CN102719238A - 一种双功能探针及其制备方法与在检测g-四链体结构中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双功能探针及其制备方法与在检测G-四链体结构中的应用。该类探针制备简单、易得，并且结构稳定，可用于特异性检测G-四链体核酸二级结构，可以通过紫外可见吸收光谱，或者荧光分光光度计，或者直接通过肉眼观察就可以快速检测出溶液中的DNA样品的二级结构。该类探针对G-四链体核酸二级结构的检测方法具有操作简便，选择性好，快捷，肉眼可见的优点，克服了其他检测方法价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型双功能探针及其制备方法，以及其在检测G-四链体核酸二级结构的用途。
背景技术
G-四链体（G-quadruplex）是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。最新研究表明，很多非编码区的RNA序列也可以形成G-四链体结构，RNA的G-四链体结构比DNA更稳定，该结构可能通过阻止基因的翻译或参与蛋白结合识别的过程而达到抑制肿瘤生长的效果。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。
目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前体外实验中检测G-四链体结构主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振、表面等离子共振、荧光共振能量转移等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。
近年来，香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等领域。其苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而申请人实验室前期的工作中合成了一系列的Isaindigotone类的化合物，其对G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将香豆素结构融合到Isaindigotone结构当中，利用分子内电荷转移的机理，得到了新型的G-四链体探针。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种双功能探针。
本发明的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述探针在检测G-四链体结构的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种双功能探针，其结构式为：
式中R1、R2为H、F、Cl、Br或I；
A-为阴离子，可以是碘离子，对甲苯磺酸离子，三氟甲磺酸离子等。
优选地，所述的A-为N原子甲基化反应后的阴离子。
本发明同时提供了上述探针的制备方法，表示如下：
具体步骤为：先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物
，再将
在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体
；再将2-吡咯烷酮与不同取代基的邻氨基苯甲酸混合，在三氯氧磷的存在下，关环反应得到化合物
，将与甲基化试剂反应，甲基化后得到化合物
，将
与醛基香豆素中间体反应，得到最终探针化合物
。
本发明还提供了上述探针在检测G-四链体结构中的应用。
优选地，在上述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构：
1）将待测DNA溶于PH值7.2-7.4的缓冲液，得到溶液A；将该探针溶解，再用PH值7.2-7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；
2）将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为1~3，混合后对混合液进行紫外可见光谱分析或荧光光谱分析，也可以在日光下或者在紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为G-四链体结构；判断方法如下：
（a）在日光下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在日光下有明显的颜色变化，由红色变为蓝紫色，即可判断待测DNA为G-四链体结构；若混合液的颜色与溶液B的颜色一样或者只有非常微弱的变化，既可以判断待测DNA为非G-四链体结构；
（b）在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到有明显的荧光增强，即可判断待测DNA为G-四链体结构；若混合液的荧光强度与溶液B的荧光强度一样或者只有非常微弱的变化，既可以判断待测DNA为非G-四链体结构；
（c）对混合液进行紫外可见吸收光谱分析时，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰明显红移，则可以判断待测DNA为G-四链体结构；若混合液的紫外可见吸收光谱与溶液B相比，最大吸收峰没有明显的红移现象，则可以判断待测DNA为非G-四链体结构；
（d）对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度明显增强，则可以判断待测DNA为G-四链体结构；若混合液的荧光发射强度与溶液B相比，没有明显增强，则可以判断待测DNA为非G-四链体结构。
优选地，上述判断方法（c）中，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰红移50-70nm，则待测DNA为G-四链体结构。
优选地，上述判断方法（d）中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强20倍或以上，则待测DNA为G-四链体结构。
优选地，在上述应用中，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液；所述探针用二甲基亚砜溶解；待测DNA与探针的混合反应时间为2分钟。
本发明提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，与G-四链体结构发生特异性的作用后，紫外光谱中的最大吸收峰明显红移，产生肉眼可见的颜色变化。并且，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与某种大分子相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的DNA作用较弱。所以，将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生紫外光谱和荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）该类探针制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存。
（2）本发明提供的探针可以特异性地检测识别G-四链体结构，实现了G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的紫外可见吸收光谱或者荧光光谱，甚至无需任何仪器，肉眼观察就可以识别出DNA样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。
（3）该类探针为双功能探针，可以同时检测紫外光谱信号以及荧光光谱信号，使得该类探针具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为探针7a滴定单链DNA （dA21） 的紫外可见吸收光谱。
图2为探针7a滴定单链DNA （dT21） 的紫外可见吸收光谱。
图3为探针7a滴定牛血清蛋白 （BSA） 的紫外可见吸收光谱。
图4为探针7a滴定小牛胸腺DNA （CT-DNA） 的紫外可见吸收光谱。
图5为探针7a滴定双链DNA （ds15） 的紫外可见吸收光谱。
图6为探针7a滴定分子内G-四链体DNA （pu22） 的紫外可见吸收光谱。
图7为探针7a滴定分子内G-四链体DNA （htg21） 的紫外可见吸收光谱。
图8为探针7a滴定分子间四聚体G-四链体DNA （tetramer） 的紫外可见吸收光谱。
图9为探针7a滴定分子间二聚体G-四链体DNA （dimer） 的紫外可见吸收光谱。
图10为探针7a滴定单链DNA （dA21） 的荧光光谱。
图11为探针7a滴定单链DNA （dT21） 的紫荧光光谱。
图12为探针7a滴定牛血清蛋白 （BSA） 的荧光光谱。
图13为探针7a滴定小牛胸腺DNA （CT-DNA） 的荧光光谱。
图14为探针7a滴定双链DNA （ds15） 的荧光光谱。
图15为探针7a滴定分子内G-四链体DNA （pu22） 的荧光光谱。
图16为探针7a滴定分子内G-四链体DNA （htg21） 的荧光光谱。
图17为探针7a滴定分子间四聚体G-四链体DNA （tetramer） 的荧光光谱。
图18为探针7a滴定分子间二聚体G-四链体DNA （dimer） 的荧光光谱。
图19为探针7a Tris-HClTris-HCl缓冲溶液中滴加不同二级结构的DNA样品以及BSA的颜色变化，探针浓度为5uM，待测样品为15uM。
图20为探针7a Tris-HClTris-HCl缓冲溶液中滴加不同二级结构的DNA样品以及BSA，在紫外灯下的荧光变化，探针浓度为1uM，待测样品为3uM。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。通过紫外光谱实验证明，本发明涉及的化合物7a,7b由于具有较大的电子共轭体系和平面，与G-四链体结构发生特异性的堆积作用后，紫外光谱中的最大吸收峰明显红移65nm左右，并且产生明显的颜色变化，肉眼就可以快速方便地检测出核酸的二级结构。并且，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与G-四链体相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的DNA作用较弱，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生紫外光谱和荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。
以其中化合物7a和7b为例来说明本发明的双功能探针在比色法以及荧光法检测G-四链体核酸二级结构的应用。
实施例一：化合物2的合成
将2.01g 4-二乙胺基水杨醛溶于30 mL 无水乙醇，加入3.20 g 丙二酸二乙酯和1 mL 哌啶，80℃下反应6 h。然后蒸出溶剂，加入20 mL乙酸和20 mL 浓盐酸，继续回流反应6 h，冷至室温后将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调pH至5，析出大量沉淀，减压抽滤干燥得粗品。以石油醚/乙酸乙酯（体积比1/10）作为洗脱剂通过硅胶层析纯化，得到0.81g纯品2，产率37.3%:1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ7.53 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.56 (dd, J = 8.8, 2.1 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 3.41 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.21 (t, J = 7.1 Hz, 6H). ESI-MS m/z: 218.1 [M+H]+。
实施例二：化合物3的合成
在氮气保护下将1.5 mL POCl3 滴加到1 mL DMF中，室温搅拌20 min。然后将0.77 g 2溶于4 mL DMF滴加入到上述混合液中， 60 oC下反应10 h，冷至室温后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调pH 至中性，减压抽滤，用水和乙醇多次冲洗，真空干燥得橙黄色固体3 0.50 g，产率58.3%: 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ10.13 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.41 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 9.0, 2.5 Hz, 1H), 6.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.48 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 6H). ESI-MS m/z: 246.1 [M+H]+。
实施例三：化合物5a的合成
将3 ml 2-吡咯烷酮与2.64g邻氨基苯甲酸混合，冰浴下缓慢滴加45ml三氯氧磷。然后回流反应7 h。冷却后，蒸出三氯氧磷，加入乙酸乙酯稀释，用氢氧化钠溶液调节溶液呈弱碱性，乙酸乙酯萃取多次，收集有机层，无水硫酸镁干燥后抽滤，旋蒸，得粗产品。以石油醚/乙酸乙酯（体积比4/1）作为洗脱剂通过硅胶层析纯化，得到1.51 g白色固体5a，产率42.1%: 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.77 - 7.69 (m, 1H), 7.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.49 - 7.42 (m, 1H), 4.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.19 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 2.36 - 2.23 (m, 2H). ESI-MS m/z: 187.1 [M+H]+。
实施例四：化合物5b的合成
合成方法同5a，得2.81 g白色固体5b，产率65.5%:1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ8.02 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 7.49 – 7.34 (m, 1H), 4.20 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.17 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.37 – 2.23 (m, 2H). ESI-MS m/z: 223.1 [M+H]+。
实施例五：化合物6a的合成
将0.60 g 5a 溶于1ml环丁砜，加入2ml碘甲烷，50℃下反应12 h，冷至室温，减压抽滤，用无水乙醚洗后真空干燥得0.91g白色固体6a，产率86.1%: 1H NMR (400 MHz, DMSO)δ8.35 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.20 – 8.14 (m, 1H), 8.11 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.86 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.32 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.73 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 2.42 – 2.29 (m, 2H).ESI-MS m/z: 201.1 [M_I]+。
实施例六：化合物6b的合成
合成方法同6a, 得0.99 g白色固体6b, 产率84.6%: 1H NMR (400 MHz, DMSO)δ8.54 - 8.32 (m, 1H), 4.32 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.73 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 2.42 - 2.30 (m, 1H). ESI-MS m/z: 237.1 [M_I]+。
实施例七：化合物7a的合成
将 0.14 g 6a, 0,11 g 3，0.02 g乙酸钠和5 mL乙酸混合，加热回流反应12 h。冷却后将反应液倒入冰水中，CH2Cl2 萃取多次，收集有机层，用无水硫酸镁干燥后抽滤浓缩，得粗品。以甲醇/二氯甲烷 (体积比1/20) 为洗脱剂通过硅胶层析纯化得0.09 g 目标产物7a，产率38.0%: 1H NMR (400 MHz, DMSO)δ8.36 - 8.29 (m, 2H), 8.19- 8.09 (m, 2H), 7.88 (s, 1H), 7.83 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 4.34 - 4.26 (m, 5H), 3.53 (q, J = 7.0 Hz, 4H), 3.37 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 7.0 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 160.37, 159.17, 157.37, 156.88, 152.61, 145.17, 140.92, 138.97, 136.60, 131.73, 128.87, 127.03, 126.79, 118.99 118.94, 112.93, 110.33, 108.41, 96.44, 46.57, 44.47, 40.56, 27.63, 12.38. ESI-MS m/z: 428.2 [M_I]+ . Purity: 96.2% by HPLC. HRMS (ESI): calcd for (M-I)+(C26H26N3O3 +) 428.1969, found 428.1976。
实施例八：化合物7b的合成
合成方法同 7a, 得0.09 g棕黑色固体7b，产率35.4%:1H NMR (400 MHz, DMSO)δ8.44 - 8.29 (m, 4H), 7.88 (s, 1H), 7.70 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.65 (s, 1H), 4.33 - 4.20 (m, 6H), 3.53 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 3.37 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.17 (t, J = 6.8 Hz, 7H). 13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 160.34, 159.79, 156.96, 156.12, 152.74, 145.41, 139.64, 138.88, 131.83, 126.28, 116.61, 115.60, 115.40, 112.81, 110.41, 109.75, 109.52, 108.48, 96.47, 46.75, 44.49, 41.27, 27.61, 12.38. ESI-MS m/z: 464.2 [M_I]+. Purity: 97.7% by HPLC. HRMS (ESI): calcd for (M-I)+ (C26H24F2N3O3 +) 464.1780, found 464.1786。
实施例九：DNA样品的检测
1.制备样品：
DNA样品：DNA样品购自英骏生物技术有限公司。将DNA适量溶于Tris-HCl的缓冲液中（PH7.4，100mM Tris，60mM KCl）或者Tris-醋酸缓冲中（PH5.5，100mM Tris，60mM KCl），超微量紫外定浓，在95℃下加热5 min 后缓慢冷却退火到室温作为储存液，4℃储存。
测试的DNA样品序列包括：
htg21 d(GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG )
pu22 d(TGAGGGTGGGTAGGGTGGGTAA)
dT21 d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)
dA21 d(AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA)
ds15 d(CGCGCGTTTCGCGCG)
dimer d(GGGGTTTTGGGG)
tetramer d(TTAGGG)
检测G-四链体结构：
探针溶液：以化合物7a为例，先用二甲基亚砜将化合物7a配成10mM的储存液，再用二甲基亚砜或者在Tris-HCl的缓冲液（PH7.4，100mM Tris，60mM KCl）中分别稀释成1 uM和5 uM浓度的探针溶液用于测试。
2.检测：
2.1）荧光光谱检测
探针7a的浓度为1uM，往探针溶液中滴加不同的待测样品溶液，吹匀后，稳定2分钟，用荧光光谱测定体系的荧光发射，将等色点555nm设定为激发波长。如果体系的荧光强度增强20倍以上，则可判断待测序列形成了G-四链体结构，如果体系只有微弱荧光增强，则可判断待测样品为非G-四链体结构。结果如图1-9所示，根据上述判断标准从图中可以看出，htg21，pu22, tetermer和dimer为G-四链体结构，而dA21, dT21, BSA，ds15和CT-DNA为非G-四链体结构。
2.2）紫外光谱检测
探针7a的浓度为5uM，往探针溶液中滴加不同的待测样品溶液，吹匀后，稳定2分钟，用紫外可见光谱测定体系的紫外吸收，如果最大吸收峰红移50-70nm，则可判断待测序列形成了G-四链体结构，如果体系只有微弱的减色效应和微弱的红移，则可判断待测样品为非G-四链体结构。结果如图10-18所示，根据上述判断标准从图中可以看出，htg21，pu22, tetermer和dimer为G-四链体结构，而dA21, dT21, BSA，ds15和CT-DNA为非G-四链体结构。
2.3）肉眼检测
将上述试紫外光谱的的样品（7a的浓度为5 uM，待测样品为15 uM）放在日光灯下，肉眼观察。如果体系颜色由粉红色变为蓝紫色，则可判断待测样品为G-四链体结构，如果没有明显变化， 则为非G-四链体结构。将上述试荧光光谱的的样品（7a的浓度为1 uM，待测样品为3 uM）放在紫外灯下，肉眼观察。如果体系发射很强的红色荧光，则可判断待测样品为G-四链体结构，如果没有明显荧光增强， 则为非G-四链体结构。结果如图19-20所示，图中htg21，pu22, tetermer和dimer的样品管均有由粉红色变为蓝紫色的颜色变化，并且在紫外灯下，由强烈的红色荧光，而dA21, dT21, BSA，ds15和CT-DNA得样品管没有明显的颜色变化，也没有肉眼可见的荧光增强，从而可以判断，htg21，pu22, tetermer和dimer为G-四链体结构，而dA21, dT21, BSA，ds15和CT-DNA为非G-四链体结构。
实施例十：
以实施例八制备的化合物7b为例，进行与实施例九相似的DNA样品的检测，其结果与实施例九中化合物7a一致，故不赘述。
Claims (10)
1. 一种双功能探针，其特征在于结构式为：
式中R1、R2选自H、F、Cl、Br或I；
A-为阴离子。
2. 如权利要求1所述的双功能探针，其特征在于A-为N原子甲基化反应后的阴离子。
3. 一种如权利要求1或2所述的双功能探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物
，再将
在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体
；再将2-吡咯烷酮与不同取代基的邻氨基苯甲酸混合，在三氯氧磷的存在下，关环反应得到化合物
，将
与甲基化试剂反应，甲基化后得到化合物
，将与醛基香豆素中间体
反应，得到最终探针化合物
。
4. 如权利要求1或2所述的双功能探针在检测G-四链体结构中的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中，通过如下方法检测G-四链体结构：
1）将待测DNA溶于PH值7.2-7.4的缓冲液，得到溶液A；将所述探针溶解，再用PH值7.2-7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；
2）将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为1~3，混合后对混合液进行紫外可见光谱分析或荧光光谱分析，或者在日光或紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为G-四链体结构；判断方法如下：
（a）在日光下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在日光下的颜色由红色变为蓝紫色，则待测DNA为G-四链体结构；
（b）在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到荧光增强，则待测DNA为G-四链体结构；
（c）对混合液进行紫外可见吸收光谱分析时，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰发生红移，则待测DNA为G-四链体结构；
（d）对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强，则待测DNA为G-四链体结构。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于判断方法（c）中，与溶液B相比，若混合液紫外可见吸收光谱中最大吸收峰红移50-70nm，则待测DNA为G-四链体结构。
7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于判断方法（d）中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强20倍或以上，则待测DNA为G-四链体结构。
8. 如权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。
9. 如权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于所述探针用二甲基亚砜溶解。
10. 如权利要求5-7中任一项所述的应用，其特征在于溶液A和溶液B的混合反应时间为2分钟。
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