CN102516987A

CN102516987A - 一种检测一氧化氮的荧光探针及其制备方法

Info

Publication number: CN102516987A
Application number: CN2011103672350A
Authority: CN
Inventors: 郑洪�; 郑小兰; 樊晓星
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2012-06-27

Abstract

一种检测一氧化氮的荧光探针及其制备方法，涉及荧光探针。探针为以4-胺基-1，8-萘酰亚胺为基本分子结构、以碳酰胺化的邻苯二胺为一氧化氮识别基团的化合物。在容器中加入4-氨基-1，8-萘酸酐和有机溶剂，再加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇加热反应后冷却；加入食盐水离心得中间体A，再溶解在吡啶中，加入醋酸酐后反应；旋转蒸发，再加入水萃取；旋转蒸发，分离得中间体B；在容器中加入B、二异丙基乙基胺和甲苯得混合液，再加到含有三光气及甲苯的溶液中，加热回流后冷却；加入二氯甲烷后离心分离得上层清液，再加入到含有邻苯二胺及二氯甲烷的溶液中反应；旋转蒸发，加入水萃取；所得乙酸乙酯干燥，旋转蒸发，分离得产物。

Description

一种检测一氧化氮的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种一氧化氮荧光探针，尤其是涉及一种检测一氧化氮的荧光探针及其制备方法。

背景技术

一氧化氮(NO)是人类首次发现的在机体中具有信号分子作用的一种气体，作为生理活性氧物种(ROS)中的重要一员，它是生物体内一种重要的细胞信使分子，被誉为“信息分子、效应分子、明星分子”。近年来的研究表明，一氧化氮作为一种新型的细胞内信使分子，广泛参与机体心血管、神经和免疫系统的生理和病理调节。它能舒张血管、降低血压、抑制血管平滑肌细胞的增值和血小板粘附，并作为一种神经递质，在神经元的信息传递中起重要作用。目前的研究表明，一氧化氮还在生殖器、肺等器官中都有递质的功能，还具有免疫调节功能、抗溃疡作用、调节性功能等其他生理功能。

鉴于一氧化氮的重要生理功能，所以一氧化氮的分析成为研究其生理功能及建立其分布模型的重要环节，如何能更快速、准确、灵活、方便的对一氧化氮进行分析已经成为揭示一氧化氮神秘面纱重要研究方向。目前，检测一氧化氮的方法有：化学发光法、电子顺磁共振法、电化学方法、分光光度法以及荧光光度法。荧光光度法由于信号直观、检测方便、易于实现对生理活性细胞进行实时的时空分辨观测而得到重点关注。

设计实用型一氧化氮荧光分子探针，要求探针自身的荧光尽可能弱，而与一氧化氮作用后荧光量子产率高。荧光最大发射波长最好处于红区以至近红外光谱区，以减少生物体自身的荧光干扰，同时，这种探针捕集一氧化氮的速度要快，进行活体分析时对活体不产生毒害作用。目前，有关一氧化氮的荧光分子传感设计主要基于以下两大机制：一种是基于一氧化氮分子与过渡金属-荧光配体配合物的中心金属离子或荧光配体作用(J.Am.Chem.Soc.，2004，126(15)，4972-4978.J.Am.Chem.Soc.2005，127，12170-12171.J.Am.Chem.Soc.，2004，126，6564-6565)。另一种是基于一氧化氮与邻苯二胺衍生物的特异性化学反应(Anal.Chem.，1998，70(13)：2446-2453.Anal.Chem.，1999，71(11)：2071-2075.J.Am.Chem.Soc.，2004，126(10)：3357-3367.J.Am.Chem.Soc.；2005；127(11)：3684-3685.J.Am.Chem.Soc.，2009，131，10189-10200.)，目前基于该种机制设计的荧光探针获得较广泛的应用，然而它却存在如合成繁琐不易、探针荧光Stokes位移较小等不足。而以酰化邻苯二胺为一氧化氮识别基团的荧光探针鲜有报道。相较于必须通过繁琐的多步合成路线而引入的邻苯二胺基团，酰化邻苯二胺更容易在荧光团上通过一步酰胺化反应直接引入，大大简化了探针的制备方法及成本，而且也拓展了可使用的荧光团的种类。

4-胺基-1，8萘酰亚胺荧光团具有长波发射以及大Stokes位移的优点(J.Am.Chem.Soc.；1981；103：7615-7620.)，能够显著减少荧光分析中散射光以及背景荧光的干扰，在针对诸如锌、汞、铜等金属离子的荧光探针设计中得到很好的应用，然而却未见应用于识别一氧化氮的荧光探针的设计中。本法以一步反应在4-胺基-1，8萘酰亚胺荧光团上引入酰化邻苯二胺基团，制得对一氧化氮具有识别作用的荧光探针并考察了其荧光特性。

发明内容

本发明的目的在于针对已报道的基于邻苯二胺衍生物的一氧化氮荧光探针所存在的不足，提供一类高灵敏、高选择性、以酰化邻苯二胺为一氧化氮识别基团的检测一氧化氮的荧光探针及其制备方法与应用。

所述检测一氧化氮的荧光探针，记为探针1，其分子结构式如下：

探针1

所述探针1为以4-胺基-1，8-萘酰亚胺为基本分子结构、以碳酰胺化的邻苯二胺为一氧化氮识别基团的化合物。

所述检测一氧化氮的荧光探针的合成路线如下所示：

所述检测一氧化氮的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤一：在容器中按摩尔比加入1.0份4-氨基-1，8-萘酸酐和15份有机溶剂，再加入1.2份2-(2-氨基乙氧基)乙醇，加热反应后，冷却至室温；然后加入30份饱和食盐水后有固体析出，离心并干燥得中间体A，所述中间体A的结构式如下：

步骤二：取一份上述中间体A溶解在20份干燥吡啶中，再加入0.4份醋酸酐后，室温反应；旋转蒸发抽干溶剂，再加入100份的水，各以100份乙酸乙酯萃取2次；所得乙酸乙酯以无水硫酸钠干燥；旋转蒸发抽干溶剂，再以柱色谱分离得中间体B，所述中间体B的结构式如下：

步骤三：在容器中分别加入1.0份中间体B、3.0份二异丙基乙基胺和10份的甲苯，得混合液，再将混合液加到含有0.8份三光气(Triphosgene)以及30份甲苯的溶液中，加热回流后冷却至室温；再加入50份二氯甲烷后离心分离，得上层清液；将所得上层清液加入到含有1.5份邻苯二胺以及10份二氯甲烷的溶液中，搅拌反应过夜；旋转蒸发抽干溶剂，再加入100份的水，各以100份乙酸乙酯萃取二次；所得乙酸乙酯以无水硫酸钠干燥，旋转蒸发抽干有机溶剂，再以柱色谱分离得检测一氧化氮的荧光探针，所述检测一氧化氮的荧光探针的结构式如下：

在步骤一中，所述加热反应的温度可为70～110℃，最好为90℃；加热反应的时间可为6～10h，最好为8h；所述有机溶剂可选自N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，乙二醇单甲醚，乙二醇二甲醚，1，4-二氧六环等中的一种；所述柱色谱可采用乙酸乙酯-二氯甲烷等。

在步骤二中，所述反应的时间可为8～16h，最好为12h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h；所述柱色谱分离可采用乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/10。

在步骤三中，所述加热回流的时间可为2～4h，最好为3h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h；所述柱色谱分离可采用乙酸乙酯/二氯甲烷。

将本发明所制备的探针1分别应用于中性条件下水溶液中一氧化氮的荧光检测。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是：

基于新颖的以酰胺化邻苯二胺为一氧化氮识别基团而设计的荧光探针分子；

探针的荧光光谱具有大Stokes位移的优点，能够显著减少荧光分析中散射光以及背景荧光的干扰。

该探针自身无荧光或荧光信号很弱，与一氧化氮作用后荧光显著增强，故检测的灵敏度高。

该探针对于一氧化氮作用的专一性强。

合成路线简单。

本发明所提供的检测一氧化氮方法依赖于以下的化学反应机制：以酰胺化邻苯二胺作为强荧光型荧光团4-胺基-1，8-萘酰亚胺分子中的一氧化氮识别基团，所获得的化合物即探针1，探针1无荧光。探针1在一氧化氮作用下，化合物中胺基发生重氮化反应，形成酰基化苯并三唑，酰基化苯并三唑在水中进一步水解，重新释放出具有强荧光性质的4-胺基-1，8-萘酰亚胺荧光团，实现荧光从“无”到“有”的信号的急剧变化。反应过程如下所示：

附图说明

图1为探针1与不同浓度的一氧化氮作用后的荧光光谱。在图1中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；在0.05mol/L的pH 7.4 3，3-二甲基戊二酸-氢氧化钠缓冲溶液(乙腈/水＝1/99，体积之比)中，探针1浓度均为10.0μmol/L，(由下而上)NOC13*浓度分别为：0，2，4，8，10，14，18，30，40，50，60，80μmol/L。激发波长：438nm。

*注：NOC13为一氧化氮载体，在碱性条件下稳定存在而中性条件下水溶液中即自发产生一氧化氮。余下同。

图2为探针1在pH 7.4的0.05mol/L 3，3-二甲基戊二酸-氢氧化钠缓冲溶液(乙腈/水＝1/99，体积之比)中，对于各种活性氧物种及阴离子NO₂ ^-和NO₃ ^-分别作用下的荧光光谱。在图2中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；探针1浓度均为10.0μmol/L，其它活性氧及阴离子NO₂ ^-和NO₃ ^-浓度均为100.0μmol/L；其它活性氧包括：H₂O₂，NaClO，ROO·，NO，O₂·^-，ONOO^-，·OH；激发波长：438nm。

图3为探针1在pH7.4的水溶液中荧光法检测NO的工作曲线图。在图3中，横坐标为NO浓度(10^-6M)，纵坐标为相对荧光强度。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但本发明不受下列实施例的严格限定。

实施例1：探针1的制备方法

步骤一、在25mL的圆底烧瓶中，加入0.5g 4-氨基-1，8-萘酸酐(1.0eq)和6.0mL N，N-二甲基甲酰胺，逐滴加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.2eq)共0.282mL，90℃加热搅拌反应8h；冷却至室温，加入饱和食盐水后有固体析出，离心并干燥得如下结构的中间体：

步骤二、取0.1g上述中间体溶解在2mL吡啶中，加入0.040mL醋酸酐后室温搅拌反应过夜，旋转蒸发抽干有机溶剂吡啶；再加入10mL的水，各以10mL乙酸乙酯萃取两次；有机相以无水硫酸钠干燥1h，旋转蒸发抽干有机溶剂，再以柱色谱(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/10)分离得如下结构的橘红色固体：

步骤三、将上述固体(60mg，1.0eq)和二异丙基乙基胺(68.02mg，3.0eq)的0.6mL甲苯溶液慢慢滴加到三光气(52.06mg，1.0eq)的3.0mL甲苯溶液中后加热回流3h；冷却至室温，加入6mL二氯甲烷后离心分离得上层清夜，将上层清液慢慢加入到邻苯二胺(22.74mg，1.5eq)的0.6mL二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应过夜。旋转蒸发抽干有机溶剂，再加入6mL的水，各以6mL乙酸乙酯萃取两次，有机相以无水硫酸钠干燥1h；旋转蒸发抽干有机溶剂，再以柱色谱(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/5)分离得黄色粉末，即目标产物探针1(28.7mg，34.4％)。结构如下：

探针1的结构表征数据如下：

¹H NMR(d₆-DMSO，400MHz)δ(ppm)：9.55(s，1H)，8.70(d，J＝8.6Hz，1H)，8.57(d，J＝8.5Hz，1H)，8.54(d，J＝8.2Hz，1H)，8.45(t，J＝4.2Hz，2H)，7.93(t，J＝7.9Hz，1H)，7.42(dd，J＝1.3Hz，7.9Hz，1H)，6.94-6.88(m，1H)，6.79(dd，J＝1.4Hz，7.9Hz，1H)，6.62(td，J＝1.4Hz，7.8Hz，1H)，4.97(s.2H)，4.24(t，J＝6.4Hz，2H)，4.09-4.05(m，2H)，3.68(t，J＝6.3Hz，2H)，3.66-3.61(m，2H)，1.89(s，3H).

¹³C NMR(d₆-DMSO，100MHz)δ(ppm)：170.71，164.05，163.42，153.05，142.64，141.83，133.01，131.33，129.00，128.38，126.56，125.54，124.70，124.28，122.84，122.55，117.22，116.34，115.06，114.93，68.40，67.34，63.54，38.94，20.99.

HRMS：m/z 499.15834([M+Na]⁺)，calculated：499.1588.

实施例2：探针1的化学性能

(1)测试液的配制步骤：

在10mL比色管中，加入1.0mL 3，3-二甲基戊二酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 7.40)，再加入不同体积的1.0×10^-3M的NOC13标准溶液(事先制备一氧化氮载体NOC13，参见文献：Hrabie J.A.，Klose J.R.J.Org.Chem.1993，58，1472-1476.)，用3次去离子水稀释至刻度，摇匀；再加入0.1mL 1.0×10^-3M1的乙腈储备溶液，再次摇匀，于37℃水浴中放置40min后以438nm为激发，于540nm处测定荧光强度。如上操作，但不加入一氧化氮或其他活性氧之探针1溶液，为空白试液的配制。

(2)水溶液中探针1的光谱特性及检测性能。

图1是探针1在中性条件下水溶液中对一氧化氮的荧光响应。图1显示，探针1在pH为7.4的3，3-二甲基戊二酸-氢氧化钠缓冲溶液中，在540nm处呈现弱荧光，随着一氧化氮的加入，540nm处的荧光显著增强。该现象表明，探针1对一氧化氮具有灵敏而迅速的荧光信号响应。

图2是探针1对各种活性氧物种及阴离子分别作用的荧光响应光谱图。曲线1为仅探针1存在下的荧光光谱图；曲线2为探针1在10当量H₂O₂，NaClO，ROO·，NO，O2·^-，ONOO^-，·OH，NO₂ ^-，NO₃ ^-分别存在下的荧光光谱；曲线3为探针1在1当量的NO存在下的荧光光谱。

图2显示，仅一氧化氮存在下体系的相对荧光强度显著增强。相比之下，浓度为一氧化氮的10倍当量的其它常见活性氧物种(H₂O₂，NaClO，ROO·，NO，O₂·^-，ONOO^-，·OH)及阴离子NO₂ ^-和NO₃ ^-分别单独存在时，探针1均几乎不产生明显的荧光信号。该现象表明，探针分子1对一氧化氮(NO)具有高度的荧光选择性识别作用。

图3为探针1在pH7.4的水溶液中检测NO的工作曲线图。研究结果表明，体系的荧光强度在10～80.0μmol/L的浓度范围内与NO浓度呈现良好的线性关系，线性相关系数为0.9911，且其检测限可达到7.1×10^-7mol/L。

Claims

1.一种检测一氧化氮的荧光探针，其特征在于记为探针1，其分子结构式如下：

探针1

2.如权利要求1所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤三：在容器中分别加入1.0份中间体B、3.0份二异丙基乙基胺和10份的甲苯，得混合液，再将混合液加到含有0.8份三光气以及30份甲苯的溶液中，加热回流后冷却至室温；再加入50份二氯甲烷后离心分离，得上层清液；将所得上层清液加入到含有1.5份邻苯二胺以及10份二氯甲烷的溶液中，搅拌反应过夜；旋转蒸发抽干溶剂，再加入100份的水，各以100份乙酸乙酯萃取二次；所得乙酸乙酯以无水硫酸钠干燥，旋转蒸发抽干有机溶剂，再以柱色谱分离得检测一氧化氮的荧光探针，所述检测一氧化氮的荧光探针的结构式如下：

3.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤一中，所述加热反应的温度为70～110℃，最好为90℃；加热反应的时间为6～10h，最好为8h。

4.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤一中，所述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，乙二醇单甲醚，乙二醇二甲醚，1，4-二氧六环中的一种。

5.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤一中，所述柱色谱采用乙酸乙酯-二氯甲烷。

6.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤二中，所述反应的时间为8～16h，最好为12h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h。

7.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤二中，所述柱色谱分离采用乙酸乙酯/二氯甲烷＝1/10。

8.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤三中，所述加热回流的时间为2～4h，最好为3h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h。

9.如权利要求2所述的一种检测一氧化氮的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤三中，所述柱色谱分离采用乙酸乙酯/二氯甲烷。

10.如权利要求1所述的一种检测一氧化氮的荧光探针用于中性条件下水溶液中一氧化氮的荧光检测。