CN112121182B - 一种检测缺氧细胞用纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测缺氧细胞用纳米探针及其制备方法与应用。所述纳米探针由荧光分子自组装形成；荧光分子由双(4‑(二乙氨基)苯基)甲酮经缩合、氧化而成；该纳米探针能通过检测细胞内CYP450酶的含量，实现对细胞缺氧程度的荧光成像；在缺氧环境中纳米探针转变成具有强质子吸附能力的荧光分子，从而实现肿瘤深层穿透；该纳米探针具有合成方法简单、水溶性强、毒性小、抗干扰能力强、灵敏度高、肿瘤深层穿透能力强的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米探针及其制备方法与应用，具体是一种检测缺氧细胞用纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤的早期检出对于提高肿瘤治愈率至关重要，而高灵敏度的肿瘤成像对于医生进行精细的手术切除具有非常重要的指导意义。由于肿瘤细胞分裂增殖迅速，血管发育异常，常导致实体瘤处于缺氧的状态。文献表明，即使实体瘤直径仅有1-2mm也会存在缺氧的情况。因此，缺氧作为实体瘤的一种异常指标，可以被用于成像实体瘤。由于肿瘤缺氧常与恶性的侵袭转移、治疗抗性及不良预后相关，因此实现对缺氧肿瘤细胞的成像具有非常重要的临床价值。
近年来随着功能分子和纳米材料的发展，已经有多种途径可以成像缺氧肿瘤，例如正电子发射断层扫描、磁共振成像、荧光成像、光声层析成像等，其中激活型荧光探针在这些检测手段中表现出了出色的分析性能，受到了众多研究者的关注，但是由于多数缺氧肿瘤细胞位于实体瘤的较深位置，而目前大多数荧光探针肿瘤穿透能力较差，同时又存在合成步骤复杂、水溶性差、潜在的系统毒性等问题，极大限制了它的进一步发展，因此迫切需要通过简单的方法开发一种水溶性好、肿瘤穿透能力较强的荧光探针实现对实体瘤的识别。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种能够检测缺氧细胞用的纳米探针。
本发明的第二目的是提供该纳米探针的制备方法。
本发明的第三目的是提供该纳米探针在检测缺氧细胞方面的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：一种检测缺氧细胞用的纳米探针，所述纳米探针由荧光分子自组装形成，其中，所述荧光分子为荧光发射强度与细胞内CYP450水平呈正相关的荧光分子。
所述的荧光分子结构式如下：
所述TPE-4NE-O溶解于水中即可自组装形成纳米探针，不需要借助载体。
本发明还提供上述的一种检测缺氧细胞用纳米探针的制备方法，工艺流程如下：
1)TPE-4NE的合成：称取双(4-(二乙氨基)苯基)甲酮、锌粉于双颈瓶中，随后抽真空充入氩气，加入无水四氢呋喃，将溶液冷却至-20℃后，缓慢将四氯化钛通过注射器推入到溶液中，随后将溶液转移至室温继续搅拌30～60min，回流搅拌过夜，待反应液冷却至室温后，真空浓缩，萃取，分离，即得TPE-4NE；
2)TPE-4NE-O的合成：称取TPE-4NE溶于二氯甲烷中，冰浴条件下将间氯过氧苯甲酸加入其中，随后将反应液转移至室温下继续搅拌反应，待反应结束后，萃取，分离，即得TPE-4NE-O。
3)TPE-4NE-O溶解于水中，随后在300～800rpm条件下搅拌1～5min后，使用0.45μm滤膜过滤，即得到所述纳米探针。
在一些实施例中，本发明所述的制备方法，在TPE-4NE-O中添加重量比为15～50％的叶酸修饰的PEG修饰剂，共同溶解到水中。
在本发明的一种具体的实施例中，本发明还提供一种具体的制备方法：将TPE-4NE-O溶解于水中，在400rpm搅拌条件下搅拌3min后，使用0.45μm滤膜过滤，即得到所述纳米探针。
在本发明的一种具体的实施方式中，所述的制备方法，添加以混合物重量比30％的PEG修饰剂，共同溶解到水中。
在一些实施例中，所述的叶酸修饰的PEG修饰剂为叶酸修饰的TPGS、叶酸修饰的DSPE-PEG、叶酸修饰的PLGA-PEG或叶酸修饰的PE-PEG；优选的，所述的PEG修饰剂为叶酸修饰的DSPE-PEG；所述的PEG修饰剂中PEG的分子量为1000～5000，优选的，所述的PEG修饰剂中PEG分子量为2000。
所述TPE-4NE具有聚集诱导发光的特性。
所述TPE-4NE-O工作浓度为10～500μM。
所述TPE-4NE-O具有深层穿透的能力。
所述TPE-4NE-O最大激发波长为380nm，最大发射波长为510nm.
所述的一种检测缺氧细胞用纳米探针在检测缺氧细胞方面的用途。
TPE-4NE-O氧气依赖性生物还原的机制是：TPE-4NE-O能够与氧气竞争性结合CYP450酶的活性位点-血铁红素；在缺氧条件下，TPE-4NE-O能够与CYP450酶活性位点结合并通过双电子还原发生不可逆生物还原转变成为TPE-4NE。
所述TPE-4NE-O在水中可自组装成如图19的纳米粒；
所述含有叶酸修饰的PEG的TPE-4NE-O在水中可形成具有图20结构的纳米粒；
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提出的一种检测缺氧细胞用纳米探针能够特异性的响应细胞中CYP450，可精准的反映细胞的缺氧程度，即使使用低至25μM氯化钴诱导缺氧，也能够清晰地成像。
(2)本发明提出的一种检测缺氧细胞用纳米探针水溶性强，在水中即可自组装形成纳米探针，无需借助载体。
(3)本发明所提供的制备方法简单可靠、成本低廉，仅需两步即可制备，适合工业化生产。
(4)所制备纳米探针粒径小于200nm，多分散系数小，粒径均一，结构稳定。
附图说明
图1为本发明实施例2的纳米探针TPE-4NE-O的透射电子显微镜照片；
图2为本发明实施例3的纳米探针FA-DSPE/TPE-4NE-O的透射电子显微镜照片；
图3为本发明实施例3的纳米探针FA-DSPE/TPE-4NE-O的粒径分布图；
图4为本发明实施例4的TPE-4NE在不同含水量四氢呋喃中的荧光发射光谱；
图5为本发明实施例5中TPE-4NE-O对不同还原性物质共孵育后的荧光发射光谱；
图6为本发明实施例6中TPE-4NE-O与不同浓度CYP450共孵育后的荧光发射光谱；
图7为本发明实施例7中利用缺氧培养箱模拟缺氧，在常氧和缺氧条件下使用等浓度TPE-4NE-O孵育Hepa1-6细胞后的荧光照片；
图8为本发明实施例7中利用不同浓度氯化钴化学诱导缺氧，使用等浓度TPE-4NE-O孵育Hepa1-6细胞后的荧光照片；
图9为本发明实施例7中使用二苯基氯化碘抑制Hepa1-6细胞内CYP450酶活性后，使用TPE-4NE-O孵育Hepa1-6细胞后的荧光照片；
图10为本发明实施例8中常氧和缺氧条件下使用等浓度FA-DSPE/TPE-4NE-O孵育Hepa1-6细胞后的荧光照片；
图11为本发明实施例8中缺氧条件下使用等浓度FA-DSPE/TPE-4NE-O或TPE-4NE-O孵育Hepa1-6或LO2细胞后的荧光照片；
图12为本发明实施例8中缺氧条件下使用/不使用叶酸预处理Hepa1-6细胞的荧光照片，其中A为未使用叶酸预处理的测试组照片，B为使用叶酸预处理后的测试组照片；
图13为本发明实施例9中3D微球荧光照片；
图14为本发明实施例9中不同深度下的肿瘤切片的荧光照片；
图15为本发明实施例10中TPE-4NE-O与FA-DSPE/TPE-4NE-O在常氧或缺氧条件下对Hepa1-6或LO2的细胞毒结果，其中图A为TPE-4NE-O与FA-DSPE/TPE-4NE-O在常氧条件下对HePa1-6细胞的毒性，图B为缺氧条件下对HePa1-6的细胞毒性，图C为在常氧条件下对LO2细胞的毒性，图D为缺氧条件下对LO2的细胞毒性；
图16为本发明实施例10中TPE-4NE、TPE-4NE-O与FA-DSPE/TPE-4NE-O的溶血率；
图17为本发明实施例11中等量FA-DSPE/TPE-4NE-O与TPE-4NE-O经尾静脉给药不同时间后，小鼠各主要脏器内的荧光分布及定量统计数据，其中图A为各时间点下小鼠经解剖后各脏器的荧光照片，图B为给药2h后小鼠各脏器中平均荧光强度定量数据，图C为给药4h后小鼠各脏器中平均荧光强度定量数据，图D为给药8h后小鼠各脏器中平均荧光强度定量数据，；
图18为本发明实施例12中利用FA-DSPE/TPE-4NE-O的荧光成像引导下的肿瘤手术切除；
图19为TPE-4NE-O在水中可自组装成纳米粒的示意图；
图20为所述含有叶酸修饰的PEG的TPE-4NE-O在水中可形成纳米粒。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但并不能将发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1荧光探针分子TPE-4NE-O的合成：
TPE-4NE的合成：称取2.0g双(4-(二乙氨基)苯基)甲酮、1.21g锌粉于双颈瓶中，随后抽真空充入氩气，加入50mL无水四氢呋喃，将溶液冷却至-20℃后，使用注射器缓慢将680μL四氯化钛加入到溶液中，继续搅拌30min后，将溶液转移至室温继续搅拌1h，随后回流搅拌过夜，待反应液冷却至室温后，加入20mL 10％K2CO3水溶液猝灭反应，抽滤除去不溶物，收集滤液，二氯甲烷萃取三次，合并有机层，真空浓缩，柱色谱分离，即得TPE-4NE；1HNMR(300MHz,CDCl3),δ(CDCl3,ppm):7.24-6.16(m,16H),4.16-2.22(m,16H),1.15-1.09(m,24H).HRMS,m/z calcd.for C42H56N4:616.4505；found,616.4482。
TPE-4NE-O的合成：称取50mg TPE-4NE溶于5mL二氯甲烷中，冰浴条件下将83mg间氯过氧苯甲酸加入其中，随后将反应液转移至室温下继续搅拌反应4h，待反应结束后，减压浓缩，分离，即得TPE-4NE-O；1HNMR(300MHz,CDCl3),δ(CDCl3,ppm):7.54-7.46(m,8H),7.12-7.04(m,8H),3.63–3.54(m,16H),1.12–1.02(t,J＝9Hz,24H).HRMS:m/z calcd forC42H56N4O4:680.4302,found,680.4306。
实施例2不含PEG修饰的纳米探针的制备：
称取5mg TPE-4NE-O溶解于5mLPBS中，400rpm转速下搅拌3min，随后使用0.45μm微孔滤膜过滤除去溶液中团聚物，即得不含PEG修饰的纳米探针溶液TPE-4NE-O NPs，将其置于4℃冰箱保存待用。
使用透射电子显微镜对所制备的纳米探针(TPE-4NE-O NPs)外观形貌、粒径分布进行表征。透射电子显微镜照片如图1，所制备的纳米探针粒径均在50nm左右，外观呈规则球形；粒径大小较为一致，表明所制备的纳米探针具有较好的均一性。
实施例3使用键合有叶酸的DSPE-PEG修饰的纳米探针的制备：
分别称取5mg TPE-4NE-O和1.5mg FA-DSPE-PEG2000，将其共同溶解于5mL PBS中，400rpm转速下搅拌3min，随后使用0.45μm微孔滤膜过滤除去溶液中团聚物，即得键合有叶酸的DSPE-PEG修饰的纳米探针FA-DSPE/TPE-4NE-O NPs，将其置于4℃冰箱保存待用。
通过透射电子显微镜和马尔文粒度仪对所制备的纳米粒外观形貌、粒径分布进行表征。透射电子显微镜照片如图2，所制备的纳米探针粒径约为200nm，外观呈规则球形；粒径分布结果如图3，纳米探针的水合粒径呈现出典型的正态分布，多分散系数为0.134，表明所制备的纳米探针粒径分布较窄，粒径大小均一。
实施例4实施例1所得TPE-4NE的聚集诱导发光效应：
选用四氢呋喃作为TPE-4NE的良溶剂，水作为不良溶剂，使用380nm作为激发光源，分别记录在不同比例溶剂下(VH2O/VTHF＝0～99％)TPE-4NE在425～700nm范围的荧光发射光谱，结果如图4，在溶剂中含水量低于80％时，TPE-4NE在425～700nm范围内的荧光发射强度很弱，而在含水量达到90％时，TPE-4NE在510nm左右的荧光发射强度增加了30倍，在含水量达到99％时，荧光发射强度达到峰值，增加了41倍，由此表明，TPE-4NE表现出了明显的聚集诱导发光的性质。而TPE-4NE-O在不同含水量的溶剂中(VH2O/VTHF＝0～99％)荧光发射强度一直维持在较低水平，没有表现出明显的变化，因此TPE-4NE-O在未被激活的状态下对测定TPE-4NE在510nm处的荧光发射强度几乎不产生影响，这对于提高检测灵敏度是极为有益的。
实施例5实施例1所得TPE-4NE-O对CYP450选择性响应：
将200μM的TPE-4NE-O的PBS溶液分别与以下还原性物质在37℃孵育2h，随后加入200μL预冷的乙腈终止反应，离心后取上清液，使用荧光分光光度计，以380nm作为激发光源，记录溶液在400～650nm范围内的溶液的荧光发射光谱。还原性物质包括物质：
a.5μg/mL硝基还原酶+NADPH(100μM)；
b.5μg/mL硝基还原酶；
c.抗坏血酸钠(Vc,1000μM)；
d.还原型谷胱甘肽(GSH,1000μM)；
e.CYP450(500μg/mL)；
f.CYP450(500μg/mL)+NADPH(100μM)；
以PBS溶液作为空白对照。
结果如图5，TPE-4NE-O只有在与CYP450和NADPH共孵育时才能引起510nm左右强烈的荧光发射，而当TPE-4NE-O只与CYP450或NADPH孵育时，均不能引起510nm处的荧光发射，表明TPE-4NE-O的激活是CYP450和NADPH共同作用的结果，二者缺一不可。而生理环境中存在的其它还原性物质，如硝基还原酶、抗坏血酸钠、还原型谷胱甘肽均不能激活TPE-4NE-O，由此表明，TPE-4NE-O对NADPH存在下的CYP450表现出极高的专一性，而CYP450/NADPH是新陈代谢中主要和氧气浓度相关的还原系统，因此TPE-4NE-O具有成像缺氧的潜力。值得注意的是，TPE-4NE-O与NADPH共孵育时在450nm所产生的发射峰应该是NADPH自身所引起的发射峰，而在与CYP450+NADPH共孵育时在450nm处产生的吸收峰则可能是TPE-4NE部分还原所产生的发射峰。
实施例6实施例1所得TPE-4NE-O对CYP450的检测性能：
将200μM的TPE-4NE-O的PBS溶液分别与不同浓度的CYP450/NADPH溶液在37℃孵育2h，随后加入200μL预冷的乙腈终止反应，离心后取上清液，使用荧光分光光度计，以380nm作为激发光源，记录溶液在400～650nm范围内的溶液的荧光发射光谱。
结果如图6，加入CYP450后，溶液在510nm与450nm左右出现双发射峰，并表现出了明显的浓度依赖性，这可能是CYP450含量越高，导致越多TPE-4NE-O被激活的原因。
实施例7实施例2所得纳米探针对缺氧细胞的检测：
分别使用缺氧培养箱(物理缺氧)及氯化钴(化学缺氧)构建缺氧环境。
将Hepa1-6小鼠肝癌细胞按照1×104/皿的密度接种于共聚焦小皿中，待细胞密度长至约70％时，向其中加入含有100μM TPE-4NE-O NPs的培养基溶液，一组放置于缺氧培养箱中继续培养4h，另一组置于常氧培养湘中培养4h，随后使用PBS清洗三次，多聚甲醛固定15min，使用激光共聚焦显微镜拍照，λex/em＝405/450～600nm。
由图7可以看出，当细胞在缺氧环境中培养时，细胞内荧光强度要明显强于常氧下培养，表明TPE-4NE-O NPs在缺氧条件下可以成功被细胞内的酶激活，因此可以用于缺氧细胞的成像。
为进一步验证TPE-4NE-O NPs成像缺氧细胞的有效性，不同浓度的氯化钴被用于化学诱导不同程度的细胞缺氧。
将Hepa1-6小鼠肝癌细胞按照1×104/皿的密度接种于共聚焦小皿中，待细胞密度长至约70％时，向其中加入含有0～400μM氯化钴的培养基溶液，培养4h后，吸弃培养基，向其中加入含有100μM TPE-4NE-O NPs的培养基溶液，继续培养4h后，使用PBS清洗三次，多聚甲醛固定15min，使用激光共聚焦显微镜拍照，λex/em＝405/450～600nm。
结果如图8，随着氯化钴浓度升高(0～400μM)，细胞缺氧程度逐渐加重，胞内荧光逐渐增强，与细胞缺氧程度表现出了明显的相关性，进一步证明TPE-4NE-O NPs可用于缺氧细胞的成像；TPE-4NE-O NPs在低至25μM氯化钴的诱导下也被成功激活，表现出了出色的灵敏度。
为证实细胞内TPE-4NE-O NPs的激活是由于CYP450酶的作用，二苯基氯化碘被用作CYP450酶的抑制剂。
将Hepa1-6小鼠肝癌细胞按照1×104/皿的密度接种于共聚焦小皿中，待细胞密度长至约70％时，实验组中加入含有100μM TPE-4NE-O NPs和300μM二苯基氯化碘混合溶液的培养基溶液，对照组中只加入含有100μM TPE-4NE-O NPs培养基溶液，将其均放置于缺氧培养箱中培养4h，随后使用PBS清洗三次，多聚甲醛固定15min，使用激光共聚焦显微镜拍照，λex/em＝405/450～600nm。
结果如图9，实验组在添加二苯基氯化碘抑制细胞内CYP450酶活性后，细胞内荧光强度与对照组相比明显降低，表明CYP450是激活TPE-4NE-O的主要酶。
实施例8实施例3所得纳米探针FA-DSPE/TPE-4NE-O对缺氧肿瘤细胞的选择性成像：
为将所制备的TPE-4NE-O用于缺氧肿瘤细胞的识别，因此有必要提高所制备的纳米探针的肿瘤靶向识别能力，降低对缺氧正常细胞的成像。由于多数肿瘤细胞表面过表达叶酸受体，因此我们在实施例3中向TPE-4NE-O添加了30％的叶酸修饰的PEG衍生物。在本实施例中我们提供以下方法用于验证实施例3所制备的纳米探针FA-DSPE/TPE-4NE-O对缺氧肿瘤细胞选择性成像：
将Hepa1-6小鼠肝癌细胞或人正常肝癌细胞LO2按照1×104/皿的密度接种于共聚焦小皿中，待细胞密度长至约70％时，分别向其中加入含有100μM TPE-4NE-O NPs或FA-DSPE/TPE-4NE-O的培养基溶液，同时将它们放置于缺氧培养箱中培养4h，随后使用PBS清洗三次，多聚甲醛固定15min，使用激光共聚焦显微镜拍照，λex/em＝405/450～600nm。
结果如图10，在FA-DSPE/TPE-4NE-O实验组中，常氧与缺氧条件下Hepa1-6胞内荧光强度存在明显差异，缺氧条件下胞内FA-DSPE/TPE-4NE-O更多的被激活，这表明在TPE-4NE-O表面修饰FA-DSPE-PEG并不影响其缺氧识别的有效性；而在区分缺氧肿瘤细胞与正常细胞方面，FA-DSPE/TPE-4NE-O比TPE-4NE-O表现出了更为优异的性能，从图11中可以看出，在缺氧条件下，经FA-DSPE/TPE-4NE-O孵育的Hepa1-6实验组比同等条件下孵育的LO2表现出更强的荧光发射，这可能是由于Hepa1-6细胞表面过表达叶酸受体，促进了细胞对纳米探针的摄取所致；而与之形成对比的TPE-4NE-O组，肿瘤细胞Hepa1-6或正常细胞LO2胞内均呈现出强烈的荧光，这表明TPE-4NE-O虽然能被缺氧细胞成功激活，但并不具有区分正常细胞与肿瘤细胞的能力。为验证肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体在FA-DSPE/TPE-4NE-O选择性成像方面的作用，游离的叶酸被用于对肿瘤细胞表面的叶酸受体进行预饱和。从图12可以看出，经游离叶酸预处理后，FA-DSPE/TPE-4NE-O在Hepa1-6细胞中的激活强度明显降低，表明纳米探针结构中的FA-DSPE-PEG在促进肿瘤细胞摄取方面发挥了至关重要的作用。
实施例9实施例2所得纳米探针3D微球实验及小鼠体内肿瘤穿透性实验
称取低熔点琼脂糖，加入不含血清的RPMI1640培养基，加热下使琼脂糖完全溶解，使其终浓度为2％(w/v)，配制完成后高压灭菌，趁其尚未凝固时分别移取100μL铺于96孔板中，待用；取生长状态良好的Hepa1-6细胞消化离心，以3×103/孔的密度接种到96孔细胞板中，1000g下离心10min，随后将其置于37℃下培养，待用；选取大小较为一致的微球，分别加入含100μM的TPE,TPE-2NE,TPE-4NE,TPE-2NE-O,TPE-4NE-O的培养基溶液，孵育6h后，使用PBS冲洗3次后，使用4％多聚甲醛固定15min，使用共聚焦显微镜成像并拍照。Ex/Em＝405nm/450-600nm。
结果如图13，TPE-4NE在30μm深度下时即表现出了比TPE-2NE与TPE更强的荧光强度，表明随着结构中二乙氨基的数目越多，探针捕获质子的能力越强，穿透肿瘤能力也越强，这对于成像深层的缺氧细胞无疑是非常有意义的，以TPE-2NE-O作为参照，可以看出，相同孵育时间下TPE-4NE-O表现出了更强的穿透能力，这提示TPE-4NE-O在深层成像缺氧细胞方面具有很大的应用潜力。
为验证TPE-4NE-O相比于TPE-2NE-O在动物水平依旧具有更强的肿瘤穿透能力，选用皮下接种Hepa1-6的C57BL/6小鼠作为动物模型用于实验。按照2×106/100μL/只的密度将Hepa1-6细胞皮下接种于C57BL/6小鼠，待肿瘤体积长至米粒大小时开始实验。分别将TPE-4NE-O与TPE-2NE-O按照10mg/kg经尾静脉注射入小鼠体内，给药4h后，将小鼠颈椎脱臼处死，将肿瘤取出后迅速进行冷冻切片并使用激光共聚焦显微镜观察不同深度下切片中荧光强度，激发波长为405nm，发射波长为450-600nm。
结果如图14，通过对比不同深度下肿瘤切片的荧光强度可以发现，在相同深度下，TPE-4NE-O组呈现出了更强的荧光强度，表明与TPE-2NE-O相比，TPE-4NE-O具有更强的深层肿瘤穿透能力，这可能是TPE-4NE-O激活后能够暴露出更多的氨基所致，由此在动物水平也证实了TPE-4NE-O具有更强的肿瘤穿透能力。
实施例10实施例2与实施例3所得纳米探针的安全性评价：
将细胞按照5×103/孔的密度接种到96孔细胞板中，将其置于37℃细胞培养箱中培养过夜，待细胞长至约80％时，吸弃培养基，分别加入含有200,100,50,25,10,5μM TPE-4NE-O或FA-DSPE/TPE-4NE-O的不含血清的培养基，继续孵育24h后，向各测试孔中加入10μLMTT，孵育4h后使用酶标仪测定570nm处紫外吸收，按下述公式计算细胞存活率(％)：
细胞存活率(％)＝(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％
从图15可以看出，在5～200μM范围内，TPE-4NE-O或FA-DSPE/TPE-4NE-O对于肝癌细胞Hepa1-6或正常肝细胞LO2在常氧或者缺氧条条件下均未表现出明显的细胞毒性，表明二者安全性良好，适合用于生物体缺氧的探查。
使用0.9％生理盐水分别配制200,40,8μg/mL的TPE-4NE,TPE-4NE-O或FA-DSPE/TPE-4NE-O纳米探针溶液，分别移取2.5mL后，分别向其中加入2.5mL 2％新西兰大白兔红细胞悬液，混匀后，立即置于37℃孵箱中孵育1h，随后3000rpm离心10min，吸取上清液加入至96孔板中测定541nm处吸光度值。以蒸馏水作为阳性对照样品，生理盐水作为阴性对照，以不含红细胞的纳米粒溶液作为空白对照。按照以下公式计算溶血率(Hemolysis Ratio,HR)：
HR(％)＝(ODsample-ODnegative control)/(ODpositivecontrol-ODnegativecontrol)×100％
从图16可以看出，高浓度(100μg/mL)的TPE-4NE表现出了明显的溶血现象，而在将其氧化成TPE-4NE-O后，溶血现象消失，这可能归因于TPE-4NE氧化后叔胺被消耗，导致其溶血的质子捕获能力消失，因此TPE-4NE-O相对于TPE-4NE表现出了优异的生物相容性。经过FA-DSPE修饰后，FA-DSPE/TPE-4NE-O也未表现出任何溶血行为，表现出了出色的安全性。
实施例11实施例2与实施例3所制备的纳米探针的组织分布
分别将实施例2所制备的TPE-4NE-O探针与实施例3所制备的FA-DSPE/TPE-4NE-O纳米探针按照10mg/kg的剂量经尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内，分别在给药2，4，8h后通过颈椎脱臼的方式将小鼠处死，随后将小鼠主要脏器(包括心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤剖出，置于小动物活体成像仪成像，并对各主要脏器中荧光强度进行定量。
结果如图17所示，肝脏和肾脏是纳米探针的主要代谢器官，在各时间点下其内部均具有较高强度的荧光分布；经尾静脉给药后，即使肿瘤直径仅有2.66mm，两种纳米探针也能迅速向肿瘤蓄积，给药4h后肿瘤内即呈现出强烈的荧光，这为他们应用于微小肿瘤的识别和术中导航提供了可能。与TPE-4NE-O相比，经叶酸修饰后的纳米探针FA-DSPE/TPE-4NE-O在相同时间内在肝脏、肾脏中的非特异性分布都显著性的减少，表明叶酸的加入有利于改善纳米探针的肿瘤靶向性，这为降低潜在的安全性风险和提高检测的灵敏度提供了很大的帮助。
实施例12使用FA-DSPE/TPE-4NE-O的荧光进行的成像引导下的肿瘤手术切除
由于FA-DSPE/TPE-4NE-O纳米探针具有更好的肿瘤靶向性，并且对直径仅为2.66mm的肿瘤也表现出很强的成像能力，因此选择FA-DSPE/TPE-4NE-O用于荧光成像引导下的肿瘤切除：将FA-DSPE/TPE-4NE-O纳米探针按照10mg/kg的剂量经尾静脉注射入C57BL/6小鼠体内，给药4h后，使用异氟烷将小鼠麻醉，并在小鼠保持麻醉的条件下，使用小动物活体进行荧光成像引导下的肿瘤切除并拍照记录。荧光激发波长与发射波长分别为430nm与500nm。
结果如图18，在FA-DSPE/TPE-4NE-O荧光的引导下可以很好地区分正常组织与肿瘤组织，肿瘤组织与正常组织呈现出了非常高的对比度，从而可以很容易的实施荧光成像引导下的肿瘤切除。肿瘤切除后，可以看到小鼠体内没有残留的荧光信号，表明使用FA-DSPE/TPE-4NE-O进行成像引导下的肿瘤手术切除具有很高的准确度与灵敏度，具有很大的临床转化潜力。
Claims (8)
1.一种荧光分子，其特征在于：所述荧光分子的结构式如下：
2.一种纳米探针，其特征在于：所述纳米探针在水或缓冲溶液中由权利要求1所述的荧光分子TPE-4NE-O通过自组装而成。
3.根据权利要求2所述的一种纳米探针的制备方法，其特征在于：
按如下步骤实现：
1)TPE-4NE的合成：称取双(4-(二乙氨基)苯基)甲酮、锌粉于反应瓶中，随后抽真空充入氩气，加入无水四氢呋喃，将溶液冷却至-20℃后，缓慢将四氯化钛通过注射器加入到溶液中，随后将溶液转移至室温继续搅拌30～60min，回流搅拌过夜，待反应液冷却至室温后，得TPE-4NE；
2)TPE-4NE-O的合成：称取TPE-4NE溶于二氯甲烷中，冰浴条件下将间氯过氧苯甲酸加入其中，随后将反应液转移至室温下继续搅拌反应，待反应结束后，得TPE-4NE-O；
3)TPE-4NE-O溶解于水中，随后在300～800rpm条件下搅拌1～5min后，得到所述纳米探针。
4.根据权利要求3所述的一种纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤3)在TPE-4NE-O中添加重量比为15～50％的叶酸修饰的PEG修饰剂，共同溶解到水中。
5.根据权利要求4所述的一种纳米探针的制备方法，其特征在于：所述的叶酸修饰的PEG修饰剂为叶酸修饰的TPGS、叶酸修饰的DSPE-PEG、叶酸修饰的PLGA-PEG或叶酸修饰的PE-PEG；所述的PEG修饰剂中PEG的分子量为1000～5000。
6.根据权利要求1所述的荧光分子或权利要求2所述的纳米探针在制备检测细胞缺氧的指示剂的应用。
7.根据权利要求1所述的荧光分子或权利要求2所述的纳米探针在制备检测肿瘤的指示剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述的指示剂为指示检测肿瘤组织或肿瘤细胞中缺氧。
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