CN103666452A - 一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明同时公开了苯并呋喃喹啉生物探针及其制备方法和在检测G-四链体结构和在白叶藤碱与G-四链体作用机制中的用途，该类生物探针具有很强的荧光强度和很好的荧光性能，可用于特异性检测G-四链体结构以及研究白叶藤碱衍生物与G-四链体的作用机制。研究白叶藤碱衍生物在体内是作用于端粒G-四链体还是启动子区域的C-MYCG-四链体更或者是其他G-四链体结构，检测方法具有操作简便，快捷，选择性好，可视化明显的优点，克服了其他检测方法体内检测无法进行以及价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。

Description

一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种生物探针，更具体地，涉及一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针及其制备方法和应用。

背景技术

    G-四链体（G-quadruplex）是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。最新研究表明，很多非编码区的RNA序列也可以形成G-四链体结构，RNA的G-四链体结构比DNA更稳定，该结构可能通过阻止基因的翻译或参与蛋白结合识别的过程而达到抑制肿瘤生长的效果。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。

目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前体外实验中检测G-四链体结构主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振、表面等离子共振、荧光共振能量转移等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。

最近Laurence H. Hurley研究组报道11-位取代的白叶藤碱衍生物并不是直接作用于C-MYC基因启动子区域的G-四链体而产生相应的抗肿瘤效果。那么这种结构的衍生物究竟直接作用于那部分区域的G-四链体呢，目前还没有明确的定论。而本专利合成出的苯并呋喃喹啉生物探针是在11位取代的白叶藤碱衍生物的基础上，在11位取代侧链融合具有很强荧光性能的荧光分子，使其能够产生荧光，以便能够简便，快捷，可视化研究该类化合物与G-四链体的作用机制，明确定位该类化合物与G-四链体的作用靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种很强荧光性能的生物探针。

    根据发明目的，先提供一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针，化学结构式如I所示：

          R₁为H、卤素、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基；

          R₂为H、卤素 、C_1-6的烷基、C_3-6的环烷基、-O(CH₂)_aCH₃或-O(CH₂)_nNR₄R₅；所述的a为0、1、2或3，

R₃为-NHR₆、-R₇(CH₂)_nR₆;

          R₄、R₅为C_1-6的烷基、C_3-6环烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基或吡噁啉基；

R₆为

或

，

R₇为NH、O、S、NCH₃或CH₂

          X为C、N、O或S；

          Y为无取代基或带正电荷的C_1-6的烷基；

          所述的n为0、1、2、3或4。

    所述的Y优选为无取代基，R₁优选为H、F、I或Br，X优选为O，R₇优选为N(CH₃)。

    R₂优选为H、-O(CH₂)_aCH₃、C_1-6的烷基或-O(CH₂)_nNR₄R₅，所述的a为0、1、2或3，所述的R₄、R₅为C_1-6的烷基。

    所述的R₄、R₅优选为C_1-3的烷基。

    所述的R₂优选取代在5位点上，R₁优选取代在15位点上。

    更进一步的，提供一种根据上述的甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针的制备方法，包括以下步骤，详细的过程如图1和图2所示：

S1. 母链的合成：

所述的R₀为H、F、Cl、Br 、C_1-6的烷基、C_3-6的环烷基或甲氧基，先与氯乙酸在碱性环境中进行烃基化反应，而后再与氯化亚砜进行氯代反应，得到化合物

；将其再与邻氨基苯甲酸进行缩合反应，得到化合物

 ；再与多聚磷酸（PPA）进行环合反应，得到化合物

；将其进行氯代反应，得到化合物

； 

S2 合成两个探针支链：

探针支链

的合成方法：戊二酸酐与2,4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚在氮气保护条件下进行反应，得到化合物

；随后将其与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐反应，得到化合物

；

探针支链的合成方法：以4- 二乙胺基水杨醛和丙二酸二乙酯为原料，用少量的哌啶催化，经Knoevenagel缩合反应，得到

，然后根据香豆素在碱性条件下开环，酸性条件闭环的特点，先在碱性条件下将其3位的酯键水解，然后在酸性条件下重新闭环得到

, 最后用氯化亚砜将

 制备成酰氯，得到

。

S3目标化合物的合成：

当合成化合物的Y为无取代基，R₂为H、卤素 、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基时，R₀为H、卤素 、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基，采用以下步骤：

S311 将步骤S1的产物

与

在苯酚中进行反应，得到化合物

；

S312 将步骤S311的产物

和步骤S2中获得的

或，进行反应，即得；

当合成化合物的Y为有取代基，R₂为H、卤素 、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基时，R₀为H、卤素 、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基，采用以下步骤：

S321 将步骤S1的产物的喹啉中的氮原子甲基化，得到化合物

，

S322 将步骤S321的产物

与

在乙二醇乙醚中进行反应，得到化合物

，

S323 将步骤S323的产物

与步骤S2中获得的

或

，进行反应，即得；

当合成化合物的Y为无取代基，R₂为-O(CH₂)_nNR₄R₅或-O(CH₂)_aCH₃时，R₀为甲氧基，采用以下步骤：

S331 将步骤S1的产物中的甲基利用三溴化硼脱去，得到化合物

；再利用mitsunobu反应，与HO-R₂进行反应，得到化合物，

S332 将步骤331的产物

与在苯酚中进行反应，得到化合物

；

S333 将步骤S311的产物

和步骤S2中获得的

或

，进行反应，即得。

所述的mitsunobu反应的条件为无水无氧。

    更进一步的提供一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针在异性检测G-四链体结构和在白叶藤碱与G-四链体作用机制中的应用，其特征在于，所述的生物探针为上述的生物探针或者根据上述的制备方法获得的生物探针。

为了更清楚的表达合成过程，提供以下对合成方法的解释说明。

其步骤为：(1)    

（T0）先与氯乙酸在碱性环境中100℃回流，进行烃基化反应得到T1，而后再与氯化亚砜进行氯代反应，得到化合物T2，再将T2与邻氨基苯甲酸进行缩合反应，得到化合物T3，再加入多聚磷酸（PPA）在130℃下进行环合反应，得到化合物T4，将T4与氯化亚砜在80℃回流进行氯代反应，氧化铝柱纯化得到化合物T5，然后在苯酚中与二胺进行反应，得到化合物T6，最后与化合物

或

反应，除去溶剂，先用硅胶柱纯化，后用凝胶柱纯化，得到终产物T9的纯品。

（2）将T5在二氯甲烷作溶剂中利用三溴化硼脱去其甲氧基中的甲基，得到化合物T6-1，然后利用人名反应mitsunobu反应，在无水无氧的条件下与醇胺进行反应，得到化合物T7，接着在苯酚中与二胺进行反应，得到化合物T8，最后与化合物

或

反应，除去溶剂，先用硅胶柱纯化，后用凝胶柱纯化，得到终产物T9的纯品。

（3）将T5用碘甲烷在环丁砜为溶剂的体系中进行甲基化反应，得到化合物T6-2，然后在乙二醇乙醚作,溶剂120℃的条件下与二胺进行亲核取代反应，得到化合物T7-1，最后与化合物

或

反应，除去溶剂，先用硅胶柱纯化，后用凝胶柱纯化，得到终产物T9的纯品。

(4)另一方面，利用戊二酸酐与2,4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚在氮气保护条件下进行反应，得到化合物P1，随后将其与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐反应，硅胶柱纯化得到化合物P2。在100ml 的圆底瓶中加入5.03 克的4- 二乙胺基水杨醛，4.25 克的丙二酸二乙酯，用新蒸的无水乙醇150ml 溶解，加入数滴哌啶，100°C 回流12小时，反应结束后，硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇=80:1），得黄色油状物K1，之后在100ml 的圆底瓶中加入2.11g的K1，用10ml的乙醇溶解，加入10%的NaOH 水溶液，析出黄色固体，100°C 下回流，固体逐渐消失，TLC 跟踪反应，30min 后反应结束，冷却至室温，冰浴下用浓盐酸调 PH至2，析出橙红色固体，抽滤，烘干，得橙红色固体K2，最后在100ml 的圆底瓶中加入0.50 克的XDS-M2 ，用 30ml氯仿溶解，加入4ml的氯化亚砜，60度下回流3小时，减压蒸除溶剂及剩余的氯化亚砜，得到化合物K3，密封保存，留待一步反应。

本发明的所涉及的苯并呋喃喹啉的生物探针与富含鸟嘌呤的C-MYC DNA具有很强的相互作用，能够用于研究11-位取代白叶藤碱衍生物与G-四链体的作用机制。

本发明还提供了上述探针在检测G-四链体结构中的应用。

在上述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构：

1）将待测DNA溶于PH值7.2-7.4的缓冲液，得到溶液A；将该探针溶解，再用PH值7.2-7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；

2）将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为1~3，混合后对混合液进行紫外可见光谱分析或荧光光谱分析，也可以在日光下或者在紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为G-四链体结构；判断方法如下：

（a）对混合液进行紫外可见吸收光谱分析时，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰红移，则可以判断待测DNA为G-四链体结构；若混合液的紫外可见吸收光谱与溶液B相比，最大吸收峰没有红移现象，则可以判断待测DNA为非G-四链体结构；

（b）对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度明显增强，则可以判断待测DNA为G-四链体结构；若混合液的荧光发射强度与溶液B相比，没有明显增强，则可以判断待测DNA为非G-四链体结构。

本发明提供的荧光探针由于融合的荧光基团具有很好的荧光量子产率，因此该类荧光探针的荧光性能很好，其荧光量子产率可以达到0.39。

在上述应用中，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液；所述探针用二甲基亚砜溶解；待测DNA与探针的混合反应时间为2分钟。

在上述应用中当该类生物探针与G-四链体结构作用时，其与探针分子间产生特异性作用，进而紫外光谱和荧光光谱发生改变。

本与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1. 该类探针具有制备简单，易得，便于储存等特点。

2. 本发明提供的探针可以特异性地检测识别G-四链体结构，用简单的紫外可见吸收光谱或者荧光光谱，甚至无需任何仪器，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。

3. 本发明提供的探针能够简便，快捷，可视化研究11位取代白叶藤碱衍生物与G-四链体的作用机制，明确定位该类化合物与G-四链体的作用靶点。

4. 该类探针可以检测荧光光谱信号，观察荧光光谱信号的变化值，对DNA进行定量检测，使得该类探针具有广阔的应用前景。

5. 近年来，BODIPY 被普遍认为是较理想的荧光标记分子，同时，关于BODIPY 类染料已有广泛的研究，大部分BODIPY 衍生物具有较高的量子产率，其量子产率不受溶液PH和极性的影响，更重要的是BODIPY衍生物与单、双链 DNA及G-四链体DNA的结合能力均较差，以上这些特点使其在生物学和光学分析上具备一定的优势。香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等领域。其苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而申请人实验室前期的工作中合成了一系列的白叶藤碱类的化合物，其对G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将香豆素和BODIPY结构融合到白叶藤碱结构当中，利用分子内电荷转移的机理，得到了新型的生物探针探针。

附图说明

图1为一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针的详细合成过程。

图2为探针支链的合成过程。

图3为生物探针BG的紫外滴定图谱。

图4为生物探针BG的紫外滴定拟合后图谱。

图5为生物探针BG的荧光滴定图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。   

实施例1：化合物2T6的合成

将0.3mol氯乙酸溶于60ml水中，用氢氧化钠调PH至9，再加入0.2mol 苯酚，100℃回流，得到化合物T1，而后再加入氯化亚砜进行氯代反应，得到化合物T2，蒸去氯化亚砜溶剂得到棕色液体， 再与邻氨基苯甲酸进行缩合反应，得到T3，而后将PPA预热至130℃加入T3进行化合反应，得到化合物T4，将T4与氯化亚砜在80℃回流进行氯代反应，得到化合物T5，之后将纯化后的T5加入单颈瓶中，并加入苯酚60℃过夜反应，然后加入1,4-丁二胺120℃反应12h，最后将产物通过硅胶柱纯化得到化合物2T6。

产率 ：82% ；熔点：158-159°C；¹H NMR：(400 MHz, CDCl₃)  δ 8.34 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.6 Hz ,1H), 7.54 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 5.69 (s, 1H), 4.02 (s, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.87-1.80 (m, 2H), 1.68-1.61 (m, 2H)；ESI+APCI-MS m/z：306[M+H]⁺。

                       2T6

实施例2：化合物4T7的合成

将0.3mol氯乙酸溶于60ml水中，用氢氧化钠调PH至9，再加入0.2mol 对甲氧基苯酚，100℃回流，得到化合物T1，而后再加入氯化亚砜进行氯代反应，得到化合物T2，蒸去氯化亚砜溶剂得到棕色液体， 再与邻氨基苯甲酸进行缩合反应，得到T3，而后将PPA预热至130℃加入T3进行化合反应，得到化合物T4，将T4与氯化亚砜在80℃回流进行氯代反应，得到化合物T5，之后将纯化后的T5用碘甲烷在环丁砜为溶剂的体系中进行甲基化反应，得到化合物T6,将T6-2加入单颈瓶中，利用乙二醇乙醚作溶剂，与 N,N-双（3-氨丙基）甲胺于120℃反应30min，最后加入大量无水乙醚，析出沉淀，过滤干燥得化合物4T7。

产率：95%；¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.69 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.03 – 7.97 (m, 2H), 7.83 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 9.2, 2.3 Hz, 1H), 4.59 (s, 3H), 4.17 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.99 (s, 3H), 3.25 – 3.17 (m, 2H), 3.13 (dd, J = 12.2, 6.6 Hz, 2H), 3.03 – 2.93 (m, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.25 – 2.14 (m, 2H), 1.84 – 1.70 (m, 2H)；C₂₄H₃₁N₄O₂ ⁺ , ESI+APCI-MS m/z：408[M-I] ⁺。

化合物4T7

实施例3：化合物5T8的合成

方法同实施例二，不同的是将T5在二氯甲烷作溶剂中，利用三溴化硼脱去甲氧基中的甲基，得到化合物T6-1，然后利用人名反应mitsunobu反应，在无水无氧的条件下与N,N-二甲基乙醇胺进行反应，经硅胶柱纯化后得到化合物T7-1，将T7-1加入单颈瓶中，并加入苯酚60℃过夜反应，然后加入1,4-丁二胺于120℃反应12h，最后将产物通过硅胶柱纯化得到化合物5T8。

产率：84%；熔点：176-177°C ；¹H NMR：(400 MHz, CDCl₃)δ 8.15 (d, J=8.3 Hz,1H),7.94 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.78 (d, J=2.5 Hz, 1H), 7.61 (t, J=7.2 Hz, 1H), 7.42-7.36 (m, 2H), 7.19 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 4.14 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.99 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.80-2.74 (m, 4H), 2.34 (s, 6H), 1.87-1.76 (m, 2H), 1.67-1.60 (m, 2H)；ESI+APCI-MS m/z ：393 [M+H] ⁺。

化合物5T8

实施例4：化合物P2的合成

利用戊二酸酐与2,4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚在氮气保护条件下进行反应，得到化合物P1，随后将其与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐反应，硅胶柱纯化得到化合物P2。

产率 20% 。¹H NMR：(400 MHz, CDCl₃) δ 6.06 (s, 2H), 3.20-3.02 (m, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.80 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.51 (s, 6H),  2.42 (s, 6H), 2.12-2.00 (m, 2H) ；ESI+APCI-MS m/z ：430 [M+H]⁺。

化合物P2

实施例5：化合物BA的合成

在100ml 的圆底瓶中加入0.1克的2T6，用20ml的干燥氯仿溶解，冰浴下滴加K3 ( 新鲜制备, eq=1.5) 的氯仿溶液，滴加完后转为室温反应，TLC跟踪反应，反应 6 小时，反应结束后，硅胶柱层析纯化（二氯甲烷：甲醇=40:1），得黄色固体BA。

产率: 95%; 熔点: 173-174°C；¹H NMR：(400 MHz, CDCl₃) δ 8.97 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 8.89 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.45 (d, J  = 8.6 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.45 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.13 (t,  J = 7.7 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.19 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.56 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.45 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 2.10-1.93 (m, 2H), 1.91-1.77 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 6H) ；HRMS (ESI)：[M+H]⁺(C₃₃H₃₂N₄ O₄) calcd 549.2496, found 549.2514 。  

化合物BA

实施例6：化合物BB的合成

在100ml 的三颈瓶中加入0.1 克的2T6，及0.4 克的P2（eq=3），用60ml的干燥氯仿溶解，氮气保护，避光，室温反应3 天，TLC 跟踪反应，反应结束后，硅胶柱层析纯化（梯度洗脱，二氯甲烷：乙酸乙酯=120:1 ，石油醚：乙酸乙酯：乙酸=80:40:1 ，二氯甲烷：甲醇=10:1），得红色固体。

产率88% ，熔点：164-165°C；¹H NMR：(400 MHz, CDCl₃) δ 8.37 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 7.3 Hz ,1H), 7.52 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.41 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.29 (t, J = 7.2 Hz ,1H), 5.99 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.35 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 3.01-2.87 (m, 2H), 2.50 (s, 6H), 2.36 (s, 6H), 2.30 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.97-1.89 (m, 2H), 1.88-1.77 (m, 2H), 1.74-1.67 (m, 2H)；HRMS (ESI)：[M+H]⁺( C₃₆H₃₈N₅ O₂ BF₂) calcd 622.3166, found 622.3204 。

化合物BB

实施例7：化合物BC的合成

方法同实施例五， 不同的是用5T8代替2T6进行反应。

产率 93% ，熔点：160-161°C；¹H NMR：(400 MHz, CDCl3) δ 8.93 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.17 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.2 Hz ,1H), 7.48 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.43 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 6.65 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 5.41 (s, 1H), 5.30 (s, 1H), 4.23 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.13 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 3.58 (dd, J = 6.4 Hz, 2H), 3.46 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 2.82 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.39(s, 6H), 2.12-1.71 (m, 4H), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 6H) ；HRMS (ESI)：[M+H]+(C37H41N5O5) calcd 636.3180, found 636.3197 。

化合物BC

实施例8：化合物BD的合成

方法同实施例六，不同的是用5T8代替2T6进行反应，最后将硅胶柱纯化出的产物，再经过葡聚糖凝聚柱纯化，得到橙红色固体。

产率 75% ，熔点：153-154°C；¹H NMR： (400 MHz, CDCl₃)δ 8.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.63 (t, J = 7.0 Hz 1H), 7.42 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.20 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 5.60 (s , 1H), 5.26 (s, 1H), 4.20 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.07 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 3.36 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 2.99-2.90 (m, 2H), 2.80 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.50 (s, 6H), 2.37 (s, 6H), 2.36 (s, 6H),2.27 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.00-1.89 (m, 2H), 1.89-1.78 (m, 2H), 1.76-1.70 (m, 2H) ；HRMS (ESI)：[M+H]⁺(C₄₀H₄₇N₆O₃BF₂) calcd 709.3850, found 709.3851。

化合物BD

实施例9：化合物BE的合成

方法同实施例二，不同的是将纯化后的T5加入到100mL的单颈瓶中，然后加入苯酚60℃过夜反应，之后再加入N,N-双（3-氨丙基）甲胺反应12h，反应完后利用硅胶柱除去溶剂苯酚和过量的N,N-双（3-氨丙基）甲胺。将得到的化合物取0.1g在100ml 的三颈瓶中，并加入0.4 克的P2（eq=3），用60ml的干燥氯仿溶解，氮气保护，避光，室温反应3 天，TLC 跟踪反应，反应结束后，硅胶柱层析纯化（梯度洗脱，二氯甲烷：乙酸乙酯=120:1 ，石油醚：乙酸乙酯：乙酸=80:40:1 ，二氯甲烷：甲醇=10:1），得红色固体。

产率：83%；熔点：159.2-160.4°C； 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.17 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.42–7.35 (m, 2H), 7.29 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, 1H), 5.93 (s, 2H), 4.16 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.35 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.05 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.97–2.88 (m, 4H), 2.60 (s, 3H), 2.45 (s, 6H), 2.38 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 2.35 (s, 6H), 2.26–2.20 (m, 2H), 2.01–1.96 (m, 2H), 1.95–1.88 (m, 2H)；HRMS (ESI)：[M+H]⁺（C₄₀H₄₇N₆O₃BF₂）calcd 709.3850, found 709.3719。

 

化合物BE

实施例10：化合物BF的合成

方法同实施例八，不同的是用4T7代替5T8进行反应。

产率：85%；熔点：178.4-180.7°C；¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.37 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.89 ( t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 9.1, 2.3 Hz, 1H), 5.66 (s, 2H), 4.29 (s, 3H), 4.16 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.18 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.50 – 2.41 (m, 2H), 2.32 – 2.20 (m, 4H), 2.17 (s, 6H), 2.07 (s, 6H), 1.86 – 1.78 (m, 2H), 1.59 – 1.46 (m, 2H)；HRMS (ESI)：[M-I]⁺（C₄₁H₅₀IN₆O₃BF₂）calcd 723.4007, found 723.4037。

化合物BF

实施例11：化合物BG的合成

方法同实施例九，不同的是将T7代替T5进行反应。

产率：69%；熔点：156.3-158.5°C； ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.21 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.48–7.40 (m, 2H), 7.30 (t, J = 3.5 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 1H), 5.94 (s, 2H), 4.83 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 4.15 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.35 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.15 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.98–2.90 (m, 4H), 2.61 (s, 3H), 2.56 (t, J = 4.8，2H), 2.50 (s, 6H), 2.46 (s, 6H), 2.38 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 2.36 (s, 6H), 2.24–2.18 (m, 2H), 2.03–1.99 (m, 2H)，1.95–1.89 (m, 2H)； ESI+APCI-MS m/z（C44H56N7O3BF2）：780 [M+H] ⁺.

                       化合物BG

实施例12: 本专利所述苯并呋喃喹啉生物探针对G-四链体的稳定能力。

选择实施例七～十一制备的生物探针，采用荧光共振能量转移(FRET)  熔点实验考察该系列化合物对端粒末端能够形成G-四链体DNA的富G 序列F21T（FAM-d[G3(T2 AG3)3]-TAMRA），癌 基 因 C-MYC 启动子区域富G序列Pu22（FAM-d[TGAG3TG3TAG3TG3 TA2]-TAMRA）,以及不能形成G-四链体的双链DNA F10T, 其稳定G-四链体的ΔTm值如表1所示。结果表明，该类化合物对Pu22具有较好的稳定能力，尤其是化合物BE，其稳定G-四链体的 ΔTm值高达11℃，而且其对F21T和不能形成G-四链体的DNA F10T几乎没有作用，因此说明该类探针对C-MYC 序列的G-四链体具有很好的选择性。

实施例13: 本专利所述苯并呋喃喹啉生物探针对与C-MYC G-四链体的结合能力。

选择实施例七～十一制备的生物探针，利用紫外滴定实验研究该类生物探针与G-四链体的结合能力。结果如图3和图4以及表2所示，由结果可知，该类生物探针与Pu27具有很强的结合能力，因此该种生物探针可用于研究白叶藤碱衍生物与G-四链体的作用机制。

实施例14: 本专利所述苯并呋喃喹啉生物探针定量检测G-四链体。

    选择实施例七～十一制备的生物探针，利用荧光滴定实验定量检测G-四连体。通过荧光滴定实验可以说明当该类化合物与G-四链体(Pu27)作用时其荧光强度增强，结果如图5所示，当与双链ds26作用时其荧光几乎没有增强，可以进一步说明该类荧光探针与G-四链体（Pu27）作用很明显，而与双链几乎没有作用。而且荧光强度的变化值与滴加入的Pu27的量成正比，根据定量关系，可用于检测G-四链体。

Claims (8)

1.一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针，其特征在于，化学结构式如I所示： 

R₁为H、卤素、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基； 

R₂为H、卤素、C_1-6的烷基、C_3-6的环烷基、-O(CH₂)_aCH₃或-O(CH₂)_nNR₄R₅；所述的a为0、1、2或3， 

R₃为-NHR₆、-R₇(CH₂)_nR₆; 

R₄、R₅为C_1-6的烷基、C_3-6环烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基或吡噁啉基； 

R₆为

或

R₇为NH、O、S、NCH₃或CH₂

X为C、N、O或S； 

Y为无取代基或带正电荷的C_1-6的烷基； 

所述的n为0、1、2、3或4。 

2.根据权利要求1所述的甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针，其特征在于，所述的Y为无取代基，R₁为H、F、I或Br，X为O，R₇为N(CH₃)。 

3.根据权利要求1所述的甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针，其特征在于，R₂为H、-O(CH₂)_aCH₃、C_1-6的烷基或-O(CH₂)_nNR₄R₅，所述的a为0、1、2或3，所述的R₄、R₅为C_1-6的烷基。 

4.根据权利要求3所述的甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针，其特征在于，所述的R₄、R₅为C_1-3的烷基。 

5.根据权利要求1所述的甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针，其特征在于，所述的R₂取代在5位点上，R₁取代在15位点上。 

6.一种根据权利要求1所述的甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

S1.母链的合成： 

所述的R₀为H、F、Cl、Br、C_1-6的烷基、C_3-6的环烷基或甲氧基，先与氯乙酸在碱性环境中进行烃基化反应，而后再与氯化亚砜进行氯代反应，得到化合物将其再与邻氨基苯甲酸进行缩合反应，得到化合物 

再与多聚磷酸（PPA）进行环合反应，得到化合物 

将其进行氯代反应，得到化合物 

S2合成两个探针支链： 

探针支链

的合成方法：戊二酸酐与2,4-二甲基吡咯、 三氟化硼乙醚在氮气保护条件下进行反应，得到化合物

随后将其与N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐反应，得到化合物

探针支链的合成方法：以4-二乙胺基水杨醛和丙二酸二乙酯为原料，用少量的哌啶催化，经Knoevenagel缩合反应，得到 

然后根据香豆素在碱性条件下开环，酸性条件闭环的特点，先在碱性条件下将其3位的酯键水解，然后在酸性条件下重新闭环得到 

最后用氯化亚砜将

制备成酰氯，得到 

S3目标化合物的合成： 

当合成化合物的Y为无取代基，R₂为H、卤素、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基时，R₀为H、卤素、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基，采用以下步骤： 

S311将步骤S1的产物与

在苯酚中进行反应，得到化合物

S312将步骤S311的产物

和步骤S2中获得的 

或进行反应，即得； 

当合成化合物的Y为有取代基，R₂为H、卤素、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基时，R₀为H、卤素、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基，采用以下步骤： 

S321将步骤S1的产物

的喹啉中的氮原子甲基化，得到化合物

S322将步骤S321的产物

与

在乙 二醇乙醚中进行反应，得到化合物

S323将步骤S323的产物与步骤S2中获得的 

或

进行反应，即得； 

当合成化合物的Y为无取代基，R₂为-O(CH₂)_nNR₄R₅或-O(CH₂)_aCH₃时，R₀为甲氧基，采用以下步骤： 

S331将步骤S1的产物

中的甲基利用三溴化硼脱去，得到化合物

再利用mitsunobu反应，与HO-R₂进行反应，得到化合物

S332将步骤331的产物

与

在苯酚 中进行反应，得到化合物

S333将步骤S311的产物

和步骤S2中获得的 

或

进行反应，即得。 

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的mitsunobu反应的条件为无水无氧。 

8.一种甲基苯并呋喃喹啉类的生物探针在异性检测G-四链体结构和在白叶藤碱与G-四链体作用机制中的应用，其特征在于，所述的生物探针为权利要求1的生物探针或者根据权利要求6的制备方法获得的生物探针。 

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