CN104974743A - 一种荧光探针及其在检测细胞溶酶体内次氯酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可用于选择性检测次氯酸的荧光探针。在萘酰亚胺荧光母体上引入偏碱性的吗啉结构使得探针能够定位到细胞的溶酶体中，引入硒醚结构作为与次氯酸反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测次氯酸，尤其是可以应用于检测活细胞溶酶体中的次氯酸。
Description
技术领域
本发明提供了一种可用于选择性检测次氯酸的荧光探针。在萘酰亚胺荧光母体上引入偏碱性的吗啉结构使得探针能够定位到细胞的溶酶体中，引入硒醚结构作为与次氯酸反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测次氯酸，尤其是可以应用于检测活细胞溶酶体中的次氯酸。
背景技术
次氯酸（HOCl）属于一种活性氧（ROS，有十分重要的生理和病理学意义），作为一种高效的杀菌剂，在生命的免疫系统中起到重要的作用。细胞内源性的次氯酸主要由白细胞（如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等）中的髓过氧化物酶（MPO，存在于溶酶体）/双氧水(H2O2)/氯离子（Cl-）系统来产生。细胞免疫反应产生的次氯酸，若超过一定的水平，则会引起严重的疾病（如关节炎，癌症，神经退行疾病）。正是因为次氯酸具有如此重要的生理和病理学意义，对存在于生物系统中的次氯酸检测引起了人们的广泛重视。
荧光探针是有效检测生命体内次氯酸的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单、亚细胞定位等优点。近年来，能够应用于检测活细胞中次氯酸的荧光探针如雨后春笋般出现了，然而这些探针都不能够定位到溶酶体（Lysosome）这一产生次氯酸的细胞器。因此开发能够定位到溶酶体中检测次氯酸的荧光探针仍具有重要意义。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞溶酶体内次氯酸的荧光探针，此探针可以在溶酶体生理条件下选择性地与次氯酸作用，作用后荧光显著增强。
本发明采用如下技术方案：采用萘酰亚胺染料作为荧光母体，在萘酰亚胺母体上引入偏碱性的吗啉结构使得探针能够定位到细胞的溶酶体（pH在4.0到5.5之间）中，引入硒醚结构作为与次氯酸反应的活性中心，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测次氯酸，尤其是可以应用于检测活细胞溶酶体中的次氯酸。
所述荧光探针的结构式如下。
上述结构式Ⅰ表示的化合物应用于检测次氯酸，其特征在于反应生成具有结构式II的化合物，从而导致荧光改变。此外，加入还原性物质（如谷胱甘肽， GSH）后，结构式II可以变为结构式Ⅰ，从而实现探针的可逆性应用。
结构式Ⅰ可对次氯酸定性、定量的检测。将浓度呈梯度变化的次氯酸水溶液分别加入含结构式Ⅰ的水溶液中，反应达到平衡后，分别测定各样品的荧光强度，然后以次氯酸的浓度为横坐标、反应后体系的荧光强度为纵坐标作图，即可根据荧光强度从图中读出待测溶液中次氯酸的含量。
本发明的有益效果：该化合物在次氯酸存在下荧光发生显著改变，可用于高选择性、高灵敏性地检测次氯酸。加入还原性物质（如谷胱甘肽，GSH）后，可以实现探针的可逆性应用。尤其是，该化合物可用于细胞内的溶酶体中的次氯酸检测，这对于深入研究次氯酸在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。
附图说明
图1本发明提供的荧光探针Lyso-NI-Se检测次氯酸的原理示意图；
图2实施例1中合成的探针Lyso-NI-Se的1H NMR(a)，13C NMR(b)，77Se NMR(c)谱图；
图3实施例2中荧光探针Lyso-NI-Se对次氯酸的选择性示意图；
图4实施例3中荧光探针Lyso-NI-Se水溶液的紫外可见吸收光谱（a）、荧光发射光谱（b）540nm处的荧光强度（c）随次氯酸浓度的变化示意图；
图5实施例3中pH对荧光强度的影响示意图；
图6实施例3中荧光探针Lyso-NI-Se及其产物的耐光氧化示意图；
图7实施例4中荧光探针Lyso-NI-Se与次氯酸反应速率的动力学示意图（a）；加入GSH后荧光降低（b）。
具体实施方式
实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
实施例1（探针的合成）：
如图3所示，实施例所采用的探针化合物的结构用代号Lyso-NI-Se表示。
Lyso-NI-Se的合成：向50mL三口烧瓶中加入0.50g4-苯硒-苯胺，0.40g碘化亚铜和0.80g氮-（乙氨基吗啉）-4-溴-1，8-萘酰亚胺，0.10g氢氧化钾，真空/氮气置换三次，加入20ml无水二甲基亚砜，开磁力搅拌，升温至90℃，反应60分钟。过滤，将滤液减压蒸发，用二氯甲烷溶解，再次过滤并将滤液减压蒸干，将所得固体经硅胶柱层析纯化（用二氯甲烷和乙酸乙酯做洗脱剂）得目标化合物Lyso-NI-Se（红色固体）。1H NMR（500MHz,d6-DMSO）δ(ppm):9.41(s,1H),8.76(d,1H,J=8.5Hz),8.47(d,J=7.5Hz,1H),8.27(d,1H,J=8.5Hz),7.78(t,1H,J=7.75Hz),7,56-7.54(m,2H),7.46-7.44(m,2H),7.39-7.31(m,6H),4.15(t,2H,J=6.75Hz),3.54-3.53(m,4H),2.55(t,2H,J=7.0Hz),2.46(s,4H).13C NMR(d6-DMSO,500MHz)δ(ppm):163.52,162.68,146.81,140.73,134.94,133.11, 131.64,131.39,130.99,129.55,129.34,128.97,127.20,125.21,123.23,122.01,121.97,111.48,108.84,66.18,55.65,53,37,36.48.77Se NMR(d6-DMSO,400MHz)δ(ppm):402.49.HRMS(ESI)Calcd for C30H27N3O3Se[MH+]558.1296,found558.1303.
实施例2（Lyso-NI-Se对次氯酸的选择性）：
先后将4000μL磷酸盐缓冲溶液（pH=5.0，浓度为0.1M）、4000uL Lyso-NI-Se的乙腈溶液（10μM）、80μL活性氧溶液加入到10mL比色管中，混匀后取3mL溶液加入1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，测量该工作液的荧光发射光谱，λex=430nm，光栅宽度为5nm，4nm。
Lyso-NI-Se对HClO的选择性实验结果如图4所示,纵坐标表示波长为540nm处的荧光强度。图3表明Lyso-NI-Se对HClO具有很好的选择性，体系荧光显著增强。测定条件下，相比于HClO，其他活性氧（当量远远超过HClO）导致的荧光增强可以忽略。
实施例3（Lyso-NI-Se对次氯酸的定量检测）：
先后将4000μL磷酸盐缓冲溶液（pH=5.0，浓度为0.1M）、4000uL Lyso-NI-Se的乙腈溶液（10μM）、80μL含不同浓度的次氯酸的溶液加入到10mL比色管中，混匀后取3mL溶液加入1cmⅹ1cmⅹ4cm的比色皿中，测量该工作液的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱（λex=430nm，光栅宽度为5nm，4nm）。
图4表明该探针可以检测人体生理水平的次氯酸。随次氯酸加入量(0到8.0μM)增加吸收光谱（a）和荧光光谱（b）的变化情况，540nm处的荧光强度随次氯酸加入量增加而增强（c）。
图5说明在pH为4.0到5.5的溶酶体pH条件下，Lyso-NI-Se的荧光在次氯酸作用下可以显著增强，pH对该探针的影响十分有限。
图6说明在实验条件下，探针本身或者探针与次氯酸作用后得到的产物均耐光氧化。
图7表明Lyso-NI-Se与次氯酸的反应十分迅速（a）；加入GSH后工作液的荧光强度又可以降低（b），表明该探针为可逆探针。
实施例4（探针Lyso-NI-Se可定位于细胞溶酶体，并能检测外源性次氯酸）：
小鼠巨噬细胞RAW264.7按照American type Tissue Culture Collection规定进行培养。用中性红（一种能够定位细胞溶酶体的荧光探针）复染细胞来验证探针Lyso-NI-Se可以定位到细胞溶酶体。对照组细胞：用含有5.0μMLyso-NI-Se的细胞培养液孵育RAW264.7细胞30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，置于共聚焦荧光显微镜下拍照；另一组细胞：用含有5.0μM Lyso-NI-Se的细胞培养液孵育RAW264.7细胞30分钟，将细胞用PBS洗涤3次后，加入5.0μM次氯酸钠，一分钟后置于共聚焦荧光显微镜下拍照。结果显示：探针与中性红复染的皮尔森系数很高；同时加入次氯酸钠的细胞荧光图像亮度明显高于对照组。
Claims (7)
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：
2.权利要求1所述的荧光探针在检测次氯酸中的应用，其特征是：结构式Ⅰ表示的化合物与次氯酸反应后生成具有结构式II结构的化合物，从而导致荧光增强；
3.根据权利要求2所述的应用，结构式II表示的化合物可以被还原性物质还原，其特征是：结构式II表示的化合物与还原性物质反应后生成具有结构式Ⅰ结构的化合物，从而导致荧光降低。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述还原性物质谷胱甘肽、硫化氢、半胱氨酸中的一种或二种以上。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：用于检测次氯酸的测定包括以下工序：
（a）使具有通式I结构的化合物与次氯酸反应；
（b）测定由上述工序中的反应引起的荧光变化。
6.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于：
所述的荧光探针在检测细胞溶酶体内次氯酸中的应用。
7.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于：
所述检测环境为生理范围内的pH=4-10，温度为20-40℃，荧光激发和发射波长均位于可见波段。
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Application publication date: 20151014 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |