CN104151301A

CN104151301A - 一种荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104151301A
Application number: CN201410328648.1A
Authority: CN
Inventors: 黄志纾; 谭嘉恒; 吴伟彬; 陈硕斌; 胡命豪
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2034-07-10
Also published as: CN104151301B

Abstract

本发明公开了一种荧光探针及其制备方法与在检测G-四链体核酸构象中的应用，具体结构式为式中R₁为F或N-甲基哌嗪基，R₂为N-甲基哌嗪基。该类探针制备简单、易得，并且结构稳定，可用于特异性检测正平行构象的G-四链体核酸二级结构，通过荧光分光光度计可以快速检测出溶液中的DNA样品的二级结构。该类探针对正平行构象的G-四链体核酸二级结构的检测方法具有操作简便，选择性好的优点，并且克服了其他检测方法难以区分G-四链体核酸的多种不同构象，价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。

Description

一种荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及探针，更具体地，涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。

G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。

目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前能够对G-四链体构象进行鉴定的探针非常少，体外实验中检测G-四链体构象主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。

近年来，香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等领域。其苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而申请人实验室前期的工作中合成了一系列的三芳基咪唑类的化合物，其对正平行构象的G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将香豆素结构融合到三芳基咪唑结构当中，得到了新型的G-四链体探针，该探针选择性识别正平行构象的G-四链体。

发明内容

本发明提供一种荧光探针，其特征在于结构式为：

式中R₁选自F或N-甲基哌嗪基，R₂选自N-甲基哌嗪基。

一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物再将在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体将溶于DMSO中，加入的N-甲基哌嗪和K2CO3，反应生成将与醛基香豆素中间体反应，得到最终探针化合物。

根据需求提供上述的荧光探针在检测G-四链体结构中的应用。

跟进一步的提供一种检测G-四链体结构的方法，包括如下步骤：

1)将待测DNA溶于PH值7.2-7.4的缓冲液，得到溶液A；将所述探针溶解，再用PH值7.2-7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；

2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为1～10，混合后对混合液进行荧光光谱分析，或者在紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为正平行构象的G-四链体结构；判断方法如下：

(a)在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到荧光增强，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构；

(b)对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。

判断方法(b)中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强30～200倍，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。

所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。

所述探针用二甲基亚砜溶解。

溶液A和溶液B的混合反应时间为1分钟。

本发明提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与某种大分子相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在正平行构象G-四连体的G-四分体的平面上，进而与正平行构象的G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的DNA作用较弱。所以，将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为正平行构象的G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)该类探针制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存。

(2)本发明提供的探针可以特异性地检测识别正平行构象的G-四链体结构，实现了正平行构象G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的荧光光谱就可以识别出DNA样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。

附图说明

图1为探针6a滴定分子内正平行构象G-四链体DNA(pu22)的荧光光谱。

图2为探针6a滴定分子内正平行构象G-四链体DNA(Kras)的荧光光谱。

图3为探针6a滴定分子内正平行构象G-四链体DNA(bcl-2)的荧光光谱。

图4为探针6a滴定分子内混合型构象G-四链体DNA(htg22)的荧光光谱。

图5为探针6a滴定分子内反平行构象G-四链体DNA(Hras)的荧光光谱。

图6为探针6a滴定单链DNA(dT21)的荧光光谱。

图7为探针6a滴定三螺旋链DNA(TAA)的荧光光谱。

图8为探针6a滴定小牛胸腺DNA(ct-DNA)的荧光光谱。

图9为探针6a滴定发夹DNA(hairpin)的荧光光谱。

图10为探针6a Tris-HCl缓冲溶液中滴加不同二级结构的DNA样品，在紫外灯下的荧光变化，探针浓度为1uM，待测样品为10uM。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

通过紫外光谱实验证明，本发明涉及的化合物6a,6b由于具有较大的电子共轭体系和平面，该类探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当探针分子与正平行构象的G-四链体相互作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，并且具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在正平行构象G-四链体的G-四分体的平面上，进而与正平行构象的G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的DNA作用较弱，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为正平行构象的G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。

以其中化合物6a为例来说明本发明的双功能探针在比色法以及荧光法检测G-四链体核酸二级结构的应用。

实施例1：化合物2的合成

将2.01g4-二乙胺基水杨醛溶于30mL无水乙醇，加入3.20g丙二酸二乙酯和1mL哌啶，80℃下反应6h。然后蒸出溶剂，加入20mL乙酸和20mL浓盐酸，继续回流反应6h，冷至室温后将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调pH至5，析出大量沉淀，减压抽滤干燥得粗品。以石油醚/乙酸乙酯(体积比1/10)作为洗脱剂通过硅胶层析纯化，得到0.81g纯品2，产率37.3％:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.53(d,J＝9.3Hz,1H),7.24(d,J＝8.8Hz,1H),6.56(dd,J＝8.8,2.1Hz,1H),6.49(d,J＝1.6Hz,1H),6.03(d,J＝9.3Hz,1H),3.41(q,J＝7.1Hz,4H),1.21(t,J＝7.1Hz,6H).ESI-MS m/z:218.1[M+H]⁺。

实施例2：化合物3的合成

在氮气保护下将1.5mL POCl₃滴加到1mL DMF中，室温搅拌20min。然后将0.77g2溶于4mL DMF滴加入到上述混合液中，60℃下反应10h，冷至室温后，将反应液倒入冰水中，用氢氧化钠溶液调pH至中性，减压抽滤，用水和乙醇多次冲洗，真空干燥得橙黄色固体30.50g，产率58.3％:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.13(s,1H),8.26(s,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,1H),6.64(dd,J＝9.0,2.5Hz,1H),6.49(d,J＝2.4Hz,1H),3.48(q,J＝7.1Hz,4H),1.26(t,J＝7.1Hz,6H).ESI-MS m/z:246.1[M+H]⁺。

实施例3：化合物5a的合成

将4,4’-二氟苯偶酰溶于DMSO中(约0.15M)，加入0.5倍摩尔量的N-甲基哌嗪和K₂CO₃，在油浴90℃下加热反应20h后，加入适量乙醚，用水洗去DMSO，用无水Na₂SO₄干燥，蒸出溶剂真空干燥得到黄色固体,收率为95％；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.85(d,J＝9.0Hz,4H),6.85(d,J＝9.1Hz,4H),3.41(t,J＝5.0Hz,2H),2.53(t,J＝5.0Hz,2H),2.34(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ193.59,154.84,132.14,123.32,113.21,54.58,46.84,46.05.MS(ESI+)m/z407[M+H]⁺.

实施例4：化合物5b的合成

将4,4’-二氟苯偶酰溶于DMSO中(约0.15M)，加入3倍摩尔量的N-甲基哌嗪和K₂CO₃，在油浴90℃下加热反应20h后，加入适量乙醚，用水洗去DMSO，用无水Na₂SO₄干燥，蒸出溶剂真空干燥得到黄色固体,收率为95％；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.85(d,J＝9.0Hz,4H),6.85(d,J＝9.1Hz,4H),3.41(t,J＝5.0Hz,2H),2.53(t,J＝5.0Hz,2H),2.34(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ193.59,154.84,132.14,123.32,113.21,54.58,46.84,46.05.MS(ESI+)m/z407[M+H]⁺.

实施例5：化合物6a的合成

将2.5mmol化合物3和2mmol化合物5a溶于10mL冰醋酸中，加热至140℃；在另一烧瓶中将20mmol NH4OAc溶于3mL冰醋酸中，加热至140℃。待固体溶解完全后，将NH₄OAc的冰醋酸溶液倒入另一烧瓶中，于140℃反应2h。冷至室温后，用3mol/L的HCl调节pH值至0.8，用乙醚萃取反应液(10mL×5)，以除去未反应的醛和酮；将水层再用3mol/L的NaOH溶液调节pH值至8，用CH₂Cl₂萃取(20mL×5)，合并有机层，用无水Na₂SO₄干燥。蒸出溶剂，得粗产物，经柱层析(CHCl₃/CH₃OH＝50/1)分离纯化，得到橙红色固体，收率81％；m.p.232-234℃.¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.34(s,1H),7.44–7.31(m,3H),7.18(d,J＝8.6Hz,2H),6.94(t,J＝8.8Hz,2H),6.82(d,J＝8.8Hz,2H),6.65(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),6.43(d,J＝2.3Hz,1H),3.38(q,J＝7.0Hz,4H),3.12(t,J＝5.0Hz,4H),2.51(t,J＝5.0Hz,4H),2.25(s,3H),1.12(t,J＝7.1Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ162.04,161.91,156.03,151.01,150.52,141.41,138.81,136.38,131.48,129.72,129.42,129.34,128.57,127.01,115.70,115.13,109.83,108.94,108.86,97.02,55.01,48.47,46.11,44.93,12.47.HRMS(ESI+)m/z:Calc.for C₃₃H₃₄N₅O₂F:552.2765[M+H]⁺.Found552.2775[M+H]⁺.

实施例6：化合物6b的合成

将2.5mmol化合物3和2mmol化合物5b溶于10mL冰醋酸中，加热至140℃；在另一烧瓶中将20mmol NH4OAc溶于3mL冰醋酸中，加热至140℃。待固体溶解完全后，将NH₄OAc的冰醋酸溶液倒入另一烧瓶中，于140℃反应2h。冷至室温后，用3mol/L的HCl调节pH值至0.8，用乙醚萃取反应液(10mL×5)，以除去未反应的醛和酮；将水层再用3mol/L的NaOH溶液调节pH值至8，用CH₂Cl₂萃取(20mL×5)，合并有机层，用无水Na₂SO₄干燥。蒸出溶剂，得粗产物，经柱层析(CHCl₃/CH₃OH＝50/1)分离纯化，得到红色固体，收率75％；m.p.184-185℃.¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.21(s,1H),7.24(d,J＝8.9Hz,1H),7.13(d,J＝8.6Hz,4H),6.70(d,J＝8.7Hz,4H),6.53(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),6.31(d,J＝1.8Hz,1H),3.26(q,J＝7.0,6.7Hz,4H),3.04(t,J＝4.2Hz,8H),2.46(t,J＝4.5Hz,8H),2.22(s,6H),1.04(t,J＝7.0Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ162.97,157.29,152.73,151.46,142.41,140.39,131.20,129.80,125.31,116.81,111.25,109.99,109.22,97.66,55.94,49.41,46.10,45.84,12.95.HRMS(ESI+)m/z:Calc.for C₃₈H₄₅N₇O₂:632.3713[M+H]⁺.Found632.3720[M+H]⁺.

实施例7：DNA样品的检测

1.制备样品：

DNA样品：DNA样品购自英骏生物技术有限公司。将DNA适量溶于Tris-HCl的缓冲液中(PH7.4，100mM Tris，100mM KCl)，超微量紫外测定浓度，在95℃下加热5min后缓慢冷却退火到室温作为储存液，4℃储存。

测试的DNA样品序列包括：

pu22 d(TGAGGGTGGGTAGGGTGGGTAA)

Kras d(AGGGCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGG)

bcl-2 d(GGGCGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG)

htg22 d(AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG)

Hras d(TCGGGTTGCGGGCGCAGGGCACGGGCG)

dT21 d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)

dA21 d(AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA)

TAA 2mol dT21与1mol dA21混合

ct-DNA 小牛胸腺DNA

hairpin d(CGCGCGCGTTTTCGCGCGCG)

检测G-四链体结构：

探针溶液：以化合物6a为例，先用二甲基亚砜将化合物6a配成10mM的储存液，再用二甲基亚砜或者在Tris-HCl的缓冲液(PH7.4，100mM Tris，100mMKCl)中分别稀释成1uM的探针溶液用于测试。

2.检测：

2.1)荧光光谱检测

探针6a的浓度为1uM，往探针溶液中滴加不同的待测样品溶液，吹匀后，稳定1分钟，用荧光光谱测定体系的荧光发射，将450nm设定为激发波长。如果体系的荧光强度急剧增强，增强范围为30～200，则可判断待测序列形成了正平行构象的G-四链体结构，如果体系只有微弱荧光增强，则可判断待测样品为非G-四链体结构。结果如图1-9所示，根据上述判断标准从图中可以看出，图1～3为正平行构象的G-四链体结构，而图4～9为非正平行构象的G-四链体结构的核酸。

2.2)肉眼检测

将上述试荧光光谱的的样品(6a的浓度为1uM，待测样品为5uM)放在紫外灯下，肉眼观察。如果体系发射很强的绿色荧光，则可判断待测样品为正平行构象的G-四链体结构，如果没有明显荧光增强，则为非正平行构象的G-四链体结构。结果如图10所示，图中6a与Kras、pu22、bcl-2的混合物存在绿色荧光，从而可以判断，Kras、pu22、bcl-2为正平行构象的G-四链体结构，而htg22、Hras、hairpin为非G-四链体结构。

Claims

1.一种荧光探针，其特征在于结构式为：

式中R₁选自F或N-甲基哌嗪基，R₂选自N-甲基哌嗪基。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物再将在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体将溶于DMSO中，加入的N-甲基哌嗪和K2CO3，反应生成将与醛基香豆素中间体反应，得到最终探针化合物。

3.如权利要求1所述的荧光探针在检测G-四链体结构中的应用。

4.一种检测G-四链体结构的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，判断方法(b)中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强30～200倍，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。

7.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述探针用二甲基亚砜溶解。

8.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，溶液A和溶液B的混合反应时间为1分钟。