CN113004258B

CN113004258B - 一种基于esipt效应的硫化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN113004258B
Application number: CN201911322945.4A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Hunan Chaoji Testing Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Chaoji Testing Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN113004258A

Abstract

本发明公开了一种基于ESIPT效应的硫化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用，其化学结构式如下：

Description

一种基于ESIPT效应的硫化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于ESIPT效应的硫化氢比率型荧光分子探针的制备方法及其应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

硫化氢（Hydrogen sulfide, H₂S）是一种内源性气体信号分子，可在心脏，肝脏，肾脏，脑，回肠，子宫等许多器官以及结缔组织，脂肪组织等组织中通过酶促产生，具有非常强的细胞保护特性。硫化氢参与调节各种生理过程，包括缺血再灌注损伤，消炎，血管舒张生成，神经调节和胰岛素信号传导等。硫化氢还可以用作抗氧化剂或有害活性氧（ROS）的清除剂，以及治疗心血管疾病和炎性疾病的硫化物抑制剂等。然而体内异常含量的硫化氢则与多种疾病有关，包括阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等。因此，在生物系统中高灵敏度、高选择性地对H₂S进行实时地监测具有非常重要的意义。

目前，测定血浆，均质组织和细胞裂解液等生物样品中H₂S的传统方法包括电化学分析法、比色法、气相色谱法等。但是，这些技术通常需要破坏珍贵的生物样品，从而限制了其进一步的广泛应用。相比之下，荧光分析法因高灵敏度、高选择性、低成本以及实时可视化监测等优点，受到了越来越多的关注和研究。

CN 109735328 A报道了一个可检测细胞内硫化氢的荧光探针，具有响应速度快、抗干扰能力强等优点，但该探针的最大发射波长位于紫外可见光区域(400-600 nm)，而许多生物体系内的小分子在紫外可见光波长范围内常会有自发荧光，会对荧光分析的灵敏度和准确度造成很大的影响。与之相比，近红外荧光染料由于能量小、对组织伤害小、组织穿透能力强、背景干扰小在细胞成像方面有很大的应用前景。同时，相比于增强型荧光探针，比率型荧光探针具有双波长发射（或激发）的特征，该波长比率值的变化独立于探针浓度和光源强度，可大大降低其他检测条件的干扰。因此研发具有灵敏度高、特异性强、水溶性好的比率型近红外荧光探针对于硫化氢的检测具有重要意义。

发明内容

针对现有硫化氢荧光分子探针存在的不足，本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、水溶性好的可用于纯水体系和生物体内硫化氢检测的比率型近红外荧光探针，具有广阔的应用前景。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种基于ESIPT效应的用于特异性识别硫化氢的比率型荧光分子探针，该荧光探针具有式I所示的结构：

式I

该探针检测硫化氢的原理如下所示。由于2,4-二硝基苯醚基阻断了探针的激发态分子内质子转移效应（excited-state intramolecular proton transfer，ESIPT），只产生烯醇式发射（475 nm），当硫化氢存在时，2,4-二硝基苯醚基会被硫化氢选择性地切割而释放出羟基，ESIPT作用恢复，探针酮式发射恢复（607 nm），从而实现对硫化氢的比率型检测。

本发明第二方面提供上述用于特异性识别硫化氢的比率型荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）将对苯二甲醛和2-羟基苯乙酮加入甲醇中，加入NaOH固体，加热回流至反应完全。将反应体系冷却至室温，并添加0.5 M NaOH溶液和35%H₂O₂溶液，继续反应至反应完全。反应结束后，加入冰水，有沉淀物析出，抽滤洗涤并干燥后，可得化合物1。

（2）在25 mL的圆底烧瓶将化合物1加入乙醇中，充分溶解后再向反应体系中加入2-甲基吡啶盐和哌啶，升温加热回流。反应结束后放冷浓缩，柱层析纯化，得化合物2。

（3）在惰性气体保护、冰浴下将化合物2溶于装有无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，向反应体系中滴加三乙胺并缓慢滴入溶有2,4-二硝基氯苯的二氯甲烷溶液，0^oC下搅拌，TLC监测反应直至反应完全。分别用水、饱和NaHCO₃溶液及饱和食盐水萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后浓缩，可得目标荧光探针。

步骤（1）中，所述反应温度为90℃，对苯二甲醛和2-羟基苯乙酮的摩尔比为1:1。

步骤（2）中，所述反应温度为90℃，化合物1和2-甲基吡啶盐的摩尔比为1:1.5。

步骤（3）中，所述惰性气体为氮气和/或氩气。

本发明的合成如下所示：

本发明第三方面提供上述比率型荧光探针在硫化氢纯水试剂及生物体等不同体系的检测应用。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

1）本发明的荧光探针合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，有利于探针的规模化推广；

2）本发明的荧光探针具有高灵敏度、高特异性，检测过程中不受生物硫醇的干扰，可用于复杂生物样品中的硫化氢检测；

3）本发明的荧光探针的最大发射波长为608 nm，为近红外分子探针，具有良好的生物组织渗透性，能够避免来自生物大分子背景荧光的干扰，且该探针具有良好的水溶性、细胞渗透性，可实现对细胞内硫化氢的准确检测，在研究外源性及内源性硫化氢对生理病理过程的影响等方面具有广阔的应用前景。

附图说明

【图1】本发明实施中荧光探针的荧光强度随硫化氢浓度变化的发射光谱图；

【图2】本发明实施中荧光探针的荧光强度比值(I_{604 nm}/I_{475 nm})和硫化氢浓度的线性关系，图横坐标为硫化氢的浓度，纵坐标为荧光强度比值（I_{604 nm}/I_{475 nm})；

【图3】本发明实施中荧光探针对硫化氢的选择性图；

【图4】本发明实施中荧光探针在HepG2细胞内荧光共聚焦成像图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

化合物1的合成

将对苯二甲醛（670.6 mg，5 mmol）和2-羟基苯乙酮（680.7 mg，5 mmol）加入20 mL甲醇中，加入0.60 g NaOH固体，加热回流3 h。将反应体系冷却至室温，并添加10 mL 0.5 MNaOH溶液和2 mL35 %H₂O₂溶液，继续反应至反应完全。反应结束后，加入冰水，有沉淀物析出，抽滤洗涤并干燥后，可得黄色固体503.2 mg，产率为37.8 %。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 8.45 (d, J=8.2 Hz, 2 H), 8.06 (d, J=7.6 Hz, 1 H), 7.68-7.66 (m, 2H),7.35 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.02 (d, J=8.2 Hz, 2 H)。

化合物2的合成

在25 mL的圆底烧瓶将化合物1 (479.2 mg, 1.8 mmol)加入10 mL乙醇中，充分溶解后再向反应体系中加入2-甲基吡啶盐 (634.6 mg, 2.7 mmol)和1 mmol 哌啶，升温至90^oC加热回流。反应结束后放冷浓缩，柱层析纯化，得产物 667.2 mg, 产率76.7%。¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ 8.93 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.12 (t, J=8.1 Hz, 1H), 8.08 (d,J=8.2 Hz, 1H), 7.66 (t, J=8.1 Hz, 1H), 7.56-7.54 (m, 2H), 7.47 (t, J=8.2 Hz,1H), 7.36-7.34 (m, 4H), 7.31 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.12 (d, J=13.2 Hz, 1H), 6.95(d, J=7.6 Hz, 1H), 4.32 (s, 3H)。

目标分子探针的合成

在氮气保护、冰浴下将化合物2（483.3 mg, 1 mmol）溶于装有10 mL无水二氯甲烷的25 mL圆底烧瓶中，向反应体系中滴加三乙胺并缓慢滴入溶有1 mmol 2,4-二硝基氯苯的二氯甲烷溶液，0^oC下搅拌，TLC监测反应直至反应完全。分别用水、饱和NaHCO₃溶液及饱和食盐水萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后浓缩，可得目标荧光探针398.1 mg，产率61.3%。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 8.95 (d, J=8.2 Hz, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.48(d, J=7.8, 1H), ,8.10 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.66 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.58-7.55 (m, 2H), 7.50(d, J=7.8, 1H), 7.45 (t, J=8.2 Hz, 1H),7.35-7.33 (m, 4H), 7.31 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.08 (d, J=13.2 Hz, 1H), 6.98 (d,J=7.6 Hz, 1H), 4.35 (s, 3H)。HR-MS (ESI, negative), calculated [M-H] -：522.12958, found [M-H] -：522.13238.

实施例2

荧光探针对不同浓度Na₂S的响应

取6.49 mg实施例1中获得的探针，用乙腈溶解后，用PBS缓冲溶液稀释成10 μM探针缓冲溶液（pH=7 .4）。取10份上述探针溶液，加入Na₂S溶液使H₂S的浓度分别为：1 μM、4 μM、7 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM、40 μM，室温下孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱。荧光光谱如图1所示。结果表明，随着加入的Na₂S浓度的增加，体系在475 nm处的荧光发射强度逐渐减弱，而605 nm处产生一个新的荧光发射峰，随着Na₂S浓度的增加，其荧光强度逐渐增强。以H₂S浓度分别为0 μM、1 μM、4 μM、7 μM、10 μM时检测物浓度为横坐标，以I_{604 nm}/I_{475 nm}的值为纵坐标，得图2。结果表明可知I_{604 nm}/I_{475 nm}的值与检测物浓度呈线性相关，随着浓度的增大荧光强度增强。回归线性方程为y=0.18853x+0.14164，线性相关系数为：0.99722，并计算出检测限 (LOD)为1 .02 μM (S/N＝3)，表明该荧光探针具有良好的灵敏度。

实施例3

荧光探针对硫化氢的选择性实验

取6.49 mg实施例1中获得的探针，用乙腈溶解后，用PBS缓冲溶液稀释成10 μM探针缓冲溶液（pH=7.4）。取10份体积为3 mL的上述探针溶液，分别加入Na₂S、Cys、Hcy、GSH、SO₄ ²-、HSO₃-、SO₃ ²-、S₂O₄ ²-、SCN-的PBS缓冲溶液，使得检测体系中探针的浓度为10 μM，H₂S的浓度为40 μM，而其他测试物的浓度则为100 μM。室温下孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱。以I_{604 nm}/I_{475 nm}的值为纵坐标，得到探针对不同物质的响应柱状图，如图3所示。由图可知，发现只有加入Na₂S时，荧光探针的荧光明显变化，而加入其它测试物时，该探针只有微弱的荧光变化或者没有变化。表明该荧光探针具有良好的选择性，能够有效地避免其它活性分子的干扰。

实施例5

荧光探针在活细胞中的成像应用

将HepG2细胞放置于含有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的培养基（DMEM）中，在37℃含5%CO₂的湿润环境培养48 h。用微量进样器吸取探针溶液于HepG2细胞的培养基中，使探针浓度为10 μM，继续在培养箱中培养30 min。然后用 PBS 缓冲液洗涤三次，除去未进入细胞的探针分子，移至荧光显微镜下成像。然后更换培养基，再由Na₂S缓冲溶液（100 μM）培养30分钟，用 PBS 缓冲溶液洗三次，置于荧光显微镜下观察其荧光变化，结果如附图4所示。实验显示，在向HepG2细胞添加的外源Na₂S后，可观察到明显红色荧光，表明该荧光探针能够实现活细胞内外源H₂S的可视化检测。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于ESIPT效应的用于特异性识别硫化氢的比率型荧光分子探针，其特征在于，具有式I结构：

式I。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将对苯二甲醛和2-羟基苯乙酮加入甲醇中，加入NaOH固体，加热回流至反应完全；将反应体系冷却至室温，并添加0.5 M NaOH溶液和35 % H₂O₂溶液，继续反应至反应完全；反应结束后，加入冰水，有沉淀物析出，抽滤洗涤并干燥后，得化合物1，所述化合物1的结构式如下所示：

2）在25 mL的圆底烧瓶将化合物1加入乙醇中，充分溶解后再向反应体系中加入2-甲基吡啶盐和哌啶，升温加热回流；反应结束后放冷浓缩，柱层析纯化，得化合物2，所述化合物2的结构式如下所示：

3）在惰性气体保护、冰浴下将化合物2溶于装有无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，向反应体系中滴加三乙胺并缓慢滴入溶有2,4-二硝基氯苯的二氯甲烷溶液，0^oC 下搅拌，TLC监测反应直至反应完全；分别用水、饱和NaHCO₃溶液及饱和食盐水萃取，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后浓缩，可得目标荧光探针。

3.一种如权利要求1所述荧光探针的用途，其特征在于，荧光探针在用于非疾病诊断和治疗的纯水体系和生物体内不同体系中硫化氢的定性定量检测中应用。