CN103728294A - 二苯并咪唑联咔唑类化合物在用于特异性结合核酸g-四链体结构及在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及二苯并咪唑联咔唑类化合物，特别涉及二苯并咪唑联咔唑类化合物在用于特异性结合核酸G-四链体结构中的应用，以及在抗肿瘤药物中的应用。本发明将二苯并咪唑联咔唑类化合物在pH值6～8的缓冲液中与待测核酸样品进行孵育，通过观察紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰出现明显增强，或观察荧光光谱在430～540nm范围内是否出现荧光峰，来检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸。将二苯并咪唑联咔唑化合物作为药物加入到含有肿瘤细胞的培养液中，与肿瘤细胞一起培养，用于抑制肿瘤细胞的增殖；或作为药物的主要活性成分用于抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的方法具有简单、快捷、廉价的优点。
Description
技术领域
本发明涉及二苯并咪唑联咔唑类化合物，特别涉及二苯并咪唑联咔唑类化合物在用于特异性结合核酸G-四链体结构中的应用，以及在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
G-四链体（G-quadruplex）是一类特殊的核酸二级结构。其是由富G的核酸链，通过链间或链内对应的G碱基之间形成Hoogsteen碱基配对，从而使四条或四段富G的核酸片段聚集形成的一种特殊的核酸二级结构[S.Burge etal.Nucleic Acids Res,2006,34,5402-5415]。据报道，人类基因组中大约包含了376000个有形成G-四链体倾向的序列。富含鸟嘌呤的核酸的序列在生物体中一些关键的基因组区域普遍存在，比如染色体端粒（telomeres），基因启动因子（gene promoters）、生长控制基因（growth control genes）、mRNA、免疫球蛋白开关区域[J.L.Huppert et al.Nucleic Acids Res,2005,33,2908-2916；2007,35,406-413；A.K.Todd et al.Nucleic Acids Res,2005,33,2901-2907]。虽然基因中大部分可形成G-四链体序列的功能还不清楚，但越来越多的证据说明G-四链体在生物过程中发挥着重要作用，例如，G-四链体结构参与端粒功能的调控，与癌症、HIV和其他疾病的形成机制密切相关等[T.A.Brooks et al.FEBSJournal2010,277,3459-3469]。因此发展对G-四链体结构具有选择性光学响应的分子探针对G-四链体结构与功能的研究具有重要的意义。G-四链体生物功能的发现也使G-四链体成为重要的药物作用靶点，用于发现新的抗肿瘤类药物[S.Balasubramanian et al.Nat Rev DrugDiscov,2011,10,261-275]。
目前人们已发现了一些可与核酸G-四链体结合的化合物，其中有些化合物表现出杀肿瘤细胞以及抑制肿瘤细胞增殖的活性。但大部分可与G-四链体结合的化合物对G-四链体的选择性不高，可同时与核酸单链和双链结合，如果以其作为药物则具有较高的副作用[T.Ou et al.ChemMedChem2008,3,690-713]。另外，大部分化合物与G-四链体结合后其光学性质变化不明显，不能用于G-四链体结构的探测。苯并咪唑类化合物具有广泛的生物活性，如抗癌、抗真菌、消炎、治疗低血糖和生理紊乱等，是一类很重要的药物中间体，在医学和药学领域被广泛应用[S.Bhattacharya et al.Curr Med Chem,2008,15,1762-1777]。很多苯并咪唑化合物可与核酸结合，用苯环和吡啶环相连的V型二苯并咪唑衍生物可与G-四链选择性结合，但没有显著的光学特性变化[A.K.Jain et al.Biochemistry-Us,2009,48,10693-10704；G.R.Li et al.ChemCommun,2008,4564-4566]。咔唑衍生物具有高的光稳定性，广泛用于光电材料中，也是重要的药物中间体[L.Z.Zhanget al.Macromol Chem Phys,2012,213,57-63；H.X.Shaoet al.J Lumin,2007,127,349-354.]。以咔唑连接二苯并咪唑形成的新月型分子，具有较大的芳香平面中心（即二苯并咪唑联咔唑母核），对G-四链体结构具有高的选择性，同时引入光学基团——咔唑，可实现对G-四链体结构的探测。
发明内容
本发明的目的之一在于提供作为分子探针的二苯并咪唑联咔唑类化合物在用于特异性结合核酸G-四链体结构中的应用，以及在抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之二在于提供一类可与核酸G-四链体选择性结合的二苯并咪唑联咔唑类化合物。
本发明目的之三在于提供一类干扰G-四链体生物功能的二苯并咪唑联咔唑类化合物。
本发明目的之四在于提供一类具有肿瘤细胞增殖抑制活性的抗肿瘤的二苯并咪唑联咔唑类化合物。
G-四链体是一类特殊的核酸二级结构，在生命过程中发挥着重要作用，与癌症、HIV和其他疾病的形成机制密切相关。本发明的主要目的在于提供二苯并咪唑联咔唑类化合物在对核酸G-四链体结构的高特异性结合中的应用，包括作为分子探针检测核酸G-四链体结构，作为干扰G-四链体功能的药物中的应用，用于抗肿瘤细胞增殖。
本发明所提供的二苯并咪唑联咔唑类化合物具有以下结构式：
式中R1选自碳原子数为1～10的直链、支链或成环的烷基，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基中的一种。
R2和R3独立地选自H，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～15的直链、支链或成环的烷基，含有取代基的碳原子数为2～10的含有N、O或S的杂环基，含有取代基的碳原子数为6～10的芳基中的一种。
所述的取代基选自羟基、胺基、巯基、卤素中的一种。
所述的含有N、O或S的杂环基为含有N、O或S的五元、六元或七元杂环或苯并杂环。
所述的芳基为苯基或萘基。
所述的卤素选自F、Cl、Br、I中的一种。
可与核酸G-四链体结合的分子一般由一个大的平面芳香核心结构和侧链组成，平面芳香核心结构与核酸G-四链体中的四个G-碱基形成的G-四分体（G-quartet）平面形成π-π堆积相互作用，侧链则与核酸G-四链体结构的沟槽处基团作用，影响结合力的大小[T.Ou et al.ChemMedChem2008,3,690–713]。因此，平面芳香核心结构的大小和形状对该分子与核酸G-四链体结合的选择性起决定性作用。平面芳香核心结构小的分子可与核酸碱基发生π-π堆积相互作用，从而可与所有核酸分子结合，选择性不高。通过分子模拟可发现（如图1a及图1b所示）二苯并咪唑联咔唑的核心结构可形成新月型（类似于V型）的平面共轭结构，平面共轭结构的尺寸略大于核酸G-四链体中的G-四分体平面，因此，可与G-四分体平面发生π-π堆积相互作用，且使侧链位于沟槽区。因此二苯并咪唑联咔唑的核心结构具有较好的选择性结合核酸G-四链体的能力。因此含二苯并咪唑联咔唑核心结构的化合物可用做分子探针检测核酸G-四链体，可干扰核酸G-四链体生物功能，具有抑制肿瘤细胞增殖活性的特点。
由上述，本发明提供了作为分子探针的二苯并咪唑联咔唑类化合物在用于特异性结合核酸G-四链体结构中的应用，以及二苯并咪唑联咔唑类化合物在抗肿瘤药物中的应用。
所述的在用于特异性结合核酸G-四链体结构中的应用，是将所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物在pH值6～8的缓冲液中分别与待测核酸样品以及参比核酸样品（单链核酸或双链核酸）混合进行孵育，通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰出现增强，并高于参比核酸样品（单链核酸或双链核酸）混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰，来检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸；或通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现荧光峰且荧光强度升高，并高于参比核酸样品（单链核酸或双链核酸）混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现的荧光强度，来检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸。
具体检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸的方法为:
1）将待检测核酸样品和参比核酸样品（单链核酸或双链核酸）分别溶于pH值6～8的缓冲液中，分别得到溶液A及溶液B，其中，溶液A中的待检测核酸样品的浓度范围为0.5～50μM，溶液B中的参比核酸样品的浓度范围为0.5～50μM；将二苯并咪唑联咔唑类化合物用二甲基亚砜溶解后，再用pH值6～8的缓冲液稀释到浓度范围为0.5～20μM，得到溶液C；
2）将步骤1）得到的溶液A和溶液C，及溶液B和溶液C分别充分混合，然后将得到的两种混合液分别进行孵育（一般孵育的时间为10分钟左右），其中，两种混合液中的待检测核酸或参比核酸分别与二苯并咪唑联咔唑类化合物的摩尔比值为1≤摩尔比值≤6；通过紫外分光光度计，对孵育后的混合液进行紫外-可见吸收光谱分析，通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰出现增强，并高于参比核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰；则待测核酸确认为G-四链体结构的核酸；反之，则为非G-四链体结构的核酸；
或将步骤1）得到的溶液A和溶液C，及溶液B和溶液C分别充分混合，然后将得到的两种混合液分别进行孵育（一般孵育的时间为10分钟左右），其中，两种混合液中的待检测核酸或参比核酸分别与二苯并咪唑联咔唑类化合物的摩尔比值为0.2≤摩尔比值≤6；通过荧光光谱仪，对孵育后的混合液进行荧光光谱分析，通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现荧光峰且荧光强度升高，并高于参比核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现的荧光强度（一般高于参比核酸样品混合液的荧光强度的2倍以上），则待测核酸确认为G-四链体结构的核酸；反之，则为非G-四链体结构的核酸。
所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物在抗肿瘤药物中的应用，是将二苯并咪唑联咔唑化合物作为药物加入到含有肿瘤细胞的培养液中，与肿瘤细胞一起培养，用于抑制肿瘤细胞的增殖；或作为药物的主要活性成分用于抑制肿瘤细胞的增殖。
所述的将二苯并咪唑联咔唑化合物作为药物加入到含有肿瘤细胞的培养液中，其中，二苯并咪唑联咔唑类化合物在含有肿瘤细胞的培养液中的浓度范围为0.1～30μM。
所述的作为药物的主要活性成分用于抑制肿瘤细胞的增殖，其中，二苯并咪唑联咔唑类化合物在药物中的质量含量30～80%。
所述的核酸G-四链体的序列为EAD：d(CTGGGTGGGTGGGTGGGA)；c-myc(Pu27)：d(TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG)；c-kit2：
d(CGGGCGGGCGCGAGGGAGGG)。
所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
本发明的二苯并咪唑联咔唑类化合物的合成路线为：
本发明的二苯并咪唑联咔唑类化合物的制备方法包括以下步骤：
（1）将HR2化合物（所述R2基团为二乙基氨基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基）与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺和缚酸剂（如碳酸钾或碳酸钠等）溶于干燥的二甲基甲酰胺（DMF）中，然后于温度为60～140℃下反应得到化合物
然后将化合物
溶解在醇中，在还原剂（还原剂与化合物的摩尔比为1≤摩尔比≤10；优选还原剂为氯化亚锡等）或在不断通入H2及使用催化量的催化剂（优选为Pd/C）的条件下，将化合物
还原得到化合物
其中HR2化合物与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺的摩尔比为1：1～3：1；缚酸剂与HR2化合物的摩尔比为1≤摩尔比≤3；
将HR3化合物（所述R3基团为二乙基氨基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基）与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺和缚酸剂（如碳酸钾或碳酸钠等）溶于干燥的二甲基甲酰胺（DMF）中，然后于温度为60～140℃下反应得到化合物
然后将化合物溶解在醇中，在还原剂（还原剂与化合物
的摩尔比为1≤摩尔比≤10；优选还原剂为氯化亚锡等）或在不断通入H2及使用催化量的催化剂（优选为Pd/C）的条件下，将化合物
还原得到化合物
其中HR3化合物与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺的摩尔比为1：1～3：1；缚酸剂与HR3化合物的摩尔比为1≤摩尔比≤3；
（2）将带有R1基团的碘甲烷、1，2-二溴乙烷或4-溴四氢吡喃等在氢化钠的作用下与咔唑在温度为0℃～120℃的条件下反应得到化合物
其中，氢化钠与咔唑的摩尔比为1≤摩尔比≤10，带有R1基团的碘甲烷、1，2-二溴乙烷或4-溴四氢吡喃与咔唑的摩尔比为1≤摩尔比≤3；将化合物
与POCl3和二甲基甲酰胺（DMF）的反应产物（Vilsmeier Haack反应），在溶剂1，2-二氯乙烷存在的条件下，于温度为90～120℃下反应得到
的粗产品；将得到的
粗产品通过重结晶或柱层析得到纯品；其中：化合物
与POCl3和二甲基甲酰胺（DMF）的反应产物的摩尔比为1：2～1：10；
上述的R1选自碳原子数为1～10的直链、支链或成环的烷基，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基中的一种；
（3）将步骤（2）得到的
纯品与步骤（1）得到的
和以化合物
化合物化合物
的摩尔比为1:1:1的比例，在醇中（优选在醇中进一步加入焦亚硫酸钠）于温度为60～90℃反应得到所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物，结构为：
所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物结构中的R1、R2及R3的定义同前所述。
上述得到的二苯并咪唑联咔唑类化合物可进一步进行重结晶或柱层析得到纯品。
所述的醇为甲醇或乙醇等。
所述的HR2化合物及所述的HR3化合物分别选自二乙胺、4-哌啶甲醇、吗啉、1-甲基哌嗪、1-(3-甲氧基苯基)哌嗪、1-(4-氯苯基)哌嗪二盐酸盐、1-(2-羟乙基)哌嗪、1-[(3-吡啶基)甲基]哌嗪、哌嗪-1-甲酰二甲胺、1-(2-苯氧基乙基)哌嗪、1-(2-糠酰)哌嗪和1-(2-四氢呋喃甲酰基)哌嗪中的一种。
本发明用紫外-可见吸收光谱以及荧光光谱的变化探讨了二苯并咪唑联咔唑类化合物与核酸G-四链体的相互作用，以及作为对比的与单链核酸、双链核酸的相互作用。
因本发明的二苯并咪唑联咔唑类化合物含有大的共轭芳香平面结构，可与核酸G-四链体的G-四分体平面形成π-π堆积而结合（见图1b），但单链核酸、双链核酸的结构中没有大的芳香平面结构，因此不能与二苯并咪唑联咔唑类化合物结合。通过-可见吸收光谱以及荧光光谱可快速判断溶液中核酸的结构为G-链体结构还是单链核酸、双链核酸结构。
在二苯并咪唑联咔唑类化合物的结构中，由于苯并咪唑与咔唑间具有可以旋转的单键，使分子成为具有一定的柔韧性的共轭平面，使其比较容易堆积在G四分体平面之上，进而与G-四链体具有较强的亲和力，其特殊的新月形结构使其与其它二级结构如双链核酸结合较弱。由于分子具有较大的共轭平面，容易在水溶液体系中通过范德华力形成分子间的聚集体，导致二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外/可见光吸收降低，同时其中的含氮基团与水相互作用产生非辐射跃迁导致其荧光消失，所以当二苯并咪唑联咔唑类化合物与核酸G-四链体样品混合时，其与G-四链体相互作用使聚集体解聚集，从而以单体的形式与G-四链体中的G-四分体平面通过π-π堆积相互作用结合，限制了单键的旋转，使共轭程度增大，导致新吸收带出现。同时，与G-四链体的结合屏蔽了其与水分子的相互作用，导致化合物荧光大大增强。
本发明同时研究了二苯并咪唑联咔唑类化合物的抗肿瘤的作用。
G‐四链体结构广泛存在于端粒和基因启动子区，特别是一些与肿瘤相关的基因的启动子区具有多段可形成G‐四链体的序列[S.Balasubramanian et al.NatRevDrugDiscov,2011,10,261-275]。G‐四链体结构参与调控相关基因的表达，因此与G‐四链体结合的分子可干扰G‐四链体相关的生物学功能。很多能与G‐四链体结合的化合物表现出杀肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖活性的能力。但大部分化合物对G‐四链体的选择性不高，可同时与核酸单链和双链结合，因此对正常细胞产生较大的毒性。因此对G‐四链体选择性高的分子将有助于减少其对正常细胞的毒副作用。我们将二苯并咪唑联咔唑化合物加入到含有肿瘤细胞的培养液中，与肿瘤细胞一起培养，发现其确实有较高的抑制肿瘤细胞增殖活性的作用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1）本发明所提供的二苯并咪唑联咔唑类化合物容易合成，并且十分稳定，便于储存，量子产率较高，具有较强的抑制肿瘤细胞增殖活性的作用，有作为抗肿瘤药物的潜力。
2）本发明所提供的二苯并咪唑联咔唑类化合物可以特异性的结合G-四链体结构，实现了与单链核酸或双链核酸结构的区别，利用紫外/可见吸收光谱和荧光光谱即可区别核酸G-四链体结构，简单，快捷，成本低廉，可实时实地的进行检测。
以下通过附图及实施例进一步对本发明进行说明，其是为了便于更好的理解本发明，但并不是对本发明进行限定。
附图说明
图1a.G-四分体平面和化合物E1的分子模拟结构。
图1b.化合物E1堆积在G-四分体表面的分子模拟结构。
图2a.本发明实施例7的不同浓度的EAD对化合物E1的紫外滴定谱图；8μM化合物E1随着加入的EAD升高，紫外光谱图的变化。
图2b.本发明实施例7的六种DNA与10μM化合物E1作用后化合物E1的紫外吸收光谱变化（虚线部分代表没有加入DNA时化合物E1的紫外吸收光谱）。
图3a.本发明实施例7的1μM化合物E1与不同DNA作用后的荧光激发光谱。
图3b.本发明实施例7的1μM化合物E1与不同浓度EAD作用后的荧光光谱变化（箭头代表随EAD浓度的增加荧光光谱变化）。
图4.本发明实施例7的化合物E1对MCF-7和A549两种细胞的增殖抑制活性。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明。利用本发明所提供的二苯并咪唑联咔唑化合物（如化合物E1），通过紫外-可见吸收光谱实验证明，本发明所提供的二苯并咪唑联咔唑化合物（如化合物E1）在水溶液中由于分子之间存在较强的范德华力，出现自聚集现象，紫外-可见吸收光谱中主要存在聚集形式的特征吸收峰，而在有机溶剂中（例如乙醇），则以单体的形式存在，相应的紫外-可见吸收光谱增强，谱图主要表现为单体的吸收。由于其大的共轭体系和相对柔性的结构，使得二苯并咪唑联咔唑化合物（如化合物E1）在水溶液中特异性的与核酸G-四链体结构结合。在缓冲液中，化合物E1的聚集形式在核酸G-四链体的存在下，都被解聚成为单体，紫外-可见吸收光谱存在明显变化，荧光增强。而在双链或单链核酸的存在下，吸收光谱变化小，荧光非常弱。
实施例1：化合物E1的合成：
（1）将1-甲基哌嗪（690mg，6.9mmol）与5-氯-2-硝基苯胺（1g，5.8mmol）和碳酸钾（1.25g，9mmol）溶于干燥的DMF（6mL）中，在温度为110℃下反应6小时得到粗产品，将得到的粗产品置于水中，粗产品在水中悬浮，用乙酸乙酯萃取，所得有机相用水洗三次，然后用无水MgSO4干燥；以氯仿作为淋洗剂过中性氧化铝柱层析提纯得到1.1g的亮黄色固体，即为化合物A1，产率81%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.01(d,J=9.7Hz,1H),6.28(dd,J=9.7,2.7Hz,1H),6.14(s,2H),5.95(d,J=2.6Hz,1H),3.49-3.25(m,4H),2.61-2.42(m,4H),2.34(s,3H)。所述的化合物A1的结构为：
将得到的化合物A1溶解在乙醇中，加入质量含量为10%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B1溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B1的结构为：
（2）将溶解在8mL的DMF中的咔唑（2.5g，15mmol），在10分钟内分批加入到氢化钠（60%，0.7g，17mol）中，于温度为0℃的条件下进行反应，在体系无气泡冒出后，逐滴加入碘甲烷（2.3g，16mmol），于温度为0℃的条件下进行反应1小时后，将反应液逐滴加入到水中，过滤，得到灰白色沉淀固体粗产品；将粗产品使用石油醚重结晶，得到2.44g的白色晶体9-甲基咔唑化合物C1，产率90%。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.17–8.12(m,2H),7.53(ddd,J=8.2,7.1,1.2Hz,2H),7.45(d,J=8.2Hz,2H),7.31–7.25(m,2H),3.89(s,3H)。所述的化合物C1的结构为：
（3）将POCl3（6g，40mmol）逐滴加入到0℃的DMF（2.92g，40mmol）中进行反应，然后将体系恢复至室温，然后加入溶解在6mL的1,2-二氯乙烷中的步骤（2）得到的9-甲基咔唑化合物C1（724mg，4mmol），于温度为90℃下反应24小时，之后倾入水中，用氯仿萃取，氯仿层用水洗三次，旋去溶剂得到深色的粗产品后，用石油醚：乙酸乙酯=7:3作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到260mg化合物D1产品；产率：27.4%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.14(s,2H),8.66(s,2H),8.10(dd,J=8.5,1.4Hz,2H),7.55(d,J=8.5Hz,2H),3.97(s3H)。所述的化合物D1的结构为：
（4）将步骤（1）得到的化合物B1溶液，按照化合物B1与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到乙醇中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，回流反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E1。产率：40%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.55(s,2H),7.89(d,J=8.5Hz,2H),7.40(d,J=8.7Hz,2H),7.29(d,J=8.6Hz,2H),6.98(s,2H),6.94(d,J=8.8Hz,2H),3.64(s,3H),3.14(s,8H),2.63(s,8H),2.36(s,6H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ153.88,149.21,143.24,139.99,135.92,125.58,123.88,121.99,119.47,116.38,115.83,110.08,101.99,56.15,51.60,46.07,29.30.HRMS(EI-TOF)calcd for C37H39N9[M]+609.3328,found609.3336。所述的化合物E1的结构为：
实施例2：化合物E2的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-(2-羟乙基)哌嗪代替1-甲基哌嗪，140℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A2。产率：90%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.02(d,J=9.3,1H),6.29(dd,J=9.3,J=2.7,1H),6.1(bs,2H,NH2),5.95(d,J=2.7Hz,1H),3.8(t,4H),3.7(t,2H),2.59-2.65(m,6H)。所述的化合物A2的结构为：
将得到的化合物A2溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B2溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B2的结构为：
（2）步骤（2）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物4-溴四氢吡喃代替碘甲烷，100℃反应过夜，得到无色固体化合物C2。产率：40%；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.12(d,2H,J=7.5Hz),7.59(d,2H,J=8.0Hz),7.46(t,2H,J=7.5Hz),7.24(d,2H,J=8.0Hz),4.75(tt,1H,J=4.5,12.5Hz),4.24(d,2H,J=14.0Hz),3.70(td,2H,J=2.0,12.5Hz),2.80(td,2H,J=4.5,12.5Hz),1.87(dt,2H,J=2.0,14.0Hz)。所述的化合物C2的结构为：
（3）步骤（3）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物C2代替化合物C1，100℃反应24小时，得到化合物D2产品。产率：32%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.53(s,2H),8.76(s,2H),8.10(dd,J=8.5,1.4Hz,2H),7.46(t,2H,J=7.5Hz),4.69(tt,1H,J=4.5,12.5Hz),4.23(d,2H,J=14.0Hz),3.90(td,2H,J=2.0,12.5Hz),2.70(td,2H,J=4.5,12.5Hz),1.89(dt,2H,J=2.0,14.0Hz)。所述的化合物D2的结构为：
（4）将步骤（1）得到的化合物B2溶液，按照化合物B2与步骤（3）得到的化合物D2的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，60℃反应18个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉甲醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E2。产率：38%；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.59(s,2H),7.87(d,J=8.5Hz,2H),7.37(d,J=8.7Hz,2H),7.43(d,J=8.6Hz,2H),6.97(s,2H),6.92(d,J=8.8Hz,2H),3.66(s,3H),3.17(s,8H),2.63(s,8H),2.56(t,4H),2.33(t,4H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ153.88,149.21,143.24,139.99,135.92,125.58,123.88,121.99,119.47,116.38,115.83,110.08,101.99,56.15,55.29,51.60,46.07,29.30.HRMS(EI-TOF)calcd for C43H49N9O3[M]+739.4572,found739.4578。所述的化合物E2的结构为：
实施例3：化合物E3的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物吗啡啉代替1-甲基哌嗪，130℃反应8小时，得到亮黄色固体化合物A3。产率：75%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(d,J=8.4Hz,1H),6.83(bs,J=8,2H),6.18(dd,J=8.4,1.9Hz1H),6.10(d,J=8.8Hz,1H),3.50-4.00(m,4H),2.40-2.50(m,4H)。所述的化合物A3的结构为：
将得到的化合物A3溶解在乙醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B3溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B3的结构为：
（2）步骤（2）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1,2-二溴乙烷代替碘甲烷，120℃反应过夜，得到无色固体化合物C3。产率：23%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.19-8.11(m,2H),7.58(ddd,J=8.2,7.1,1.2Hz,2H),7.44(d,J=8.2Hz,2H),7.31-7.25(m,2H),4.59(t,2H)，3.79(t,2H)。所述的化合物C3的结构为：
（3）步骤（3）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物C3代替化合物C1，120℃反应24小时，得到化合物D3产品。产率：40%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.57(s,2H),8.65(s,2H),8.32(dd,J=8.5,1.4Hz,2H),7.86(t,2H,J=7.5Hz),4.12(t,2H,J=4.5),4.03(t,2H,J=4.5Hz)。所述的化合物D3的结构为：
（4）将步骤（1）得到的化合物B3溶液，按照化合物B3与步骤（3）得到的化合物D3的摩尔比为2：1的比例加入到乙醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，90℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E3。产率：58%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.54(s,2H),7.82(d,J=8.5Hz,2H),7.41(d,J=8.7Hz,2H),7.40(d,J=8.6Hz,2H),6.99(s,2H),6.96(d,J=8.8Hz,2H),3.65(s,3H),3.17(s,8H),2.63(s,8H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ154.88,148.21,144.24,138.99,134.92,125.58,123.88,121.99,119.47,116.38,115.83,110.08,101.99,56.15,55.29,51.60.HRMS(EI-TOF)calcd for C35H33N7O2[M]+675.2038,found675.2098。所述的化合物E3的结构为：
实施例4：化合物E4的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物二乙胺代替1-甲基哌嗪，60℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A4。产率：92%；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(d,J=8.4Hz,1H),6.81(bs,J=8,2H),6.16(dd,J=8.4,1.9Hz1H),6.13(d,J=8.8Hz,1H),3.52-4.10(m,4H),2.39-2.51(m,6H)。所述的化合物A4的结构为：
将得到的化合物A4溶解在乙醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B4溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B4的结构为：
（2）步骤（2）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物碘苯代替碘甲烷，120℃反应过夜，得到无色固体化合物C4。产率：23%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.55(dd,J=14.2,3.7Hz,1H),8.25–8.12(m,1H),7.64(ddd,J=6.4,5.9,4.5Hz,1H),7.61–7.55(m,2H),7.55–7.46(m,3H),7.44–7.35(m,1H),7.26–7.03(m,4H)。所述的化合物C4的结构为：
（3）步骤（3）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物C4代替化合物C1，120℃反应24小时，得到化合物D4产品。产率：21%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.30(d,J=2.9Hz,1H),9.17(d,J=3.1Hz,1H),8.41(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),7.79(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),7.73(d,J=15.0Hz,1H),7.67–7.55(m,4H),7.54–7.44(m,2H)。所述的化合物D4的结构为：
（4）将步骤（1）得到的化合物B4，按照化合物B1与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到乙醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E4。产率：62%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.31(d,J=3.0Hz,2H),7.87(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),7.71(d,J=15.0Hz,1H),7.66–7.56(m,4H),7.53–7.45(m,3H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.04(dd,J=15.2,3.0Hz,2H),6.72(ddd,J=15.0,5.4,3.0Hz,2H),3.40(q,J=12.6Hz,8H),1.12(t,J=12.6Hz,12H).13CNMR(151MHz,CD3OD)δ154.48,154.21,153.69,149.32,147.35,143.71,138.36,138.10,135.59,133.21,131.95,128.73,127.36,126.90,123.23,122.96,119.63,117.66,114.02,113.06,113.02,111.90,97.61,93.72,46.42,12.99.HRMS(EI-TOF)calcd for617.3328C40H39N7[M]+,found617.3346。所述的化合物E4的结构为：
实施例5：所述的化合物E5的结构为：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-(4-氯苯基)哌嗪二盐酸盐代替1-甲基哌嗪，90℃反应8小时，得到亮黄色固体化合物A5。产率：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(d,J=15.0Hz,1H),7.17–7.05(m,2H),6.79–6.64(m,2H),6.34(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.16(d,J=2.9Hz,1H),5.23(s2H)3.57(s8H)。所述的化合物A5的结构为：
将得到的化合物A5溶解在乙醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B5溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B5的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B5溶液加入到，按照化合物B5与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到乙醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，70℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E5。产率：38%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.27(d,J=2.8Hz,1H),8.04(d,J=2.9Hz,1H),7.96(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),7.59(d,J=14.9Hz,1H),7.53–7.44(m,2H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.23(dd,J=2.8,2.2Hz,2H),7.16–7.07(m,4H),6.86(ddd,J=15.0,8.8,3.1Hz,2H),6.77–6.66(m,4H),3.77(s,3H),3.57(s,16H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ155.03,154.21,153.69,150.01,149.03,146.10,138.74,137.42,134.27,133.77,129.89,129.71,127.51,127.29,123.99,119.48,118.64,116.83,114.82,114.67,114.14,108.36,99.07,94.08,49.40,31.69.HRMS(EI-TOF)calcd for801.2927C47H41N9Cl2[M]+,found801.2932。所述的化合物E5的结构为：
实施例6：化合物E6的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物4-哌啶甲醇代替1-甲基哌嗪，100℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A6。产率：82%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J=15.0Hz,1H),6.34(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),6.16(d,J=2.9Hz,1H),5.21(s,2H),3.61–3.20(m,4H),3.22–2.89(m,2H),2.00–1.64(m,2H),1.61–1.35(m,3H),1.29(s,1H)。所述的化合物A6的结构为：
将得到的化合物A6溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B6溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B6的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B6溶液，按照化合物B6与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，90℃反应6个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E6。产率：45%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.06(d,J=2.9Hz,2H),7.91(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),7.63–7.50(m,2H),7.47(d,J=15.0Hz,1H),7.39(d,J=14.8Hz,2H),7.20(d,J=2.9Hz,2H),6.85(dd,J=15.0,2.9Hz,2H),3.77(s,3H),3.53–3.26(m,8H),3.26–2.89(m,4H),2.03–1.64(m,4H),1.66–1.30(m,8H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ155.03,154.21,146.10,138.74,134.27,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,114.14,108.36,94.08,66.34,49.89,38.21,31.69,29.22..HRMS(EI-TOF)calcd for639.3357C39H41N7O2[M]+,found639.3357。所述的化合物E6的结构为：
实施例7：化合物E7的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-(3-甲氧基苯基)哌嗪代替1-甲基哌嗪，100℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A7。产率：73%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J=15.0Hz,1H),7.12(t,J=14.9Hz,1H),6.75–6.51(m,1H),6.45–6.25(m,2H),6.17(dd,J=13.9,2.9Hz,2H),5.27(s,2H),3.74(s,3H),3.57(s,8H)。所述的化合物A7的结构为：
将得到的化合物A7溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B7溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B7的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B7溶液，按照化合物B7与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，65℃反应10个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E7。产率：48%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.07(d,J=2.9Hz,2H),7.91(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),7.63–7.50(m,2H),7.47(d,J=15.0Hz,1H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.19(d,J=2.9Hz,2H),7.12(t,J=14.9Hz,2H),6.88(dd,J=15.0,2.9Hz,2H),6.62(dt,J=15.0,3.0Hz,2H),6.38(t,J=2.9Hz,2H),6.17(dt,J=15.0,3.0Hz,2H),3.77(s,3H),3.74(s,6H),3.57(s,16H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ162.10,155.03,154.21,153.17,146.10,138.74,134.27,130.60,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,114.14,113.07,108.36,105.98,102.86,94.08,56.08,49.40,31.69.HRMS(EI-TOF)calcd for793.3981C49H47N9O2[M]+,found793.3971。所述的化合物E7的结构为：
实施例8：化合物E8的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-[(3-吡啶基)甲基]哌嗪代替1-甲基哌嗪，120℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A8。产率：68%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.81–8.54(m,1H),8.53–8.29(m,1H),7.81(d,J=15.0Hz,1H),7.65(dt,J=15.0,3.1Hz,1H),7.29(t,J=14.9Hz,1H),6.34(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),6.16(d,J=2.9Hz,1H),5.21(s,2H),3.66(s,2H),3.19(t,J=10.3Hz,4H),2.62(t,J=10.3Hz,4H)。所述的化合物A8的结构为：
将得到的化合物A8溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B8溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B8的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B8溶液，按照化合物B8与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E8。产率：38%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.66–8.55(m,2H),8.48–8.36(m,2H),8.06(d,J=2.9Hz,2H),7.91(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),7.71–7.50(m,4H),7.47(d,J=15.0Hz,1H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.29(t,J=14.9Hz,2H),7.16(d,J=3.1Hz,2H),6.85(dd,J=14.9,3.0Hz,2H),3.77(s,3H),3.66(s,4H),3.19(t,J=10.3Hz,8H),2.62(t,J=10.3Hz,8H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ155.03,154.21,149.40,147.19,146.10,138.74,136.60,135.62,134.27,129.71,127.51,127.29,124.04,119.48,118.64,114.14,108.36,94.08,62.21,50.71,50.28,31.69..HRMS(EI-TOF)calcd for763.3941C47H45N11[M]+,found763.3956。所述的化合物E8的结构为：
实施例9：化合物E9的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物哌嗪-1-甲酰二甲胺代替1-甲基哌嗪，130℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A9。产率：82%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J=15.0Hz,1H),6.34(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.16(d,J=3.1Hz,1H),5.19(s,2H),3.29(s,8H),2.99(s,6H)。所述的化合物A9的结构为：
将得到的化合物A9溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B9溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B9的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B9溶液加入，按照化合物B9与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，70℃反应7个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E9。产率：43%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.06(d,J=3.0Hz,2H),7.91(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),7.63–7.50(m,2H),7.47(d,J=15.0Hz,1H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.21(d,J=2.9Hz,2H),6.84(dd,J=14.9,3.0Hz,2H),3.77(s,3H),3.29(s,16H),2.99(s,12H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ160.76,155.03,154.21,146.10,138.74,134.27,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,114.14,108.36,94.08,49.73,46.86,38.26,31.69..HRMS(EI-TOF)calcd for723.3871C41H45N11O2[M]+,found723.3861。所述的化合物E9的结构为：
实施例10：化合物E10的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-(2-苯氧基乙基)哌嗪代替1-甲基哌嗪，100℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A10。产率：74%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J=15.0Hz,1H),7.43–7.12(m,2H),7.08–6.64(m,3H),6.34(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),6.16(d,J=2.9Hz,1H),5.23(s,2H),4.06(t,J=14.2Hz,2H),3.44(s,8H),2.66(t,J=14.2Hz,2H)。所述的化合物A10的结构为：
将得到的化合物A10溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B10溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B10的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B10溶液，按照化合物B10与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E10。产率：29%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.06(d,J=2.9Hz,2H),7.91(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),7.63–7.50(m,2H),7.47(d,J=14.9Hz,1H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.32–7.20(m,4H),7.17(d,J=2.9Hz,2H),7.00–6.87(m,6H),6.82(dd,J=15.0,2.9Hz,2H),4.06(t,J=7.6Hz,4H),3.77(s,3H),3.44(s,16H),2.66(t,J=7.6Hz,4H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ159.39,155.03,154.21,146.10,138.74,134.27,130.02,129.71,127.51,127.29,121.13,119.48,118.64,115.72,114.14,108.36,94.08,67.38,55.07,52.14,50.28,31.69..HRMS(EI-TOF)calcd for821.4275C51H51N9O2[M]+,found821.4263。所述的化合物E10的结构为：
实施例11：化合物E11的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-(2-糠酰)哌嗪代替1-甲基哌嗪，100℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A11。产率：64%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(dt,J=14.8,1.4Hz,2H),7.03(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.62(t,J=15.0Hz,1H),6.34(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),6.16(d,J=2.9Hz,1H),5.26(s,2H),3.37(dd,J=15.4,5.2Hz,4H),3.12(dd,J=15.2,5.2Hz,4H)。所述的化合物A11的结构为：
将得到的化合物A11溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B11溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B11的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B11溶液，按照化合物B11与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E11。产率：39%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.13(d,J=2.9Hz,2H),7.90(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),7.80(dd,J=15.0,2.9Hz,2H),7.55(dd,J=30.6,8.8Hz,2H),7.46(d,J=14.9Hz,1H),7.38(d,J=15.0Hz,2H),7.13(d,J=2.9Hz,2H),7.02(dd,J=14.9,3.0Hz,2H),6.80(dd,J=15.0,2.9Hz,2H),6.61(t,J=15.0Hz,2H),3.76(s,3H),3.36(t,J=9.8Hz,8H),3.13(t,J=9.8Hz,8H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ159.93,155.03,154.21,147.02,146.10,144.18,138.74,134.27,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,116.51,114.14,110.96,108.36,94.08,49.73,44.62,31.69..HRMS(EI-TOF)calcd for769.3114C45H39N9O4[M]+,found769.3123。所述的化合物E11的结构为：
实施例12：化合物E12的合成：
（1）步骤（1）基本上与实施例1相同，所不同的是用化合物1-(2-四氢呋喃甲酰基)哌嗪代替1-甲基哌嗪，100℃反应过夜，得到亮黄色固体化合物A12。产率：87%；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.80(d,J=15.0Hz,1H),6.33(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.15(d,J=2.9Hz,1H),5.28(s,2H),4.62(t,J=16.3Hz,1H),4.09–3.79(m,2H),3.73(t,J=10.3Hz,2H),3.46(dd,J=10.9,9.8Hz,2H),3.28(dd,J=15.5,5.5Hz,4H),2.42–2.11(m,1H),2.00(dddd,J=24.6,16.3,14.5,13.2Hz,1H),1.84–1.48(m,2H)。所述的化合物A12的结构为：
将得到的化合物A12溶解在甲醇中，加入质量含量为5%的Pd/C作为催化剂，通入H2，反应过夜，得到化合物B12溶液，用硅藻土滤去杂质，由于邻苯二胺结构容易被氧化而不稳定，所以不经纯化直接投入下一步反应；所述的化合物B12的结构为：
（2）将步骤（1）得到的化合物B12溶液，按照化合物B12与步骤（3）得到的化合物D1的摩尔比为2：1的比例加入到甲醇溶液中，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应8个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E12。产率：42%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.06(d,J=2.9Hz,2H),7.91(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),7.64–7.50(m,2H),7.47(d,J=15.0Hz,1H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.19(d,J=3.1Hz,2H),6.88(dd,J=14.9,3.0Hz,2H),4.79(t,J=8.3Hz,2H),4.08–3.64(m,11H),3.46(dd,J=10.9,9.7Hz,4H),3.28(dd,J=15.4,5.4Hz,8H),2.30(dtd,J=24.7,13.1,8.3Hz,2H),2.12–1.84(m,2H),1.84–1.37(m,4H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ171.26,155.03,154.21,146.10,138.74,134.27,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,114.14,108.36,94.08,77.54,68.70,49.73,45.11,31.69,31.41,25.47.HRMS(EI-TOF)calcd for777.3828C45H47N9O4[M]+,found777.3838。所述的化合物E12的结构为：
实施例13：化合物E13的合成
将实施例3步骤（1）得到的化合物B3
溶液、实施例4步骤（1）得到的化合物
和实施例1步骤（3）得到的化合物D1
按摩尔比为1:1:1的比例用甲醇溶解，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应9个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E13。产率：48%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.16(d,J=2.9Hz,1H),8.00–7.89(m,2H),7.59(d,J=15.0Hz,1H),7.53–7.42(m,2H),7.39(d,J=14.9Hz,2H),7.16(d,J=2.9Hz,1H),7.01(d,J=3.1Hz,1H),6.82(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),6.71(dd,J=15.0,2.9Hz,1H),3.74(dd,J=19.2,9.9Hz,7H),3.40(q,J=12.6Hz,4H),3.27(t,J=9.3Hz,4H),1.12(t,J=12.6Hz,6H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ155.03,154.48,154.21,146.10,138.74,138.36,133.75,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,117.66,114.14,113.02,108.36,94.08,93.72,65.85,47.26,46.42,31.69,12.99.HRMS(EI-TOF)calcd for569.2998C35H35N7O[M]+,found569.2987。所述的化合物E13的结构为：
实施例14：化合物E14的合成
将实施例1步骤（1）得到的化合物B1溶液、实施例4步骤（1）得到的化合物B4
和实施例1步骤（3）得到的化合物D1
按摩尔比为1:1:1的比例用甲醇溶解，再加入1当量的焦亚硫酸钠，80℃反应9个小时，之后冷却到室温，后用硅藻土过滤；旋转蒸发掉乙醇得到粗产品，粗产品用乙酸乙酯、甲醇作为淋洗剂进行硅胶柱色谱分离，得到化合物E14。产率：52%；1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.17(d,J=2.9Hz,1H),7.96(dd,J=18.0,2.9Hz,2H),7.59(d,J=15.0Hz,1H),7.54–7.43(m,2H),7.39(d,J=15.0Hz,2H),7.18(d,J=2.9Hz,1H),7.02(d,J=2.9Hz,1H),6.81(dd,J=14.9,3.0Hz,1H),6.71(dd,J=15.0,3.1Hz,1H),3.77(s,3H),3.41(dt,J=25.2,11.5Hz,8H),2.35(t,J=10.3Hz,4H),2.21(s,3H),1.12(t,J=12.6Hz,6H).13C NMR(151MHz,CD3OD)δ155.03,154.48,154.21,146.10,138.74,138.36,133.75,129.71,127.51,127.29,119.48,118.64,117.66,114.14,113.02,108.36,94.08,93.72,52.65,50.30,46.42,46.06,31.69,12.99.HRMS(EI-TOF)calcd for582.3214C36H38N8[M]+,found582.3224。所述的化合物E14的结构为：
实施例15：实施例1的化合物E1与核酸结合后光谱学的变化
1.制备样品：
DNA样品：DNA样品购自生工（北京）公司，将DNA适量溶于缓冲液中（10mM Tris-HCl，pH=7.4，20mM KCl,100mMNaCl），在95℃下变性10分钟后放入4℃冰箱中退火过夜。
测试的DNA样品及序列包括：
参比核酸：
ss-DNA1：d(CCAGTTCGTAGTAACCC)
ss-DNA2：d(GGGTTACTACGAACTGG)
dsDNA：ss-DNA1+ssDNA2
待测核酸：
核酸G-四链体EAD：d(CTGGGTGGGTGGGTGGGA)
c-myc(Pu27)：d(TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG)
c-kit2：d(CGGGCGGGCGCGAGGGAGGG)
化合物E1溶液：化合物E1先用二甲基亚砜配成10mM的储存母液，再用缓冲液（10mMTris-HCl，pH=7.4，20mMKCl,100mMNaCl）将储存母液稀释成浓度为8μM的溶液C用于测试。
核酸溶液的制备：将待测核酸溶于Tris-HCl（pH=7.4）缓冲液中，得到浓度为8μM～50μM的溶液A；以Tris-HCl（pH=7.4）的缓冲液稀释参比核酸，得到浓度为8μM～50μM的溶液B。
2.吸收光谱：
将溶液A和溶液C，及溶液B和溶液C分别充分混合，然后将得到的两种混合液分别进行孵育10分钟，对上述孵育后的两种反应溶液进行紫外-可见吸收光谱分析。
2.1）以核酸G-四链体EAD、c-myc、c-kit2为例
如图2a所示，在浓度为8μM的化合物E1溶液中分别加入浓度为0μM、8μM、12μM、16μM、24μM、32μM、40μM、48μM的核酸G-四链体EAD溶液，通过紫外分光光度计，对孵育后的混合液进行紫外-可见吸收光谱分析，通过观察其紫外-可见吸收光谱，紫外-可见吸收光谱整体增强，其是由于化合物E1由聚集体向单体的变化引起的。此外，化合物E1与核酸G-四链体EAD的混合溶液在390nm至440nm范围内出现了一个新的宽的吸收带，且吸光度随核酸G-四链体浓度的增加逐渐增强，当核酸G-四链体与化合物E1的摩尔比达到6左右的时候，吸收峰不再变化。
如图2b所示，当核酸G-四链体EAD、C-myc或c-Kit2与10μM化合物E1的摩尔比为6：1时，混合液中作用后化合物E1的紫外吸收光谱变化均在390nm至430nm区间出现新的吸收带。
2.2）以参比核酸ss-DNA1、ss-DNA2、dsDNA为例
如图2b所示，在紫外-可见吸收光谱中，当参比核酸ss-DNA1、ss-DNA2或dsDNA与10μM化合物E1的摩尔比为6：1时，化合物E1的吸收光谱整体增强，是由聚集体向单体的变化所致，但ss-DNA1、ss-DNA2或dsDNA的加入未使化合物E1在390nm至440nm范围内出现一个宽的吸收带，说明化合物E1只与G-四链体结合，具有高的选择性。因此比较化合物E1吸收光谱在390nm至440nm范围内吸收峰是否明显增强并高于参比核酸混合液，则可判断待测核酸为G-四链体结构的核酸；反之，则为非G-四链体结构的核酸。
3.荧光光谱
化合物E1溶液：化合物E1先用二甲基亚砜配成10mM的储存母液，再用缓冲液（10mMTris-HCl，pH=7.4，20mMKCl,100mMNaCl）将储存母液稀释成浓度为1μM的溶液C用于测试。
核酸溶液的制备：将待测核酸溶于Tris-HCl（pH=7.4）缓冲液中，得到浓度为1μM～30μM的溶液A；以Tris-HCl（pH=7.4）的缓冲液稀释参比核酸，得到浓度为1μM～30μM的溶液B。
将溶液A和溶液C，及溶液B和溶液C分别充分混合，然后将得到的两种混合液分别进行孵育10分钟，对上述孵育后的两种反应溶液进行荧光激发光谱与发射光谱分析。
3.1）以核酸G-四链体EAD、C-myc、c-kit2为例
如图3a所示，通过荧光光谱仪，对孵育后的混合液进行荧光光谱分析，化合物E1本身在缓冲液中几乎没有荧光，当核酸G-四链体EAD、C-myc或c-kit2与1μM化合物E1的摩尔比为6：1时，荧光激发光谱强度大大增强。如图3b所示，通过荧光光谱仪，对孵育后的混合液进行荧光光谱分析，通过观察待测核酸样品混合液中的化合物E1的荧光光谱在430～540nm范围内出现荧光峰且荧光强度显示随着核酸G-四链体EAD浓度（0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.6μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、4.0μM和5.0μM）的增加而增强。核酸G-四链体C-myc、c-kit2的荧光光谱变化与EAD相似。
3.2）以参比核酸ss-DNA1、ss-DNA2、dsDNA为例
如图3a所示，当参比核酸ss-DNA1、ss-DNA2或dsDNA与1μM化合物E1的摩尔比为6：1时，化合物E1的荧光强度未出现明显的变化。说明化合物E1只与G-四链体结合，具有高的选择性。
因此以化合物E1在430～540nm范围内的荧光强度是否明显升高，并高于参比核酸混合液中的化合物E1的荧光强度的2倍以上时，则可判断待测核酸为G-四链体结构的核酸；反之，则为非G-四链体结构的核酸。
实施例16：实施例1的化合物E1对肿瘤细胞的增殖抑制活性
1.实验步骤：
1.1）细胞的种板：每个96孔板中每孔接种5000个细胞（细胞株为MCF-7或A549），含有细胞的培养液每孔体积100微升。
1.2）被测物的加入：接种过细胞的96孔板在37℃的恒温箱中放置24小时后，将化合物E1分为9个浓度梯度（对MCF-7，化合物E1的9个浓度分别为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM、1.0μM、2.4μM、4.8μM、7.2μM和10μM；对A549，化合物E1的9个浓度分别为1μM、2μM、3μM、4μM、8μM、12μM、20μM、50μM和100μM），然后将每个浓度的化合物E1分别加入到96孔板中的3个平行孔中，调零孔（不含细胞）中可不加或加等体积的培养液。
1.3）细胞活性的检测，48小时后弃除旧培养液，加入110μL含CCK-8的溶液（Dojindo Molecular Technologies,Inc）（100μL培养液+10μL含CCK-8的溶液），37℃温浴30～60min后用酶标仪检测450nm处的吸光度。
2.化合物E1对肿瘤细胞的抑制活性
如图4所示，以乳腺癌细胞MCF-7和人肺腺癌细胞A549为例，随化合物E1浓度的升高MCF-7和A549细胞的存活率降低。分别计算抑制细胞生长达50%时的化合物E1的浓度，以IC50值表示，结果如表1所示。结果表明本发明所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物在体外对这两种肿瘤细胞株具有较强的抑制作用。因此本发明所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物可用于制备抗癌的药物。
表1，化合物E1-E14对不同肿瘤细胞株生长抑制作用（IC50/μM）
Claims (12)
1.一种二苯并咪唑联咔唑类化合物在用于特异性结合核酸G-四链体结构及在抗肿瘤药物中的应用，其特征是：
所述的在用于特异性结合核酸G-四链体结构中的应用，是将二苯并咪唑联咔唑类化合物在pH值6～8的缓冲液中分别与待测核酸样品以及参比核酸样品混合进行孵育，通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰出现增强，并高于参比核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰，来检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸；或通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现荧光峰且荧光强度升高，并高于参比核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现的荧光强度，来检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸；
所述的在抗肿瘤药物中的应用，是将二苯并咪唑联咔唑化合物作为药物加入到含有肿瘤细胞的培养液中，与肿瘤细胞一起培养，用于抑制肿瘤细胞的增殖；或作为药物的主要活性成分用于抑制肿瘤细胞的增殖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述的检测待测核酸样品是否是G-四链体结构的核酸的方法为:
1）将待检测核酸样品和参比核酸样品分别溶于pH值6～8的缓冲液中，分别得到溶液A及溶液B，其中，溶液A中的待检测核酸样品的浓度范围为0.5～50μM，溶液B中的参比核酸样品的浓度范围为0.5～50μM；将二苯并咪唑联咔唑类化合物用二甲基亚砜溶解后，再用pH值6～8的缓冲液稀释到浓度范围为0.5～20μM，得到溶液C；
2）将步骤1）得到的溶液A和溶液C，及溶液B和溶液C分别充分混合，然后将得到的两种混合液分别进行孵育，其中，两种混合液中的待检测核酸或参比核酸分别与二苯并咪唑联咔唑类化合物的摩尔比值为1≤摩尔比值≤6；
通过紫外分光光度计，对孵育后的混合液进行紫外-可见吸收光谱分析，通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰出现增强，并高于参比核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的紫外-可见吸收光谱在390～440nm范围内的吸收峰；则待测核酸确认为G-四链体结构的核酸；反之，则为非G-四链体结构的核酸；
或通过荧光光谱仪，对孵育后的混合液进行荧光光谱分析，通过观察待测核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现荧光峰且荧光强度升高，并高于参比核酸样品混合液中的所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的荧光光谱在430～540nm范围内出现的荧光强度，则待测核酸确认为G-四链体结构的核酸；反之，则为非G-四链体结构的核酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述的将二苯并咪唑联咔唑化合物作为药物加入到含有肿瘤细胞的培养液中，其中，二苯并咪唑联咔唑类化合物在含有肿瘤细胞的培养液中的浓度范围为0.1～30μM；
所述的作为药物的主要活性成分用于抑制肿瘤细胞的增殖，其中，二苯并咪唑联咔唑类化合物在药物中的质量含量30～80%。
4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征是：所述的核酸G-四链体的序列为EAD：d(CTGGGTGGGTGGGTGGGA)；c-myc(Pu27)：
d(TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG)；c-kit2：
d(CGGGCGGGCGCGAGGGAGGG)。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是：所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征是：所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物具有以下结构式：
式中R1选自碳原子数为1～10的直链、支链或成环的烷基，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基中的一种；
R2和R3独立地选自H，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～15的直链、支链或成环的烷基，含有取代基的碳原子数为2～10的含有N、O或S的杂环基，含有取代基的碳原子数为6～10的芳基中的一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是：所述的含有N、O或S的杂环基为含有N、O或S的五元、六元或七元杂环或苯并杂环；
所述的取代基选自羟基、胺基、巯基、卤素中的一种；
所述的芳基为苯基或萘基；
所述的卤素选自F、Cl、Br、I中的一种。
8.一种二苯并咪唑联咔唑类化合物，其特征是：所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物具有以下结构式：
式中R1选自碳原子数为1～10的直链、支链或成环的烷基，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基中的一种；
R2和R3独立地选自H，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～15的直链、支链或成环的烷基，含有取代基的碳原子数为2～10的含有N、O或S的杂环基，含有取代基的碳原子数为6～10的芳基中的一种。
9.根据权利要求8所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物，其特征是：所述的含有N、O或S的杂环基为含有N、O或S的五元、六元或七元杂环或苯并杂环；
所述的取代基选自羟基、胺基、巯基、卤素中的一种；
所述的芳基为苯基或萘基；
所述的卤素选自F、Cl、Br、I中的一种。
10.一种权利要求8或9所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物的制备方法，其特征是：所述的制备方法包括以下步骤：
（1）将HR2化合物与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺和缚酸剂溶于干燥的二甲基甲酰胺中，然后于温度为60～140℃下反应得到化合物
然后将化合物
溶解在醇中，在还原剂或在不断通入H2及使用催化量的催化剂的条件下，将化合物
还原得到化合物
其中，HR2化合物与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺的摩尔比为1：1～3：1；缚酸剂与HR2化合物的摩尔比为1≤摩尔比≤3；还原剂与化合物
的摩尔比为1≤摩尔比≤10；
将HR3化合物与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺和缚酸剂溶于干燥的二甲基甲酰胺中，然后于温度为60～140℃下反应得到化合物
然后将化合物
溶解在醇中，在还原剂或在不断通入H2及使用催化量的催化剂的条件下，将化合物
还原得到化合物
其中，HR3化合物与5-氯-2-硝基苯胺或5-溴-2-硝基苯胺的摩尔比为1：1～3：1；缚酸剂与HR3化合物的摩尔比为1≤摩尔比≤3；还原剂与化合物
的摩尔比为1≤摩尔比≤10；
上述的R2、R3独立地为二乙基氨基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基；
（2）将带有R1基团的碘甲烷、1，2-二溴乙烷或4-溴四氢吡喃在氢化钠的作用下与咔唑在温度为0℃～120℃的条件下反应得到化合物
其中，氢化钠与咔唑的摩尔比为1≤摩尔比≤10，带有R1基团的碘甲烷、1，2-二溴乙烷或4-溴四氢吡喃与咔唑的摩尔比为1≤摩尔比≤3；将化合物
与POCl3和二甲基甲酰胺的反应产物，在溶剂1，2-二氯乙烷存在的条件下，于温度为90～120℃下反应得到
的粗产品；将得到的
粗产品通过重结晶或柱层析得到
纯品；其中：化合物
与POCl3和二甲基甲酰胺的反应产物的摩尔比为1：2～1：10；
上述的R1选自碳原子数为1～10的直链、支链或成环的烷基，含有N、O、S或卤素的碳原子数为1～9的直链、支链或成环的烷基中的一种；
（3）将步骤（2）得到的
纯品与步骤（1）得到的
和
以化合物化合物
化合物的摩尔比为1:1:1的比例，在醇中于温度为60～90℃反应得到所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物，结构为：
所述的二苯并咪唑联咔唑类化合物结构中的R1、R2及R3的定义同权利要求1或权利要求2所述。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是：所述的步骤（3）中的醇中加入有焦亚硫酸钠；所述的醇为甲醇或乙醇。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是：所述的HR2化合物及所述的HR3化合物分别选自二乙胺、4-哌啶甲醇、吗啉、1-甲基哌嗪、1-(3-甲氧基苯基)哌嗪、1-(4-氯苯基)哌嗪二盐酸盐、1-(2-羟乙基)哌嗪、1-[(3-吡啶基)甲基]哌嗪、哌嗪-1-甲酰二甲胺、1-(2-苯氧基乙基)哌嗪、1-(2-糠酰)哌嗪和1-(2-四氢呋喃甲酰基)哌嗪中的一种；
所述的缚酸剂是碳酸钾或碳酸钠；
所述的还原剂为氯化亚锡；
所述的催化剂为Pd/C；
所述的醇为甲醇或乙醇。
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