CN107325095A - 一种溶酶体次氯酸荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种溶酶体次氯酸荧光探针，化学名称为8,8,9‑三甲基‑5‑（2‑吗啉乙基）‑9,10‑二氢苯并[de]吡咯[2,3‑9]异喹啉‑4,6（5H,8H）二酮，简称TPS‑Lyso‑HClO。所述溶酶体次氯酸荧光探针可检测溶液及溶酶体中次氯酸含量：检测溶液的激发波长为380 nm；pH为7.0‑7.4时，发射波长为446nm；pH为5‑5.5时，发射波长为490nm；双光子细胞荧光成像激发波长为780 nm，发射波段为480‑540 nm和560‑620 nm；单光子细胞荧光成像激发波长为405 nm，发射波段为480‑540 nm和560‑620 nm。本发明的溶酶体次氯酸对次氯酸反应的专一性强，抗多种干扰物；具有溶酶体靶向性；灵敏度高，检测限低，检测次氯酸浓度范围广。本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种溶酶体次氯酸荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种快速检测次氯酸的光敏性荧光探针及其制备和在检测溶酶体次氯酸中的应用，属于小分子探针领域。
背景技术
次氯酸（HClO）属于活性氧的一种，作为一种高效的杀菌剂，在生命的免疫系统中起到重要的作用。细胞内源性的次氯酸主要由白细胞（如单核细胞，嗜酸性细胞，嗜中性粒细胞等）中的髓过氧化物酶系统产生。细胞免疫反应产生可产生次氯酸，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病。在细胞内溶酶体作为一类较为重要的细胞器，次氯酸可以维持溶酶体的氧化-还原的平衡，对溶酶体的功能的稳定起到了十分重要的作用，检测溶酶体内次氯酸对判断机体状态具有重要意义。
可用于选择性检测次氯酸/次氯酸盐的方法有很多，如碘量滴定法、比色法、化学发光法、库仑法、极谱法和辐解法等。然而，这些方法往往比较繁琐，一些工作必须在有机介质或有机/水介质中进行，限制其应用。与传统检测方法相比，荧光探针被认为是生物研究理想的手段，因为荧光检测所需的仪器相对简单，选择性和灵敏度高，检测范围广，响应时间快速，而且检测过程对样品没有破坏，对细胞危害也很小，荧光检测结合显微镜可以提供实时检测，但不会对测试的生物样品造成损伤。在荧光成像技术中，双光子显微镜（TPM）可以进行组织中不同深度生物分子的研究。TPM的激发光是处于近红外区域的飞秒激光，相对于传统的单光子荧光显微镜技术（OPM）来说，它具有更大的组织穿透能力，较低的背景荧光和较低的光毒性。但迄今为止，双光子次氯酸荧光探针报道极少。因此，开发新的双光子次氯酸荧光探针具有应用价值。
发明内容
针对目前双光子次氯酸荧光探针数量极少的现状，本发明提供了一种检测细胞溶酶体中次氯酸的荧光探针及其制备方法。
本发明另一目的是提供该荧光探针通过荧光成像技术在检测溶液及溶酶体次氯酸中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种溶酶体次氯酸荧光探针，化学名称为8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮，简称TPS-Lyso-HClO，具有如下式（Ⅰ）所示的结构：
式（I）。
所述溶酶体次氯酸荧光探针，以吗啉基团为溶酶体定位基团。
一种所述溶酶体次氯酸荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨乙基吗啉在溶剂中加热回流，生成4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺：
；
（2）4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺与水合肼在溶剂中加热回流搅拌，生成4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺：
；
（3）在催化剂下，将化合物4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺和过量的3-甲基二丁酮加热回流，得8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮：
；
（4）8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮在溶剂中，经硼氢化钠还原得到8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮：
。
步骤（1）中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨乙基吗啉的摩尔比为1:1-1.5；4-溴-1,8-萘二甲酸酐的浓度为0.8-1.2mol/L；所述溶剂为乙醇；加热温度为80℃，加热时间为2-4 h。
步骤（2）中，水合肼质量浓度为40-80%；4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺与水合肼的摩尔比为1:20-70；4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺的浓度为0.1-0.5 mol/L；所述溶剂为乙醇；加热温度为80℃，加热时间为2-4 h；所述4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺经柱层析分离得到，淋洗剂为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇。
步骤（3）中，所述催化剂为浓硫酸；加热温度为100℃，加热时间为3-6 h；反应条件为惰性气体保护；所述8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮过柱色谱分离提纯，淋洗剂为体积比1:50的乙醇和二氯甲烷。
步骤（4）中，8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮与硼氢化钠的摩尔比为1:2-3；8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮的浓度为1.0 mmol/L；所述溶剂为甲醇；反应温度为小于5℃；8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮经过柱色谱分离得到，淋洗剂为体积比2:50的乙醇和二氯甲烷。
一种上述溶酶体次氯酸荧光探针在检测溶液及细胞溶酶体次氯酸含量中的应用。
所述应用，荧光检测溶液中次氯酸的激发波长为390 nm；pH为7.0-7.4时，荧光发射波长为446nm；pH为5-5.5时，荧光发射波长为490nm。
所述应用，双光子细胞荧光成像激发波长为780 nm，发射波段为500-540 nm和560-620 nm。
所述应用，单光子荧光成像激发波长为405 nm，发射波段为500-540 nm和560-620 nm。
检测的机理如下：
本发明所述检测次氯酸的荧光探针TPS-Lyso-HClO本身由于二级胺的强供电子能力，使得荧光探针产生强的分子内电荷转移效应，从而使探针具有红色的发射光（585 nm），在pH为中性的7.0-7.4时，当探针与次氯酸分子作用后，化合物TPS-Lyso-HClO上的氢化吲哚被次氯酸分子氧化成吲哚，使得探针整体的推拉电子能力降低，荧光发射波长向短波方向移动，使得荧光发射光变为蓝色（446 nm）；在pH为酸性的5-5.5时，当探针与次氯酸分子作用后，化合物TPS-Lyso-HClO上的氢化吲哚被次氯酸分子氧化成吲哚进而又被氧化成氧代吲哚，使得荧光发射波长向长波方向轻微移动，荧光发射光变为绿色（490 nm）。
反应式如下：
。
本发明具有以下优点：本发明的溶酶体次氯酸对次氯酸反应的专一性强，抗多种干扰物；近中性及酸性pH下，双光子荧光检测的发射波长不同，具有溶酶体靶向性；灵敏度高，检测限低，检测次氯酸浓度范围广。基于本发明中不同pH环境下次氯酸探针的特异性和显著的颜色变化，其可作为显示溶液中和生物细胞溶酶体内次氯酸分子存在的专一性指示剂，可进行实时定性检测和含量传感检测。故而，本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1探针TPS-Lyso-HClO的1H NMR谱图；
图2为实施例1探针TPS-Lyso-HClO的13C NMR谱图；
图3为TPS-Lyso-HClO对不同分子和离子的选择性；
图4为TPS-Lyso-HClO随不同浓度次氯酸的荧光强度变化；
图5为TPS-Lyso-HClO与次氯酸作用随时间的荧光强度变化；
图6为TPS-Lyso-HClO的溶酶体靶向荧光成像；
图7为TPS-Lyso-HClO对外源性次氯酸双光子细胞成像；
图8为TPS-Lyso-HClO对外源性次氯酸单光子细胞成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针TPS-Lyso-HClO的合成
（1）化合物4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺的合成：
在100 mL圆底烧瓶中，加入4-溴-1,8-萘二甲酸酐1 mmol，氨乙基吗啉1.2 mmol，再加入乙醇5 mL，加热回流3 h后，冷却至室温，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得浅灰色固体4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺。产率：81 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.57 (dd, J1= 7.2 Hz, J2= 0.8 Hz, 1H),8.55 (dd, J1= 8.4 Hz, J2= 0.8 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.22 (d, J =7.6 Hz, 1H), 8.00 (dd, J1= 8.4 Hz, J2= 7.2 Hz, 1H), 4.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H),3.53 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.57 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.47 (s, 4H); 13C NMR(100 MHz, DMSO-d 6 ): 163.30, 163.25, 133.09, 132.07, 131.82, 131.44, 130.20,129.63, 129.27, 128.68, 123.11, 122.33, 66.68, 55.91, 53.87, 37.38。
（2）化合物4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺的合成：
将化合物4-溴-N-(2-吗啉基乙基)萘酰亚胺0.2 mmol与水合肼（80%）0.5mL混合，在1mL乙醇中加热回流搅拌4h，冷却至室温，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，滤渣过柱层析分离，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇（V/V=30：1），得到化合物4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺。产率：77 %。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.16 (s, 1H), 8.62 (d, J= 8.4 Hz, 1H),8.42 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.29 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.64 (t, J = 7.6 Hz, 1H),7.25 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.15 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.54 (s,4H), 2.53 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.46 (s, 4H)；
13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ): 165.05, 164.14, 154.50, 133.52, 131.87,130.59, 129.56, 125.39, 122.94, 119.68, 108.52, 106.27, 67.49, 57.09, 54.70,37.63。
（3）化合物8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮的合成
将4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺1 mmol溶解在20 mL 3-甲基-2-丁酮中，然后缓慢滴加0.5 mL浓硫酸。反应体系在氮气氛围中加热回流4小时。然后减压蒸除多余的3-甲基-2-丁酮，粗产物经过柱色谱分离提纯（淋洗剂EtOH/CH2Cl2=1:50），最后得到黄色固体化合物8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮，产率：49%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.90 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 6.7Hz, 1H), 8.58 (s, 1H), 7.82 (s, 1H), 4.37 (s, 2H), 3.70 (s, 4H), 2.73 (s,2H), 2.62 (s, 4H), 2.48 (s, 3H), 1.44 (s, 6H)；
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 193.30, 163.59, 161.08, 153.93, 143.98, 142.06,130.25, 129.73, 129.06, 128.63, 127.95, 127.43, 125.80, 124.61, 123.87,121.91, 121.68, 119.91, 118.36, 98.96, 65.98, 55.20, 54.50, 52.79, 36.19,35.17, 28.68, 26.29, 21.47, 15.11。
（4）化合物8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮的制备
维持反应温度在5℃以下，将8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮1 mmol溶解在无水甲醇中，向反应体系中缓慢加入硼氢化钠2.6mmol。维持反应温度，继续搅拌1小时后，升温至室温再继续搅拌1小时。向反应体系中加入60 mL水，出现黄色固体，粗产物经过柱色谱分离（淋洗剂EtOH/CH2Cl2=2:50），得到红色固体8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9.10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H, 8H）二酮（9），产率90%。其1H NMR谱图如图1所示，其13C NMR谱图如图2所示：
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.52 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.00(d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.55 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 4.33 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.94– 3.84 (m, 1H), 3.70 (s, 4H), 2.69 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.61 (s, 4H), 1.39(s, 3H), 1.32 (d, J = 6.5 Hz, 3H), 1.18 (s, 3H)；
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 163.67, 163.24, 150.78, 132.51, 130.25, 128.60,127.11, 126.58, 123.47, 121.95, 115.84, 110.36, 66.04, 65.14, 55.30, 52.81,42.83, 35.99, 26.34, 21.65, 14.52。
实施例2 TPS-Lyso-HClO对不同分子和离子的选择性
取实施例1制备的TPS-Lyso-HClO次氯酸荧光探针溶于乙醇中，制成1 mM储备液。
分别配制5 mL浓度为40 mM的各种常规的离子及活性氧的磷酸缓冲液（10 mmol/LPBS，pH=5.5和pH=7.4）溶液。
在试管中加入25 μL探针母液、75 μL乙醇和100 mmol/L分析物的溶液，分别用pH=5.5和pH=7.4的10 mmol/L PBS定容至10 mL，摇匀后进行荧光检测（λex=390 nm；pH 7.4，λem=446 nm和λem=585 nm；pH 5.5，λem=490 nm和λem=585 nm），以短波的荧光强度与长波荧光强度的比值为纵坐标（I446/I585或I490/I585），建立不同分子和离子的荧光强度比率图，如图3所示，其中1-12分别为探针，过氧化氢，羟基自由基，超氧化物，过氧乙酸，氯化铁，氯化铜，氯化钴，氯化锌，亚硝酸钠，硝酸钠和次氯酸钠；图a为pH 7.4，图b为pH 5.5。由图3可以发现，不管是在pH=7.4，还是pH=5.5的条件下，其他离子（或活性氧）对TPS-Lyso-HClO的荧光几乎没有影响，而次氯酸的加入使化合物TPS-Lyso-HClO的荧光比率性质显著增强。
实施例3 TPS-Lyso-HClO随不同浓度次氯酸的荧光强度变化
配制10 mL浓度为100 mmol/L次氯酸钠母液备用（次氯酸钠在水溶液中解离为ClO-）。
将实施例1中配制的探针储备液稀释成浓度为2.5 μmol/L荧光探针工作液，分别与15个成等差浓度的次氯酸（0-250 μmol/L）反应，并进行荧光检测（λex=390 nm；pH 7.4，λem=446 nm和λem=585 nm；pH 5.5，λem=490 nm和λem=585 nm），计算各体系中荧光强度，以荧光强度为纵坐标以扫描波长为横坐标作图4中a、b、d，将荧光强度归一化后数值为纵坐标以扫描波长为横坐标作图4中c，其中a与b为pH为7.4时，c与d为pH为5.5时。如图4所示，随着次氯酸浓度的增加，在pH=7.4的时候，585 nm处的荧光逐渐降低，而446 nm处的荧光逐渐升高；在pH=5.5的情况下，585 nm处的荧光逐渐降低，在446 nm出的荧光也逐渐升高，然后该处的荧光逐渐向490 nm移动。
实施例4 TPS-Lyso-HClO与次氯酸作用随时间的荧光强度变化
将实施例1中配制的探针储备液稀释成浓度为2.5 μmol/L荧光探针工作液，实施例2中的次氯酸钠母液分别以pH 7.0和pH5.5的PBS稀释成100 μM的溶液。两者混合后，在0-30min下，不同时间点进行荧光检测（λex=390 nm；pH 7.0，λem=446 nm和λem=585 nm；pH 5.5，λem=490 nm和λem=585 nm），计算各体系中随时间变化的荧光强度，以荧光强度为纵坐标以扫描波长为横坐标作图5。如图5所示，在pH=7.0的条件下，当探针与次氯酸相互作用后，两分钟内，460 nm处的荧光强度达到顶峰，并在之后的30 min内维持稳定基本不再变动，同时585nm处的荧光强度降低到最低值；在pH=5.5的条件下，当探针与次氯酸相互作用后，两分钟内，460 nm处的荧光强度达到顶峰，同时585 nm处的荧光强度降低到最低值，在2-30 min的时间内，460 nm处的荧光强度逐渐降低，490 nm处的荧光强度逐渐升高。
实施例5 TPS-Lyso-HClO的溶酶体靶向荧光成像
将本发明荧光探针TPS-Lyso-HClO应用于HeLa细胞中进行荧光成像，得图6，具体操作步骤如下：
（1）将密度为3×105 个/mL的HeLa细胞在温度为37 ℃，CO2浓度为5 %的培养箱中培养至细胞贴壁；
（2）将上述细胞，溶酶体绿色定位染料Lyso-Tracker Green加入到细胞培养皿中孵育20 min，然后用PBS缓冲液冲洗细胞3次，将探针TPS-Lyso-HClO 5 μM加入到细胞培养皿中，于细胞培养箱内继续孵育30 min，用PBS缓冲液冲洗细胞3次制样后进行荧光成像：
在荧光显微镜下明场成像得图a）；以488 nm作为激发波长，绿通道（500-540 nm）成像得图b）；以541 nm作为激发波长，红通道（560-620 nm）成像得图c）；红、绿通道的图b）和图c）叠加得图d）；明场、红通道的图a）和图b）叠加得图e）；明场、绿通道的图a）和图c）叠加得图f）；g）为b和c的荧光强度曲线图。
由图6中g）可知，绿色荧光信号与红色荧光信号能够高度吻合，本发明的次氯酸荧光探针TPS-Lyso-HClO能够高度靶向细胞的溶酶体，经过测试，细胞定位系数Pearson'sCoefficient高达91%。
实施例6 TPS-Lyso-HClO对外源性次氯酸双光子细胞成像
将本发明荧光探针TPS-Lyso-HClO应用于HeLa细胞中，对外源性的次氯酸进行双光子荧光成像得图7，具体操作步骤如下：
a）将5μM荧光探针TPS-Lyso-HClO的溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min，用PBS（pH 7.4）洗涤三次后，进行荧光成像，如图a）-c）所示，其中：a）单独探针孵育细胞的绿色荧光图片；b）单独探针孵育细胞的红色荧光图片；c）单独探针孵育细胞的比率成像图片；
b）将5μM荧光探针TPS-Lyso-HClO的溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min，再外加20 μM次氯酸钠孵育30 min，用PBS（pH 7.4）洗涤三次后，进行荧光成像，如图d）-f）所示，其中：d）探针与20 μM孵育细胞的绿色荧光图片；e）探针与20 μM孵育细胞的红色荧光图片；f）探针与20 μM孵育细胞的比率成像图片；
c）将5μM荧光探针TPS-Lyso-HClO的溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min，再外加100 μM次氯酸钠孵育30 min，用PBS（pH 7.4）洗涤三次后，进行荧光成像，如图g）-i）所示：g）探针与100 μM孵育细胞的绿色荧光图片；h）探针与100 μM孵育细胞的红色荧光图片；i）探针与100 μM孵育细胞的比率成像图片。
上述双光子荧光成像的激发波长：780 nm，发射波段：500-540 nm（绿通道）和560-620 nm（红通道）。由图7可知，单独加入探针的细胞在红通道有强烈的荧光信号产生；加入20 μM次氯酸钠后，红色荧光信号逐渐降低，并且在绿通道中有荧光信号产生；加入100 μM次氯酸钠后，红色荧光信号几乎消失不见，并且在绿通道中有强烈的荧光信号产生，说明本发明的探针可以用于双光子荧光成像检测细胞中次氯酸含量。
实施例7 TPS-Lyso-HClO对外源性次氯酸单光子细胞成像
将本发明荧光探针TPS-Lyso-HClO应用于HeLa细胞中，对外源性的次氯酸进行双光子荧光成像得图8，具体操作步骤如下：
a）将5μM荧光探针TPS-Lyso-HClO的溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min，用PBS（pH 7.4）洗涤三次后，进行荧光成像，如图a）-c）所示，其中：a）单独探针孵育细胞的绿色荧光图片；b）单独探针孵育细胞的红色荧光图片；c）单独探针孵育细胞的比率成像图片；
b）将5μM荧光探针TPS-Lyso-HClO的溶液加入到育有HeLa细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min，再外加100 μM次氯酸钠孵育30 min，用PBS（pH 7.4）洗涤三次后，进行荧光成像，如图d）-f）所示，其中：d）探针与100 μM孵育细胞的绿色荧光图片；e）探针与100μM孵育细胞的红色荧光图片；f）探针与100 μM孵育细胞的比率成像图片。
上述单光子荧光成像，激发波长为405 nm，发射波段为500-540 nm和560-620 nm。由图8可知，单独加入探针的细胞在红通道有强烈的荧光信号产生；加入100 μM次氯酸钠后，红色荧光信号几乎消失不见，并且在绿通道中有强烈的荧光信号产生，本发明的探针可以用于单光子荧光成像检测细胞中次氯酸含量。

Claims (10)

1.一种溶酶体次氯酸荧光探针，化学名称为8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮，具有如下式（Ⅰ）所示的结构：
式（I）。
2.根据权利要求1所述溶酶体次氯酸荧光探针，其特征在于，以吗啉基团为溶酶体定位基团。
3.一种如权利要求1所述溶酶体次氯酸荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨乙基吗啉在溶剂中加热回流，生成4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺：
；
（2）4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺与水合肼在溶剂中加热回流搅拌，生成4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺：
；
（3）在催化剂下，将化合物4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺和过量的3-甲基二丁酮加热回流，得8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮：
；
（4）8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮在溶剂中，经硼氢化钠还原得到8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮：
。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨乙基吗啉的摩尔比为1:1-1.5；步骤（2）中，4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺与水合肼的摩尔比为1:20-70；步骤（4）中，8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮与硼氢化钠的摩尔比为1:2-3。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐的浓度为0.8-1.2mol/L；步骤（2）中，4-溴-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺的浓度为0.1-0.5mol/L；水合肼质量浓度为40-80%；步骤（4）中，8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮的浓度为1.0 mmol/L。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和（2）中，所述溶剂为乙醇；加热温度为80℃，加热时间为2-4 h；步骤（3）中，所述催化剂为浓硫酸；反应条件为惰性气体保护；加热温度为100℃，加热时间为3-6 h；步骤（4）中，所述溶剂为甲醇；反应温度为小于5 ℃。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中4-肼基-N-（2-吗啉基乙基）萘酰亚胺经柱层析分离得到，淋洗剂为体积比30:1的二氯甲烷和甲醇；步骤（3）中8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮过柱色谱分离提纯，淋洗剂为体积比1:50的乙醇和二氯甲烷；步骤（4）中8,8,9-三甲基-5-（2-吗啉乙基）-9,10-二氢苯并[de]吡咯[2,3-9]异喹啉-4,6（5H,8H）二酮经过柱色谱分离得到，淋洗剂为体积比2:50的乙醇和二氯甲烷。
8.一种如权利要求1所述溶酶体次氯酸荧光探针在检测溶液及细胞溶酶体次氯酸含量中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，荧光检测溶液中次氯酸的激发波长为390nm；pH为7.0-7.4时，荧光发射波长为446nm；pH为5-5.5时，荧光发射波长为490nm。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，双光子细胞荧光成像激发波长为780nm，发射波段为500-540 nm和560-620 nm；单光子荧光成像激发波长为405 nm，发射波段为500-540 nm和560-620 nm。
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