CN107854689A - 激活型纳米探针及其生物应用 - Google Patents
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Abstract
激活型纳米探针及其生物应用。本发明提供一种稳定性好的、主动靶向性强以及1O2产率高的复合纳米探针，利用两亲性磷脂聚合物包裹TMPyP‑Zn‑QDs纳米复合物、荧光染料和肿瘤细胞特异性靶向物质制备了生物相容性好、肿瘤靶向能力强、整合荧光成像和PDT治疗的纳米探针。所述探针具备肿瘤微环境和肿瘤细胞特异性识别的功能，使之能够选择性蓄积到肿瘤细胞和组织中，能够实现肿瘤细胞和组织的成像与治疗一体化。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米探针及其生物应用，属于癌症光动力学疗法技术领域。
背景技术
光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)作为一种无创的癌症治疗手段已经被广泛的应用于临床应用研究中。近年来，由于纳米技术的蓬勃发展，许多研究小组开始致力于发展新的、高效的PDT纳米诊疗探针用于癌细胞的检测与治疗。如Ge等人报道一种生物相容性好、1O2产率高的石墨烯量子点用于肿瘤的 PDT。Wang等人报道了一种可光降解并产生大量1O2的黑磷纳米片用于癌细胞的PDT。Cheng等人发展了一种自供氧纳米体系用于克服肿瘤微环境中乏氧不足引起的PDT疗效不佳的问题。尽管如此，这些纳米材料在实际应用中荧光和PDT效应一直处于“开启”的状态，降低了癌细胞成像的对比度，不利于肿瘤的精准诊断；同时，在生物体内应用时易引发皮肤等部位正常细胞的光毒性，带来副作用；此外，目前报道的激活型的PDT探针，其激活后的1O2产率相对较低，对肿瘤的治疗作用相对有限。因此，发展一种激活型的PDT 纳米诊疗探针，一方面其增强的荧光信号用于癌症的成像分析，另一方面其激活的PDT能力，产生大量的1O2用于癌症的有效治疗，有利于提高成像诊断的灵敏度并降低体内治疗的系统毒性。
ATP是细胞内重要的生命物质，在许多生命过程如能量输送、细胞代谢和酶催化等方面具有不可替代的功能。研究表明，细胞内ATP的浓度为1-10mM，而细胞外环境中ATP浓度小于0.4mM。这种巨大差异为设计细胞内ATP刺激响应型的成像检测和药物释放提供了契机。因此，人们也在积极利用ATP来研究其在肿瘤细胞内调控释放抗肿瘤化学药物分子。但是，这些研究都是利用ATP来刺激药物输送载体再肿瘤细胞内释放出传统的化学药物(如阿霉素DOX)，然后产生抗肿瘤效果。而利用ATP来特异性作用于PDT的探针，在肿瘤细胞内产生1O2产率显著增加的研究尚未报道。利用肿瘤细胞内的ATP激活PDT治疗的方法相对传统的药物释放具有较多的优势，主要表现为创伤性小，毒副作用小，选择性好，适用广，而且可以实现成像和治疗相结合。此外，癌细胞对光敏剂无耐药性，病人不会因多次PDT治疗而增加毒性反应。
发明内容
5,10,15,20-肆(1-甲基4-吡啶基)卟啉四(对甲苯磺酸盐)(5,10,15,20-tetrakis(1-methyl 4-pyridinio)porphyrintetra(p-toluenesulfonate)，TMPyP)是一种水溶性的阳离子型PS分子，其在水中的1O2产率约为0.58，这使得其被广泛应用于PDT研究中。然而，TMPyP在在水溶液中容易发生聚集，使其1O2产率下降。将TMPyP与ZnO NPs纳米粒子表面的Zn2+发生螯合作用，进而在ZnO NPs表面形成TMPyP-Zn，提高1O2的产率。这主要归功于两方面的作用：(1)利用ZnO NPs的运载功能，可以有效地避免PS分子在水中的聚集作用，从而提高PS的1O2产生能力；(2)生成的TMPyP-Zn产生1O2的能力相对于TMPyP会有所增强，这主要是由于TMPyP-Zn的金属中心的自旋-轨道耦合作用能增强激发态电子的系间窜越(intersystem crossing，ISC)能力。由于ZnO NPs本身无荧光发射的能力，因此，TMPyP-ZnONPs体系的ROS产生能力完全来自于ZnO NPs表面分散形成的TMPyP-Zn分子。基于上述分析，我们设想利用具有优越光学性能的 CdTe/ZnS QDs代替ZnO NPs，一方面利用QD壳层上的Zn2+与TMPyP直接络合，以减少TMPyP在书中的聚集；另一方面，通过QDs与TMPyP之间发生高效的荧光能量共振转移(FRET)过程，从而增强TMPyP产生1O2的能力。
因此，本发明首先设计合成了水溶性的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)包被的CdTe/ZnSQDs。在水溶液中，带负电的NAC-CdTe/ZnS QDs能与带正电的TMPyP发生强的静电作用，从而使TMPyP吸附到QD表面，拉近 TMPyP与QD表面Zn2+之间的距离；接着TMPyP分子中吡咯骨架上的N原子与Zn2+发生络合，从而在QD表面原位生成TMPyP-Zn，以单分子的形式紧密的附着在QD表面，形成稳定的TMPyP-Zn-QD复合物。由于在 TMPyP-Zn-QD复合物中，生成的TMPyP-Zn与QD之间的距离很近，因此，QD与TMPyP-Zn之间能形成有效的FRET过程。QD作为能量供体，可以把吸收的光能有效的转移给TMPyP-Zn，从而使其荧光显著增强，进而提高TMPyP-Zn-QDs体系的1O2产率。
为了得到一种稳定性好的、主动靶向性强以及1O2产率高的复合纳米探针，本发明利用两亲性磷脂聚合物包裹TMPyP-Zn-QDs纳米复合物、荧光染料罗丹明6G(R6G)和近红外荧光染料NIR775制备了生物相容性好、肿瘤靶向能力强、整合荧光成像和PDT治疗的纳米探针。通过在纳米体系中引入了二次FRET过程，显著增强HyNPs的单线态氧产率(～0.91)；同时，由于在HyNPs表面引入较多的叶酸分子(～1726)，HyNPs可以通过癌细胞表面叶酸受体介导其在癌细胞的特异性摄取。小鼠体内实验表明，HyNPs能够有效蓄积到肿瘤部位，产生显著增强的近红外荧光；同时，在荧光成像指导下，通过光照肿瘤病灶位点引发PDT过程，从而有效抑制肿瘤生长。通过对癌细胞凋亡机制的研究发现，HyNPs在PDT治疗时，主要是通过摧毁癌细胞溶酶体进而杀死癌细胞。体内荧光成像实验表明，HyNPs具备良好的稳定性、生物相容性和肿瘤靶向性。同时，体内PDT研究表明，我们设计合成出的纳米探针在光的诱导作用下能有效抑制肿瘤生长。这些实验结果都表明，HyNPs可作为一种优良复合纳米探针用于体内癌症靶向成像诊断和PDT治疗，为进一步发展新颖的肿瘤早期诊断与高效PDT诊疗一体化的研究提供了新思路。
在本发明中，利用生物相容性好的两亲性磷脂聚合物，如DSPE-PEG，具体可为DSPE-PEG2000-OMe和 DSPE-PEG2000-NH2，将前述合成的TMPyP-Zn-QDs和荧光材料包埋形成稳定的、NH2功能化的纳米探针 NH2-NPs。为此，我们选用具有较好发光性质的荧光染料罗丹明6G(R6G)，形成纳米探针NH2-R6G-NPs。 R6G的荧光发射位于555nm，恰好与TMPyP-Zn化合物的Q带发生充分的光谱重叠，从而也能产生有效的 FRET，通过两次FRET过程，可以有效提高卟啉分子的1O2产率。在该纳米体系中，TMPyP-Zn-QDs和R6G 分别在627nm和555nm处发射荧光，而且R6G的部分能量通过能量转移的形式传递给TMPyP-Zn-QDs，使 TMPyP-Zn-QDs在光的诱导作用下产生大量的1O2，杀伤细胞。当然，我们也可选用波长在530-550nm的其他荧光材料或为近红外荧光团，如NIR775。
腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)是细胞内重要的生命物质，在许多生命过程如能量输送、细胞代谢和酶催化等方面具有不可替代的功能。研究表明，细胞内ATP的浓度为1-10mM，而细胞外环境中ATP浓度小于0.4mM。这种巨大差异为设计细胞内ATP刺激响应型的成像检测和药物释放提供了契机。本发明提供了一种ATP刺激响应的PDT纳米探针用于肿瘤细胞内ATP的实时检测和ATP诱导下肿瘤治疗研究。本发明选用适配体序列AS1411和S-ATP(nAS1411:nS-ATP＝1:9)通过共价键结合的方式修饰到NH2-NPs 表面，得到适配体功能化的纳米探针Apt-NPs。其中，AS1411对肿瘤细胞具有靶向识别的功能；S-ATP是由15个碱基组成的单链DNA适配体序列，它与ATP适配体的片段能够通过碱基之间的互补配对作用结合形成双链DNA序列。因此，我们随后将BHQ2标记的ATP适配体(ATP aptamer)通过碱基互补配对作用修饰到纳米探针Apt-NPs表面形成新的纳米探针Apt-NPs/BHQ2。通过引入的BHQ2分别与R6G和TMPyP-Zn-QDs之间产生能量转移作用，将二者位于555nm和627nm处荧光猝灭，同时抑制TMPyP-Zn-QDs释放1O2的能力(图 1)。当纳米探针Apt-NPs/BHQ2表面的AS1411与肿瘤细胞靶向作用后，肿瘤细胞将纳米探针Apt-NPs/BHQ2内吞进入肿瘤细胞内。在肿瘤细胞内高浓度ATP的作用下，ATP适配体携带BHQ2远离Apt-NPs表面，使R6G 和TMPyP-Zn-QDs荧光同时打开，TMPyP-Zn-QDs在光的诱导作用下释放大量的1O2，杀伤肿瘤细胞，从而实现肿瘤细胞内ATP特异性刺激响应的荧光成像检测分析和1O2可控释放研究。该工作通过联合使用 AS1411的靶向功能以及细胞内高浓度ATP的激活功能，最终实现对肿瘤细胞和组织的高特异性、高灵敏性成像分析和光动力学治疗研究。
有益效果：
一个理想的激活型PDT纳米诊疗探针应当具备以下几个基本特征。(1)应当具备肿瘤微环境和肿瘤细胞特异性识别的功能，使之能够选择性蓄积到肿瘤细胞和组织中；(2)响应分子的表达水平在细胞内外具有明显的差异性，从而能够选择性的释放响应信号；(3)无响应分子存在时，其暗毒性和光毒性均十分低下，难以对细胞和组织产生毒副作用；反之，在响应分子高表达时，其具有低下的暗毒性和强的光毒性诱导肿瘤细胞和组织的凋亡、坏死。(4)实现肿瘤细胞和组织的成像与治疗一体化。
附图说明
图1.Apt-NPs/BHQ2用于癌症的选择性识别和ATP特异性激活成像和光动力学治疗的机理图。
图2.(A)NH2-NPs的动态光散射，其水合粒径约为～46.0nm；(B)NH2-NPs的表面电位(5.3±1.1mV)和 Apt-NPs(-34.13±0.95mV)；(C)NH2-NPs和Apt-NPs的琼脂糖凝胶电泳；(D)不同浓度FAM-AS1411的荧光光谱；(E)FAM-AS1411荧光强度与浓度的线性关系；插图：滤液中FAM-AS1411的荧光光谱。
图3.(A)Apt-NPs和Apt-NPs/BHQ2在pH 7.4的PBS缓冲溶液中紫外-吸收光谱；(B)Apt-NPs和 Apt-NPs/BHQ2在pH 7.4的PBS缓冲溶液中荧光光谱(激发：443nm，发射：600-750nm)；(C)Apt-NPs/BHQ2的动态光散射；(D)Apt-NPs/BHQ2的透射电子显微照片；(E)铀酰乙酸染色后的Apt-NPs/BHQ2透射电子显微照片；(F)Apt-NPs/BHQ2在水中的稳定性。
图4.(A)Apt-NPs和Apt-NPs/BHQ2在pH 7.4的PBS缓冲溶液中荧光光谱(激发：490nm，发射：500-660 nm)；(B)曲线1为BHQ2的紫外-吸收光谱，曲线2为R6G的荧光发射光谱，曲线3为TMPyP-Zn-QDs 的荧光发射光谱；(C)8nmol Apt-NPs的荧光光谱和其在不同浓度ATP适配体中的荧光光谱，浓度范围0-10 nmol(激发：490nm，发射：500-660nm)；(D)纳米探针在不同量ATP适配体中的荧光猝灭效率，以555 nm处的荧光计算。
图5.(A)6.5μM Apt-NPs/BHQ2在2.0mM ATP中的荧光随时间的变化，以555nm处计算(激发：490nm)； (B)6.5μM Apt-NPs/BHQ2在不同浓度ATP中的荧光光谱(激发：490nm，发射：510-720nm)，其中ATP 的浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0和2.2mM，插图：探针在555nm处荧光强度与不同浓度ATP的线性关系，其中F0为空白Apt-NPs/BHQ2的荧光强度，F为Apt-NPs/BHQ2在不同浓度ATP共同孵育下的荧光强度；(C)6.5μM Apt-NPs/BHQ2分别对2.0mM ATP、TTP、CTP、GTP 和UTP的荧光响应；(D)6.5μM Apt-NPs/BHQ2；(D)6.5μM Apt-NPs/BHQ2与2.0mM ATP共同孵育前后探针在443nm激发下600-750nm处的荧光光谱。
图6.60mM TEMP分别与6.5μM Apt-NPs(黑暗)、6.5μM Apt-NPs(光照)、6.5μM Apt-NPs+30mM NaN3 (光照)在pH 7.4的PBS缓冲溶液中的电子自旋共振光谱，光照强度为3.6J/cm2白光(400nm滤光片)。
图7.(A)60mM TEMP分别与6.5μM Apt-NPs(黑暗)、6.5μM Apt-NPs/BHQ2(光照)、6.5μM Apt-NPs/BHQ2+2.0mM ATP(光照)在pH 7.4的PBS缓冲溶液中的电子自旋共振光谱，光照强度为3.6J/cm2白光(400nm滤光片)；(B)比较20.0μM SOSG分别与6.5μM Apt-NPs、6.5μM Apt-NPs/BHQ2、6.5μM Apt-NPs/BHQ2+2.0mM ATP和2.0mM ATP在3.6J/cm2(400nm滤光片)照射后位于525nm处的荧光强度以及6.5μM Apt-NPs和6.5μM Apt-NPs/BHQ2+2.0mM ATP在黑暗处位于525nm处的荧光强度；(C) 6.5μM Apt-NPs/BHQ2和20.0μM SOSG共同孵育之后在不同光照剂量的照射后的荧光照片。光源为400 nm滤光片白光在0、1.2、1.8、2.4和3.6J/cm2；(D)图4-7C中20.0μM SOSG在525nm处的归一化荧光强度。
图8.pH对Apt-NPs/BHQ2与ATP孵育之后产生1O2的影响。(A)20.0μM SOSG和6.5μMApt-NPs/BHQ2 +2.0mM ATP在pH 5中孵育光照前后的荧光光谱；(B)20.0μM SOSG和6.5μMApt-NPs/BHQ2+2.0mM ATP在pH 6.5中孵育光照前后的荧光光谱；(C)20.0μM SOSG和6.5μMApt-NPs/BHQ2+2.0mM ATP在 pH 7.4中孵育光照前后的荧光光谱。光源为20mW/cm2，400nm滤光片照射0和40s；(D)比较20.0μM SOSG和6.5μM Apt-NPs/BHQ2与2.0mM ATP在不同pH下位于525nm处的荧光增强的程度(ΔF＝F光照-F 黑暗525nm处)。
图9.HeLa细胞与2.0μM Apt-NPs/BHQ2(2.0μM)分别孵育0、0.5、1、2、4h和6.0h后的荧光照片和微分干涉成像(DIC)。标尺：100μm。
图10.HeLa细胞分别与0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、和8.0μM。Apt-NPs/BHQ2分别孵育2h后的荧光照片和微分干涉成像。标尺：100μm。
图11.HeLa细胞分别与Apt-NPs/BHQ2在37℃，Apt-NPs/BHQ2+AS1411在37℃，Apt-NPs/BHQ2+IAA在 37℃，Apt-NPs/BHQ2在4℃孵育之后的荧光照片以及NIH 3T3细胞与Apt-NPs/BHQ2在37℃孵育之后的荧光照片。标尺：100μm。
图12.Apt-NPs/BHQ2，DAPI和溶酶体靶向染料在HeLa细胞中的共定位分析。标尺：50μm。
图13.HeLa细胞与Apt-NPs/BHQ2 2.0h后的荧光成像.绿色荧光来自于R6G通道激发(530-550nm)，收集 600-630nm的荧光发射；红光来自于TMPyP-Zn通道激发(400-440nm)，收集600-630nm的荧光发射。标尺： 20μm。
图14.HeLa细胞在不同浓度(A)Apt-NPs/BHQ2和(B)TMPyP分别在3.6J/cm2白光(400nm滤光片) 光照前后细胞活性分析；(C)Apt-NPs/BHQ2和TMPyP的IC50值比较；(D)空白HeLa细胞和2.0μM Apt-NPs/BHQ2孵育之后的HeLa细胞在400nm滤光片添加的白光在不同的剂量照射下的细胞活性；(E) 膜联蛋白V-FITC/PI染色的HeLa细胞分别与Apt-NPs/BHQ2(2.0μM)孵育2.0h前后和3.6J/cm2白光照射前后的双色流式分析。
图15.HeLa细胞经Apt-NPs/BHQ2孵育后细胞内1O2产生情况分析。(A)HeLa细胞经Apt-NPs/BHQ2(2.0μM) 和DCFH-DA(30μM)共同孵育后，并分别在3.6J/cm2白光照射、3.6J/cm2白光照射并经2.5mM维生素C处理，以及不处理的细胞荧光成像分析，标尺：100μm；(B)HeLa细胞经Apt-NPs/BHQ2(2.0μM)和DCFH-DA (30μM)共同孵育后分别在0、1.2、2.4和3.6J/cm2白光照射下的荧光成像照片；(C)图4-15B中DCF的归一化荧光强度值；(D)细胞流式分析HeLa细胞内1O2产生情况。
图16.ATP调控的Apt-NPs/BHQ2在HeLa细胞肿瘤模型的小鼠体内的成像与PDT治疗研究。(A)小鼠肿瘤内注射Apt-NPs/BHQ2后小鼠的实时荧光成像图片；(B)在不同时间肿瘤部位相对荧光强度分析；每组数据三只小鼠取平均值；(C)经过四种不同方式处理之后小鼠肿瘤体积的变化；(D))经过四种不同方式处理之后小鼠体重的变化；(E)经过四种不同方式处理前和(F)治疗18天后小鼠的照片，其中箭头方向指的是小鼠肿瘤部位。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实验部分
试剂及仪器
TMPyP(5,10,15,20-肆(1-甲基4-吡啶基)卟啉四(对甲苯磺酸盐)，5,10,15,20-tetrakis(1-methyl 4-pyridinio)porphyrintetra(p-toluenesulfonate))购买于百灵威科技有限公司(上海，中国)；1,2-二硬脂酰基-sn- 丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000] (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000]，(DSPE-PEG2000-NH2))和1,2-二硬脂酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]， DSPE-PEG2000-OMe)购自Avanti(Alabaster,AL,USA)。2’,7’-二氯荧光素-双醋酸酯 (2’,7’-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)、罗丹明6G(Rhodamine 6 G，Rh 6G)、2,2,6,6-四甲基哌啶 (2,2,6,6-tetramethylpiperidine，TEMP)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)购自于 Sigma-Aldrich化学公司(St Louis,MO,USA)。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，三磷酸胞苷 (Cytidine triphosphate，CTP)，三磷酸尿苷(Uridine triphosphate，UTP)，二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate， ADP)，单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate，AMP)和三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate，GTP)均购自于Worthington Biochemical(Lakewood,NJ,USA)。单线态氧捕获剂(Singlet oxygen sensor green， SOSG)，溶酶体定位染料LysoTracker@Red DND-99和细胞核定位染料hoechst 33342均购自Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒，灭菌PBS(pH＝7.4，1X)和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)试剂盒均购自KeyGen Biotech(Nanjing,China)。HeLa和NIH 3T3细胞购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞库(上海，中国)。碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)购自上海生物工程股份有限公司(上海，中国)。所有的溶液都是用超纯水配制(≥18 MΩ，Milli-Q，Millipore)。文章中使用的所有核酸适配体均由上海生物工程股份有限公司合成与纯化。具体序列如下：
ATP适配体：5'-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCA-BHQ2-3'
S-ATP适配体：5'-COOH-TGGACCCCCTCATAA-3'
AS1411适配体：5'-COOH-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'
AS1411-FAM适配体：5'-COOH-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-FAM-3'
Hitachi F-7000型荧光分光光度计(Hitachi Company,Tokyo,Japan)，用于记录实验过程中的所有荧光光谱；UV-3600 UV-VIS-NIR型分光光度计(Shimadzu Company,Japan)，用于采集实验中的所有吸收光谱； JEM-1200EX透射电子显微镜(TEM,JEOL Ltd.,Japan)用于观察和记录纳米粒子的形貌和粒径分析；动态光散射仪(DLS,Brook haven,USA)用于记录和分析纳米粒子的水合粒径大小；Zetasizer(Nano-Z，Malvern， UK)电位测试仪用于记录纳米粒子表面电荷的变化；流式细胞分析实验由Coulter FC-500 flowcytometer (Beckman Coulter,USA)测得；细胞荧光成像实验由TCS SP5 laser scanningconfocal microscope(Leica， Germany)和IX73 optical microscope(Olympus,Japan)测得；琼脂糖凝胶电泳由DYCP-31 BN electrophoresis analyser(Liuyi InstrumentCompany，China)和Bio-Rad ChemDoc XRS(USA)完成；MTT细胞毒性实验由 microplatereader(680，Bio-Rad，USA)测得；EPR光谱由电子顺磁共振波谱仪测得；活体成像实验由IVIS Lumina XR III活体成像系统(PerkinElmer，USA)测得。
实施例1NH2-NPs的制备
DSPE-PEG2000(1.2mg)和DSPE-PEG2000-NH2(0.8mg)溶解在1.5mL CH2Cl2/CH3OH(9/1)混合溶液中。快速加入1.5mL含有45.3μM TMPyP-Zn-QDs(参见2.2.3)和20g Rh 6G水溶液。混合均匀，超声反应5min 后，在避光条件下搅拌过夜。利用旋蒸仪在37℃下除去有机溶剂。剩余溶液转入10KD Millipore离心(4000 rmp)，并用去离子水清洗三次得到表面带-NH2的纳米材料(NH2-NPs)。本实施例选用DSPE-PEG，如 DSPE-PEG2000(1.2mg)和DSPE-PEG2000-NH2(0.8mg)作为两亲性磷脂聚合物。除这两种物质外，还可以使用PLA-PEG，PS-PEG，F127等两亲性聚合物来包裹TMPyP-Zn-QDs纳米材料，制备不同类型的纳米材料。实施例2Apt-NPs的制备
在室温环境下，将9nmol S-ATP，1nmol AS1411,100nmol EDC和100nmol NHS加入到pH＝7.4PBS 混合均匀，并孵育反应30.0min。随后，加入8nmol NH2-NPs，混合均匀后将反应液置于摇床上轻微振荡反应2.0h。反应完成后，利用30KD Millipore离心(4000rmp)，并用去离子水清洗三次，得到纯净的适配体功能化的纳米材料(Apt-NPs)。
实施例3Apt-NPs/BHQ2的制备
将制备得到的8nmol Apt-NPs和足量的(10nmol)ATP适配体加入到pH＝7.4PBS中混合均匀，并置于摇床上轻微振荡反应2.0h得到Apt-NPs/BHQ2。利用30KD Millipore离心(4000rmp)，并用去离子水清洗三次，对制备得到的Apt-NPs/BHQ2进行纯化，并避光储存于4℃下备用。所有纳米材料的浓度均由卟啉 (TMPyP)的浓度确定。Apt-NPs/BHQ2的形貌通过TEM进行表征。一份样品直接滴加在Cu网上，另一份样品滴加在Cu网上后用0.2％(w/v)乙酸双氧铀进行染色。
实施例4HyNPs的合成
DSPE-PEG2000(1.9mg)和DSPE-PEG2000-FA(0.1mg)溶解在1.5mL CH2Cl2/CH3OH(9/1)混合溶液中。快速加入1.5mL含有45.3μM TMPyP-Zn-QDs(参见2.2.3)和20μg Rh 6G水溶液。混合均匀，超声反应5min 后，在避光条件下搅拌过夜。利用旋蒸仪在37℃下除去有机溶剂。剩余溶液转入10KD Millipore离心(4000 rmp)并用去离子水清洗三次得到HyNPs储存液，并避光储存于4℃下备用。HyNPs的浓度由卟啉TMPyP 的浓度确定。HyNPs的形貌通过TEM进行表征。一份样品直接滴加在Cu网上，另一份样品滴加在Cu网上后用0.2％(w/v)乙酸双氧铀进行染色。
Apt-NPs/BHQ2的表征
(1)溶液中1O2产生能力的检测
利用两种不同的方法来检测Apt-NPs/BHQ2在溶液中1O2的产生能力。
首先，通过电子自旋共振实验，利用TEMP作为1O2的捕获剂，验证1O2的产生。具体如下，60mM TEMP 分别和6.5μM Apt-NPs、6.5μM Apt-NPs/BHQ2、6.5μM Apt-NPs/BHQ2+2.0mMATP混合溶液置于光剂量为3.6J/cm2的白光(LED灯，400nm高通滤光片)下照射。ESR光谱通过电子自旋共振仪获得。
其次，利用SOSG作为1O2的检测探针。具体操作如下，一定浓度的Apt-NPs/BHQ2和20.0μM SOSG 的混合溶液置于20.0mW/cm2的白光(LED灯，400nm高通滤光片)下照射不同的时间。在488nm激发下，收集SOSG位于500nm-650nm之间的荧光光谱。通过比较SOSG位于525nm处的荧光强度来判断 Apt-NPs/BHQ2产生1O2的能力。
细胞培养
HeLa细胞用Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)培养液加10％胎牛血清，100.0mg·L-1链霉素和100IU·mL-1青霉素培养。NIH 3T3细胞用Dulbecco's modifiedEagle's medium(DMEM)培养液加10％小牛血清，100.0mg·L-1链霉素和100IU·mL-1青霉素培养。所有的细胞置于37℃下，5％CO2/95％空气培养箱中培养。培养液隔天换，并且细胞融合度达70％后分化。
(2)Apt-NPs/BHQ2靶向癌细胞内ATP激活成像分析
癌细胞靶向成像分析：分别将适量HeLa细胞和NIH 3T3细胞种植于35.0mm共聚焦培养皿(Glass Bottom Dish)中并且在37℃下孵育24h。随后，用含有2.0μM Apt-NPs/BHQ2新鲜DMEM完全培养液培养2.0h。用1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次，置于荧光倒置显微镜下进行荧光成像分析。其中 Apt-NPs/BHQ2中R6G的荧光在～530nm处被激发，收集570nm-600nm处的荧光发射。
癌细胞内ATP激活成像分析：将适量HeLa细胞分别种植于两份35.0mm共聚焦培养皿(Glass Bottom Dish)中并且在37℃下孵育24h。随后，一份用含有2.0μM Apt-NPs/BHQ2新鲜DMEM完全培养液培养 2.0h，另一份用含有2.0μM Apt-NPs/BHQ2和足量IAA新鲜DMEM完全培养液培养2.0h。用1×PBS(pH 7.4) 缓冲溶液清洗上述癌细胞三次，置于荧光倒置显微镜下进行荧光成像分析。其中Apt-NPs/BHQ2的绿色荧光利用530nm-550nm处激发，收集575nm-600nm处的荧光发射；Apt-NPs/BHQ2的红色荧光利用400 nm-440nm处激发，收集600nm-630nm处的荧光发射；
细胞共定位实验：HeLa细胞首先用含2.0μM Apt-NPs/BHQ2培养液培养2.0h,1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次,加入含1.0μM Lyso-Tracker@Red DND-99新鲜DMEM完全培养液继续孵育20min。1×PBS (pH 7.4)缓冲溶液清洗三次，用4.0％的多聚甲醛固定20.0min。除去固定液，并用1×PBS(pH 7.4)缓冲液清洗HeLa细胞三次，加入1.0μM DAPI于室温条件下继续培养20min。1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次，加入1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液，进行荧光成像分析。Apt-NPs/BHQ2荧光利用～530nm处光激发，收集570nm -600nm的荧光发射。DAPI利用340nm-390nm之间的光激发，收集420nm-460nm之间发射的荧光。 Lyso-Tracker@Red DND-99利用540nm-580nm之间的光激发，收集其在600nm-650nm之间发射的荧光。
(3)MTT分析细胞毒性
首先，～5×103HeLa细胞种植于96孔板的每个孔当中，置于37℃孵育24h。为了监测不同试剂的暗毒性，所有的细胞用PBS清洗一次后，加入100μL含有不同浓度Apt-NPs/BHQ2或TMPyP的DMEM完全培养基，于37℃下继续孵育24h。同样，进行光毒性实验前，所有的细胞用PBS清洗一次后，加入100 μL含有不同浓度Apt-NPs/BHQ2或TMPyP的DMEM完全培养基，于37℃下孵育2.0h。然后每个孔置于20.0mW/cm2的白光(LED灯，400nm高通滤光片)下照射不同时间。随后，继续置于37℃孵育24h，加入50μL,1mg/mL MTT PBS缓冲溶液，于37℃下孵育4h，除去培养液，加入150μL DMSO到每个孔中。利用酶标仪检测490nm处的OD值。空白细胞(ODcontrol)作为对照组，细胞活性的百分比通过计算 OD/ODcontrol。
(4)流式细胞仪监测细胞凋亡
首先，将～200K HeLa细胞种植于6孔板当中并且在37℃下孵育24h后，用1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次，再加入2mL新鲜的含2.0μM Apt-NPs/BHQ2DMEM完全培养基在37.0℃条件下继续孵育2.0 h。
其次，除去上述培养基，并用1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗后加入细胞培养基，并将HeLa细胞置于 20mW/cm2台灯结合400nm的高通滤光片作为光源照射3min。
随后，用1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗HeLa细胞，并用1.0mL不含EDTA的胰酶消化HeLa细胞，待这些HeLa细胞变圆彼此不连接时，用1.0mL DMEM完全培养液终止消化，并反复吹打细胞，离心4min， 1×PBS(pH 7.4)缓冲液清洗三次，收集～5×105细胞于500μL试剂盒中的缓冲液得到悬浮细胞液。
最后，5.0μL膜联蛋白V-FITC和5.0μL propidium iodide(PI)先后加入悬浮细胞液中，混合均匀后，避光孵育15.0min。选择FITC和PI通道对细胞凋亡情况进行流式细胞仪检测。所有的实验检测～1×104个细胞利用FlowJo software进行统计分析。
(5)荧光成像分析细胞内1O2的产生
为了证实Apt-NPs/BHQ2特异性靶向摄取进入癌细胞，在癌细胞内高水平ATP激发下，能够表现出优异的PDT效率，我们选取DCFH-DA作为1O2产生的指示荧光探针。首先将适量的HeLa细胞种植于五个 35.0mm共聚焦培养皿中于37℃下培养24h后，1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次并分别编号为(1)空白对照，(2)光照，(3)Apt-NPs/BHQ2，(4)Apt-NPs/BHQ2+光照，(5)Apt-NPs/BHQ2+光照+Vitamin C。其中1、2号样品用新鲜DMEM完全培养基继续孵育2.0h，3、4、5样品用含有2.0μM Apt-NPs/BHQ2的新鲜DMEM完全培养基继续孵育2.0h。用新鲜培养基分别清洗上述五份细胞三次，1-4号样品分别加入 1.0mL含30.0μM DCFH-DA的新鲜培养基，5号样品加入1.0mL含30.0μM DCFH-DA+2.5mM Vitamin C的新鲜培养基，所有的细胞均继续孵育20min。2，4，5号样品用20.0mW/cm2的白光(LED灯，400nm 高通滤光片)下照射180s。所有细胞用1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次，置于荧光倒置显微镜下进行荧光成像分析，收集FITC和R6G通道的荧光。
(6)流式细胞仪分析细胞内1O2的产生
将～200K HeLa细胞种植于6孔板当中并且在37℃下孵育24h。随后，利用2mL新鲜的DMEM完全培养基和2.0μM Apt-NPs/BHQ2在37.0℃条件下继续孵育2.0h后，除去上述培养基，并用1×PBS(pH 7.4) 缓冲溶液清洗后，继续加入含30.0μM DCFH-DA的新鲜培养基孵育20min。再次除去上述培养基并用 1×PBS(pH 7.4)缓冲溶液清洗三次。把这些细胞置于20mW/cm2台灯下，分别照射0s,60s,120s和180s。最后，将上述所有的HeLa细胞置于流式细胞仪上监测DCF的荧光，进而评估细胞内产生1O2的水平。
(7)小鼠体内实验
肿瘤动物模型的构建
裸鼠BALB/c，雌性，年龄在5-6周，购买于南京大学模式动物研究所(MARC)，整个动物实验操作均遵从南京大学动物保护和使用委员会的规章和制度。将～2.0×106HeLa细胞选择性注入裸鼠皮下指定位置，待肿瘤成型后，进行动物实验。肿瘤体积(V)利用游标卡尺通过监测肿瘤长度(L)和宽度(W)，并利用公式V＝ (L×W2)/2计算得到。
小鼠荧光成像分析
将HeLa皮下荷瘤裸鼠肿瘤内注射100μL,200μM Apt-NPs/BHQ2。分别在注射0,0.5,1.0,1.5,2.0,4.0, 12.0,24.0,48.0,96.0和120.0h后用2.5％异氟烷麻醉进行活体荧光成像分析。选择540nm激发，收集620nm 通道的荧光。肿瘤部位的荧光强度通过小鼠成像软件进行统计分析。
小鼠肿瘤PDT
将肿瘤体积大小～120mm3的12只HeLa皮下荷瘤裸鼠随机分成4组，每组3只，并分别作不同处理。组1，瘤内注射100μL生理盐水；组2，瘤内注射100μL生理盐水并进行光照实验；组3，瘤内注射100μL, 200μM Apt-NPs/BHQ2；组4，瘤内注射100μL,200μM Apt-NPs/BHQ2并在注射4.0h后进行光照实验。组 2和4的光照实验使用120mW/cm2氙灯和400nm的高通量滤光片对每只老鼠照射两次，一次15min。所有的小鼠连续监测18天，每隔两天监测一次肿瘤的体积和质量，18天后处死小鼠。
统计分析
实验结果展示出来的数据均用平均值±SD表示，除非有特殊说明。所得实验数据用Prism 6(Prism GraphPad Software,Inc.,San Diego)进行统计分析，P<0.05为有统计学意义上的差异。结果与讨论
(1)从图2数据分析，将过量的10nmol的ATP适配体与8nmol制备好的Apt-NPs在pH＝7.4的PBS 中充分反应得到Apt-NPs/BHQ2，纯化后对Apt-NPs/BHQ2进行了表征。如图3(A)所示，在Apt-NPs/BHQ2的紫外-吸收曲线上，我们能够明显的发现在500-700nm之间吸收强度明显增强，这主要归因于BHQ2的特征吸收带，这表明ATP适配体成功的修饰到了Apt-NPs的表面生成Apt-NPs/BHQ2。荧光光谱表明，BHQ2的引入有效地猝灭了Apt-NPs/BHQ2中TMPyP-Zn-QDs的荧光，这也进一步证明了Apt-NPs/BHQ2的生成，如图3(B)所示。DLS分析可知，Apt-NPs/BHQ2的水合粒径为58.0±3.1nm，如图3(C)所示。TEM表明，一个Apt-NPs/BHQ2纳米颗粒像纳米簇一样由～12个TMPyP-Zn-QDs组成，如图3(D)所示。通过乙酸双氧铀负染色实验表明，Apt-NPs/BHQ2纳米颗粒呈现球形，而且在水溶液中分散良好，如图3(E)所示。利用DLS连续5天监测Apt-NPs/BHQ2的水合粒径的变化。结果表明其水合粒径几乎没有发生明显的变化，这表明Apt-NPs/BHQ2在水中具有良好的稳定性。
(2)Apt-NPs/BHQ2对ATP的荧光特异性响应
将ATP适配体成功修饰到Apt-NPs表面，生成稳定的Apt-NPs/BHQ2之后，我们发现除了Apt-NPs/BHQ2中TMPyP-Zn-QDs位于～627nm处的荧光被急剧猝灭，而且Apt-NPs/BHQ2中来自R6G位于～555nm处的荧光也发生了猝灭，如图4(A)所示。这可能是Apt-NPs/BHQ2表面引入的BHQ2分别与Apt-NPs/BHQ2内包裹的R6G和TMPyP-Zn-QDs之间发生能量转移所致，如图4(B)所示。实验过程中，由于R6G的荧光量子产率远大于TMPyP-Zn-QDs的荧光量子产率。因此，我们选取R6G的荧光变化来筛选ATP特异性荧光响应的最优条件，以期获得最佳的实验结果。基于此，我们根据R6G的荧光信号的变化，研究了Apt-NPs 与不同ATP适配体孵育2.0h之后的荧光强度的变化，如图4(C)和(D)所示。Apt-NPs的荧光随着ATP适配体投入量的增加而明显降低，进一步证明了Apt-NPs/BHQ2的成功制备。
如图5(A)所示，在不加入ATP的情况下，6.5μM Apt-NPs/BHQ2位于555nm处的荧光强度在60.0min 内基本维持不变；反之，当加入2.0mM ATP共同孵育之后，6.5μM Apt-NPs/BHQ2位于555nm处的荧光强度随着孵育时间的增加而呈现出增强的趋势，且孵育60.0min后荧光不再增强。这表明，ATP能够激活 Apt-NPs/BHQ2中R6G的荧光用于ATP的检测。基于此，我们将不同浓度的ATP分别与6.5μM Apt-NPs/BHQ2充分反应60.0min，在490nm激发下收集500-720nm之间的荧光。如图5(B)所示，6.5μM Apt-NPs/BHQ2的荧光在2.0mM ATP作用下被完全激活，荧光增强程度达到最大。且加入的ATP浓度在 0-1.4mM之间时，Apt-NPs/BHQ2位于555nm处的荧光强度增强程度与ATP的浓度呈线性关系。其线性方程为：ΔF＝3982.65C+11.96(R2＝0.9996)；检出限为：3σ/K＝3.2μΜ(σ为11次空白值的标准偏差，K为线性方程的斜率3982.65)。同时，我们将6.5μM Apt-NPs/BHQ2分别与2.0mM ATP,TTP,CTP,GTP和UTP 充分反应60.0min。结果只有ATP能够有效地激活Apt-NPs/BHQ2的荧光，表明Apt-NPs/BHQ2对ATP具有专一性，如图5(C)所示。
为了能有效地实施PDT的in vitro和in vivo治疗,我们也考察了ATP对Apt-NPs/BHQ2中 TMPyP-Zn-QDs的荧光响应情况。如图5(D)所示，当2.0mM ATP与6.5μM Apt-NPs/BHQ2充分反应60.0min 后，之前被BHQ2猝灭的TMPyP-Zn-QDs的荧光被激活，其位于627nm处的荧光强度增强～16倍。这进一步表明，Apt-NPs/BHQ2表面的BHQ2对R6G和TMPyP-Zn-QDs的荧光具有双重猝灭功能。而当ATP的引入，ATP适配体携带BHQ2远离Apt-NPs的表面，使R6G和TMPyP-Zn-QDs的荧光均被激活、恢复。这主要是由于ATP与其适配体之间强的特异性结合能力高于ATP适配体与其部分碱基对间的结合力。
(3)ATP诱导Apt-NPs/BHQ2单线态的可控释放
尽管Apt-NPs具有很强的1O2的产生能力(图6)，但是其在实施PDT过程中1O2释放却难以控制，容易对正常组织和皮肤产生一定的光毒性。而激活型的PDT诊疗探针能够很好地克服这一局限。这主要是由于在激活型的诊疗体系中，PSs物质的荧光首先被抑制，导致其1O2的产生能力很弱，从而降低整个体系的光毒性；反之，当PSs物质选择性地被靶向物质激活后，PSs的荧光和1O2的产生能力在目标靶点释放，产生光毒性，导致靶向细胞凋亡；从而实现PDT诊疗过程中1O2的可控释放。因此，我们首先选取TEMP 作为1O2的捕获探针，利用ESR光谱技术对Apt-NPs与BHQ2组装后1O2的抑制和Apt-NPs/BHQ2与ATP 诱导反应后1O2的恢复情况进行了研究。如图7(A)所示，在3.6J/cm2的白光照射下，Apt-NPs具有较强的1O2产生能力，而当BHQ2成功修饰到Apt-NPs表面后，Apt-NPs的1O2产生能力被抑制。当ATP加入到 Apt-NPs/BHQ2后，BHQ2在ATP的诱导作用下，BHQ2远离Apt-NPs的表面，使Apt-NPs的1O2产生能力被恢复，从而实现1O2的可控释放。
为了进一步证明ATP可特异性调控Apt-NPs/BHQ2的1O2的释放，我们选取1O2的特异性识别的荧光探针SOSG来进一步研究Apt-NPs与BHQ2组装后1O2的抑制和Apt-NPs/BHQ2与ATP诱导反应后1O2的恢复情况进行了研究。如图7(B)所示，无光照射时，含有Apt-NPs和Apt-NPs/BHQ2+ATP体系中SOSG 的荧光较弱；反之，在3.6J/cm2白光(400nm long pass filter)照射下，Apt-NPs和Apt-NPs/BHQ2+ATP体系中SOSG的荧光急剧增，而分别只含有Apt-NPs/BHQ2和ATP的SOSG体系的荧光依旧较弱。这再次证实 ATP能够特异性调控Apt-NPs/BHQ2的1O2的释放。而且ATP调控Apt-NPs/BHQ2的1O2释放能力随着光照强度的增强而急剧增强，如图7(C)和(D)所示。这说明Apt-NPs/BHQ2释放1O2能力与光照强度无关，而只与ATP专一性调控有关。由于正常细胞与肿瘤微环境之间的pH存在一定差异，因此为了更好的实施PDT 对癌细胞的靶向治疗，我们利用SOSG的荧光变化研究了Apt-NPs/BHQ2+ATP体系在不同pH下1O2的释放情况。如图8所示，在pH分别为5.0,6.5,和7.4的介质中，ATP诱导Apt-NPs/BHQ2释放1O2的能力基本不变这表明ATP诱导Apt-NPs/BHQ2释放1O2的能力不受pH的影响。
(4)细胞内ATP调控Apt-NPs/BHQ2成像条件的优化
为了提高Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞的选择性识别功能，将肿瘤细胞靶向适配体AS1411通过共价键结合的方式连接到纳米探针Apt-NPs/BHQ2的表面，使Apt-NPs/BHQ2能够与HeLa细胞表面表达的核仁素特异性结合，并通过内吞作用进入肿瘤细胞内并与肿瘤细胞内高表达的ATP发生作用。我们首先分别对纳米探针Apt-NPs/BHQ2与HeLa细胞的孵育时间，孵育浓度进行了优化。如图9所示，纳米探针Apt-NPs/BHQ2与HeLa 细胞的孵育后，HeLa细胞内荧光随着孵育时间的变化而逐渐增强。孵育2.0h后，细胞内的荧光强度达到最大。这表明纳米探针Apt-NPs/BHQ2能够有效地进入HeLa细胞并对HeLa细胞内ATP表达水平进行成像检测分析。微分干涉(DIC)成像显示Apt-NPs/BHQ2与HeLa细胞孵育之后细胞仍保持良好的生命形态，这直接反映出Apt-NPs/BHQ2具有低的暗毒性。随后，我们分别将不同浓度的纳米探针Apt-NPs/BHQ2与HeLa分别细胞孵育2.0h,观察HeLa细胞内荧光成像情况。如图10所示，当孵育浓度为2.0μM时，HeLa细胞内的荧光强度达到最大。因此，我们选择2.0μM Apt-NPs/BHQ2与细胞孵育2.0h进行细胞内ATP靶向成像分析和可控 PDT治疗研究。
(5)ATP调控Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞的靶向成像分析
为了证实纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞具有主动靶向功能，我们首先将纳米探针Apt-NPs/BHQ2分别与肿瘤细胞(HeLa cells)和正常细胞(NIH 3T3cell)在相同条件下孵育，并进行荧光成像分析。如图11所示，在37.0℃下孵育2.0h后的HeLa细胞中观察到较强的荧光，而在NIH 3T3细胞中观察到的荧光十分微弱。证实了纳米探针Apt-NPs/BHQ2对HeLa细胞具有主动靶向功能。同时，我们加入单纯的AS1411和纳米探针 Apt-NPs/BHQ2与HeLa细胞在37.0℃下共同孵育2.0h。结果表明，由于AS1411和纳米探针Apt-NPs/BHQ2通过竞争作用被HeLa细胞摄取，从而使HeLa细胞内的荧光强度比纳米探针Apt-NPs/BHQ2孵育后的HeLa细胞内荧光强度弱很多。随后，我们研究了37.0℃和4.0℃条件下纳米探针Apt-NPs/BHQ2与HeLa细胞内荧光强度变化，发现纳米探针Apt-NPs/BHQ2与HeLa细胞在37.0℃下孵育2.0h的荧光强度比4.0℃下孵育2.0h的荧光强度强许多。这主要是由于纳米探针Apt-NPs/BHQ2通过其表面共价键结合的AS1411与HeLa细胞表面高表达的核仁素特异性结合，并通过内吞作用进入HeLa细胞内部；反之，正常的细胞NIH 3T3表面核仁素的表达量较低，使纳米探针Apt-NPs/BHQ2难以被NIH 3T3细胞摄取，从而使纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞具有高选择性。为了证实纳米探针Apt-NPs/BHQ2在肿瘤细胞内的荧光成像是由于ATP调控所致，我们在 37.0℃下将纳米探针Apt-NPs/BHQ2、IAA与HeLa细胞一起共同孵育2.0h观察荧光成像情况。研究结果表明，与Apt-NPs/BHQ2+IAA共同孵育后的HeLa细胞内的荧光强度明显弱于单独Apt-NPs/BHQ2孵育后的HeLa细胞。这主要是由于IAA能够有效地减少细胞内ATP的表达水平，从而抑制纳米探针Apt-NPs/BHQ2的荧光释放。证实了ATP对纳米探针Apt-NPs/BHQ2的调控能力。
荧光共定位成像实验表明，Apt-NPs/BHQ2通过HeLa细胞表面过表达的核仁素介导内吞进入HeLa细胞后，主要是分布在HeLa细胞的溶酶体中，并在溶酶体内ATP的诱导下，释放荧光信号。与此同时，我们也观察到Apt-NPs/BHQ2中TMPyP-Zn-QDs的红色荧光在ATP的诱导作用下得到释放，而且与R6G发射的绿色荧光几乎完全重叠在一起，这表明ATP对Apt-NPs/BHQ2具有良好的激发性能(图13)。基于上述分析，我们可以证实通过引入AS1411的靶向识别能力和ATP激活的双重功能，能够有效地保证纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞的选择性摄取和肿瘤细胞内ATP的可控释放。
(6)Apt-NPs/BHQ2靶向肿瘤细胞PDT疗效
临床上对PS物质选择的一个重要标准即是通过判断PS物质是否具有低的暗毒性和强的光毒性。因此，为了证实纳米探针Apt-NPs/BHQ2能够有效地杀伤肿瘤细胞，我们首先利用MTT比色分析法对纳米探针 Apt-NPs/BHQ2在肿瘤细胞内的暗毒性和光毒性进行了分析研究。如图14(A)所示，在没有光照射下，HeLa 细胞具有良好的生命活性。且随着纳米探针Apt-NPs/BHQ2浓度的增加，HeLa细胞的生命活性依旧维持在较高水平，这表明纳米探针Apt-NPs/BHQ2具有低的暗毒性和良好的生物相容性。反之，在同等的实验条件下，将不同浓度纳米探针Apt-NPs/BHQ2经3.6J/cm2白光照射后，HeLa细胞的生命活性随着纳米探针 Apt-NPs/BHQ2浓度的增加，而呈明显的下降趋势，其半数抑制率(IC50)为0.425μM，这表明纳米探针Apt-NPs/BHQ2具有较强的光毒性。同时，我们利用MTT分别研究了TMPyP对HeLa细胞的暗毒性和光毒性。如图14(B)所示，经TMPyP孵育后的HeLa细胞具有良好的生命活性，即使当孵育浓度高达50μM时，HeLa 细胞的生命活性依旧良好。这表明TMPyP对HeLa细胞具有良好的暗毒性。反之，在同等的实验条件下，将不同浓度TMPyP经3.6J/cm2白光照射后，HeLa细胞的生命活性在一定程度上随着TMPyP浓度的增加，而呈下降趋势，其半数抑制率(IC50)为13.66μM。通过比较纳米探针Apt-NPs/BHQ2与TMPyP对HeLa细胞的IC50值，可以发现在同等的实验条件下纳米探针Apt-NPs/BHQ2的IC50值是TMPyP的32倍，如图14(C)所示。说明纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞具有良好的暗毒性和强的光毒性。随后，我们考察了光剂量调控纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞的毒性研究。如图14(D)所示，首先将不同剂量的白光照射空白的HeLa细胞，结果发现随着光剂量的加大，HeLa的生命活性基本维持不变，保持良好的生命特征。这表明我们所用的光源本身对细胞无毒副作用。反之，当我们将2.0μM纳米探针Apt-NPs/BHQ2分别置于不同光剂量下照射， MTT结果分析发现在一定范围内，随着光剂量的增加，HeLa细胞的生命活性逐渐下降，且当光剂量为3.6 J/cm2时，HeLa细胞基本完全失去生命活性。这更加证实了纳米探针Apt-NPs/BHQ2在肿瘤细胞内高水平ATP 和低剂量的白光双重诱导作用下，能够有效地杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞。
膜联蛋白V-FITC/PI是一种行之有效的且被广泛应用于分析细胞凋亡情况检测手段。因此，为了从统计学意义上证实纳米探针Apt-NPs/BHQ2能够高效的摧毁肿瘤细胞，我们利用细胞流式分析膜联蛋白 V-FITC/PI的荧光来判断纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞的PDT治疗疗效。如图14(E)所示，单纯3.6J/cm2的白光照射和2.0μM纳米探针Apt-NPs/BHQ2孵育2.0h后的HeLa细胞的死亡率不超过3％。这从统计学意义上证实3.6J/cm2的白光对细胞无毒副作用，且纳米探针Apt-NPs/BHQ2对细胞具有低的暗毒性。但是，当3.6 J/cm2的白光照射经2.0μM纳米探针Apt-NPs/BHQ2孵育2.0h后的HeLa细胞时，超过90％的HeLa细胞处于凋亡状态。这从统计学意义上证实，纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞具有强的光毒性。综上所述，通过膜联蛋白V-FITC/PI双色细胞流式分析实验，我们可以从统计学层面充分证实，纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞具有低的暗毒性和强的光毒性。即在无光的诱导作用下，纳米探针Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞是安全的；反之，在3.6J/cm2白光照诱导作用下对肿瘤细胞具有强的光毒性。从而证实了MTT实验的结果。
(7)PDT诱导癌细胞凋亡机制研究
为了验证纳米探针Apt-NPs/BHQ2通过主动靶向作用被摄取进入肿瘤细胞后能够在肿瘤细胞内高表达的ATP和光的双重作用下，产生大量毒副作用的1O2，诱导肿瘤细胞凋亡。我们实施了肿瘤细胞PDT过程中1O2的产生和清除实验。我们选择DCFH-DA作为1O2捕获剂，由于其本身荧光十分微弱，但是当其与1O2发生作用之后，其反应产物DCF发射很强的绿色荧光。因此，我们首先考察了光对单纯DCFH-DA孵育后的 HeLa的荧光成像情况。研究结果表明，我们所使用的光照剂量不能使HeLa细胞内产生DCF的荧光，同时白光成像图片显示细胞的状态良好。这表明我们所使用的光照剂量对细胞不会产生毒副功能。随后，当将纳米探针Apt-NPs/BHQ2与DCFH-DA一起与HeLa细胞孵育2.0h后，发现纳米探针Apt-NPs/BHQ2自身的荧光完全释放出来，而DCF的荧光十分微弱，白光图片显示细胞状态良好，这表明纳米探针Apt-NPs/BHQ2对HeLa 细胞具有较低的暗毒性；反之，经3.6J/cm2白光的照射后，我们既可以观察到HeLa细胞内纳米探针 Apt-NPs/BHQ2的荧光又可以观察你到强的DCF荧光，其白光照片显示细胞膨胀，逐渐凋亡。这表明，纳米探针Apt-NPs/BHQ2进入HeLa细胞后，在ATP和光的双重作用下，产生了大量的1O2，诱导HeLa细胞发生了凋亡。为了进一步证实1O2的产生，我们将纳米探针Apt-NPs/BHQ2、DCFH-DA和过量的VC与HeLa细胞一起孵育0.5h后，经3.6J/cm2白光的照射后执行荧光成像实验。结果发现，HeLa细胞内纳米探针Apt-NPs/BHQ2的荧光依旧很强，而DCF的荧光却十分微弱，白光图片显示HeLa细胞的状态良好。这表明，此过程中在ATP 和光的双重作用下，产生的1O2被还原性物质VC清除，不足以对HeLa细胞产生毒副作用所致。这进一步证实纳米探针Apt-NPs/BHQ2进入HeLa细胞后，在ATP和光的双重调控作用下，产生了大量毒副作用的1O2，诱导细胞凋亡，如图15(A)所示。随后，我们利用细胞内DCF荧光强度的变化，研究了不同光剂量诱导纳米探针Apt-NPs/BHQ2在HeLa细胞内产生1O2的情况。如图15(A)和(C)所示，我们将纳米探针Apt-NPs/BHQ2、 DCFH-DA与HeLa细胞一起共同孵育后，分别给予0,1.2,2.4和3.6J/cm2的光照射，通过荧光可视化成像可以观察到DCF的荧光与光照剂量成依赖关系。这表明，在肿瘤细胞内部ATP的调控作用下，纳米探针 Apt-NPs/BHQ2产生1O2的能力与光照剂量成正相关性。为了避免偶然因素产生的假阳性，我们通过细胞流式实验从统计学层面分析不同光照剂量照射后10000个HeLa细胞内DCF荧光强度的变化情况。如图15(D)所示，随着光照剂量的加大，HeLa细胞内的DCF荧光强度逐渐增强。进一步证实了在肿瘤细胞内部ATP的调控作用下，纳米探针Apt-NPs/BHQ2产生1O2的能力与光照剂量成正相关性。这也意味着在ATP和光的双重作用下纳米探针Apt-NPs/BHQ2在肿瘤细胞内产生了大量毒副作用的1O2，诱导细胞凋亡。
(8)小鼠荧光成像分析和PDT治疗研究
基于上述细胞成像分析可以得知，Apt-NPs/BHQ2对肿瘤细胞具有良好的特异性识别能力。同时，在细胞内高表达的ATP诱导作用下，释放R6G和TMPyP-Zn-QDs的双重荧光信号，用于肿瘤细胞内ATP激活响应的荧光成像分析。此外，在光的诱导作用下，释放1O2的能力得到恢复，这为实现体内肿瘤ATP刺激响应的成像分析和PDT奠定了坚实的基础。基于此，我们首先考查了肿瘤部位ATP诱导Apt-NPs/BHQ2在不同时间点释放荧光信号的成像研究。如图16(A)和(B)所示，当将100μL,200μM Apt-NPs/BHQ2通过瘤内注射的方式注入小鼠肿瘤部位，随着时间的推移，小鼠肿瘤部位的荧光强度逐渐变亮，4.0h后，肿瘤部位荧光强度达到最大，并在120h后小鼠肿瘤部位荧十分微弱。这表明Apt-NPs/BHQ2注入肿瘤后，在肿瘤细胞高表达的ATP诱导作用下，BHQ2逐渐从Apt-NPs/BHQ2表面脱落，释放TMPyP-Zn-QDs的红色荧光，并且在4h内反应完全。
基于上述分析，我们随机选取12只状态相同的小鼠，随机分成四组，每组3只小鼠。分别为：(1)空白对照组；(2)单独光照组；(3)单纯给药组；(4)给药后光照组。对上述四组小鼠进行不同处理之后，连续18 天监测各组小鼠肿瘤体积和小鼠体重的变化。如图4-16C&4-16D所示，空白对照组、单独光照组和单纯给药组HeLa荷瘤裸鼠的肿瘤体积呈指数函数持速增长，而且小鼠状态良好，体重没有发生明显变化。这说明， 120mW/cm2(400nm高通滤光片)的白光对小鼠无毒副作用，且Apt-NPs/BHQ2在小鼠体内具有良好的生物相容性，暗毒性非常低。然而，给药4.0h后的小鼠肿瘤在120mW/cm2(400nm高通滤光片)的白光照射之后，小鼠的肿瘤部位出现局部炎症效应，肿瘤体积随着时间的延长逐渐下降，18天后，小鼠的肿瘤基本消失，而小鼠的体重几乎没有发生明显的变化，如图16(E)和(F)所示。基于上述分析可以证实，Apt-NPs/BHQ2注入肿瘤后，在肿瘤细胞内高表达的ATP的诱导作用下，BHQ2脱离探针表面，释放出TMPyP-Zn-QDs的红色荧光和1O2的产生能力。在低剂量的白光诱导作用下，产生大量的1O2诱导肿瘤细胞凋亡和肿瘤组织死亡，从而达到治愈肿瘤的目的。同时，也可以证实Apt-NPs/BHQ2在小鼠体内具有良好的生物相容性、低的暗毒性和ATP调控下的强光毒性。
综上所述，本发明利用分子识别技术将肿瘤细胞靶向的AS1411和ATP特异性识别的生物适配体巧妙的通过共价键结合的方式修饰到我们前期制备出的高1O2产生能力的纳米材料NH2-NPs表面，构建了一种肿瘤细胞靶向识别的、细胞内ATP激活的双重功能的诊疗一体化纳米探针。通过在纳米探针的表面引入猝灭剂 BHQ2，使其既能猝灭纳米探针内部包载的R6G和TMPyP-Zn-QDs的荧光，又能够有效地抑制纳米探针内 TMPyP-Zn-QDs产生1O2的能力，从而使纳米探针具有低的荧光背景和弱的光动力学能力。同时，由于AS1411 的引入，使纳米探针能够有效地与肿瘤细胞表面高表达的核仁素特异结合，内吞进入肿瘤细胞的溶酶体中。在肿瘤细胞内高水平的ATP的诱导作用下，BHQ2从纳米探针的表面脱落，使纳米探针内部R6G和 TMPyP-Zn-QDs的荧光均得到恢复，产生的荧光信号用于肿瘤细胞内ATP检测成像分析。在低剂量的白光照射下，纳米探针内得到恢复的TMPyP-Zn-QDs能够有效地产生细胞毒副作用的1O2,高效摧毁肿瘤细胞。本发明成功地构建了一种新型纳米探针，实现对肿瘤细胞的特异性靶向识别和高效PDT治疗，实现对肿瘤诊疗一体化研究，为人们设计其他高效的PDT诊疗一体化纳米探针应用于肿瘤的选择性高效治疗提供新的思路。
Claims (10)
1.一种纳米探针，其特征在于包含卟啉功能化的半导体量子点、两亲性磷脂聚合物、荧光染料和肿瘤细胞特异性靶向物质。
2.如权利要求1所述的纳米探针，其特征在于卟啉功能化的半导体量子点是TMPyP-Zn-QDs。
3.如权利要求1所述的纳米探针，其特征在于两亲性磷脂聚合物是DSPE-PEG。
4.如权利要求1所述的纳米探针，其特征在于所述荧光材料的发光波长为530-550nm或为近红外荧光染料。
5.如权利要求4所述的纳米探针，其特征在于所述荧光染料是罗丹明6G(R6G)或NIR775。
6.如权利要求1所述的纳米探针，其特征在于所述肿瘤细胞特异性靶向物质是指能与肿瘤细胞特异性结合的物质，如核酸适配体序列AS1411、叶酸等。
7.如权利要求7所述的纳米探针，其特征在于还包括ATP适配体及其互补配对的核苷酸链。
8.如权利要求1至7中任一项所述的纳米探针在肿瘤细胞及活体肿瘤荧光成像中的应用。
9.如权利要求1至7中任一项所述的纳米探针在致使细胞死亡和摧毁肿瘤组织中的应用。
10.如权利要求1至7中任一项所述的纳米探针在光动力学疗法中的应用。
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