CN108434467A - 一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂及其制备方法，包括由特异性荧光素感应剂、特异抗体PD‑1和９‑（邻羧苯基）‑６‑羟基‑３Ｈ‑咕吨‑３‑酮以及所述特异性荧光素感应剂包含4‑硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺和EDTA组成的荧光素感应剂，所述特异性荧光素感应剂的外层设置特异抗体PD‑1，所述特异性荧光素感应剂的内层设置９‑（邻羧苯基）‑６‑羟基‑３Ｈ‑咕吨‑３‑酮，特异性荧光素感应剂纳米探针富集到肿瘤部位并在近红外光的照射下，能很好地将肿瘤锁定，并且不会对其他的部位造成损失，本发明在医学领域具应用具有有深远的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂及其制备方法和应用。
背景技术
作为体内重要的信使物质和效应分子，一氧化氮(Nitric oxide，NO)参与了许多生理和病理反应，具有广泛的生理功能。然而，由于NO 是一种气体自由基，其在细胞和组织中具有扩散快、与生物目标发生反应等特点。因此，在生物体内检测NO 的形成和迁移十分困难。所以探寻能实时、快速、简便检测NO 的方法一直是研究者们竞相研究的热门课题。在众多的NO 检测方法中，荧光探针法具有非入侵式、高灵敏度、选择好以及可对检测对象在原位进行实时监控和观察等优点。为开发新的用检测NO 的荧光探针。然而，这些基于荧光成像或生物发光的纳米探针常常受到组织穿透深度的限制，无法实现深层组织中一氧化氮的检测。因此，迫切需要开发高特异性和灵敏度的新型纳米探针以实现深层组织和器官中一氧化氮的精准成像，从而提高疾病的检测灵敏度。
光声成像是基于光声转换现象的成像方法。在检测过程中，样品吸收入射激光的能量而发生热膨胀，伴随产生超声波，仪器将接收到的超声波转换为影像信息。样品对激光能量吸收的差异导致超声波强度的不同，从而形成影像的明暗差异。光声成像技术结合光学和超声两种成像技术的优点，能实现对组织体较大深度的高分辨率、高对比度的功能成像。目前，许多在近红外区有强吸收的纳米粒子被广泛用于肿瘤的光声成像。此外，对生理上的某些信号例如活性氧、酸碱性和酶响应的光声造影剂也被广泛用于疾病的检测。然而，利用光声成像技术对体内一氧化氮检测还鲜有报道。
发明内容
针对目背景技术中的诸多问题，本发明提出了一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂，包括荧光素感应剂，所述荧光素感应剂由特异性荧光素感应剂、特异抗体PD-1和９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮构成；所述特异性荧光素感应剂包含4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺和EDTA组成；所述特异性荧光素感应剂的外层设置特异抗体PD-1，所述特异性荧光素感应剂的内层层设置９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮。
优选地，所述4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺与所述EDTA的摩尔比5.8：4：0 .5。
优选地，所述检测肿瘤并能辅助成像的试剂的粒径为70～115纳米。
本发明的另一个目的提供一中制备该试剂的方法，包括如下步骤：将4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺、EDTA和９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮溶解在乙二醇溶液中，然后通过旋转蒸发形成晶体或膜；然后将所述晶体或膜与特异抗体PD-1的磷酸盐缓冲溶液混合，以使形成所述特异性荧光素感应剂的外层设置特异抗体PD-1，所述特异性荧光素感应剂的内层层设置９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮，并将混合液进行冻融；将冻融后的混合液进行过滤、纯化，得到检测肿瘤并能辅助成像的试剂。
优选地，所述4-硝基邻苯二甲酸酐、所述蔡酞亚胺、所述EDTA与所述９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮的摩尔比为5.8：4：0 .5：12。
优选地，所述冻融为：将混合液在液氮中冷冻，然后在5.85℃条件下解冻。
优选地，所述冻融的次数为5次。
优选地，所述过滤为：将冻融后的混合液在200纳米的滤膜上过滤40～50次。
优选地，所述纯化为：通过S-300的凝胶柱纯化除去游离的９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮。
本发明还有一个目的为所述制备方法制得的检测肿瘤并能辅助成像的试剂在制备基于光声成像技术的炎症或肿瘤检测试剂中的应用。
本发明的有益效果具有1 .本发明制备的检测肿瘤并能辅助成像的试剂具有非常好的一氧化氮响应性，可以实现纳摩级别一氧化氮的检测；跟传统的利用荧光或生物发光进行一氧化氮检测的技术相比，光声成像进行的检测能明显提高组织的穿透深度，实现深层组织的一氧化氮成像；利用荧光素感应剂的光声成像能实时监测炎症的发生与发展。
2 .本发明提供的检测肿瘤并能辅助成像的试剂，除了可以实现炎症的成像，还能与肿瘤微环境中一氧化氮反应实现肿瘤的光声成像。另外，该特异性荧光素感应剂纳米探针可以有效地区分具有转移瘤的淋巴结和正常的淋巴结。
3 .利用本发明制备的检测肿瘤并能辅助成像的试剂除了有很好的一氧化氮检测性能，还是一个非常好的一氧化氮激活的光热试剂。特异性荧光素感应剂纳米探针富集到肿瘤部位并在近红外光的照射下，能很好地将肿瘤锁定，并且不会对其他的部位造成损失。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示实施例1中荧光素感应剂的透射电镜照片；
图2示实施例1中荧光素感应剂的激光粒径分布；
图3示实施例3中荧光素感应剂与不同浓度的一氧化氮孵育后的紫外吸收光谱图；其中，a示荧光素感应剂与不同浓度的一氧化氮孵育后的紫外吸收光谱图；b示荧光素感应剂与不同浓度的一氧化氮孵育后的800纳米处吸收；
图4示实施例3中荧光素感应剂与不同浓度的一氧化氮孵育后的光声信号；
图5示实施例5中荧光素感应剂用于淋巴转移瘤的成像；a示将荧光素感应剂注射到有转移瘤的淋巴结或正常淋巴结中的光声成像图；b为a的光声成像信号强度曲线图；
图6示实施例7中小鼠淋巴结位温度与激光照射时间的关系；其中，a示将荧光素感应剂注射到有转移瘤的淋巴结或正常淋巴结中再进行激光照射后的红外热成像图；b为各组肿瘤表面温度变化曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的，技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例，仅仅用于解释本发明，而非对发明的限定。
另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部内容。
本发明公开了一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂及其制备方法和应用，本领域技术员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
名词解释：PD-1是 Programmed Death-1 的简称，中文名叫程序性死亡受体-1，EDTA是乙二胺四乙酸的有机化合物。
在本发明提供的检测肿瘤并能辅助成像的试剂的制备方法包括以下步骤：
将4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺、EDTA以及９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮以摩尔比5.8:4:0 .5:12溶解在乙二醇溶液中，然后通过旋转蒸发形成晶体或膜；
然后将其中加入0 .2mg/ml的特异抗体PD-1磷酸盐缓冲溶液，并将混合液冷冻，然后在5.85℃下解冻；
将经过五次冻融后的溶液在200纳米的滤膜上过滤～50次，再通过S-300的凝胶柱纯化除去游离的９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮和特异抗体PD-1。
本发明提供的检测肿瘤并能辅助成像的试剂及其制备方法和应用中所用试剂、仪器或生物材料等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：制备检测肿瘤并能辅助成像的试剂：
本发明所述检测肿瘤并能辅助成像的试剂，包括荧光素感应剂其特征在于，所述荧光素感应剂由特异性荧光素感应剂、特异抗体PD-1和９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮构成；所述特异性荧光素感应剂包含4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺和EDTA；所述特异性荧光素感应剂的外层设置特异抗体PD-1，所述特异性荧光素感应剂的内层层设置９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮。
具体的制法有以特异性荧光素感应剂为基底，在其外层壳中设置特异抗体PD-1，内层层用来设置９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮等，形成荧光素感应剂。具体包括以下步骤：
将4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺、EDTA以及９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮以摩尔比5.8:4:0 .5:12溶解在乙二醇中，然后通过旋转蒸发形成晶体或膜；然后将其中加入0 .2mg/ml的特异抗体PD-1磷酸盐缓冲溶液并将混合液在5.85℃下处理；由于升温和冷和冷却的过程中PD-1和９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮物性状态不同，结合上述的工艺方法先后顺序如蒸发形成晶体或膜后加特异抗体PD-1和在不同物性下易形成所述特异性荧光素感应剂的外层设置特异抗体PD-1，所述特异性荧光素感应剂的内层层设置９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮，将经过五次冻融后的溶液在200纳米的滤膜上过滤约50次，再通过S-300的凝胶柱纯化除去游离的９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮和特异抗体PD-1。然后，进行表征(透射、动态光散射)。
附图1是检测肿瘤并能辅助成像的试剂的透射电镜照片，从图上可以看到荧光素感应剂分布均匀并且粒径大约为～100nm。图2是上述荧光素感应剂的激光粒径分布，如图2所示，荧光素感应剂的水化半径约为100nm左右。进一步证明了本实施例成功合成了荧光素感应剂。
实施例2：荧光素感应剂的一氧化氮响应的特异性
为了研究荧光素感应剂的一氧化氮响应的特异性，本实施例将荧光素感应剂和EDTA与不同的活性氧孵育，包括一氧化氮(NO)，叔丁基一氧化氮，次氯酸根(-OCl)，羟自由基(·OH)，叔丁基自由基(·OtBu)，氧化氮自由基(NO·)，过氧根(O2-)。
用上述荧光素感应剂与不同的活性氧孵育半小时后测得在800nm处的吸收。可以的到荧光素感应剂几乎对所有的活性氧都不响应。荧光素感应剂与一氧化氮孵育后在800nm处的吸收有明显的增强，而对其他类型的活性氧的响应并不是很强。因此，荧光素感应剂S的确有非常好的一氧化氮响应的特异性。
实施例3：荧光素感应剂一氧化氮浓度依赖的吸收
为了研究荧光素感应剂的一氧化氮浓度依赖的近红外吸收，本实施例将荧光素感应剂分散在不同浓度的一氧化氮中(0 .8-50 .0μM)，然后测其紫外可见光谱。结果如附图3所示，荧光素感应剂在800nm处的吸光度与一氧化氮的浓度成比例增加。
由于荧光素感应剂具有非常好的一氧化氮浓度依赖的近红外吸收，本实施例又对分散在不同浓度的一氧化氮中荧光素感应剂进行光声成像。结果如附图4所示，荧光素感应剂在4-硝基邻苯二甲酸酐在800nm处的光声信号随一氧化氮浓度的增加而增加。因此，该一氧化氮荧光素感应剂具有非常好的特异性和灵敏度。
实施例4：荧光素感应剂用于脂多糖(LPS)诱导的炎症模型的检测
为了证明荧光素感应剂纳米探针可用于活体一氧化氮的检测，本实施例通过腹腔注射脂多糖(LPS)来建立炎症模型。在模型建立24小时后，腹腔注射荧光素感应剂和荧光素感应剂后对小鼠腹部进行光声成像，对建立了炎症模型的小鼠，在注射荧光素感应剂后，小鼠腹部出现非常强的光声信号，而注射荧光素感应剂和EDTA后，小鼠腹部出现光声信号要弱很多。作为阴性对照，健康小鼠注射荧光素感应剂后，小鼠腹部几乎没有光声信号。这些结果共同证明荧光素感应剂可用于有炎症引起的体内一氧化氮的检测。从图中还能看到具有炎症的小鼠腹部的光声信号在注射荧光素感应剂后20-30分钟内达到峰值，因此选择20分钟作为标准的成像时间。
另外，为了抑制LPS诱导的炎症，在LPS注射前连续给小鼠口服抗炎药(Celecoxib)三天。在LPS注射后的不同时间点，给小鼠腹腔注射荧光素感应剂，并在20分钟后进行光声成像。小鼠腹部的光声信号从0小时到24小时逐渐增强。而Celecoxib提前处理的小鼠腹部的光声信号明显较弱，表面Celecoxib可以抑制炎症的进展。
实施例5：荧光素感应剂用于肿瘤的成像
在癌细胞的生长过程中，炎症细胞和快速生长的肿瘤细胞会在肿瘤微环境中生成大量的一氧化氮，也可将本发明的试剂做成各种探针形式的检测，因此，一氧化氮响应的荧光素感应剂纳米探针也许可以用于肿瘤的检测。将荧光素感应剂和EDTA、4-硝基邻苯二甲酸酐或者荧光素感应剂通过尾静脉注射到携带有皮下肿瘤的小鼠体内，在不同时间点进行光声成像，注射了荧光素感应剂小鼠肿瘤的光声信号随着时间而增强接下来，又进一步证明该纳米探针可用于淋巴转移瘤的成像。将癌细胞注射到小鼠的足部，大约12天后，小鼠的前哨淋巴结会有明显的转移瘤。然后，将荧光素感应剂注射到足部的原发性肿瘤中，为了比较，将相同量的荧光素感应剂注射到另一侧没有肿瘤的小鼠足部。在不同时间点，对小鼠的淋巴结进行光声成像。结果如图5所示，在有转移瘤的淋巴结中有非常明显的光声信号。因此，本发明的一氧化氮响应的纳米探针能非常准确的区分转移性淋巴结和正常的淋巴结。
实施例6：基于荧光素感应剂的光热治疗由于荧光素感应剂有非常好的一氧化氮浓度依赖近红外吸收，因此荧光素感应剂不仅是很好的一氧化氮探针，该探针也许可以作为一氧化氮激活的光热试剂。将光素感应剂和EDTA、和4-硝基邻苯二甲酸酐或者荧光素感应剂分别注射到携带有皮下肿瘤的小鼠体内。注射24小时后，在808nm激光器的照射10分钟，同时使用红外热成像仪来监测肿瘤部位的温度。注射了荧光素感应剂的小鼠，其肿瘤表面温度从34℃快速升温至55℃。而对照组，在相同照射条件下，注射了其他纳米粒子小鼠肿瘤表面的温度几乎没有变化。
接下来，本实施例开展了光热治疗。选取5只背部带有4T1肿瘤的小鼠作为实验组，从尾静脉注射荧光素感应剂，经过24小时后，然后将肿瘤部位暴露在808纳米激光下照射10min，激光功率为0 .5W/cm2。另外三组背部带有肿瘤的小鼠(每组5只)做为对照组试验，分别注射磷酸盐缓冲液、荧光素感应剂和EDTA或荧光素感应剂和4-硝基邻苯二甲酸酐，并在相同功率的激光下照射10min。当处理完每组小鼠之后，小鼠背部的肿瘤体积每隔二天测量一次，体积的计算方法是：长*宽/2。小鼠注射了荧光素感应剂并在808纳米激光照射下，其肿瘤几乎全部锁定。
实施例7：基于荧光素感应剂对淋巴转移瘤的光热效应
除了皮下肿瘤模型，本发明还研究了荧光素感应剂在淋巴肿瘤模型上的光热效应。在小鼠的足部(有或者没有肿瘤)分布注射了荧光素感应剂，4小时后，对小鼠的淋巴结进行激光照射5分钟，同时用热成像仪监测淋巴结的温度。结果如图6所示，有转移瘤的淋巴结的温度有明显的升高，而在相同照射条件下正常淋巴结表面的温度几乎没有变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。
Claims (10)
1.一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂，包括荧光素感应剂，其特征在于，所述荧光素感应剂由特异性荧光素感应剂、特异抗体PD-1和９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮构成；所述特异性荧光素感应剂包含4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺和EDTA；所述特异性荧光素感应剂的外层设置特异抗体PD-1，所述特异性荧光素感应剂的内层设置９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮。
2.根据权利要求1所述的检测肿瘤并能辅助成像的试剂，其特征在于，所述4-硝基邻苯二甲酸酐、所述蔡酞亚胺与所述EDTA的摩尔比5.8：4：0 .5。
3.根据权利要求1至3中任一项所述的检测肿瘤并能辅助成像的试剂，其特征在于，所述检测肿瘤并能辅助成像的试剂的粒径为70～115纳米。
4.一种检测肿瘤并能辅助成像的试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺、EDTA和９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮溶解在乙二醇溶液中，然后通过旋转蒸发形成晶体或膜；然后将所述晶体或膜与特异抗体PD-1的磷酸盐缓冲溶液混合，以使形成所述特异性荧光素感应剂的外层为特异抗体PD-1，所述特异性荧光素感应剂的内层为９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮，并将混合液进行冻融；将冻融后的混合液进行过滤、纯化，得到检测肿瘤并能辅助成像的试剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述4-硝基邻苯二甲酸酐、蔡酞亚胺、所述EDTA与所述９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮的摩尔比为5.8：4：0 .5：12。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述冻融为：将混合液在液氮中冷冻，然后在5.85℃条件下解冻。
7.根据权利要求4至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述冻融的次数为5次。
8.根据权利要求4至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过滤为：将冻融后的混合液在200纳米的滤膜上过滤40～50次。
9.根据权利要求4至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为：通过S-300的凝胶柱纯化除去游离的９-（邻羧苯基）-６-羟基-３Ｈ-咕吨-３-酮。
10.如权利要求1至3中任一项所述的检测肿瘤并能辅助成像的试剂或如权利要求4至5中任一项所述制备方法制得的检测肿瘤并能辅助成像的试剂在制备基于光声成像技术的炎症或肿瘤检测试剂中的应用。
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