CN105694851A - 一种肿瘤靶向诊疗荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤靶向的诊疗一体的荧光探针，所述探针是以肿瘤靶向多肽序列和凋亡酶特异性识别多肽序列为骨架，荧光淬灭分子荧光对和光动力学治疗光敏剂组成。本发明公开的诊疗探针可以实现对肿瘤的靶向治疗，并且降低光动力学治疗光敏剂的毒副作用；在实现对肿瘤进行光动力学治疗的同时，对治疗效果进行原位、精确和实时的评估。本发明还可以作为一种通用的荧光探针，采用比例荧光成像的方式，用于肿瘤治疗药物的筛选和细胞凋亡成像。本发明可以实现对肿瘤治疗反馈的早期检测，对于推动肿瘤的精确治疗和实现个性化治疗具有重要意义。

Description

一种肿瘤靶向诊疗荧光探针
技术领域
本发明涉及用于检测肿瘤标记物并结合光动力学疗法实现靶向治疗的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
癌症严重威胁着人类健康。化疗、放疗和基因治疗已经广泛的应用于癌症治疗研究，但面临着如何进一步提高癌症治疗效果降低药物产生的毒副作用的难题，实现对肿瘤部位的靶向药物传递已经成为当今临床医学和生物医药领域的研究热点之一；多药耐药性的产生，肿瘤微环境的变化以及个体之间的差异导致肿瘤治疗的失败，对肿瘤治疗实现个性化的治疗方式，及时的反馈肿瘤治疗效果，快速优化治疗方案将更有效的解决肿瘤治疗的难题。
近年来，光动力学治疗由于其安全和非侵入性的肿瘤治疗方式，已经被广泛应用于食道癌、皮肤癌、膀胱癌、老年性黄斑变性等癌症疾病的治疗。获得FDA认证的光动力学治疗药物有 等。光动力学治疗是通过光激发光敏剂，而激发态的光敏剂将能量传递给附近的氧，从而形成具有强氧化能力的单线态氧(1O2)，进而与周围的生物大分子作用，从而诱导细胞的凋亡或者坏死，实现对肿瘤的治疗。与传统的化疗和放疗方法相比，光动力学治疗可以通过光照时间和强度控制光动力学治疗的程度，而受给药量的影响较小。这个独特的特点使光动力学治疗在实际医疗过程中能够适应因个体差异和微环境的变化导致的治疗效果的差异，及时对治疗方案做出调整。然而，光敏剂非特异性的定位，通常会导致不理想的治疗效果以及对正常组织非预期的毒性。近年来越来越多的研究着重于如何提高光敏剂的肿瘤选择性，尤其是光敏剂的靶向输送和特异性激活。
多肽是从生物蛋白中选择出来的，现在可以化学合成的，由一定的氨基酸组合而成的，具有特殊生理活性的物质。由于其简单的合成方法，广泛的生物活性及多样的可修饰选择性，已经被广泛的应用到化学分析，生物分析以及生物医药领域。例如，利用特定多肽序列修饰或者运载小分子药物，可以有效的改善药物的溶解性，提高药物的靶向性，增强药物在血液循环过程中的稳定性，促使药物跨越血脑屏障，促进肿瘤细胞对药物的内吞等。与此同时，固相合成技术的成熟和生物分析技术的发展极大的方便和促进了多肽的应用范围。通过正交化学的应用，可以方便的对多肽序列进行修饰，从而有效的在特定的多肽序列中引入药物分子或者荧光分子。并且，利用生物分子所特异性识别的多肽序列，联合荧光成像技术，可以有效的满足不同的检测和分析等需求。
由于光动力学治疗(PDT)能够诱导细胞凋亡或者坏死，并且能够促进细胞内诸如色素沉积、凋亡酶激活、DNA破碎等生物化学反应的变化，而这些变化为肿瘤治疗效果的早期评估提供了途径。因此，从分子水平上评估光动力学治疗效果是可行的，可以极大的推动个性化的肿瘤治疗的发展。凋亡酶是一种半胱氨酸水解酶，在调控细胞程序死亡过程中扮演重要角色。大部分的肿瘤治疗药物都具有凋亡相关的机制，比如，阿霉素，喜树碱，顺铂类化疗药物以及酞菁和卟啉类光动力学治疗药物。凋亡酶的检测有利于早期肿瘤治疗效果的评价、推进和优化肿瘤治疗方案。而凋亡酶-3是凋亡酶家族中的执行凋亡酶，激活的凋亡酶-3可以识别和切断含特定序列的多肽或者蛋白，从而影响细胞周期促进细胞程序死亡。因此，凋亡酶-3被广泛应用到相关疾病的检测，以及肿瘤治疗效果的评价。
小分子荧光探针被广泛的应用于化学分析，生物分析以及生物动态过程实时、非侵入性监测。因此，小分子荧光探针被广泛用于药物筛选和治疗效果的评估，实现了肿瘤治疗效果的早期监测。但是，传统的小分子荧光探针与治疗药物分步进行，而由于药物分子和小分子荧光探针在生物环境中的分布的区别，使小分子荧光探针在肿瘤治疗效果的监测和检测上造成延迟。近年来，为实现对肿瘤治疗的原位监测，人们提出了诊疗一体的载药系统的概念。这种诊疗为一体的载药系统同时具有肿瘤治疗和成像(包括药物释放监测，肿瘤诊断，治疗评价等)的性质，不仅解决了肿瘤治疗和成像监测不同步、治疗药物和成像探针分布不可控的问题，同时也极大的推动了肿瘤治疗效果的早期诊断、实时监测的进步。但是，这种诊疗系统应用在复杂的生理环境中时，同样面临着一些问题。传统的诊疗为一体的系统利用诊疗系统与靶向底物作用前后荧光强度的变化，从而验证生物环境中的动态过程。这种方法应用在体外过程中可以有较高的准确度，但是在复杂的生理环境中，探针在局部位置的富集可能造成背景荧光增强，而这些背景荧光会对检测的准确性造成极大的干扰。同时，生物体或者细胞的内吞及外排的动态作用也会导致局部区域荧光强度的变化。此外，个体的差异性和生理环境的复杂性同样可能造成假阳性信号。因此，依赖单一的荧光强度的变化不能对生物体内的动态过程进行准确的反馈和监测。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其如图1所示。
所述探针是以凋亡酶特异性识别多肽序列B和肿瘤靶向多肽序列D为骨架，能量共振转移的分子荧光对C和光动力学治疗光敏剂A组成，所述的能量共振转移的分子荧光对C由给体C1和受体C2组成，C1和C2分别键合在B的两边，结构如下述任意一式：
A-C1-B-C2-D、A-C2-B-C1-D、A-D-C1-B-C2、A-D-C2-B-C1、D-A-C1-B-C2、D-A-C2-B-C1。
所述的光动力学治疗光敏剂为酞菁类光敏剂或卟啉类光敏剂。
所述的能量共振转移的分子荧光对为荧光素和二甲氨基偶氮苯、二甲氨基偶氮苯和四甲基罗丹明、四甲基罗丹明和荧光素中的一种。
所述的凋亡酶是早期凋亡诊断信号，为凋亡酶-9，凋亡酶-3，或者其它凋亡酶。
所述的肿瘤靶向多肽序列为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸、半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸中的一种。
所述的凋亡酶特异性识别多肽序列为天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸、亮氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸或者色氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸中的一种。
本发明的目的是提供一种肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，原卟啉-赖氨酸(荧光素)-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸(二甲氨基偶氮苯)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，PpIX-K(FAM)SDEVDSK(Dabcyl)RGD，结构式为式(I)所示：
本发明所提供的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，是采用多肽固相合成的方法制备。
本发明的再一个目的是提供肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针的应用，1)在制备抗肿瘤光动力治疗药物中的应用；2)通过荧光成像，可以应用到药物筛选和肿瘤治疗效果的评价。
上述应用可以实现对肿瘤进行光动力学治疗，并能对治疗效果进行原位、精确和实时的评估。
所述的在荧光成像中的应用，是采用比例荧光成像的方法，在响应荧光信号中引入参比荧光信号，所述的响应荧光信号是荧光给体C1发出的，参比荧光信号由光动力学治疗光敏剂A发出的，探针中荧光给体C1的荧光强度和光动力学治疗光敏剂A的荧光强度的比例用于记录对靶向底物的检测。
所述的响应荧光信号是荧光素FAM发出的，参比荧光信号由原卟啉发出的，探针中荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度的比例用于记录对靶向底物的检测。
本发明的优点是：
1)整个合成过程采用固相多肽合成技术，制备方法简单，提纯过程简便。
2)通过引入多肽片段，可以显著改善光动力学治疗光敏剂的溶解性,，降低光敏剂的暗毒性，提高光敏剂对肿瘤细胞的靶向性。
3)这种诊疗荧光探针有较高的荧光猝灭效率，对凋亡酶-3具有很好的响应性和特异性，在不具有凋亡酶-3的情况下具有相对的稳定性。
4)这种荧光探针采用比例荧光成像的方式检测凋亡酶-3，可以提高荧光探针在检测应用中的准确性。
5)这种荧光探针同时具有光动力学治疗和治疗效果评价的作用，尤其可以对治疗效果进行原位，精确和实时的评估，可以极大的推进个性化治疗方案。
6)这种光动力学治疗探针在不光照的情况下具有良好的生物相容性，可以作为通用的比例荧光探针作为药物筛选和治疗效果评价。
7)这种光动力学治疗探针可以被广泛应用到肿瘤的早期诊断，药物分子的肿瘤靶向运输，肿瘤的选择性治疗，具有广泛的实用性价值。
附图说明
图1：肿瘤靶向诊疗荧光探针的示意图。
图2：肿瘤靶向诊疗荧光探针与凋亡酶-3作用前后的荧光光谱。
图3：肿瘤靶向诊疗荧光探针与凋亡酶-3及凋亡酶-3抑制剂存在的情况下的荧光变化。
图4：肿瘤靶向诊疗荧光探针在不同浓度下与凋亡酶-3作用前后的比例荧光变化。
图5：肿瘤靶向诊疗荧光探针与不同浓度的凋亡酶-3作用的比例荧光随时间延长的变化。
图6：肿瘤靶向诊疗荧光探针在凋亡酶-3作用条件下比例荧光恢复与时间的线性关系。
图7：肿瘤靶向诊疗荧光探针在经过2小时后的比例荧光恢复与对应的凋亡酶-3浓度的线性关系。
图8：共聚焦证明肿瘤靶向诊疗荧光探针在正常细胞和肿瘤细胞中的内吞。
图9：流式细胞术证明肿瘤靶向诊疗荧光探针在正常细胞和肿瘤细胞内吞。
图10：流式细胞术分析肿瘤细胞对诊疗荧光探针的内吞及细胞内的绿色荧光强度和比例荧光强度。
图11：利用共聚焦和诊疗荧光探针原位监测星孢菌素诱导的细胞早期凋亡。
图12：利用流式细胞术和诊疗荧光探针分析不同处理条件下细胞内的比例荧光变化。
图13：肿瘤靶向诊疗荧光探针产生的单线态氧与光照的响应关系。
图14：肿瘤靶向诊疗荧光探针对于正常细胞和肿瘤细胞在不同光照时间下的细胞毒性。
图15：利用流式细胞术分析记录探针对细胞进行光动力学治疗的同时可以对治疗效果进行有效反馈。
图16：利用流式分析探针对细胞进行光动力学治疗时的细胞凋亡百分率与相对应的细胞内比例荧光的对应关系。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
【实施例1】肿瘤靶向诊疗荧光探针的合成
原卟啉-赖氨酸(荧光素)-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸(二甲氨基偶氮苯)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，PpIX-K(FAM)SDEVDSK(Dabcyl)RGD)在室温条件下的合成：
(1)往装有10mL重蒸过的N,N-二甲基甲酰胺的反应器中加入0.5g氨树脂(0.525mmol/g)，待氨树脂在N,N-二甲基甲酰胺中在室温条件下溶胀2h后抽除N,N-二甲基甲酰胺。
(2)往反应器中加入20％(V/V)哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(即哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为2:8)溶液10mL，室温反应15min后，抽除溶剂；重复加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液进行反应以切落FMOC保护基，反应结束后，抽除溶剂，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2～4次。
(3)将FMOC保护的天冬氨酸(树脂活性位点的4倍当量)、N,N-二异丙基乙胺(氨基酸的8倍当量)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(树脂活性位点的4.8倍当量)、1-羟基苯并三氮唑(树脂活性位点的4.8倍当量)溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，再加到反应器中室温反应2h将亮氨酸键合到树脂上，抽除溶剂，N,N-二甲基甲酰胺洗涤2～4次。
(4)往反应器中加入20％(V/V)哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(即哌啶与N,N-二甲基甲酰胺体积比为2:8)溶液10mL，室温反应15min后，抽除溶剂；重复加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液进行反应以切落FMOC保护基，反应结束后，抽除溶剂，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2～4次。
(5)将FMOC保护的氨基酸(甘氨酸)(树脂活性位点的4倍当量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(树脂活性位点的4.8倍当量)、1-羟基苯并三氮唑(树脂活性位点的4.8倍当量)、N,N-二异丙基乙胺(树脂活性位点的8倍当量)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入反应器中室温反应2h将甘氨酸键合上去，抽除溶剂，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2～4次。
(6)其它的氨基酸按照步骤(4)(5)逐一键合上去。
(7)FMOC保护脱出后，将5(6)-羧基荧光素(树脂活性位点的4倍当量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(树脂活性位点的4.8倍当量)、1-羟基苯并三氮唑(树脂活性位点的4.8倍当量)、N-甲基吗啉(树脂活性位点的8倍当量)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入反应器中室温反应2～10h将5-(6)羧基荧光素键合上去，抽除溶剂，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2～4次。
(8)将树脂依次用N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷各洗涤三次，用10mL1.5％(v/v)的三氟乙酸/二氯甲烷溶液加入反应器中室温反应，反应结束后抽除溶剂，再加入混合溶液反应，每次反应5分钟，共反应5次。反应结束后，依次用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2～4次。
(9)将二甲氨基偶氮苯(Dabcyl)(树脂活性位点的3倍当量)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(树脂活性位点的3.6倍当量)、1-羟基苯并三氮唑(树脂活性位点的3.6倍当量)、N,N-二异丙基乙胺(树脂活性位点的6倍当量)溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入反应器中室温反应6h将二甲氨基偶氮苯键合上去，抽除溶剂，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2～4次。
(10)按照步骤(4)的方法脱出FMOC保护基团后，将原卟啉(PpIX，树脂活性位点的3倍当量)，苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐(树脂活性位点的3.6倍当量)，1-羟基苯并三氮唑，N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中(树脂活性位点的3.6倍当量)，加入反应器中室温反应2～12h，抽除溶剂，N,N-二甲基甲酰胺洗涤2～4次。
(11)N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2～4次，甲醇洗涤2～4次，二氯甲烷洗涤2～4次。
(12)往反应器中加入由如下体积百分含量的组分组成的溶液于室温下作用2h以切落氨树脂上的多肽键合物及侧基：95％三氟乙酸、5％水。
(13)收集切落液，旋蒸，真空干燥得到产物，于-20℃避光保存。
【实施例2】肿瘤靶向诊疗荧光探针对凋亡酶-3的响应检测
将探针溶解在HEPES缓冲溶液中，配置成1微摩尔/升的工作溶液。向含探针的缓冲溶液中加入凋亡酶-3(1U)，并用缓冲溶液将工作溶液稀释至终浓度为0.5微摩尔/升。通过荧光光谱仪(LS55荧光分光光度计，Perkin-Elmer)检测凋亡酶-3刚加入时和凋亡酶-3加入11小时后溶液的荧光素的荧光强度。荧光素的激发波长为：465纳米。
结果如图2所示，刚加入凋亡酶-3时溶液中探针的荧光素荧光强度较弱，而与凋亡酶-3作用11小时后，探针的荧光素强度在520纳米处有约11倍的增强。从而证明，探针中荧光素和二甲氨基偶氮苯通过能量共振转移，使荧光素荧光得到有效猝灭，并且具有较高的猝灭效率。同时，探针对凋亡酶-3具有良好的响应，可以通过荧光素荧光恢复检测凋亡酶-3的活性。
【实施例3】肿瘤靶向诊疗荧光探针对凋亡酶-3响应的特异性检测
将凋亡酶-3(1U)与商业化的凋亡酶-3特异性的抑制剂(Ac-DEVD-CHO，50微摩尔/升)在37摄氏度条件下孵育2小时。将探针溶液在HEPES缓冲溶液中配制成1微摩尔/升的工作溶液。含有探针的缓冲溶液中加入凋亡酶-3(1U)，凋亡酶抑制剂孵育过的凋亡酶-3(1U)，并用缓冲溶液将探针浓度稀释至终浓度为0.5微摩尔/升。用荧光光谱仪记录未加入凋亡酶-3，加入凋亡酶-3，加入凋亡酶-3和抑制剂的探针溶液的荧光随时间是如何变化的。荧光素的激发波长：465纳米；收集的荧光素的发射波长：520纳米。
结果如图3所示，在没有凋亡酶-3作用下，探针的荧光素荧光强度几乎没有恢复，而在凋亡酶-3的作用下，探针的荧光素荧光强度随时间增强。同时，在和经过凋亡酶抑制剂孵育后的凋亡酶-3作用下，探针的荧光素荧光强度与没有加入凋亡酶的荧光素荧光变化相当。表明探针在不含有凋亡酶的情况下具有一定的稳定性，并且，探针中荧光素的荧光恢复是凋亡酶-3特异性的。
【实施例4】肿瘤靶向诊疗荧光探针通过比例荧光成像的方法准确的成像凋亡酶-3的活性
将探针溶解在HEPES缓冲溶液中，分别在不同浓度的探针溶液中加入0.5U的凋亡酶-3，并用缓冲溶液将探针溶液稀释至终浓度为0.25，0.5，1和2微摩尔/升。用荧光光谱仪测试探针在加入酶时和加入酶4小时后探针溶液荧光素和原卟啉的荧光强度。荧光素的激发波长：465纳米，收集的荧光素的发射波长：520纳米；原卟啉的激发波长：408纳米，收集的原卟啉的发射波长：636纳米。
结果如图4所示，刚加入酶时，探针溶液中荧光素的荧光强度与卟啉的荧光强度比例保持在一个较低水平。并且，在不同探针浓度的情况下，这个比例几乎保持不变。在与凋亡酶作用后，荧光素的荧光强度与卟啉的荧光强度比例都升高了，并且保持在一个较高水平，而且这个比例同样保持不变。说明这个荧光探针通过比例荧光成像的方法可以准确的成像凋亡酶的活性，而不受探针的局部浓度的影响。
【实施例5】肿瘤靶向诊疗荧光探针通过比例荧光成像的方法反映凋亡酶-3的浓度和活性
将探针溶解在HEPES缓冲溶液中，配置成1微摩尔/升的工作溶液。分别向含探针的缓冲溶液中加入凋亡酶-3(0U，0.1U，0.2U，0.5U)或者凋亡酶-3抑制剂孵育过的凋亡酶-3(0.5U)，并用缓冲溶液将工作溶液将探针终浓度稀释为0.5微摩尔/升。通过荧光光谱仪记录在各个凋亡酶-3浓度下探针在不同时间处的荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度。荧光素的激发波长：465纳米，收集的荧光素的发射波长：520纳米；原卟啉的激发波长：408纳米，收集的原卟啉的发射波长：636纳米。
结果如图5所示，在各个凋亡酶-3的浓度下，探针中荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度随培养时间增长而逐渐增强。其中，在没有凋亡酶-3和经过凋亡酶-3抑制剂孵育过的凋亡酶-3培养的探针溶液的比例荧光几乎没有增强，再一次证明了探针中荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度的比例荧光恢复是凋亡酶-3特异性的。同时，在不同凋亡酶-3浓度的情况下，在相对应的培养时间里，探针中荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度的比例荧光随凋亡酶浓度增加而变大，证明比例荧光强度可以较好的反映凋亡酶的浓度和活性。
【实施例6】肿瘤靶向诊疗荧光探针通过比例荧光成像的方法检测凋亡酶-3与探针作用时间的线性关系
将探针溶解在HEPES缓冲溶液中，配置成1微摩尔/升的工作溶液。分别向含探针的缓冲溶液中加入凋亡酶-3(0.2U)，并用缓冲溶液将工作溶液的探针终浓度稀释为0.5微摩尔/升。用荧光光谱仪记录在不同时间点处荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度。
结果如图6所示，在经过凋亡酶-3的培养后，探针溶液中荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度比例逐渐增大，并且与作用时间保持较好的线性关系。
【实施例7】肿瘤靶向诊疗荧光探针通过比例荧光成像的方法检测凋亡酶-3与浓度的线性关系
将探针溶解在HEPES缓冲溶液中，配置成1微摩尔/升的工作溶液。分别向含探针的缓冲溶液中加入凋亡酶-3(0U，0.05U，0.1U，0.2U，0.5U)，并用缓冲溶液将工作溶液将探针终浓度稀释为0.5微摩尔/升。用荧光光谱仪记录培养2小时后在不同凋亡酶-3浓度条件下荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度。
结果如图7所示，在经过2小时的培养后，探针溶液中荧光素的荧光强度和原卟啉的荧光强度比例随凋亡酶-3浓度增加逐渐增大，并且保持较好的线性关系。
【实施例8】肿瘤靶向诊疗荧光探针靶向肿瘤细胞的能力
非洲绿猴肾细胞(COS7)和人神经胶质瘤细胞(U87)分别以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，分别向COS7和U87细胞中加入1mL含有探针(40微摩尔/升)的培养基。作为对比，另一组U87细胞中加入1mL含有探针和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(100微摩尔/升)的培养基。培养6小时后，将含有探针的培养基吸出，有PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次后加入新的培养基，用激光共聚焦显微镜观察细胞内的原卟啉荧光强度。
结果如图8所示，在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸受体低表达的COS7细胞中，原卟啉的红色荧光较弱，而在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸受体高表达的U87细胞中，原卟啉的红色荧光较强，从而证明探针具有靶向肿瘤细胞的能力。与此同时，在精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽的竞争下，U87细胞内原卟啉的红色荧光较没有竞争时更弱，从而证明了U87细胞对探针内吞的增强是由于探针中精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列引起的。
【实施例9】流式细胞仪定量分析肿瘤靶向诊疗荧光探针靶向肿瘤细胞的机制
U87细胞以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在2mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，U87细胞中加入2mL含有探针(40微摩尔/升)的培养基。作为对比，另一组U87细胞中加入1mL含有探针和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(100微摩尔/升)的培养基。培养6小时后，将含有探针的培养基吸出，有PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次后加入，然后用0.25％的胰蛋白酶消化1分钟。低速离心，用PBS洗涤细胞，最后将细胞重新分散在0.3mLPBS中，用流式细胞仪定量分析细胞内原卟啉荧光，用Flowjo7.6软件对数据进行分析。
结果如图9所示，在具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽竞争的情况下，U87细胞对探针的内吞较没有竞争时的少，因此再次证明探针对于肿瘤细胞的靶向性。
【实施例10】比例荧光成像的方式解决细胞中由于局部浓度导致的背景荧光增强问题
U87细胞以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在2mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，U87细胞中分别加入2mL含有探针(40微摩尔/升)的培养基。分别培养3小时，4小时，5小时，6小时后，将含有探针的培养基吸出，有PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次后，然后用0.25％的胰蛋白酶消化1分钟。低速离心，用PBS洗涤细胞，最后将细胞重新分散在0.3mLPBS中，用流式细胞仪定量分析细胞内荧光素荧光和原卟啉荧光，用Flowjo7.6软件对数据进行分析。
结果如图10所示，随培养时间增加，细胞内的荧光素荧光增加了2倍以上，但是细胞内荧光素荧光和原卟啉荧光的比例却保持相对稳定。说明探针在细胞内具有一定的稳定性，同时，通过比例荧光成像的方式能够降低由于探针在局部的富集引起的背景荧光的增强，增强了探针对靶向底物检测的准确性。
【实施例11】肿瘤靶向诊疗荧光探针用来检测细胞凋亡
将星孢菌素溶解在细胞培养基中，终浓度为4微摩尔备用。U87细胞以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在1mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，U87细胞中加入1mL含有探针(40微摩尔/升)的培养基。培养6小时后，将含有探针的培养基吸出，用PBS将细胞洗涤三次。将备好的星孢菌素培养基溶液1mL加入细胞中，并通过共聚焦随时间对细胞进行观察。
结果如图11所示，细胞中原卟啉的荧光随培养时间增加而没有变化，荧光素的荧光在刚加入星孢菌素时较弱，但随培养时间增加而逐渐增强。同时，从图中可以看出，荧光素荧光和原卟啉荧光比例随星孢菌素培养的时间而增强，从而证明了细胞的凋亡过程。由此可以看出，该探针可以作为通用的探针，用来检测细胞凋亡，或者作为治疗药物的筛选。
【实施例12】肿瘤靶向诊疗荧光探针用于检测药物引起的早期细胞凋亡
U87细胞以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在2mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，U87细胞中加入2mL含有探针(40微摩尔/升)的培养基。培养6小时后，将含有探针的培养基吸出，用PBS将细胞洗涤三次。作为实验组，将备好的星孢菌素培养基溶液1mL(4微摩尔)加入细胞中，分别培养15分钟，30分钟，45分钟，60分钟。作为空白对照，在对照组中，加入不含星孢菌素的培养基培养；作为实验对照，在对照组中，加入星孢菌素的之前，将细胞与凋亡酶-3抑制剂(50微摩尔)预培养2小时，然后再加入星孢菌素，作为对照。将培养基吸出，有PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次后，然后用0.25％的胰蛋白酶消化1分钟。低速离心，用PBS洗涤细胞，最后将细胞重新分散在0.3mLPBS中，用流式细胞仪定量分析细胞内荧光素荧光和原卟啉荧光，用Flowjo7.6软件对数据进行分析。
结果如图12所示，在加入凋亡酶-3抑制剂的实验对照组中，荧光素荧光与原卟啉荧光比例变化与空白对照组相当。而在实验组中，这个比例在星孢菌素培养的各个时间段内都较空白对照组合实验对照组的高，由此可以再次证明探针可以适用于药物引起的早期细胞凋亡检测。
【实施例13】肿瘤靶向诊疗荧光探针单线态氧产生的激活
将探针溶解在PBS(pH7.4)缓冲溶液。向缓冲溶液中加入二氯荧光素，并用缓冲溶液调整探针终浓度为10微摩尔/升，二氯荧光素的终浓度为20微摩尔/升，得到工作溶液。用630纳米(光照强度：29.8毫瓦/平方厘米)的LED灯间歇性的照射工作溶液，并用荧光光谱仪测试在每个照射间歇处工作溶液二氯荧光素的荧光强度。二氯荧光素的激发波长：465纳米；收集的二氯荧光素的发生波长：520纳米。
结果如图13所示，探针在光照条件下产生单线态氧，而单线态氧氧化二氯荧光素使其具有荧光。探针具有良好的产生单线态氧的能力，并且其产生单线态氧的能力具有良好的光响应性。
【实施例14】通过MTT实验评估肿瘤靶向诊疗荧光探针对COS7和U87细胞的PDT效率
COS7和U87细胞分别以6000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，用100μL培养基培养24小时。然后，将用培养基配制的探针浓度梯度溶液100μL分别加入到各孔中。培养6小时后，吸出培养基，加入200μL新的培养基。分别对96孔板进行光照100秒、200秒(LED灯，29.8mW/cm2)，或者避光培养。光照结束后，所有细胞在避光条件下37摄氏度培养48小时。随后在每个孔中加入20μL5mg/mL的MTT(MTT溶解在PBS缓冲液中)。共培养4h后，吸出培养基，加入150μL二甲亚砜(DMSO)。酶标仪测量每个孔中570纳米处的吸光值，计算细胞存活率，进而得到各条件下探针分别对COS7和U87细胞的毒性。
结果如图14所示，探针在没有光照时对COS7和U87两种细胞都具有较小的毒性，随光照时间的增加，探针对细胞的光毒性增强。同时，在相同光照时间和相同浓度探针的情况下，探针对U87细胞的光毒性较COS7细胞的光毒性高，这是由于探针能够更多的被U87细胞内吞导致的。
【实施例15】肿瘤靶向诊疗荧光探针实现光动力学治疗和治疗效果原位评价
U87细胞以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在2mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，U87细胞中加入2mL含有探针(40微摩尔/升)的培养基。培养6小时后，将含有探针的培养基吸出，用PBS将细胞洗涤三次。作为实验对照，将细胞与凋亡酶-3抑制剂(50微摩尔)共培养2小时。之后对细胞进行光照100秒(LED灯，29.8mW/cm2)，细胞继续避光培养1小时后，将培养基吸出，有PBS缓冲溶液将细胞洗涤三次后，然后用0.25％的胰蛋白酶消化1分钟。低速离心，用PBS洗涤细胞，最后将细胞重新分散在0.3mLPBS中，用流式细胞仪定量分析细胞内荧光素荧光和原卟啉荧光，用Flowjo7.6软件对数据进行分析。
结果如图15所示，在凋亡酶-3抑制剂存在的情况下，U87细胞内荧光素荧光与原卟啉荧光比例较没有凋亡酶-3抑制剂存在时的小。导致这个结果的原因是，在凋亡酶-3抑制剂存在的情况下，探针光动力学治疗所导致的细胞凋亡受到影响，凋亡酶-3的表达受到抑制，所以探针的比例荧光恢复较弱。与此同时，经过光照的细胞内荧光素荧光与原卟啉荧光比例较没有经过光照的高，是因为在没有光照的情况下，探针对细胞具有较低的毒性，而不能导致细胞凋亡。因此，探针可以对细胞进行光动力学治疗，同时可以对治疗效果进行及时有效的反馈。
【实施例16】肿瘤靶向诊疗荧光探针通过比例荧光成像的方法对PDT引起的细胞凋亡进行适时定量检测
U87细胞以1×105个细胞/孔的密度接种，37℃条件下在2mL培养基中培养。24小时后，将探针溶解在培养基中，U87细胞中加入2mL含有探针(20微摩尔/升)的培养基。培养6小时后，将含有探针的培养基吸出，用PBS将细胞洗涤三次后加入新的培养基。将细胞分别光照(LED灯，29.8mW/cm2)10秒，30秒，50秒，70秒，100秒，然后将细胞避光培养。2小时后，将培养基吸出，然后用0.25％的胰蛋白酶消化1分钟。低速离心，用PBS洗涤细胞，最后将细胞重新分散在0.3mLPBS中，用流式细胞仪定量分析细胞内荧光素荧光和原卟啉荧光，用Flowjo7.6软件对数据进行分析。作为细胞凋亡分析，得到的细胞用异硫氰基荧光素标记的膜联蛋白和碘化丙啶染色，然后用流式细胞仪分析细胞凋亡情况，用Flowjo7.6软件对数据进行分析。
结果如图16所示，随光照时间增加，凋亡细胞的百分率增大，而与此对应的荧光素荧光和原卟啉荧光的比例也逐渐增大。并且，凋亡细胞的百分率与荧光素荧光和原卟啉荧光的比例具有良好的线性关系，证明探针可以实现光动力学治疗和治疗效果原位评价的作用。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其特征在于：所述探针是以凋亡酶特异性识别多肽序列B和肿瘤靶向多肽序列D为骨架，能量共振转移的分子荧光对C和光动力学治疗光敏剂A组成；所述的能量共振转移的分子荧光对C由给体C1和受体C2组成，C1和C2分别键合在B的两边，结构如下述任意一式：A-C1-B-C2-D、A-C2-B-C1-D、A-D-C1-B-C2、A-D-C2-B-C1、D-A-C1-B-C2、D-A-C2-B-C1。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其特征在于：所述的光动力学治疗光敏剂为酞菁类光敏剂或卟啉类光敏剂。
3.根据权利要求2所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其特征在于：所述的能量共振转移的分子荧光对为荧光素和二甲氨基偶氮苯、二甲氨基偶氮苯和四甲基罗丹明、四甲基罗丹明和荧光素中的一种。
4.根据权利要求3所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其特征在于：所述的凋亡酶为凋亡酶-9，凋亡酶-3，或者其它凋亡酶中的一种。
5.根据权利要求4所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其特征在于：所述的凋亡酶特异性识别多肽序列为天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸、亮氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸或者色氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸中的一种；所述的肿瘤靶向多肽序列为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸、天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸、半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸中的一种。
6.根据权利要求5所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针，其特征在于：其为原卟啉-赖氨酸(荧光素)-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-赖氨酸(二甲氨基偶氮苯)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，化学结构如式(I)所示：
7.权利要求1-6任一项所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针在下述方面的应用：1)在制备抗肿瘤光动力治疗药物中的应用；2)通过荧光成像，可以应用到药物筛选和肿瘤治疗效果的评价。
8.根据权利要求7所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针的应用，其特征在于：实现对肿瘤进行光动力学治疗，并能对治疗效果进行原位、精确和实时的评估。
9.根据权利要求7或8所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针的应用，其特征在于：所述的在荧光成像中的应用，是采用比例荧光成像的方法，在响应荧光信号中引入参比荧光信号，所述的响应荧光信号是给体C1发出的，参比荧光信号由光动力学治疗光敏剂A发出的，探针中给体C1的荧光强度和光动力学治疗光敏剂A的荧光强度的比例用于记录对靶向底物的检测。
10.根据权利要求8所述的肿瘤靶向光动力学治疗诊疗探针的应用，其特征在于：所述的给体C1是荧光素，光动力学治疗光敏剂A是原卟啉。
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