CN113773265B - 一种用于检测cyp450的荧光探针及其制法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测CYP450的聚集诱导发射荧光探针及其制备方法和应用，其中，该荧光探针是基于N‑氧化物连接四苯乙烯类化合物的有机化合物，结构式如下式所示：
Figure DDA0003318495380000011
本发明提供的荧光探针TPE‑CYP，在缺氧环境下，在CYP450存在下，荧光强度发生变化，可用于CYP450的定性、定量检测，并且可大大降低外部检测条件的干扰，具有较高的检测精度。

Description

一种用于检测CYP450的荧光探针及其制法和应用
技术领域
本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种用于检测CYP450(细胞色素P450酶)的聚集诱导发射荧光探针及其制备方法和应用，属于化学技术领域。
背景技术
癌症是一种复杂的疾病，每年的发病率和死亡率都很高。然而，癌症耐药性大大降低了肿瘤的治愈率，细胞色素P450酶(CYP450)在肿瘤顺铂耐药性的形成中起着重要作用。临床实践中90％以上由肝脏代谢的药物都涉及CYP450亚型。因此，更好地了解CYP450与癌症耐药性的关系，将改善现有的治疗策略，促进个性化治疗的发展。小分子荧光探针具有多种多样的化学结构修饰，其更容易捕获各种生物目标。这也允许设想特定酶的特异性荧光探针。尽管CYP450在生物系统中起着重要作用，但用于快速有效检测体内CYP450水平的荧光探针却很少。
荧光探针是有效检测生命体内的手段之一。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性可用于活体检测等优点。HaileyJ.Knox等公开了一类用以CYP450为底物检测肿瘤组织缺氧的荧光探针HyP-1(结构见图1，Knox，H.J.；Hedhli，J.；Kim，T.W.；Khalili，K.；Dobrucki，L.W.；Chan，J.NatureCommunications 2017.8)，唐本忠小组公开了一种响应CYP450的聚集诱导发射荧光探针TPE-2E N-Oxide(结构见图2，Xu，C.；Zou，H.；Zhao，Z.；Zhang，P.；Kwok，R.T.K.；Lam，J.W.Y.；Sung，H.H.Y.；Williams，I.D.；Tang，B.Z.Advanced Functional Materials 2019，29，1903278)。但是上述两种荧光探针均没有用来直接研究CYP450。因此，开发易于合成、具有良好选择性、可进行快速有效检测生物体系中CYP450的荧光探针具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于快速有效检测体内CYP450的荧光探针及其制备方法和应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于检测CYP450的荧光探针，其特征在于，前述荧光探针是基于N-氧化物连接四苯乙烯类化合物的有机化合物，结构式如式I所示：
Figure BDA0003318495360000021
前述的用于检测CYP450的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成化合物1：将二苯甲酮、4-羟基苯甲酮和锌粉在无水THF和氮气保护下回流，在回流的过程中在冰浴中缓慢滴加四氯化钛，将反应溶液回流搅拌12h，冷却至室温，放入冰水中，抽滤，用二氯甲烷萃取滤液2次，合并萃取液，减压浓缩合并的萃取液，旋干浓缩液，通过硅胶色谱法纯化，旋干，得到白色固体，记为化合物1；
(2)合成化合物2：将化合物1和乌洛托品在冰醋酸中回流2h，将反应溶液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取反应溶液2次，合并萃取液，减压浓缩合并的萃取液，通过硅胶色谱法纯化，旋干，得到橙黄色固体，记为化合物2；
(3)合成化合物3：将化合物2、2-氨基-5-氯苯甲酰胺和对甲苯磺酸溶解在无水乙醇中，回流5h，加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，在室温下搅拌2h，加入水之后抽滤，并用乙醇洗涤抽滤后得到的固体，烘干，得到黄色固体，记为化合物3；
(4)合成化合物4：将二乙基氨基甲酰氯和N,N-二甲基-4-吡啶胺在二氯甲烷中回流30min，加入化合物3并在25℃搅拌6h，将反应物减压浓缩，通过硅胶色谱法纯化，减压蒸发掉溶剂，得到白色固体，记为化合物4；
(5)合成化合物TPE-CYP：将化合物4溶解在乙酸乙酯中，并置于冰浴中，加入碳酸氢钠和间氯过氧苯甲酸，将混合物加热至室温并搅拌1h，将混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，除去溶剂，得到白色薄膜样粗产物，将粗产物通过柱色谱纯化，以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂纯化，旋干溶剂，得到白色固体，即前述式I所示荧光探针TPE-CYP。
前述的用于检测CYP450的荧光探针的应用，其特征在于，用于检测肿瘤细胞、肿瘤组织以及耐药肿瘤细胞、耐药肿瘤组织中的CYP450。
前述的应用，其特征在于，前述荧光探针TPE-CYP可对CYP450进行定性、定量检测，具体的：
将浓度呈梯度变化的含大鼠肝微粒体的溶液分别加入荧光探针TPE-CYP的HEPES缓冲溶液中，分别测定加入大鼠肝微粒体前后体系的荧光强度，然后分别以大鼠肝微粒体的浓度和最大发射波长处的荧光强度值为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度值即可从图中读出溶液中CYP450的含量。
本发明的有益之处在于：本发明提供的荧光探针TPE-CYP，在缺氧环境下，在CYP450存在下，荧光强度发生变化(明显增强)，可用于CYP450的定性、定量检测，并且可大大降低外部检测条件的干扰，具有较高的检测精度；尤其是，该荧光探针TPE-CYP可用于肿瘤细胞、肿瘤组织以及耐药肿瘤细胞、耐药肿瘤组织中CYP450的检测，这对深入研究CYP450在肿瘤细胞以及耐药性肿瘤细胞中的表达，尤其是研究CYP450在肿瘤耐药性形成中发挥的作用具有重要的生物医学意义。
附图说明
图1是荧光探针HyP-1的结构示意图；
图2是荧光探针TPE-2E N-Oxide的结构示意图；
图3是荧光探针TPE-CYP的合成路线图；
图4是荧光探针TPE-CYP检测CYP450的原理图；
图5是验证荧光探针TPE-CYP对CYP450的选择性的实验结果图；
图6是荧光探针TPE-CYP对不同的CYP450亚型的响应图；
图7是荧光探针TPE-CYP在加入RLM前后的紫外吸收光谱图；
图8是荧光探针TPE-CYP的荧光强度随RLM浓度的变化的荧光光谱图；
图9是荧光探针TPE-CYP在460nm处的荧光强度随RLM浓度变化的线性拟合曲线；
图10是荧光探针TPE-CYP检测HepG2细胞和HepG2/DDP细胞内源性CYP450的共聚焦显微镜照片；
图11是荧光探针TPE-CYP检测HepG2/DDP异种移植瘤组织内源性CYP450的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
第一部分、用于检测CYP450的荧光探针的结构及其制备方法1、荧光探针的结构
本发明提供的用于检测CYP450的荧光探针是一种基于N-氧化物连接四苯乙烯类化合物(TPE)的有机化合物，记为荧光探针TPE-CYP，结构式如式I所示：
Figure BDA0003318495360000061
2、荧光探针TPE-CYP的制备方法
参照图3，式I所示荧光探针TPE-CYP的制备方法具体包括以下步骤：
(1)合成化合物1：将二苯甲酮(18.2g，2mmol)、4-羟基苯甲酮(9.9g，1mmol)和锌粉(13g，4mmol)在无水THF(300mL)和氮气保护下回流，在回流的过程中用注射器在冰浴中缓慢滴加四氯化钛(20mL)，然后将反应溶液回流搅拌12h，之后冷却至室温，放入冰水中，抽滤，用二氯甲烷萃取滤液2次，合并萃取液，减压浓缩合并的萃取液，旋干浓缩液，最后通过硅胶色谱法(石油醚/二氯甲烷，5∶1，v/v)进行纯化，并用旋转蒸发仪旋干，得到白色固体(5.0g，26％)，记为化合物1；
(2)合成化合物2：将化合物1(3.482g，10mmol)和乌洛托品(2.102g，15mmol)在冰醋酸(100mL)中回流2h，然后将反应溶液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取反应溶液2次，合并萃取液，减压浓缩合并的萃取液，最后通过硅胶色谱法(石油醚/二氯甲烷，5∶1，v/v)进行纯化，并用旋转蒸发仪旋干，得到橙黄色固体(1.316g，35％)，记为化合物2；
(3)合成化合物3：将化合物2(0.3761g，1mmol)、2-氨基-5-氯苯甲酰胺(0.2050g，1.2mmol)和对甲苯磺酸(10mg，2mmol)溶解在无水乙醇(100mL)中，回流5h，然后加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(0.454g，2mmol)，在室温下搅拌2h，加入20mL水之后抽滤，并用乙醇洗涤抽滤后得到的固体，烘干，得到黄色固体(0.368g，70％)，记为化合物3，无需进一步纯化；
(4)合成化合物4：将二乙基氨基甲酰氯(0.677g，5mmol)和N,N-二甲基-4-吡啶胺(0.611g，5mmol)在二氯甲烷(30mL)中回流30min，然后加入化合物3(0.5g，1mmol)并在25℃搅拌6h，将反应物减压浓缩，最后通过硅胶色谱法(石油醚/二氯甲烷，1∶2，v/v)纯化，减压蒸发掉溶剂，得到白色固体(0.5g，49％)，记为化合物4；
(5)合成化合物TPE-CYP：将化合物4(200mg，0.32mmol)溶解在乙酸乙酯(10mL)中，并置于冰浴中，然后加入碳酸氢钠(50mg，0.59mmol)和间氯过氧苯甲酸(200mg，1.16mmol)，将混合物加热至室温并搅拌1h，然后将混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，除去溶剂(乙酸乙酯)，得到白色薄膜(粗产物)，最后将粗产物通过柱色谱纯化，以二氯甲烷/甲醇(10∶1，v/v)为洗脱剂纯化，旋干溶剂，得到白色固体(180mg，70％)，记为化合物TPE-CYP(即式I所示荧光探针TPE-CYP)。
化合物TPE-CYP的核磁共振波谱以及液相色谱-质谱联用的检测结果分别如下：
1H NMR(500MHz，CDCl3-D1)δ(ppm)：9.47(s，1H)，7.67-7.62(m，1H)，7.28(s，1H)，7.23-7.22(m，2H)，7.14-7.12(m，12H)，7.06-6.99(m，5H)，3.41-3.30(m，4H)，1.17-1.07(m，6H)；
13C NMR(125MHz，CDCl3-D1)δ(ppm)：160.54，154.09，150.54，147.44，143.32，143.11，142.71，142.41，141.70，138.91，135.06，134.92，132.92，132.71，131.41，131.19，129.35，128.17，127.94，127.75，127.15，126.91，126.76，126.45，125.85，123.07，122.17，42.60，42.15，14.13，13.13，11.25；
LC-MS(ESI)：m/z calcd for C39H32ClN3O4 -[M]-641.21，found624.23。
第二部分、荧光探针TPE-CYP检测CYP450的原理
本发明提供的荧光探针TPE-CYP，采用TPE染料作为荧光母体，通过引入N-氧化物作为与CYP450反应的活性中心，如图4所示，用荧光探针TPE-CYP检测CYP450的原理如下：
当荧光探针TPE-CYP上的N-氧化物与CYP450反应后，荧光探针TPE-CYP上的氮氧键断开，生成水不溶性的化合物(式II)，化合物聚集，分子内运动被限制，在激发状态下发出强烈的荧光，从而实现选择性地检测CYP450，利用氮氧键断开前后对荧光探针TPE-CYP荧光强度的影响作为探针识别的检测信号，即可将荧光探针TPE-CYP用来检测细胞内CYP450的荧光成像。
荧光探针TPE-CYP可对CYP450进行定性、定量检测，具体的：
将浓度呈梯度变化的含大鼠肝微粒体(富含CYP450)的溶液分别加入荧光探针TPE-CYP的HEPES缓冲溶液中，分别测定加入大鼠肝微粒体前后体系的荧光强度，然后分别以大鼠肝微粒体的浓度和最大发射波长处的荧光强度值为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度值即可从图中读出溶液中CYP450的含量。
第三部分、荧光探针TPE-CYP对CYP450的选择性
将荧光探针TPE-CYP溶于DMSO中，配制出浓度为1mM的荧光探针TPE-CYP母液。
以去离子水为溶剂，配制出浓度为20μM的氯化亚铁溶液、氯化锰溶液、氯化铁溶液、硫酸铜溶液和氯化锌溶液，以及浓度为1mM的氯化钠溶液、硫酸镁溶液、氯化钾溶液和氯化钙溶液，还有浓度为100μg/mL的大鼠肝微粒体(RLM)溶液(含有100μM NADPH)。
以去离子水为溶剂，配制出浓度为100μM的过氧化氢溶液、次氯酸钠溶液、谷胱甘肽溶液、半胱氨酸溶液、硫化氢溶液、葡萄糖溶液、γ-谷氨酰转肽酶溶液、酪氨酸酶溶液、丝氨酸溶液和赖氨酸溶液，以及浓度为100μg/mL的RLM溶液(含有100μM NADPH)。
以去离子水为溶剂，配制出浓度为1μM的重组CYP1A2溶液、CYP2C9溶液、CYP3A4溶液。
用1.5mL离心管中将10μL浓度为1mM的荧光探针TPE-CYP母液加到pH值为7.4的浓度为0.1M的磷酸钾缓冲液中，之后加入10μL待测物，接着用0.1M磷酸钾缓冲液定容到1mL，摇匀溶液，平衡2h，最后将溶液倒进荧光皿中测定荧光光谱(460nm)。
荧光探针TPE-CYP对CYP450的选择性如图5所示，其中：
在a中，待测物从1到11依次为：空白、氯化亚铁(20μM)、氯化锰(20μM)、氯化铁(20μM)、硫酸铜(20μM)、氯化锌(20μM)、氯化钠(1mM)、硫酸镁(1mM)、氯化钾(1mM)、氯化钙(1mM)、RLM(100μg/mL RLM和100μM NADPH)；
在b中，待测物从1到12依次为：空白、过氧化氢(100μM)、次氯酸钠(100μM)、谷胱甘肽(100μM)、半胱氨酸(100μM)、硫化氢(100μM)、葡萄糖(100μM)、γ-谷氨酰转肽酶(100μM)、酪氨酸酶(100μM)、丝氨酸(100μM)、赖氨酸(100μM)、RLM(100μg/mL RLM和100μM NADPH)。
由图5可以看出：
(1)荧光探针TPE-CYP对CYP450具有很好的选择性，与CYP450作用后，荧光探针TPE-CYP对应的460nm荧光显著增强；
(2)在测定条件下，各类的金属离子、氨基酸和活性氧、活性硫物质对荧光探针TPE-CYP的荧光强度几乎没有影响。
也就是说，本发明提供的荧光探针TPE-CYP对CYP450具有良好的选择性，适合用于细胞以及生物体的研究。
荧光探针TPE-CYP对不同的CYP450亚型的响应情况如图6所示。在图6中，待测物从左到右依次为：空白、CYP1A2溶液、CYP2C9溶液、CYP3A4溶液，终浓度均为200nM。
由图6可以看出：荧光探针TPE-CYP被不同的CYP450亚型响应开启荧光。
以上说明我们制备得到的荧光探针TPE-CYP确实是与微粒体中的CYP450相应的。
第四部分、荧光探针TPE-CYP对CYP450的定量检测
用1.5mL离心管将10μL浓度为1mM的荧光探针TPE-CYP母液加到pH值为7.4的浓度为0.1M的磷酸钾缓冲液中，之后加入10μL不同浓度的RLM溶液(各RLM溶液中均含有NADPH)，接着用0.1M磷酸钾缓冲液定容到1mL，摇匀溶液，平衡2h，最后将溶液倒进荧光皿中测定荧光光谱。
其中，用0.1M磷酸钾缓冲液将反应体系定容到1mL后，RLM溶液的浓度分别是：0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL，溶液中的NADPH的浓度均为100μM。
在加入RLM溶液(100μg/mL)前后，荧光探针TPE-CYP溶液(10.0μM)的紫外吸收强度如图7所示。由图7可以看出：加入RLM后，荧光探针TPE-CYP的最大吸收波长发生变化，说明探针被RLM中的CYP450还原生成了新的物质。
荧光探针TPE-CYP的荧光强度随RLM浓度的变化如图8所示。由图8可以看出：随RLM浓度的增加，体系在460nm处的荧光强度增强。
荧光探针TPE-CYP在460nm处的荧光强度随RLM浓度变化的线性拟合曲线如图9所示。由图9可以看出：该线性拟合曲线的线性回归常数为0.9764，表明荧光探针TPE-CYP可以定量的测定CYP450的浓度。
第五部分、荧光探针TPE-CYP用于细胞和肿瘤组织内源性CYP450检测
1、荧光探针TPE-CYP用于细胞内源性CYP450检测
A组(对照组)：用10μM的荧光探针TPE-CYP孵育HepG2细胞和HepG2/DDP细胞2h，进行共聚焦成像。
B组(实验组)：选取与A组相同生长状态的HepG2细胞和HepG2/DDP细胞，加入500μM的CYP450抑制剂1-ABT，在培养箱中孵育0.5h，随后加入10μM的荧光探针TPE-CYP，再在培养箱中孵育2h，进行共聚焦成像。
C组(实验组)：用与B组相同的方法处理HepG2细胞和HepG2/DDP细胞，但是1-ABT的浓度变为1mM。
荧光探针TPE-CYP检测HepG2细胞和HepG2/DDP细胞内源性CYP450的共聚焦显微镜照片如图10所示。由图10可以看出：
A组细胞显示很强的荧光；
B组细胞的荧光减弱；
C组的细胞基本没有荧光。
由此可见，荧光探针TPE-CYP能够用于检测细胞中内源性的CYP450。
2、荧光探针TPE-CYP用于肿瘤组织内源性CYP450检测
荷瘤鼠用1-ABT治疗的最后一天，从肿瘤中制备冷冻组织切片。然后将切片与荧光探针TPE-CYP(10μM)在缺氧条件下孵育2h，之后用PBS洗涤三次，最后进行成像实验。
荧光探针TPE-CYP检测HepG2/DDP异种移植瘤组织内源性CYP450的共聚焦显微镜照片如图11所示。由图11可以看出：
对照组(不做处理)：具有很强的荧光强度；
实验组(用1-ABT处理8h)：荧光强度明显降低。
由此可见，荧光探针TPE-CYP能够用于检测肿瘤组织中内源性的CYP450。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种用于检测CYP450的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针是基于N-氧化物连接四苯乙烯类化合物的有机化合物，结构式如式I所示：
Figure QLYQS_1
式I。
2.权利要求1所述的用于检测CYP450的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成化合物1：将二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮和锌粉在无水THF和氮气保护下回流，在回流的过程中在冰浴中缓慢滴加四氯化钛，将反应溶液回流搅拌12h，冷却至室温，放入冰水中，抽滤，用二氯甲烷萃取滤液2次，合并萃取液，减压浓缩合并的萃取液，旋干浓缩液，通过硅胶色谱法纯化，旋干，得到白色固体，记为化合物1；
（2）合成化合物2：将化合物1和乌洛托品在冰醋酸中回流2h，将反应溶液倒入冰水中，用二氯甲烷萃取反应溶液2次，合并萃取液，减压浓缩合并的萃取液，通过硅胶色谱法纯化，旋干，得到橙黄色固体，记为化合物2；
（3）合成化合物3：将化合物2、2-氨基-5-氯苯甲酰胺和对甲苯磺酸溶解在无水乙醇中，回流5h，加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌，在室温下搅拌2h，加入水之后抽滤，并用乙醇洗涤抽滤后得到的固体，烘干，得到黄色固体，记为化合物3；
（4）合成化合物4：将二乙基氨基甲酰氯和N,N-二甲基-4-吡啶胺在二氯甲烷中回流30min，加入化合物3并在25℃搅拌6h，将反应物减压浓缩，通过硅胶色谱法纯化，减压蒸发掉溶剂，得到白色固体，记为化合物4；
（5）合成化合物TPE-CYP：将化合物4溶解在乙酸乙酯中，并置于冰浴中，加入碳酸氢钠和间氯过氧苯甲酸，将混合物加热至室温并搅拌1h，将混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，除去溶剂，得到白色薄膜样粗产物，将粗产物通过柱色谱纯化，以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂纯化，旋干溶剂，得到白色固体，即权利要求1中的式I所示荧光探针TPE-CYP。
3.权利要求1所述的用于检测CYP450的荧光探针在制备检测肿瘤细胞和肿瘤组织中CYP450的探针中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用所述荧光探针定性、定量检测肿瘤细胞和肿瘤组织中的CYP450，检测方法具体包括以下步骤：
将浓度呈梯度变化的含大鼠肝微粒体的溶液分别加入荧光探针的HEPES缓冲溶液中，分别测定加入大鼠肝微粒体前后体系的荧光强度，然后分别以大鼠肝微粒体的浓度和最大发射波长处的荧光强度值为横坐标、纵坐标作图，根据荧光强度值即可从图中读出溶液中CYP450的含量。
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