CN111297830B

CN111297830B - 一种介导光疗的分级靶向纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111297830B
Application number: CN202010162949.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋冠; 陶盈凯; 杨春生
Original assignee: Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111297830A

Abstract

本发明公开了一种介导光疗的分级靶向纳米粒及其制备方法和应用，该靶向纳米粒呈核‑壳‑壳的球形结构，采用W/O/W双乳化法制备而成，5‑ALA和CAT作为水相分布于纳米粒内部，TPP和PLGA作为油相构成纳米粒内壳，最外层则包被有HA作为外壳。该纳米粒能够主动靶向肿瘤细胞，高效递送光敏剂5‑ALA；另外，该纳米粒通过进一步靶向肿瘤细胞内线粒体，并通过CAT产生大量氧气，有效缓解TME乏氧，进而在激光照射下产生大量ROS并增强ROS的杀伤作用，从而发挥增强的抗肿瘤作用。

Description

一种介导光疗的分级靶向纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物医学技术领域，具体而言，涉及一种介导光疗的分级靶向纳米粒及其制备方法和应用，尤其涉及一种以聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体的分级靶向纳米粒及其制备方法和治疗黑素瘤的应用。

背景技术

黑素瘤是起源于表皮深层的黑素细胞的一种恶性肿瘤，多由恶化的单个黑素细胞或良性功能障碍的痣转化而来，恶性程度高，是致死率最高的皮肤肿瘤。尽管近年来肿瘤诊断和治疗技术发展迅速，越来越多的药物和治疗方法被开发用于治疗黑素瘤，但在全球范围内黑素瘤的发病率和死亡率仍逐年增加，并伴有低龄化的趋势[Monro S, Colón Kl,Yin H, Roque J, Konda P, Gujar S, et al. Transition Metal Complexes andPhotodynamic Therapy from a Tumor-Centered Approach: Challenges,Opportunities, and Highlights from the Development of TLD1433. Chemicalreviews. 2019; 119: 797-828.]。目前临床上占主导地位的治疗方法仍然是手术治疗、放射治疗和化疗。此外，分子靶向治疗和免疫治疗取得了巨大进展，尤其是以抗CTLA-4 单克隆抗体和抗PD-1/PD-L1 单克隆抗体为代表的免疫检查点抑制剂被批准应用于临床并取得了显著疗效，大大推动了黑素瘤免疫治疗的发展。然而，越来越多的证据表明这些治疗手段并非对所有的癌症患者有效，且随之而来的免疫副作用和耐药性也限制了这些药物的广泛应用和发展[Lamberti Mj, Rettel M, Krijgsveld J, Rivarola Va, Rumie Vittar Nb.Secretome profiling of heterotypic spheroids suggests a role of fibroblastsin HIF-1 pathway modulation and colorectal cancer photodynamic resistance.Cellular oncology （Dordrecht）. 2019; 42: 173-96.。因此，探索新的高效无毒的治疗手段具有重要的意义。

光动力治疗（PDT）是一种无创、副作用小、耐药性小、可重复的治疗技术，已成为癌症治疗的重要辅助手段之一。经典的PDT由三种元素组成：氧（O₂）、光敏剂（PSs）和光源。经过特定波长的激发光照射后，肿瘤细胞内积累的光敏剂被激活，将其周围的O₂转化为活性氧（ROS），诱导肿瘤细胞凋亡、坏死。遗憾的是，PDT对包括黑素瘤在内的多种侵袭性肿瘤疗效不佳。其原因之一是由于侵袭性肿瘤的快速生长和血管的扭曲导致肿瘤微环境（TME）长期处于乏氧状态，TME乏氧不仅会导致PDT的ROS产量低，而且会上调低氧诱导因子（HIF-1α）的表达。HIF-1α是一种机体内普遍存在的受氧气水平调控的核蛋白亚单位，参与肿瘤细胞增殖、转移、免疫、耐药以及肿瘤新生血管生成等过程。因此，HIF-1α是一个颇有潜力的肿瘤治疗靶点，研究发现降低 HIF-1α的表达水平，能够抑制肿瘤的发生和发展，并发挥增敏放疗、化疗以及 PDT 治疗的作用。限制PDT疗效的另一个原因是大多数PSs稳定性较差，对肿瘤细胞的特异性低，导致即使较高剂量的PSs被用于PDT，也仅有小部分PSs最终能够到达肿瘤细胞并发挥作用。此外，由于ROS半衰期短（< 40 ns）、扩散距离有限（< 20 nm），ROS对肿瘤细胞的杀伤范围仅限于ROS生成部位，导致PDT对侵袭性肿瘤治疗不彻底 [Zhou Z, SongJ, Nie L, Chen X. Reactive oxygen species generating systems meetingchallenges of photodynamic cancer therapy. Chemical Society reviews. 2016;45: 6597-626.]。因此，开发有效的策略来提高光动力治疗的抗肿瘤作用是当务之急。

近年来，纳米粒子具有纳米级尺寸、良好的生物相容性和良好的可塑性等特点，引起了越来越多研究者的关注，各种基于纳米粒子的PDT （nano-PDT）的策略被开发以克服传统PDT的上述局限性，逐渐成为了一种新型的抗肿瘤技术。为了改善TME缺氧，研究人员设计了多种纳米复合物来提高肿瘤组织内氧含量，如全氟碳氧穿梭纳米粒、二氧化锰（MnO2）纳米颗粒、纳米金属有机骨架和过氧化氢酶纳米胶囊。此外，为了更高效地传递PSs，诸如适配体修饰的上转换纳米颗粒（UCNP-Ce6-sgc8）、PH响应蛋白-三苯氧胺纳米复合物（HSA-Ce6/TAM）、谷胱甘肽响应性纳米金属-有机骨架（Cu^II-metalated nano-MOF）等多种类型的纳米复合物已经被开发出来。遗憾的是，无论是改善TME缺氧供氧，还是提高PSs转运效率，都不能显著提高PDT对侵袭性肿瘤的治疗效果。

5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）是临床常用的光敏剂，与其他传统的PSs不同的是，5-ALA是光敏剂的前体物质，被体内细胞摄入后，它需要在细胞内线粒体中进一步转化为强效光敏剂PphIX，才能发挥光敏作用，安全性较高。基于5-ALA的PDT （ALA-PDT）是一种创伤小，副作用低，不易发生耐药和可重复的治疗技术，目前临床多用于浅表非侵袭性肿瘤的术后辅助治疗，如光化性角化病（AK）[Zhang G, Cao Z, Wang P, Zhu L, Zhang L, Zhou Z, etal. Comparison of efficacy, adverse effects and costs between 20% ALA-PDT and10% ALA-PDT for the treatment of actinic keratosis in Chinese patients.Photodiagnosis and photodynamic therapy. 2019; undefined: 101605.]，基底细胞癌（BCC）[Mu X, Wang L, Wang L, Ge R, Dang H, Mou K. Plum-blossom needlingenhanced the effect of photodynamic therapy on basal cell carcinoma.Photodiagnosis and photodynamic therapy. 2018; 23: 339-41.]和鳞状细胞癌（SCC）[Peng J, Feng W, Luo X, Wang T, Xiang W, Dai Y, et al. A Clinical Trial UsingAttrition Combined with 5-Aminolevulinic Acids Based Photodynamic Therapy inTreating Squamous Cell Carcinoma. Medical science monitor : internationalmedical journal of experimental and clinical research. 2017; 23: 1347-54.]，疗效显著。然而，由于5-ALA具有亲水性、稳定性差、生物利用度低的特点，肿瘤细胞摄取的5-ALA有限。此外，由于肿瘤微环境乏氧导致光动力治疗中的主要毒性物质ROS产量低，ROS半衰期短（< 40 ns）、扩散距离有限（< 20 nm），ALA-PDT对黑色素瘤等侵袭性肿瘤疗效不佳。

发明内容

鉴于肿瘤微环境乏氧导致光动力治疗中的主要毒性物质ROS产量低、半衰期短、扩散距离有限，本发明的目的在于提供一种以聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载体的分级靶向纳米粒及其制备方法和治疗黑素瘤的应用，从而解决了ALA-PDT对黑色素瘤等侵袭性肿瘤疗效不佳的问题。

为了实现上述技术目的，发明人考虑到线粒体是细胞内有氧呼吸的主要场所，也是细胞内H₂O₂的主要产生场所，线粒体功能障碍与线粒体ROS稳态的破坏密切相关。因此，开发一种靶向线粒体的纳米光敏剂，不仅可以进一步提高5-ALA的转运效率，还可以在线粒体内生成ROS，打破线粒体内ROS的稳态，诱导线粒体崩塌和发生不可逆的细胞凋亡，提高ROS对肿瘤细胞的杀伤作用，从而增强PDT的疗效。

基于发明人前期的研究积累和设想，本发明人将HA的主动靶向作用和TPP的线粒体靶向作用结合起来，将5-ALA的光敏作用与CAT的产氧作用结合起来，构建具有分级靶向抗肿瘤作用的纳米粒HTACNP，并将HTACNP暴露于MV3黑素瘤细胞和MV3荷瘤小鼠，在体外研究该纳米递释系统的抗肿瘤作用。结果显示，HTACNP能够主动靶向MV3细胞，在HA外壳被分解后，能够进一步靶向肿瘤细胞内线粒体，并在激光照射下， HTACNP 能够生成大量ROS，发挥强效的PDT 作用，有效杀伤MV3黑素瘤细胞。

具体地，本发明的第一个目的是这样实现的：一种介导光疗的分级靶向纳米粒，该靶向纳米粒呈核-壳-壳的球形结构，采用W/O/W双乳化法制备而成，5-ALA和CAT作为水相分布于纳米粒内部，TPP和PLGA作为油相构成纳米粒内壳，最外层则包被有HA作为外壳，其中HA为透明质酸，PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，TPP为三苯基膦，ALA为5-氨基乙酰丙酸，CAT为过氧化氢酶。

本发明的第二个目的是提供上述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，该方法包括如下步骤：

（1）称取ALA、CAT溶于0.7-2.0%聚乙烯醇溶液中，得到内水相；

（2）称取PLGA溶于有机溶剂中，得到油相；

（3）在超声波作用下，将步骤（1）制备的内水相溶液逐滴加入步骤（2）制备的油相中，得到初乳；

（4）将HA加入1-4% 聚乙烯醇溶液中，搅拌至完全溶解，加入2.5-10 mg/mL TPP的DMSO溶液，随后逐滴加入步骤（3）制备的初乳，在超声波作用下得到复乳；

（5）将步骤（4）得到的复乳在室温、避光条件下，200-400 r/min搅拌8-16h，去除多余的有机溶剂，收集得到的澄清溶液，使用高速冷冻离心机4 ℃、15000 rpm 离心4-6 min收集上清，4 ℃、10000 rpm 离心18-25 min，收集沉淀，双蒸水洗涤2-5次，去除游离药物及杂质，得到靶向纳米粒。

进一步优选地，如上所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其中的ALA、CAT、TPP、PLGA、HA的用量分别为：

ALA 1.8-2.5重量份；

CAT 0.8-1.2重量份；

TPP 0.3-0.5重量份；

PLGA 13-20重量份；

HA 0.8-1.3重量份。

再进一步优选地，如上所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其中的ALA、CAT、TPP、PLGA、HA的用量分别为：

ALA 1.9-2.1重量份；

CAT 0.9-1.1重量份；

TPP 0.3-0.4重量份；

PLGA 14-16重量份；

HA 0.9-1.1重量份。

在本发明最优选的实施例中，如上所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其中的ALA、CAT、TPP、PLGA、HA的用量分别为：

ALA 2重量份；

CAT 1重量份；

TPP 0.38重量份；

PLGA 15重量份；

HA 1重量份。

另外，如上所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其中：步骤（2）所述的PLGA为PLGA 50:50；步骤（2）所述的有机溶剂选自如下的一种：二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮；步骤（3）所述的超声波参数为：160-200W超声1.5-2.5 min；步骤（4）所述的超声波参数为：160-200W超声3-5 min。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著进步性：

（1）成功构建核-壳-型分级靶向纳米粒HTACNP，平均水合粒径为211.27 nm，Zeta电位为-14.3 mV，稳定性良好，呈球形，分散性良好，5-ALA和CAT的包封率分别为28.4%和16.4%，TPP和HA含量分别为41.20 μg/mL和59.19 μg/mL。

（2）共定位结果表明，HTACNP能够主动靶向MV3细胞。在HA外壳被分解后，能够进一步靶向肿瘤细胞内线粒体。

（3）HTACNP具有良好的产氧能力，通过CAT能与线粒体内H₂O₂反应生成大量O₂。

（4）流式细胞计数法和TUNEL法结果显示在激光照射下， HTACNP 能够生成大量ROS，发挥强效的PDT 作用，有效杀伤MV3黑素瘤细胞。

（5）动物实验结果显示经尾静脉注射的 HTACNP，能够进入肿瘤组织，并利用组织内 H₂O₂ 产生氧气，改善肿瘤微环境乏氧，下调HIF-1α的表达。在激光照射下，HTACNP能发挥强效的 PDT 作用，能够有效抑制恶性黑素瘤生长。

（6）MTT结果显示在避光条件下，HTACNP对MV3细胞没有明显的细胞毒性，生物安全性良好。动物病理检测结果表明 HTACNP+ Laser 治疗对小鼠未显示出明显的系统毒副作用，生物安全性良好。

附图说明

图1为HTACNP纳米粒和合成和结构示意图。

图2为HTACNP的TEM照片（A、B代表不同放大倍数）。

图3为HTACNP的水合粒径（A）、Zeta电位（B）。 SHAPE \* MERGEFORMAT

图4为标准曲线及回归方程，其中：（A）ALA标准品，（B）CAT标准品，（C）HA标准品，（D）TPP标准品。

图5为溶氧仪研究HTACNP 催化H2O2产生氧气的能力。 SHAPE \* MERGEFORMAT

图6为MTT法研究不同浓度HTACNP的暗毒性。

图7为倒置荧光显微镜（A-B）和流式细胞仪（C-D）检测MV3细胞对HTACNP的靶向摄入（ns：无统计学意义；***：P<0.001）。

图8为激光扫描共聚焦显微镜（A-B）和透射电镜（B）研究MV3 细胞对HTACNP 纳米粒的摄入和线粒体共定位研究。

图9为倒置荧光显微镜检测HTACNP在肿瘤细胞内的产氧能力（A）和平均荧光强度分析（B）（**：P<0.01；***：P<0.001）。

图10为式细胞仪研究HTACNP介导的PDT产生ROS的能力（***：P<0.001）。

图11为流式细胞仪（A-B）和TUNEL法（C-D）研究HTACNP介导的PDT作用（***：P<0.01）。

图12为MTT法研究HTACNP介导的PDT作用（***：P<0.001）。

图13为免疫荧光法（A-B）研究HTACNP进入肿瘤组织后调节HIF-1α的含量。

图14为荷瘤小鼠模型研究HTACNP介导的PDT作用对黑素瘤的治疗效果（A：治疗结束后肿瘤组织图；B：治疗结束后肿瘤组织重量分析；C：肿瘤生长曲线；D-E：TUNEL法分析肿瘤组织凋亡；F：H&E染色分析肿瘤组织凋亡和/或坏死）。

图15为 HTACNP对小鼠主要脏器的组织病理学检测切片图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、材料

1.1细胞株：人皮肤黑素瘤细胞MV3购自中科院上海细胞库。

实验动物：BALB/c-nu 雌性裸鼠， 4～6 周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。裸鼠饲养于徐州医科大学 SPF 级屏障系统中。饲料和饮水由动物房经灭菌处理后供动物自由饮食。

试剂

PLGA （50:50, 10 kD）	西安瑞禧生物科技有限公司
		PVA （30~70 kD）	美国 Sigma-Aldrich 公司

二、方法

2.1 HA-TPP-PLGA-ALA-CAT纳米粒（HTACNP）的制备

采用W/O/W改良双乳化法制备HA-TPP-PLGA-ALA-CAT纳米粒（HTACNP），首先精密称取2 mg ALA、1 mg CAT溶于200 μL 1% PVA溶液中，制备内水相。称取15 mg PLGA溶于2mL DCM中，制备油相。随后将200 μL 内水相溶液逐滴加入2 mL油相中，于超声细胞破碎仪，180w超声2 min，得到初乳。将10 mL 2% PVA溶液置于磁力搅拌器上，加入1 mg HA，搅拌至完全溶解，加入76 μL含TPP （5 mg/mL）的DMSO溶液，随后逐滴加入制备好的初乳，180 w超声4 min，得到复乳，转移至50 mL茄形瓶中。室温、避光条件下，300 r/min搅拌过夜，去除多余的DCM。次日收集得到的澄清溶液，使用高速冷冻离心机4 ℃，15000 r 离心5 min收集上清，4 ℃、10000 r 离心20 min，收集沉淀，双蒸水洗涤3次，去除游离药物及杂质，最后加入1 mL PBS重悬，得到HTACNP纳米粒原液，4 ℃保存。

按照上述步骤，制备HA-PLGA-ALA-CAT （HACNP）、TPP-PLGA-ALA-CAT （TACNP）、香豆素6-HA-TPP-PLGA-CAT （f-HTCNP）纳米粒，除在制备过程中不投入TPP、HA、或在DMSO中加入1 mg/mL香豆素6外，其余步骤相同。

纳米粒的表征

2.2.1 透射电镜（TEM）观察HTACNP纳米粒的粒径和形貌

吸取HTACNP纳米粒原液10 μL，适当稀释后滴加至铜网上，吸附10 min后，用滤纸小心吸去多余溶液，随后滴加少量醋酸双氧铀染色1 min，室温下晾干后，于透射电子显微镜下观察纳米粒形貌，并通过Nano Measurer 1.2软件测量其粒径，取平均值。

粒度分析仪测定HTACNP纳米粒的水合粒径，Zeta电位及稳定性

取100 μL HTACNP纳米粒原液，加入900 μL双蒸水稀释，采用Malvern激光粒度仪检测HTACNP的水合粒径和Zeta电位。每个样检测三次，取平均值。

取200 μL HTACNP纳米粒原液分别加入1800 μL双蒸水、PBS缓冲液（PH=7.4）、DMEM培养基、DMEM+10% FBS培养基中，在第0、1、2、3、7、13、18天，分别用Malvern粒度分析仪检测并记录HTACNP的水合粒径，并绘制稳定性曲线。

纳米粒ALA包封率的测定

（1）ALA-乙酰丙酮荧光衍生荧光分光光度计法制备标准曲线

称取ALA 12.5 mg，于50 mL量瓶中，加0.01 mol/L PBS（PH=7.4）溶液溶解，定容50mL，得到250 μg/mL的ALA-PBS储备液。精密吸取0.2，0.4，1.0，1.4，2.0，4.0 mL ALA储备液，分别加PBS溶解，定容至25 mL，得到浓度（C）为1.0，2.0，5.0，7.0，10.0，20.0 μg/mL 的ALA-PBS标准液。乙酰丙酮试剂的配制：乙酰丙酮：无水乙醇：蒸馏水=3: 2: 15 （v: v: v）; 10%甲醛溶液的配制：37% 甲醛：蒸馏水=10: 27（v: v）；

采用ALA-乙酰丙酮荧光衍生荧光分光光度计法测算溶液中ALA的含量。取3.5 mL乙酰丙酮试剂，0.45 mL 10% 甲醛溶液，50 μL待测的ALA-PBS标准液，于4 mL EP管混匀，避光条件下，100℃水浴加热10 min，冰浴5 min，随后取1 mL于比色皿中，荧光分光光度计Ex=378 nm，Em =466 nm，狭缝宽度= 4，测定荧光强度A₁。以荧光强度度A₁对浓度C₁进行线性回归处理，得回归方程并绘制标准曲线。

（2）ALA包封率（EE₁）测定

收集纯化HTACNP过程中的上清液，取50 μL，按上述ALA标曲测定步骤测定样品荧光强度，带入回归方程，计算上清液中游离ALA的浓度，最后乘以上清液总体积，得到游离ALA质量。

ALA包封率（EE₁）=（投药量₁- 游离ALA质量）/投药量₁* 100%。

纳米粒CAT包封率的测定：

（1）BCA蛋白浓度法制备标准曲线

蛋白标准品的配制：取0.8 mL蛋白标准配制液加入至20 mg BSA中，充分溶解，得到25 mg/mL的蛋白标准溶液。加入适量PBS, 稀释至0.5 mg/mL即蛋白标准品。

BCA工作液的配制：BCA试剂A：BCA试剂B= 50: 1（v: v）, 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20 μL ，浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。每孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃静置20 min。用酶标仪测定并记录波长为562 nm时，各孔的吸光度A₂。以吸光度A₂对浓度C₂进行线性回归处理，得回归方程并绘制标准曲线。

（2）CAT 包封率（EE₂）测定

收集纯化HTACNP过程中的上清液，取20 μL，按上述步骤测定样品吸光度，带入回归方程，计算上清液中游离CAT的浓度，最后乘以上清液总体积，得到游离CAT质量。

CAT包封率（EE₂）=（投药量₂- 游离CAT质量）/投药量₂* 100%。

电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定TPP含量：

按照前述方法制备3份HTACNP纳米粒，离心洗涤后分别加入去双蒸水定容至3 mL，样品送北京中科百测科技有限公司，应用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定TPP的含量。

试剂盒测定HA含量

按前述方法制备HTACNP纳米粒。按HA-ELISA试剂盒说明书配制标准品（标准品浓度：50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.125 ng/mL、1.56 ng/mL、0 ng/mL）、洗涤液、生物素化抗体工作液、SABC工作液。

（1）加样：所需板孔用洗涤液洗板2次，甩干。设标准孔、空白孔、待测样品孔，每孔3个复孔。每孔按需加入标准品或待测样品50 μL，立即加入生物素标记的抗体工作液50 μL/孔，轻轻晃动混匀。酶标板覆膜，37 ℃孵育45 min。

（2）弃去孔内液体，甩干、洗板3次，每孔350 μL洗液，每次浸泡1 min。

（3）每孔加SABC工作液100 μL，覆膜，37℃ 孵育30 min。

（4）弃去孔内液体，甩干，洗板5次。

（5）每孔加底物溶液（TMB） 90 μL，覆膜，37℃ 避光孵育15 min。

（6）每孔加终止液50 μL，终止反应。

（7）立即用酶标仪在450 nm波长检测并记录各孔OD值，绘制HA标准曲线，计算HA含量。

纳米粒中CAT产氧能力测定

在0.1 Mm H₂O₂溶液中加入1 mM CAT溶液、100 μL HTACNP（相当于1 mM CAT溶液）和等量的HTANP, 磁力搅拌37℃，300 r/min。使用便携式溶解氧计测定并记录在不同时间下，H₂O₂溶液中溶解氧的含量。

纳米粒的体外抗肿瘤作用研究

2.3.1 细胞培养、传代和细胞计数

2.3.1.1 细胞培养

MV3细胞常规培养于含1% 青霉素-链霉素溶液、10% FBS的高糖DMEM培养液中， 37℃，5% CO₂饱和湿度细胞培养箱中培养。

细胞传代

从培养箱中取出MV3细胞，倒置显微镜下观察MV3细胞的形态和生长密度，贴壁细胞生长至90%融合时，去除培养基，加入灭菌PBS 1 mL漂洗细胞2次，去除死细胞和残余培养基，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，3 min后迅速吸去胰酶，加入1 mL完全培养液终止消化。移液枪轻轻吹打培养皿底部，至所有细胞脱落，继续吹打使细胞分散，按1: 2比率，接种到新的培养皿中，加入适量的培养液，于37 ℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱培养。

细胞计数

细胞培养至饱和密度，常规漂洗、消化细胞，收集细胞悬液，1500 r离心3 min，弃上清，加入2 mL完全培养基，吹打混匀，移液枪吸取10 μL细胞悬液，加入10 μL台盼蓝染色，从计数板A面滴入，避免产生气泡，全自动细胞计数仪计数。

法检测 HTACNP 纳米粒对 MV3细胞的细胞毒性

（1）铺板：取处对数生长期的MV3 细胞，常规漂洗、消化并计数，配置成 5×10⁴/mL 的单细胞悬液，将细胞接种于 96 孔板，每孔 100 μL，外围孔加 PBS封边，37℃培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。

（2）加药：吸出旧的培养基，分别加入含不同浓度HTACNP （0、0.5、 1、 2、 4、 8、16µg/mL）的完全培养基，并设对照组，每组设5个复孔，37℃培养 24 h。

（3）每孔加入 MTT 溶液 10 μL，于 37℃培养箱中孵育 4 h。

（4）每孔加入Formazan溶解液100 μL，孵育4 h

（5）测定：用酶标仪测定 570 nm 波长处每孔的吸光度，记录实验结果。

倒置荧光显微镜、流式细胞计数检测MV3细胞对HTACNP纳米粒的摄入

2.3.3.1 倒置荧光显微镜检测MV3细胞对HTACNP纳米粒的摄入

（1）铺板：6孔板中预先加入灭菌24*24mm盖玻片，取生长状态良好的MV3 细胞常规漂洗、消化并计数，以 5×10⁴ 个/孔的细胞密度接种于 6 孔板，每孔2 mL，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。

（2）分组：（a） HTACNP; （b） TACNP; （c） TACNP+ free HA; （d） HTACNP+ anti-CD44, 每组3个复孔，c组用1 mg/mL HA，d组用 200 µg/mL anti-CD44封闭4 h，

（3）加药：按照分组分别加入含TACNP或HTACNP 纳米粒的完全培养基（16 µg/mL），每组设3个复孔，放入37℃培养箱中避光培养 4 h。

（4）固定：弃去培养基，PBS 洗涤三次，每孔加入 1mL 4%多聚甲醛覆盖细胞，37℃固定15 min，使用 PBS 振荡洗涤三次。

（5）染核：每孔加入 500ul DAPI 溶液覆盖细胞表面，室温避光静置3min，PBS避光洗涤三次。

（6）封片：取出盖玻片，每片加入20 μL防淬灭封片液封片，置于载玻片上，防止荧光淬灭。

（7）观察：使用倒置荧光显微镜进行观察拍照（激发波长:488 nm，发射波长:530nm）。

流式细胞仪检测MV3细胞对 HTACNP 纳米粒的摄入

（1）铺板：取生长状态良好的MV3 细胞常规漂洗、消化并计数，以 1×10⁵ 个/孔的细胞密度接种于 6 孔板，每孔2 mL，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。

（2）分组、预处理及加药同上。

（3）常规漂洗、消化，收集细胞悬液，1000 r 离心 5 min

（4）弃上清，加入适量PBS 洗涤细胞再次离心，重复三次。

（5）加入适量PBS悬浮细胞，使用流式细胞仪进行检测, 激发波长（Ex）: 488 nm，发射波长（Ex）: 530 nm。

激光扫描共聚焦显微镜检测MV3细胞对f-HTCNP纳米粒的摄入和线粒体共定位

（1）按前述方法制备香豆素-6标记的、不含ALA的纳米粒f-HTCNP。

（2）铺板：取MV3 细胞常规漂洗、消化并计数，以 1×10⁴ 个/孔的细胞密度接种于共聚焦显微镜专用细胞培养皿，每孔 1.5 mL，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。

（3）加药：次日弃去旧培养基，加入含2 µg/mL f-HTCNP纳米粒的完全培养基，每组设3个复孔，放入细胞培养箱中培养 4 h。弃去培养基，加入 PBS 洗涤三次，除去游离的纳米粒，加入新鲜培养基，培养4 h。

（4）染色：弃去培养基，加入 PBS 洗涤三次，加入含 Mito-Tracker Red CMXRos的DMEM培养基，37℃避光孵育20 min，或加入1mL含Lyso Tracker Red的（60 nM） DMEM培养基，37℃避光孵育60 min，弃去培养基，加入 PBS 振荡洗涤三次。

（5）观察：使用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照（ Mito-Tracker Red CMXRos染色液: Ex: 579 nm, Em: 599 nm；Lyso Tracker Red：Ex：579 nm，Em：599 nm；香豆素-6：Ex: 466 nm，Em: 504 nm ）。

纳米粒在MV3细胞内产氧能力检测

（1）细胞爬片：取MV3 细胞常规漂洗、消化并计数，以 1×10⁵个/孔的细胞密度接种于含盖玻片的6 孔板，每孔2mL，37℃培养箱过夜使细胞贴壁。

（2）预染：向细胞中加入含5 μM [Ru（dpp）₃]Cl₂的完全培养基预处理 4 h。

（3）加药：去除培养基，PBS振荡洗涤3次，分别加入含PBS, HTANP, HACNP和HTACNP纳米粒的完全培养基（16 μg/mL），每组设 3个复孔，放入37℃培养箱避光培养4 h。

（4）固定：弃去培养基，PBS 振荡洗涤三次，每孔加入 1 mL 4%多聚甲醛覆盖细胞，37 ℃固定15 min，使用 PBS 振荡洗涤三次。

（5）染核：每孔加入 500 μL DAPI 溶液覆盖细胞表面，室温避光静置3 min，PBS避光振荡洗涤三次。

（7）观察：使用倒置荧光显微镜进行观察拍照，并使用 Image J 软件对[Ru（dpp）₃]Cl₂的荧光强度进行定量分析。

流式细胞计数检测MV3细胞内ROS产生量

（1）铺板：取生长状态良好的 MV3 细胞，常规漂洗、消化并计数，以 1×10⁵个/孔的细胞密度接种于 6 孔板，每孔2 mL，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。

（2）加药：去除培养基，PBS振荡洗涤3次，分别加入含PBS,ALA, HTANP, HACNP和HTACNP 纳米粒的完全培养基（16 μg/mL），每组设 3个复孔，放入37℃培养箱避光培养4h。

（3）照光：去除孔内培养基，每孔PBS洗涤3次，去除游离药物及死细胞。照射组每孔加入1 mL 无酚红培养基，光动力治疗仪635 nm激光照射30 min （8 mW；光斑覆盖孔板）；

（4）加入10 μM DCFH-DA染料，轻轻混匀，37 ℃避光孵育30 min。

（5）PBS轻柔漂洗细胞1次，收集上清，用不含EDTA的胰酶消化细胞2 min, 随后加入等量培养基终止消化，收集细胞悬液，1000 r，离心3 min，弃去上清，每管加入1 mL PBS悬浮细胞，再次离心，弃上清后，每管加入500 μL Binding buffer 悬浮细胞。

研究HTACNP 纳米粒在体内介导的PDT 作用

2.3.7.1 TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling （TUNEL）检测细胞凋亡

封闭液配制：3% H₂O₂+甲醇（v: v= 1:9）;

通透液配制：0.1% Triton+0.1 %枸橼酸钠（v: v= 1:1000）;

TUNEL染色液配制：50 μL vital①+450 μL vital②。

（1）铺板：6孔板中预先加入灭菌24*24mm盖玻片，取生长状态良好的 MV3 细胞，常规漂洗、消化并计数，以 1.5×10⁵个/孔的细胞密度接种于 6 孔板，每孔2 mL，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。

（2）分组：a：Ctr; b: HTACNP; c: ALA+ Laser; d: HTANP+ Laser; e:HACNP+Laser; f: HTACNP+ Laser。

（3）加药：按预定分组分别加入等量含相应药物的完全培养基，每组设 3个复孔，37℃孵育4 h。

（4）照光：去除孔内培养基，每孔PBS洗涤3次，去除游离药物及死细胞。每孔加入1mL 无酚红培养基，光动力治疗仪635 nm激光照射30 min （8 mW；光斑覆盖所有孔板），37℃继续避光孵育24 h；

（5）弃去孔内液体，每孔加入1mL 4%多聚甲醛，37 ℃固定1 h。PBS振荡洗涤3次，每次1 min。

（6）每孔加入封闭液1 mL，室温封闭5 min。PBS振荡洗涤3次。

（7）每孔加入通透液1 mL，室温通透10 min。PBS振荡洗涤3次。

（8）每孔滴加TUNEL染色液50 μL，置于湿盒中，37℃孵育1 h。PBS避光洗涤3次。

（9）染核：每孔加入 500 μL DAPI 溶液覆盖细胞表面，室温避光静置3 min，PBS避光洗涤3次。

（10）封片：取出盖玻片，每片加入20 μL防淬灭封片液封片，置于载玻片上，防止荧光淬灭。

（11）镜检拍照：切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

流式细胞术检测细胞凋亡

（1）铺板：取生长状态良好的 MV3 细胞，常规漂洗、消化并计数，以 1×10⁵ 个/孔的细胞密度接种于 6 孔板，每孔2ml，37℃培养箱培养过夜使细胞贴壁。

（2）分组、加药、照光步骤同上。

（3）收集孔内液体，PBS轻柔漂洗细胞1次，收集上清，用不含EDTA的胰酶消化细胞2 min, 随后加入等量培养基终止消化，收集细胞悬液，1000 r，离心3min，弃去上清，每管加入1 mL PBS悬浮细胞，再次离心，弃上清后，每管加入500 μL Binding buffer 悬浮细胞，5 μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Iodide （PI）染料，涡旋混匀，静置5 min，30min内上机检测。

检测HTACNP介导的增强PDT对MV3细胞的细胞毒性

（2）分组、加药、照光步骤同上，每组设5个复孔。

（3）每孔加入 MTT 溶液 10 μL，于 37℃培养箱中孵育 4 h。

（4）每孔加入Formazan溶解液100 μL，孵育4 h

纳米粒的体内抗肿瘤作用研究

实验中所用动物均按照《实验动物护理原则》和《实验动物护理和使用指南》护理和使用实验动物。所有动物实验均按照徐州医科大学实验动物伦理委员会批准的方案进行。

建立MV3荷瘤鼠模型

将处于对数生长期的MV3 细胞，常规消化、离心后收集， PBS 漂洗 3 次，加入适量PBS稀释，调整细胞浓度为5×10⁷/mL，取 100 µL 皮下接种于 4-6周大小的BALB /c裸鼠右后肢，于徐州医科大学实验动物屏障系统饲养2周，MV3荷瘤裸鼠模型建立。

免疫荧光检测HTACNP纳米粒在体内改善乏氧能力

(1)分组：待肿瘤长至 200~250 cm³ 后将小鼠随机分成 4 组，分别为Ctr、HTANP、HACNP和 HTACNP组,每组3只。

(2)给药：按照分组分别注射 200 μL 生理盐水、HTANP、HACNP或HTACNP （1mg/mL）。

(3)取材和固定：注射药物24 h后处死小鼠，剥离肿瘤组织，浸泡于10%甲醛固定液中固定 48 h。

(4)洗涤、脱水：将固定后的组织用流水冲洗，去除残留的固定液和杂质。50%、70%、85%、95%、无水乙醇，每级2 h，逐级脱水。

(5)透明：将组织块置入污水乙醇和二甲苯的等体积混合液中2 h，随后置入二甲苯两小时，重复两次。

(6)浸蜡、包埋：将组织块放在熔化的石蜡和二甲苯的等体积混合液浸泡1 h，先后移入2个熔化的石蜡液中，每个浸泡3 h，用预温的镊子夹取已浸蜡的组织块放入熔蜡盒中，冷却凝固成块。

(7)切片：蜡块在-20度冰箱冷冻30 min，固定蜡块于切片机上，调整切片机上的切片厚度为5 μm，然后切片。

(8)烤片、脱蜡：将玻片置于65 ℃恒温烘箱中烘烤30 min；于二甲苯I中浸泡15min，二甲苯II 中浸泡15 min脱蜡。

(9)抗原修复：将玻片置于0.01M柠檬酸钠缓冲溶液中高压修复15 min，自然冷却后，0.02 M PBS洗3 min× 3次。

(10)一抗孵育：滴加HIF-1α抗体（稀释比例1: 50），湿盒孵育， 4℃孵育过夜。0.02M PBS冲洗3 min×3次。

(11)二抗孵育：滴加适当比例稀释的荧光二抗，湿盒孵育，室温下放置1 h。0.02 MPBS冲洗3min×3次。

(12)封片、拍照、图片分析：防淬灭封片剂与DAPI 1: 500稀释封片，-20℃冰箱保存，倒置荧光显微镜拍片，Image J软件分析荧光强度。

研究HTACNP纳米粒在体内介导的PDT 作用

（1）实验分组：（I） Ctrl; （II） HTANP+ Laser; （III） HACNP+ Laser; （IV）HTACNP+ Laser。待肿瘤长至约100 mm³ 后将裸鼠随机分成 4组，每组 5只。

（2）给药：分别于第0天，第2天，第4天经尾静脉注射 200 μL 生理盐水，HTANP，HACNP或HTACNP溶液（1mg/mL），注射药物4 h后，应用光动力治疗仪按照分组对肿瘤部位进行照射处理，100 mW/cm²，30 min。

（3）测量并记录小鼠体重和肿瘤体积：每两日称量小鼠体重和测量肿瘤体积，自初次给药日起连续观测 16 天。体积V（mm³） =（d²×D） / 2。（d : 肿瘤短径; D:肿瘤长径，单位：mm）。治疗期间，如荷瘤小鼠肿瘤体积大于2000 mm³或出现严重并发症，则按照动物伦理委员会要求予以安乐死。

（4）血生化检测：治疗及观测结束后，经小鼠眼球取血，立即置于生化管中，4000 r,离心 5 min。样品送徐州医科大学附属医院检验科进行血生化检测，检测指标：谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、尿酸（UA）。

组织病理学检测

（1）取材和固定：眼球取血结束后处死小鼠，解剖取出主要脏器（脑、心、肺、肝、脾、肾）及肿瘤组织，浸泡于 10%的甲醛固定液中固定 48 h。

（2）石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡步骤同上。

（3）水化：将脱蜡后的切片经100 %酒精、95 %酒精、85 %酒精、75 %酒精各浸泡5min，自来水冲洗10 min。

（4）苏木素染色：将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5min，氨水中分色数秒。流水冲洗15min，入70％和90％酒精中脱水各10min。

（5）伊红染色：入酒精伊红染色液染色2min，染色后的切片经无水乙醇脱水。

（6）透明和封片：将玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性树胶封片，放入65℃烘箱15 min。

（7）拍照：正置显微镜观察拍照。

染色检测肿瘤组织凋亡

（1）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15min, 二甲苯Ⅱ 15 min, 无水乙醇Ⅰ 5 min, 无水乙醇Ⅱ 5min, 85%酒精5 min, 75%酒精5 min, 蒸馏水洗。

（2）修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃ 温箱孵育25 min。将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。

（3）破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20 min，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

（4）滴加适量TUNEL染色液至圈内覆盖组织，切片平置于湿盒内，37℃恒温箱孵育2h。

（5）DAPI复染细胞核：切片用PBS洗涤3次，每次5min。随后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

（6）封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

（7）镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

三、结果

1 HTACNP纳米粒的制备

如图1所示，我们采用W/O/W改良双乳化法成功制备具有核-壳-壳结构的纳米粒HTACNP。5-ALA和CAT作为水相分布于纳米粒内部，TPP和PLGA作为油相构成纳米粒内壳，最外层则包被有HA作为外壳。

纳米粒的鉴定和表征

2.1 TEM观察HTACNP的形貌特征

使用TEM观察了HTACNP纳米粒的形态和大小，如图2A-B所示，合成的HTACNP纳米粒呈明显的核-壳-壳球形结构，分散性良好，大小较均匀。

的水合粒径，Zeta电位及稳定性

DLS结果显示HTACNP纳米粒的平均水合粒径为211.27 nm，PDI为0.023，较窄的粒径分布及较小的PDI表明合成的纳米粒的粒径分布较为均一，单分散性好（图3A），平均Zeta电位为-18.4 mV （图3B）。

我们将等量的 HTACNP加入至 H₂O₂、PBS、DMEM和DMEM+10% FBS溶液中来模拟纳米粒在不同生理环境中的状态从而评估纳米粒在生理环境中的稳定性。结果显示，HTACNP在H₂O₂、PBS、DMEM中的水合粒径相近（~220 nm），在DMEM+10% FBS中HTACNP的水合粒径较小（~200 nm），在18d内，HTACNP在各溶液中的水合粒径保持基本稳定，组内差异无统计学意义（P>0.05）。这些结果表明我们合成的 HTACNP纳米粒在水溶液和多种生理溶液中，能够在较长时间内保持结构稳定。

的药物含量测定

2.3.1 ALA-乙酰丙酮荧光衍生法测定ALA包封率

采用ALA-乙酰丙酮荧光衍生法测定ALA的含量。如图4A所示，ALA标准曲线：A₁=13.55C₁+15.071，R²=0.9991，ALA在0~ 21 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。根据标曲方程计算上清中游离药物含量，按照包封率计算公式EE₁=（投药量₁-游离ALA质量）/投药量₁*100%，得到ALA包封率为28.4%。

蛋白浓度法测定CAT含量

采用BCA蛋白浓度法测定CAT的含量。如图4B所示，CAT标准曲线: A₂=0.817C₂+0.1364, R²=0.9991, CAT在0.0~0.5 mg/mL浓度范围内线性关系良好。根据标曲方程计算上清中游离药物含量，按照包封率计算公式EE₂=（投药量₂-游离CAT质量）/投药量₂*100%，得到CAT包封率为16.4%。

测定TPP含量：

如图4C所示，TPP标准曲线: A₃=0.0014C₃-0.0379, R²=0.9999，TPP在0.0~10.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。根据标曲方程测得HTACNP纳米粒中TPP含量为41.20 μg/mL。

试剂盒测定HA含量

采用酶联免疫吸附法测定HA的含量。图4D结果显示，HA标准曲线：A₄=2.5854+2.4763/（1+（C₄/1.8530） ^1.0125）, R²=0.9999, HA在0~50 ng /mL浓度范围内相关度良好。根据标曲方程测得HTACNP纳米粒中HA含量为59.19 μg/mL。

催化H₂O₂产氧能力检测

H₂O₂分解产生的氧气能够溶解于水溶液中，因此可以通过检测水溶液中溶解氧含量的变化的生成来判断HTACNP 纳米粒的产氧能力。如图5所示，PBS或HTANPs组未见溶解氧水平的明显变化，说明HTANPs不能催化H₂O₂并产生氧气。HACNPs组和HTACNPs组溶解氧浓度较PBS或HTANPs组明显升高，表明HACNP与HTACNP均能快速、大量生成O₂，差异有统计学意义（p<0.01）。结果表明，CAT被成功地包裹在HTACNPs纳米颗粒中，且具有良好的酶催化活性。

体外实验测定HTACNP对人黑素瘤细胞MV3的杀伤作用

3.1 MTT法检测 HTACNP对MV3细胞的细胞毒性

纳米材料的生物安全性是开发过程中需要考虑的重要问题之一。我们应用MTT细胞毒性检测试剂盒检测了避光条件下HTACNP对MV3细胞的细胞毒性。如图6所示，在0~32μg/mL浓度范围内，HTACNPs处理24 h后，MV3细胞存活率仍在95%以上，表明我们构建的HTACNP对MV3细胞没有明显的细胞毒性，具有良好的生物安全性。

细胞对HTACNP的靶向摄入作用研究

5-ALA在细胞内生成的PphIX在适当激发光源照射下可以发出明亮的绿色荧光，因此我们使用倒置荧光显微镜和流式细胞计数来研究MV3细胞对HTACNP的靶向摄入作用。如图7A-B所示，HTACNP处理MV3细胞4 h后，细胞内可以见到明显的绿色荧光且荧光强度明显高于TACNPs组和TACNPs + free HA组。然而，当我们用CD44抗体提前封闭MV3细胞上的CD44受体后，纳米粒表面的HA无法与MV3细胞表面的CD44受体结合，细胞内绿色荧光强度明显降低，差异有统计学意义，流式细胞计数的结果进一步证实了这一点（图7A-D）。这表明，具有HA涂层的HTACNP有良好的特异性靶向能力，能够与MV3细胞表面的CD44受体特异性结合，促使细胞摄入大量HTACNP，显著提高5-ALA的转运效率。

细胞对HTACNP 纳米粒的摄入和线粒体共定位研究

由于PphIX的发射波长范围较宽（Ex=407nm, Em=635nm）易对CLSM检测的结果产生干扰，因此将一种绿色荧光染料香豆素-6 （Ex=466 nm, Em=504 nm）包埋在纳米颗粒中合成f-HTCNPs，来模拟HTACNPs在细胞中的定位，以避免PphIX荧光对纳米粒细胞内定位检测的干扰。MV3细胞与f-HTCNPs孵育4小时后，用Mito-Tracker Red CMXRos染料标记线粒体，用Lyso -Tracker Red染料标记溶酶体。CLSM图片显示，f-HTCNPs （绿色）与Mito-Tracker Red CMXRos（红色）区域高度重叠，呈现出明亮的黄色荧光，表明大多数f-HTCNPs与MV3细胞内线粒体共定位（图8B）。而仅有少部分f-HTCNPs（绿色）与Lyso Tracker Red（红色）区域重叠，表明仅有少量纳米粒进入溶酶体（图8A）。这一结果表明，f-HTCNPs可以通过CD44介导的内吞作用进入细胞质，随后在TPP的引导下主要进入细胞内线粒体。

此外，我们利用透射电镜观察了细胞摄取HTACNP 4小时后线粒体的形态结构。如图8C所示，在HTACNP组中，在线粒体内部可以观察到粒径100 nm左右的纳米粒，这证实了HTACNP可以特异性定位于MV3细胞的线粒体内。值得注意的是，Ctrl组线粒体大小正常，形态结构完整。但HTACNP组的线粒体体积明显增大，形态结构发生改变，我们推测这与HTACNP与H₂O₂在线粒体内反应产生大量O₂有关。

纳米粒在MV3细胞内产氧能力检测

[Ru（dpp）3]Cl2 是一种溶解氧检测指示剂，其荧光可被氧分子猝灭，导致荧光强度降低。如图9A-B示，Ctrl组和HTANP组内细胞均呈现明显的红色荧光，而HACNP组和HTACNP组的荧光强度较低，说明HACNP可以催化H₂O₂在细胞内产生氧气。值得注意的是，HTACNP组的荧光强度低于HACNP组，差异有统计学意义（P<0.01）。这是由于HTACNP能够进入细胞内产生H₂O₂的主要部位线粒体，从而产生更多的氧气，导致[Ru（dpp）3]Cl2的荧光明显淬灭。

纳米粒介导的PDT 产生ROS能力检测

HTACNP催化H₂O₂产生的大量氧气，为ROS的生成提供了足够的底物。我们以DCFH-DA作为ROS的检测探针，采用流式细胞计数来研究HTACNP 纳米粒介导的PDT 产生ROS的能力。如图10A-B所示，与ALA+ Laser相比，HTANP+ Laser组、HACNP+ Laser组和HTACNP+ Laser组的细胞内DCFH-DA荧光强度较高，其中HTACNP+ Laser组的荧光强度最高，这是由于5-ALA、CAT和TPP三者发挥了协同作用，使得HTACNP介导的PDT能够产生的ROS量最高。

纳米粒介导的PDT 促MV3细胞凋亡作用检测

我们分别采用流式细胞计数和TUNEL染色法研究了HTACNP介导的PDT作用。流式细胞计数的结果如图11A-B所示，Ctrl和HTACNP组未发现明显的MV3细胞凋亡；经过635nm光照射后，ALA+ Laser组、HTANP+ Laser组、HACNPs+ Laser组和HTACNPs+ Laser组的细胞凋亡率分别为19.79%、26.12%、39.51%和96.60%。TUNEL染色的结果显示了相似的趋势，ALA+Laser组、HTANP+ Laser组、HACNP+ Laser组、HTACNPs+ Laser组阳性面积分别为21.0%、35.18%、42.73%、95.64%，Ctrl组和HTACNP组未发现明显的细胞凋亡，阳性面积极低，低于2%（图11C-D）。

纳米粒介导的PDT对MV3细胞的抗肿瘤作用检测

我们采用MTT法来评估HTACNP介导的PDT的抗肿瘤作用。如图11所示，Ctrl组和HTACNP组无明显的细胞死亡，细胞存活率在95%以上，说明我们合成的HTACNP具有良好的生物安全性。ALA+ Laser组、HTANP+ Laser组、HACNP+ Laser组、HTACNP+ Laser组的细胞存活率分别为78.91±2.55%、63.42±1.12%、41.64±2.21%、6.05±1.85%。其中HTACNP+ Laser组的细胞存活率最低，这是由于我们构建的HTACNPs可以有效缓解肿瘤微环境乏氧，更高效地传递5-ALA，同时增强ROS的杀伤效果，从而使PDT得以发挥出强大的抗肿瘤作用。

体内实验测定纳米粒对MV3荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

4.1 HTACNP 纳米粒改善荷瘤小鼠肿瘤微环境乏氧能力检测

HIF-1α的含量受到肿瘤组织中氧浓度的调节，通过检测肿瘤组织中 HIF-1α 的水平可以反应肿瘤微环境的缺氧情况，免疫荧光染色结果显示：Ctrl组和HTANP组的HIF-1α的表达水平较高，定量分析IOD值分别为0.82和0.78，二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。而HACNP组IOD值为0.69，HTACNP组IOD值为0.62，同Ctrl组和HTANP组相比，HIF-1α表达降低，特别是HTACNPs组最低（图13）。这些结果表明HTACNP可以有效进入肿瘤组织，并进一步进入肿瘤细胞线粒体，催化线粒体内充沛的H₂O₂产生足够的氧气以改善肿瘤微环境缺氧，这与我们的体外实验得到结果一致。

纳米粒介导的PDT体内抗肿瘤作用研究

首先，我们通过比较不同组荷瘤小鼠肿瘤的体积和重量来评估 PDT 疗效。肿瘤体积曲线显示，Ctrl组肿瘤体积随着时间延长快速增加，HTANP+ Laser和HACNP+ Laser组经相应处理后，肿瘤生长速度较Ctrl组有所减慢，但仍持续生长。而HTACNP+ Laser组肿瘤生长完全被抑制，在第16天时，肿瘤几乎消失，显示出HTACNP-PDT强效的抗肿瘤作用（图14C）。观测周期结束后，对各组小鼠的肿瘤进行剥离并称重，结果显示各组肿瘤之间存在差异，同肿瘤生长曲线结果一致（图14A-B）。

随后，我们采用TUNEL法和H&E染色进一步评估HTACNP介导的PDT在体内诱导细胞凋亡和/或坏死的能力。如图14D-E所示，Ctrl组的肿瘤组织TUNEL染色呈阴性; HTANP+Laser组和HACNP+ Laser组阳性面积较Ctrl组有所增大，但仍有大量肿瘤细胞残留，残留的大量肿瘤细胞能够继续生长发育，从而导致疗效不佳，肿瘤复发。HTACNP+ Laser组阳性面积较其余三组明显增大，差异有统计学意义（P>0.001）。这一结果证实了HTACNP介导PDT能够在体内诱导大量肿瘤细胞凋亡和/或坏死的突出能力。此外，肿瘤组织的H&E染色结果也显示了同样的结论（图14F）。这些结果证实了HTACNP可以特异性靶向肿瘤细胞以提高5-ALA的转运效率，并进一步进入肿瘤细胞线粒体，缓解TME缺氧，增强激光照射后ROS的损伤效果，从而增强PDT的抗肿瘤作用。

纳米粒介导的PDT的生物安全性评价

HTACNP纳米粒介导的PDT疗法的生物安全性是其能否进行临床转化的一个重要问题。对治疗及观测期间小鼠体重变化以及治疗结束后血生化水平和主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织病理学进行研究。实验结果显示，治疗过程中所有治疗组中小鼠的体重未出现明显下降。同Ctrl组相比，在 HTACNP+ Laser 治疗 16 天后，小鼠心、肝、脾、肺、肾的病理切片中没有显示出明显的病理学变化（图15）。这些结果表明 HTACNP-PDT疗法无明显的系统毒性，具有良好的生物安全性和潜在的临床转化价值。

四、讨论

本研究设计了一种分级靶向载药纳米粒（HTACNP），采用PLGA作为载体，负载5-ALA和CAT，修饰以线粒体靶向基团TPP 并在最外层包裹HA，从而增强PDT的抗肿瘤作用。为了证明HTACNP在特异性靶向肿瘤细胞、缓解TME缺氧和增强PDT抗肿瘤作用方面的重要作用，我们合成了不含HA的纳米颗粒（TACNP）、不含CAT的纳米颗粒（HTANP）和不含TPP的纳米颗（HACNP）在相应实验中作为对比。

具有HA涂层的HTACNP纳米粒具有良好的特异性靶向能力，如图7A-D所示，细胞荧光和流式细胞计数证实HTACNP能够与MV3细胞表面的CD44受体特异性结合，促使细胞摄入大量HTACNP纳米粒，显著提高5-ALA的转运效率。此外，HTACNP组的明亮荧光表明，纳米颗粒中的5-ALA可以成功转化为强效光敏剂PphIX。

在HA涂层被TME中的HAase分解后，纳米粒表面暴露出来的TPP能够引导纳米粒进一步靶向MV3细胞中的线粒体（图8A-C）。MV3细胞线粒体内充沛的H₂O₂能够与HTACNP负载的CAT反应，产生大量O₂。在H₂O₂溶液中，HTACNP和HACNP组溶解氧含量明显高于HTANP和Ctrl组，且组内无明显差异。值得注意的是，当细胞与HTACNP孵育时，O₂的产量明显高于HACNP组（图9A-B），这是由于线粒体中H₂O₂的含量远高于细胞质中H₂O₂的含量。肿瘤微环境的乏氧可以提高缺氧调节因子HIF-1α的表达。近期的研究显示HIF-1α表达水平的上调与肿瘤的生长、转移和难治性密切相关。如图13A-B所示，荷瘤小鼠尾静脉注射HACNP或HTACNP 24 h后，其肿瘤组织HIF-1α的表达水平明显降低，其中HTACNP组的HIF-1α表达水平最低，表明HTACNP显著改善了肿瘤微环境的乏氧。

在635nm激光照射30分钟后，HTACNP介导的PDT与其他三组相比，能够产生更多的ROS（图10A-B），且由于线粒体对ROS具有高度的敏感性，HTACNP-PDT所致的细胞凋亡和/或坏死数量远高于HTANP+ Laser组和HACNP+ Laser组（图11A-D，图12）。在动物实验中，HTACNP-PDT也表现出了强大的抗肿瘤作用（图14A-F）。此外，体内和体外实验均表明，我们合成的HTACNP具有良好的生物安全性（图15）。这些证据表明应用 HCINP 介导的 PDT 治疗是一种安全有效的抗肿瘤策略。

Claims

1.一种介导光疗的分级靶向纳米粒，其特征在于，该靶向纳米粒呈核-壳-壳的球形结构，采用W/O/W双乳化法制备而成，5-ALA和CAT作为水相分布于纳米粒内部，TPP和PLGA作为油相构成纳米粒内壳，最外层包被有HA作为外壳，其中HA为透明质酸，PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，TPP为三苯基膦，ALA为5-氨基乙酰丙酸，CAT为过氧化氢酶。

2.一种根据权利要求1所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）称取ALA、CAT溶于0.7-2.0%聚乙烯醇溶液中，得到内水相；

（2）称取PLGA溶于有机溶剂中，得到油相；

3.根据权利要求2所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的ALA、CAT、TPP、PLGA、HA的用量分别为：

ALA 1.8-2.5重量份；

CAT 0.8-1.2重量份；

TPP 0.3-0.5重量份；

PLGA 13-20重量份；

HA 0.8-1.3重量份。

4.根据权利要求3所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的ALA、CAT、TPP、PLGA、HA的用量分别为：

ALA 1.9-2.1重量份；

CAT 0.9-1.1重量份；

TPP 0.3-0.4重量份；

PLGA 14-16重量份；

HA 0.9-1.1重量份。

5.根据权利要求4所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的ALA、CAT、TPP、PLGA、HA的用量分别为：

ALA 2重量份；

CAT 1重量份；

TPP 0.38重量份；

PLGA 15重量份；

HA 1重量份。

6.根据权利要求2所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的PLGA为PLGA 50:50。

7.根据权利要求2所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的有机溶剂选自如下的一种：二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮。

8.根据权利要求2所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的超声波参数为：160-200W超声1.5-2.5 min。

9.根据权利要求2所述介导光疗的分级靶向纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的超声波参数为：160-200W超声3-5 min。

10.权利要求1所述的分级靶向纳米粒在制备治疗黑素瘤的药物中的应用。