结合，并且导致荧光大幅增强。然而，这几个探针的荧光发射波长都较短，不利于生物体内的荧光成像。由于长波荧光具有穿透能力强、生物组织伤害小等优点，因此，设计合成长波发射的G四链体荧光探针是非常有必要的。
取代的香豆素是一种便宜易得的化学原料，多个反应位点使其容易修饰，从而制备很多香豆素衍生物，这种衍生手段操作性和经济性都很强。利用取代的香豆素和噻唑橙可以构建大共轭的体系，并且具备分子内电荷转移，使其发光达到红色甚至近红外区域。而取代的香豆素-噻唑橙衍生物，又形成了月牙型的共面分子，使其能够堆叠与G四聚体平面上。与G四链体作用后的探针刚性增强，分子内旋转受抑制，荧光大幅增强。因此这类探针可以高效选择性地荧光识别G四链体，并用于细胞成像。
发明内容
本发明要解决的第一个问题是提供一种取代的香豆素-噻唑橙衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为C1～C8烷氧基、-NH2或-OH；R1～R3独立地为C1～C8烷基或C1～C8羰基。
作为本发明优选的方案，R为C1～C4烷氧基、R1～R3独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基。
进一步优选的，R为R1～R3独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基。
更进一步优选的，R为R1、R2独立地为C1～C4烷基。
最优的，R为二乙基氨基。
本发明还提供了上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，其反应式如下：
上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法包括以下步骤：
a、将取代的水杨醛和丙二酸二乙酯溶于无水有机溶剂中，然后再加入哌啶，回流6～8小时，制备得到中间体1；
b、将中间体1溶于强酸中，回流反应4～6小时，制备得到中间体2；
c、将中间体2、三氯氧磷，在无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中回流反应2.5～3.5小时，制备得到中间体3；
d、将中间体3，2-甲基噻唑橙，哌啶在无水乙醇中回流反应12～15小时，制备得到取代的香豆素-噻唑橙衍生物。
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤a所述的丙二酸二乙酯的摩尔量为取代水杨醛的2.0～2.5倍，所述哌啶的摩尔量为取代水杨醛的1.2～1.6倍。
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤a所述的无水有机溶剂为无水乙醇。
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤b所述的强酸为质量百分比18％～20％的浓盐酸。
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤c所述的三氯氧磷的用量为中间体2的1.6～1.8倍。
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤d所述的2-甲基噻唑橙与中间体3的摩尔比为1︰1。
本发明还提供了上述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物在对G四链体进行荧光识别的用途。
本发明利用取代香豆素的醛基和2-甲基噻唑橙缩合构建长波发射的荧光体系，设计合成了一种发射红色荧光的G四链体荧光探针。本发明通过在含有强供电子基团的取代香豆素中引入强吸电子基的噻唑橙部分，使得整个化合物的发射波长可以红移到600nm以上，完全满足生物实验中对荧光波长的需求。噻唑橙部分的引入也可以使化合物对于G-四链体有更好的选择性结合能力，从而实现对G-四链体的专一性识别。该系列化合物对G四链体具有优良的选择性、灵敏性，抗干扰能力强，可以在生物体内高效地检测G四链体的存在。此外，本发明提供的取代的香豆素-噻唑橙衍生物具有毒副性小、原料简单易得、整条合成路线可操作性强、反应条件也比较温和、总体成本较低等优势，和现有低效的G-四链体荧光探针相比，无疑更有市场竞争力。
附图说明
图1化合物5的氢谱图。
图2化合物5的MTT细胞毒性实验。
图3不同浓度的化合物5与HeLa细胞共培养后，用流式细胞分析技术分析细胞膜通透率。其中，A、B、C、D图分别为：0、1.0、3.0、5.0μM浓度的化合物5与HeLa细胞共培养后的结果图。
图41.0μM化合物5和市售线粒体荧光探针Mito-TrackerGreen在Hela细胞中共同孵化后的共聚焦荧光成像图。其中，A图为Mito-TrackerGreen的荧光成像图(488nm激发，500-540nm收集)；B图为化合物5的荧光成像图(488nm激发，630-670nm收集)；C图为A图和B图的叠加图。
具体实施方式
取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法包括以下步骤：
a、将取代的水杨醛和丙二酸二乙酯溶于无水有机溶剂中，然后再加入哌啶，回流6～8小时，制备得到中间体1；所述的丙二酸二乙酯的用量为取代水杨醛的2.0～2.5倍，所述哌啶的用量为取代水杨醛的1.2～1.6倍；
b、将中间体1溶于强酸中，回流反应4～6小时，制备得到中间体2；
c、将中间体2、三氯氧磷，在无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中回流反应2.5～3.5小时，制备得到中间体3；所述的三氯氧磷的用量为中间体2的1.6～1.8倍；
d、将中间体3，2-甲基噻唑橙，哌啶在无水乙醇中回流反应12小时，制备得到取代的香豆素-噻唑橙衍生物；所述的2-甲基噻唑橙与中间体3的摩尔比为1︰1；
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤a所述的无水有机溶剂为无水乙醇。
其中，上述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法中，步骤b所述的强酸为质量百分比18％～20％的浓盐酸。
在合成中间体1的过程中，反应的产率较高，但仍有很多副产物。尝试通过柱层析色谱分纯(石油醚︰乙酸乙酯＝3︰1)，效果不佳，几乎全部的副产物随着产物一起被收集到。因此没有必要通过柱层析色谱分纯，可直接用于下一步反应。
在合成中间体2的过程中，可通过薄层色谱及时检测反应的进行，反应时间可适当延长。在后处理过程中，加入45％氢氧化钠溶液调节pH至4～5，应当注意不可调到过碱，香豆素在pH>10的条件下内酯键会断裂。
在合成中间体3的过程中，POCl3用量优选为中间体2的1.7倍当量，也可以适当提高其用量，以防止溶剂中残留的水以及反应体系中的水，使三氯氧磷失去活性。中间体3需要先溶解在DMF中，再通过恒压滴液漏斗加入，以减少副反应的发生。
在合成取代的香豆素-噻唑橙衍生物的过程中，优选哌啶催化反应，碱性过强或者过弱都不利于反应的进行。2-甲基噻唑橙在无水乙醇中的溶解性不好，在反应开始前不能完全溶解，而随着反应的发生会逐渐全部溶解。反应的溶剂可以随着碱的不同而变化。
本发明实施例中，所有的寡核苷酸都购Sangon公司，HeLa细胞株购于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)公司，10％胎牛血清购于Hyclone公司，DMEM(H)培养基购于美国Gibco。线粒体染料Mito-TrackerGreen均购自于LifeTechnologies公司。
实施例1中间体1的合成：
将4-二乙胺基水杨醛(10.0g，56.4mmol)、丙二酸二乙酯(18.0g，112.4mmol)、哌啶(2mL，79.0mmol)溶于60mL无水乙醇，80℃下回流。TLC监测反应不再进行时(约6小时)，减压除去溶剂，直接用于下一步的反应。得到黑色油状液15.6g，粗产率为95.7％。
1HNMR(400MHZ,CDCl3)δ8.40(s,1H)，7.35(d,J＝8.8Hz,1H)，6.66(dd,J＝8.9,2.3Hz,1H)，6.50(s,1H),4.36(q,J＝7.15Hz,4H)，3.42(q,J＝7.1Hz,4H)，1.36(t,J＝7.1Hz,3H)，1.21(t,J＝7.1Hz,6H)。
实施例2中间体2的合成：
将中间体1(5.0g,17.3mmol)溶于150mL18％的浓盐酸中，100℃回流。TLC监测反应不再进行时(约5小时)，冷却反应至室温，加入饱和碳酸钠溶液，再用45％浓氢氧化钠溶液调节pH至4-5，观察到有大量橙色固体析出。减压抽虑，收集到大量土黄色固体，真空干燥除水，直接用于下一步反应。得到黄绿色粉末2.7g，产率为72.0％。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(d,J＝9.5Hz,1H)，7.28(d,J＝8.8Hz,1H),6.74(bs,1H),6.61(s,1H),6.08(d,J＝9.2Hz,1H),3.4(q,J＝7.1Hz,4H),1.19(t,J＝7.1Hz,6H)。
实施例3中间体3的合成：
将三氯氧磷(3mL，19.5mmol)溶于20mL无水DMF，50℃搅拌45分钟，此时溶液呈微黄色。再将中间体2(2.5g,11.5mmol)溶于15mL无水DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到三氯氧磷溶液中，此时溶液为红色。60℃下反应2小时，直至中间体2完全反应。反应结束后，将反应液倒入200mL冰水中，搅拌2小时，再用20％氢氧化钠溶液pH至7，减压抽虑，得到橙红色固体，真空干燥过夜。将所得粗产品用200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚＝1：2(V/V)。最终得到橙黄色固体2.06g，产率为73.6％。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3)δ10.13(s,1H)，8.26(s,1H),7.42(d,J＝9.0Hz,1H),6.67(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),6.52(s,1H),3.48(q,J＝7.1Hz,4H),1.26(t,J＝7.2Hz,6H)。
实施例4化合物5的合成：
将中间体3(55mg,0.224mmol)和2-甲基噻唑橙(100mg，0.224mmol)溶于无水乙醇(20mL)，再加入5滴哌啶。将混合的反应液在氮气的保护下，80℃回流过夜。反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去有机溶剂，粗产品用300-400目硅胶柱分离，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷＝1：20(V/V)。最终得到棕色固体59mg，产率为39.1％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.69-8.67(d,1H,J＝8.8Hz),8.42(s,1H),8.09-8.07(d,1H,J＝9.0Hz),8.00-7.93(br,3H),7.69-7.66(t,2H,J＝8.4Hz),7.53-7.47(m,4H),7.36-7.32(t,1H,J＝8.5Hz),6.83-6.77(m,2H),6.59(s,1H),4.06(s,3H),3.94(s,3H),3.49-3.44(q,4H,J＝6.5Hz),1.15-1.12(t,6H,J＝6.9Hz)ppm；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ158.4,156.3,152.1,151.3,146.4,146.2,140.3,138.7,136.6,133.0,130.8,127.9,124.9,123.9,123.2,119.3,118.2,113.1,112.4,108.6,106.8,96.2,87.5,44.8,37.7,33.8,12.9.
HRMS:(ESI)m/z：546.2205[M-I]+。
实施例5化合物5的细胞毒性实验：
将处于对数生长期的HeLa细胞接种于96孔培养板中，每孔接种3000个细胞，用含10％胎牛血清的DMEM(H)培养基在37℃，5％CO2条件下培养过夜。待细胞完全贴壁，加入不同浓度梯度的化合物5，每个浓度设3个复孔，同时设空白对照组。加药后继续培养24小时，MTT法检测细胞的抑制率。
如图2所示，在浓度范围0.5～4μM范围内，化合物5的细胞毒性非常小。
实施例6化合物5的细胞膜通透性研究：
将处于对数生长期的HeLa细胞接种于60mm的培养皿中，每皿接种1×106个细胞，在DMEM培养基中培养24小时。然后将这些细胞与梯度浓度的化合物5(0，1.0，3.0和5.0μM)以及DMSO(二甲基亚砜)(0.1％作为对照)一式两份，再培养12小时。把细胞用胰蛋白酶处理，离心，用1×PBS洗涤，用2mL70％乙醇重新悬浮，4℃存放过夜。将样品离心，用1×PBS洗涤两次后，用流式细胞仪统计带荧光的细胞个数，以此研究化合物5的细胞膜通透性。
图3中，HeLa细胞与不同浓度的化合物5培养后，细胞被荧光标记的数量。其中，纵坐标SSC-A表示侧向角散射，即指与激光束正交90度方向的散射信号，它代表细胞的颗粒度，用于区分细胞的类别。横坐标FL3-A表示荧光峰面积，代表了细胞内的荧光强度。A～D分别对应0、1.0、3.0和5.0μM浓度的化合物5与HeLa细胞共培养，其文件名称分别为“A030c”、“A061c”、“A093c”、“A125c”。“Gate:p2”表示该结果是对于P2区域细胞进行流式分析所得到的结果，在这个应用中，P2区域代表了全部的培养细胞。Q2-LL区域为未染色的细胞，Q2-LR区域为被荧光标记的细胞。
从图3中可以看出，没有与化合物5共培养的细胞(A)都集中在Q2-LL区域，而其他三个图(BCD)都集中在了Q2-LR区域。这说明，各种浓度的化合物5都能完全地将细胞染色，从而说明化合物5的细胞膜通透性很好。
实施例7化合物5在HeLa细胞中与Mito-TrackerGreen的共成像：
首先，在含10％胎牛血清的DMEM(H)培养基中，通5％CO2，将HeLa细胞于37℃下培育24小时。然后将培养基去除后，加入含有0.5μM或1.0μM化合物4的生理盐水并加入0.5μM市售细胞线粒体染料Mito-TrackerGreen，共培养30分钟，取出培养皿，用生理盐水洗3次后，将培养皿放在荧光共聚焦显微镜上成像得到图4。
图4中，A图的激发光为488nm，收集500-540nm波段；B图的激发光为488nm，收集630-670nm波段。从叠加图C可以看出，化合物5的染色区域和市售线粒体染料基本一直，说明化合物5对于线粒体有很好的靶向性，可以用于荧光检测线粒体中的G四链体。
本发明提供的取代的香豆素-噻唑橙衍生物具有毒副性小、选择性好、灵敏度高、原料简单易得、整条合成路线可操作性强、反应条件也比较温和、总体成本较低等优势，和现有低效的G-四链体荧光探针相比，无疑更有市场竞争力。

Claims (9)

1.取代的香豆素-噻唑橙衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：
其中，R为C1～C8烷氧基、-NH2或-OH；R1～R3独立地为C1～C8烷基或C1～C8羰基。
2.根据权利要求1所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物，其特征在于：R为C1～C4烷氧基、-NH2或-OH；R1～R3独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基；
优选的，R为C1～C4烷氧基、或R1～R3独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基；
进一步优选的，R为或R1～R3独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基；
更进一步优选的，R为R1、R2独立地为C1～C4烷基；
最优的，R为二乙基氨基。
3.权利要求1或2所述取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，包括一下步骤：
a、将取代的水杨醛和丙二酸二乙酯溶于无水有机溶剂中，然后再加入哌啶，回流6～8小时，制备得到中间体1；
b、将中间体1溶于强酸中，回流反应4～6小时，制备得到中间体2；
c、将中间体2、三氯氧磷，在无水N,N-二甲基甲酰胺中回流反应2.5～3.5小时，制备得到中间体3；
d、将中间体3,2-甲基噻唑橙，哌啶在无水乙醇中回流反应12～15小时，制备得到取代的香豆素-噻唑橙衍生物。
4.根据权利要求3所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，其特征在于：步骤a所述的丙二酸二乙酯的摩尔量为取代水杨醛的2.0～2.5倍，所述哌啶的摩尔量为取代水杨醛的1.2～1.6倍。
5.根据权利要求3所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，其特征在于：步骤a所述的无水有机溶剂为无水乙醇。
6.根据权利要求3所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，其特征在于：步骤b所述的强酸是质量百分比为18％～20％的浓盐酸。
7.根据权利要求3所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，其特征在于：步骤c所述的三氯氧磷的摩尔量为中间体2的1.6～1.8倍。
8.根据权利要求3所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物的制备方法，其特征在于：步骤d所述的2-甲基噻唑橙与中间体3的摩尔比为1︰1。
9.权利要求1或2所述的取代的香豆素-噻唑橙衍生物在对G四链体进行荧光识别的用途。
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