CN104258391B - 一种多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子化学与生物医学工程领域，具体公开了一种多功能刺激敏感型聚合物‑纳米金笼载体及其制备方法，所述多功能载体是由聚合物胶束形成的核、纳米金笼形成的壳和甲氧基聚乙二醇‑支化聚乙烯亚胺‑硫辛酸形成的冠组成的核‑壳‑冠结构；该纳米载体在808 nm具有有良好的光热转换效果。该载体对细胞的毒性小，该载体不仅可以负载药物，还可以负载基因或核酸，从而实现载体定位、化疗、热疗与基因治疗的一体化，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于高分子化学与生物医学工程领域，更具体地，涉及一种多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体及其制备方法。
背景技术
随着生活条件的改善和社会环境的不断变化，威胁人类的疾病更为多样，其中肿瘤也越来越受到人们的关注，肿瘤的早期诊断和有效治疗是提高肿瘤患者生存率的关键措施。目前抗肿瘤药物仍然是临床上治疗肿瘤的主要方法，但抗肿瘤药物的应用同时有很多缺陷：多数具有很大的毒性，缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，会杀伤大量的正常细胞。
为了提高早期癌症检测和诊断的准确性，人们致力于研究开发识别和治疗癌症组织的技术，其中靶向药物载体的研究较为突出。虽然近年来靶向药物载体研究取得了重大的进展，但各种治疗方法都存在不同的缺陷，目前还没能找到一种对人体安全性高，治疗效率高的治疗方法。随着纳米科学的迅速发展，传统的肿瘤治疗以及诊断模式正在和纳米技术揉合在一起，出现了一些新颖的诊断和治疗方法。聚合物纳米载体被认为在解决基因和化学治疗的困难中起到了重要的作用而成为研究热点。从肿瘤的诊断以及治疗出发，设计出不同的纳米传输载体，可分别应用于显像、药物治疗和基因治疗，
基于聚合物胶束的药物释放系统是一类新型的纳米载体，它同时具有亲水性和疏水性基团，在水中形成胶束，并对药物进行増溶和包裹。对胶束疏水性内核的筛选有利于携带不同性质的药物；而对其亲水性外壳的设计和优化则能使载药胶束体系逃避单核巨噬细胞的吞噬；纳米金主要是指利用化学和物理技术合成的直径在1～200nm之间的金纳米颗粒，现有金纳米壳状结构、金纳米棒和金纳米笼；纳米金被不同的化学基团修饰后，具有毒性小且对肿瘤细胞具有靶向性的特点。金纳米颗粒能够在特殊波长（近红外波段，800～1200nm）对光进行吸收和散射，这种特殊的局域表面等离子体共振（LSPR）显像可以增强某些特定组织的光信号特征。
纳米金的形貌与各向异性直接影响其在近红外吸收情况，通过调节等离子共振纳米金笼内外径之比，可实现吸收可见光至近红外光区，从而实现最大的“吸收窗口”，在此段波长区组织器官透明性最强。从而在成像（基于X-射线成像、荧光成像、表面增强拉曼光谱成像、光声成像、光学成像等），肿瘤诊断与治疗（药物输送、核酸传送、光热治疗、放射治疗等）方面有着广泛的应用。
光-热转换剂纳米金笼可以吸收特定的近红外光，并向为肿瘤提供养分的血管移动，光-热转换的同时温度升高，外表面所修饰的纳米金笼一方面发生变形、甚至破裂，另一方面表面不够致密，在肿瘤酸性环境中，由于胶束本身具有酸性环境响应性，药物可以通过酸敏性环境释放出来，然后再经过外层的纳米金笼的本身“缝隙”或“变形破裂”将药物输送到肿瘤细胞，实现对肿瘤组织的靶向治疗；而加热对周围的正常的健康组织器官影响很小；温度越高或作用时间越长肿瘤的疗效呈指数性增加，热疗既可以诱发细胞凋亡，又可以杀死细胞。
化疗与热疗的联合治疗可以提高肿瘤组织的治疗效果，增强抗肿瘤效应；同时可降低化疗药物对未加热的正常组织器官的毒性作用；两者联用还有助于防止和推迟耐药性的产生，化学方法（化疗）与物理方法（热疗）优势互补，可以起到协同的肿瘤治疗效果，同时也为肿瘤的治疗提供了较为崭新的思路与方法，也为肿瘤的临床治疗提供了科学的理论基础。目前现有技术中缺乏能同时实现化疗、热疗和精确定位的多功能金纳米载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有肿瘤诊断和治疗所用的靶向药物载体的研究缺陷，提供一种多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体。
本发明的第二个目的是提供上述多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现：
提供一种多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，是由PAsp(MEA)-PAsp(DIP)聚合物自组装得到的胶束形成的核、纳米金笼形成的壳和甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸形成的冠组成的核-壳-冠结构。所述多功能纳米载体粒径大约为100 nm。
优选地，所述PAsp(MEA)-PAsp(DIP)聚合物为双亲的两嵌段聚合物，该聚合物以聚天冬氨酸为主链，一端亲水、另一端疏水。其在一定条件下自组装形成胶束，所述自组装形成胶束的过程为：取双亲的、两嵌段的聚合物PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 50 mg以DMSO进行溶解，然后在50mL的PBS=8.0左右的溶液里面分散，在超声波的作用下自主装为胶束 ，透析，然后经过450 nm的滤膜过滤胶束溶液，以分子量10万的超滤管超滤除去杂质。
优选地，所述PAsp(MEA)-PAsp(DIP)聚合物的制备方法包括以下步骤：
（1）天冬氨酸苄酯的合成，（2）苄氧羰基天冬氨酸酸酐（BLA-NCA）的合成，（3）BA-PBLA的合成（4）BA-PBLA-COOH的合成，（5）BA-PAsp(DIP)-COOH的合成，（6）PAsp(DIP)- PBLA的合成，（7）合成PAsp(MEA)-PAsp(DIP)。
更优选地，上述步骤包括以下步骤：
S1. 以天冬氨酸为原料，无水乙醚为溶剂，加入苯甲醇，以浓硫酸为催化剂，加入吡啶以95%乙醇沉淀获得天冬氨酸苄酯；
S2. 以天冬氨酸苄酯为原料经一系列反应获得BA-PBLA-COOH；
S3. 以 BA-PBLA-COOH为原料，加入N,N-二异丙基乙二胺反应获得BA-PAsp(DIP)-COOH；同时以BA-PBLA-COOH为原料，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺反应获得PAsp(DIP)- PBLA；
S4. 以PAsp(DIP)- PBLA为原料，加入巯基乙二胺，在反应温度为35℃和N2保护下反应，并以甲醇透析得到。
优选地，所述冠的制备方法包括以下步骤：
S1. 以单甲醚聚乙二醇（mPEG）为原料，与N,N-羰基二咪唑(CDI)在氩气保护下室温反应，得到单甲醚聚乙二醇-羰咪唑(mPEG-CDI)；
S2. 分枝状聚乙烯亚胺（bPEI）与mPEG-CDI室温下反应，经透析、减压、沉淀后得到甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺（mPEG-bPEI）；
S3. 依次加入硫辛酸（LA）、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解后，加入S2所述mPEG-bPEI室温下反应后沉淀即得。
优选地，所述冠由甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸(mPEG-bPEI-LA)组成，能够负载基因。所述基因可以是报告基因，例如Luciferase报告基因，该报告基因表达荧光蛋白成像，可以用来定位载体；所述负载基因也可以是用于进行基因治疗的基因。
更优选地，所述聚合物胶束对pH敏感；在pH=8.0左右，其pH敏感的侧链呈现疏水状态，可以负载抗肿瘤的药物，例如阿霉素（DOX），而在pH=5.0还原性的肿瘤微环境中，该胶束解体，抗肿瘤的药物DOX释放出来，杀死肿瘤细胞；当所述胶束负载药物时，该药物的包裹量占胶束质量的5%。
有研究发现，现有金纳米（等同于纳米金）有金纳米壳状结构、金纳米棒和金纳米笼。纳米金的形貌与各向异性直接影响其在近红外吸收情况，因此对金纳米进行调控就会引起LSPR波长的红移，发明人也发现，通过对金纳米形成金纳米笼的制备过程的精确控制以及对金纳米笼的内外孔径的控制可以得到性能差异显著的纳米金笼载体。即上述纳米载体通过调节纳米金笼内外径之比获得。上述纳米金笼在激光器照射下具有良好的光热转换作用，对肿瘤细胞有热疗的效果，可以实现联合治疗肿瘤的目的。
所述纳米金笼的内外径之比由氯金酸与还原剂的用量比控制；当所述氯金酸与还原剂的质量比为1：3，所得纳米金笼的内外径之比为5：7。所述还原剂优选为羟胺。
提供上述多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体的制备方法，包括以下步骤：
S1. 以PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 聚合物自组装形成胶束；
S2. 加入纳米金和还原剂，反应形成纳米金笼；
S3. 加入甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸，形成载体；所述甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸与S2所述纳米金笼形成共价键。
作为一种优选方式，上述制备方法包括以下步骤：
首先合成聚合物，需要经过（1）天冬氨酸苄酯的合成，（2）苄氧羰基天冬氨酸酸酐（BLA-NCA）的合成，（3）BA-PBLA的合成（4）BA-PBLA-COOH的合成，（5）BA-PAsp(DIP)-COOH的合成，（6）PAsp(DIP)- PBLA，（7）PAsp(MEA)-PAsp(DIP)等步骤。
接着，取双亲的、两嵌段的聚合物PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 50 mg以DMSO进行溶解，然后在50mL的PBS=8.0左右的溶液里面分散，在超声波的作用下自主装为胶束 ，透析，然后经过450 nm的滤膜过滤胶束溶液，以分子量10万的超滤管，超滤除去杂质。
采用种子与原位两种的相互结合的方法，第一步，纳米金种子与胶束相互作用，形成薄薄的一层纳米金“环”，然后，加入还原剂，进一步以原位生长金的方法，形成纳米金笼；该纳米金笼的内外径比由氯金酸与还原剂的用量比控制；接着，加入可以负载基因的，带有bPEI的修饰纳米金笼的聚合物，一方面可提高整个载体的稳定性，另外一方面，又可以赋予其纳米载体定位的作用。
提供上述多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体在肿瘤靶向治疗中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供一种多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，所述载体以pH敏感的胶束为核，以纳米金笼为壳，以甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸为冠，所述纳米金笼形成的纳米载体在808 nm具有良好的光热转换效果。该载体对细胞的毒性小，该载体不仅可以负载药物，还可以负载基因或核酸，从而实现载体定位、化疗、热疗与基因治疗的一体化，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为聚合物PAsp(DIP)-PAsp(MEA)的核磁谱图；
图2为胶束PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的粒径分布图；
图3为胶束PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的TEM图；
图4为纳米金颗粒的种子的TEM图；
图5为 PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG的TEM图；
图6为DOX-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG的pH敏感荧光；(1) pH=5.0,laser, DTT；(2)pH=5.0,No laser, DTT；(3)pH=7.4,laser, DTT；(4)pH=7.4,No laser,DTT；(5) Free DOX；
图7为空胶束的紫外可见-近红外谱图；
图8为空胶束PAsp(DIP)-PAsp(MEA) -Au/LA-bPEI-mPEG激光照射时间-温度图；
图9为 DOX-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG的激光照射时间-温度图；
图10为PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG Concentration(100μg/mL)的细胞毒性。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1 聚合物的合成
（1）天冬氨酸苄酯的合成，反应机理及反应过程如下：
取500 m L单口茄形瓶，加入100 mL无水乙醚，再加入10 mL H2SO4(98%），边加边搅拌，冷却至室温后，加入100 mL苯甲醇（1 mol，1.04 g/mL，108.06 g/mol），充分搅拌，旋蒸掉乙醚。分多次加入L-天冬氨酸共13.3 g (0.1 mol，133.04 g/mol)。室温下搅拌反应24 h后，加入200 mL 95%乙醇，再逐滴加入50 mL吡啶，边滴边剧烈搅拌。然后置于冰箱冷冻过夜，抽滤，滤饼用超纯水洗涤洗多次，再用无水乙醚洗涤两次。抽干，置于500 mL三角瓶中，加300～400 mL水，70 ℃加热搅拌溶解，可补充水至400～500 mL，在1.5 h内使全部溶解，溶液变清。热过滤，滤液冷藏过夜。抽滤，重结晶，得到纯净的天冬氨酸苄酯。
（2）苄氧羰基天冬氨酸酸酐（BLA-NCA）的合成，反应机理及反应过程如下：
将10.0g（0.04mol，250g/mol）的天冬氨酸苄酯加入到干燥的500mL圆底两口瓶中，在N2的保护下，加入约200 mL新蒸的乙酸乙酯，在90℃下回流。5.4 g（0.0182 mol，296.75g/mol）三光气溶于约100 mL的新蒸乙酸乙酯，采用缓慢滴的方式加入圆底两口瓶中，在90℃下，继续回流直至溶液变澄清。
反应结束后，将其置于冰盐浴中充分冷却，然后快速地通过冷的、饱和的、碳酸氢钠溶液洗涤两次并萃取分液；接着再以冷的、饱和的氯化钠溶液洗涤两次，萃取分液，以无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩，加入新蒸沉淀剂的石油醚。白色沉淀过滤后，用乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行重结晶，溶液冷却后，最后收集得到白色针状晶体7.0 g（0.028 mol，249.22 g/mol）。
（3）BA-PBLA的合成，反应机理及反应过程如下：
手套箱中，将约74 μL新蒸的正丁胺，（0.35 mmol，55.08 g/mol，0.803 g/mL）加至100 mL干燥的反应烧瓶中，再加入50 mL新蒸的CH2Cl2，充分搅拌。用小烧杯称取2.84 gBLA-NCA(11.4 mmol)，加入5 mL DMF溶解。然后将DMF溶液滴加到CH2Cl2溶液中，充分摇匀，反应开始有大量小气泡生成。密封反应瓶，移出手套箱，置于35 ℃的油浴中加热搅拌反应72 h。反应结束后，先蒸馏除去绝大部分CH2Cl2，将混合液滴入过量的乙醚（约500 mL）中沉淀，低温冰箱冷冻过夜，经离心和无水乙醚的反复洗涤，真空干燥得到最终产物。
（4）BA-PBLA-COOH的合成，反应机理及反应过程如下：
称取2.7 g BA-PBLA（3000 g/mol，0.90 mmol）加于100 mL单口施莱克反应瓶中，加入30 mL新蒸的CHCl3，待其溶解后再加入0.43 g丁二酸酐（100.07 g/mol，1.6 mmol，10eq），于70 ℃下搅拌回流反应48 h。反应完毕后，往反应瓶加入30 mL超纯水，再继续40 ℃搅拌回流反应30 min，然后旋转蒸发除去氯仿，把水倒掉，再加入30 mLCHCl3溶解，往反应瓶加入30 mL超纯水，再继续40 ℃搅拌回流反应30 min，然后旋转蒸发除去氯仿，把水倒掉。这样，将未反应的丁二酸酐水解成丁二酸而去掉。产品冷冻干燥，得到白色粉末状产物。
（5）BA-PAsp(DIP)-COOH的合成，反应机理及反应过程如下：
在手套箱中，称取0.60g BA-PBLA-COOH（3000 g/mol，0.20 mmol）于25 mL的反应管中，加入8 mL 反应级DMF进行溶解。溶解完毕，加入0.11 mL N,N-二异丙基乙二胺（144.26 g/mol，1.45 g/mL，0.012mol，约5eq），充分摇匀。在手套箱外，于35 ℃油浴中加热搅拌反应24 h。反应完毕，将产物置于1K Da透析袋，以甲醇透析除去杂质，得到产物BA-PAsp(DIP)-COOH。
（6）PAsp(DIP)- PBLA的合成
取0.60g BA-PBLA-COOH（3000 g/mol，0.20 mmol）于25 mL的反应瓶中，加入适量的DMSO溶解，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.115 g(191.7 g/mol，0.6mmol)（EDC·HCl），N-羟基琥珀酰亚胺0.069g，（115 g/mol，0.6 mmol，NHS），活化、搅拌30min；然后，加入0.73 g BA-PBLA（4100 g/mol，0.18 mmol）反应2天，以甲醇透析，然后除去甲醇，得到0.7 g产物，产率53 %。
（7）PAsp(MEA)-PAsp(DIP)的合成
取0.5 g PAsp(DIP)- PBLA（7100 g/mol，0.07 mmol），加入32 mg的巯基乙二胺77.15 g/mol，0.42 mmol，在N2的保护下进行，反应温度35℃，然后在N2的保护下反应后，过滤出沉淀物，以甲醇进行透析，获得产物0.25 g，产率大约为50%。
实施例2 聚合物自组装为胶束
取实施例1制备得到的双亲的、两嵌段的聚合物PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 50 mg以DMSO进行溶解，然后在50 mLPBS=8.0左右的溶液里面分散，通过超声破碎仪器超声，自主装为胶束 ，透析，然后经过450 nm的滤膜过滤胶束溶液，以氮气保护胶束溶液，以分子量10万的超滤管超滤除去杂质备用，对获得的胶束进行核磁分析，其结构如图1，从图1中可以看出，主要的核磁峰都有一个很好的归属，表明PAsp(DIP)-PAsp(MEA)已经成功制备。
以PhihPsCM120电子显微镜表征制备得到的聚合物胶束的形貌，激发电压为60KV。样品的制备方法如下：将10 µL（浓度为1 mg/mL）的样品溶液滴于铜网上，静置1 min后，以滤纸吸干。将铜网放在加有硅胶的干燥器中，6 h后，以醋酸铀（质量浓度为2％）对胶束样品进行染色，静置1 min后，用滤纸吸干。将铜网置于干燥器继续室温干燥。其形貌结果如图3所示。可以看出，所制备得到的胶束粒径分布比较均匀，从图2中的粒径分布图，可以看出，其胶束的粒径大多分布在85 nm，并且比较均一，这为下一步的制备多功能载体，提供良好的基础。
实施例3 mPEG-bPEI-LA的制备
(1) 单甲醚聚乙二醇-羰咪唑(mPEG-CDI)的合成
反应路线如下，4.0 g单甲醚聚乙二醇(mPEG-OH)加入到两口瓶中，50℃下真空干燥4 h，溶于30 mL四氢呋喃后加入3.2 g(10eq.)的N,N-羰基二咪唑(CDI)，氩气保护，室温反应24 h，沉淀在大量无水乙醚中，过滤后干燥得白色粉末状产物，产率85％。
(2) 单甲醚聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(mPEG-bPEI)的合成
反应路线如下，1.1 g PEI加入到50 mL两口瓶中，加入20 mL三氯甲烷使其溶解，然后加入800 mg mPEG-CDI(10eq.)，在室温下搅拌反应24 h，用透析袋(MWCO = 3.5 kDa)在1000 mL三氯甲烷中透析24h，减压除去部分三氯甲烷，然后沉淀在无水乙醚中，过滤干燥得白色蜡状产物，产率80％。
(3) 单甲醚聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺-硫辛酸(mPEG-bPEI-LA)的合成
反应路线如下：取0.206 g的硫辛酸（LA），加入98 mg 的乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC），56 mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，以氯仿溶解并活化1 h，然后加入0.76g的mPEG-bPEI，在室温下反应3天，并以冷的无水乙醚沉淀三次，0.5 g得到浅黄色固体。
实施例4 多功能纳米金笼载体PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG的制备
取实施例2制备得到的浓度约1 mg/mL的PAsp(MEA)- PAsp(MEA)胶束溶液1.5 mL，加入新配置浓度为2 mg /mL的硼氢化钠溶液，反应5 h，以充分的打开交联二硫键；然后加入适量的超纯水超滤多次，以除去残余的杂质；然后充氩气，以免被打开的巯基再次交联，进而影响纳米金笼的修饰与生长，最后影响整个材料的光热转换效果；并以稀氢氧化钠溶液或PBS将其pH调为8.0的溶液，以保护胶束的稳定性。
取浓度为20 mM的HAuCl4的溶液1 mL，将其稀释至4.5 mL，然后分别加入1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL至1#、2#、3#的血清瓶中并充氩气进行保护，30 min后分别加入0.25 mL，5%（质量百分数）的羟胺溶液，作用一段时间后，在每个血清瓶中加入2 mL浓度为5 mg/mL的mPEG-bPEI-LA溶液，PEG是无毒的聚合物，而bPEI用来负载基因，LA中巯基与纳米金笼的Au形成共价键，具有生物相容性与水溶性，并防止稳定裸露在外表面的纳米金笼团聚、沉淀。所述载体能减少体内非特性的绑定，明显延长血液循环时间。
上述制备过程中胶束通过正负电荷的吸引在吸附金种子，形成薄薄的一层纳米金“环”，然后在还原剂存在时，进一步以原位生长金的方法，形成纳米金笼。
所述的纳米金笼再以共价键形成的方式与mPEG-bPEI-LA结合。
通过对纳米金制备过程的精确控制得到的3种纳米金笼，所述3种纳米金笼的内外径之比分别为3:7、4:7和5:7，所述3种纳米金笼与空胶束（即没有负载药物的胶束）和mPEG-bPEI-LA结合形成空胶束-纳米金载体1、空胶束-纳米金载体2和空胶束-纳米金载体3，其获得的空胶束-纳米金载体具有显著不同的吸收光谱图（图7）。
实施例5 负载药物的胶束的制备
将实施例2制备得到的胶束与阿霉素（DOX）进行反应（所述DOX占胶束的质量的5%）得到包裹DOX的胶束，该制备方法采用本技术领域常规技术。
实施例6 DOX-PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG的制备
采用实施例4所述方法制备该载体，唯一不同的是所用的胶束是实施例5所述负载药物的胶束。
实施例7 载体结构分析
实施例4所述纳米金种子的TEM形貌如图4，纳米金的种子的粒径大约5 nm。图5为实施例4制备得到的PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG的TEM图，从图中可以看出整个纳米载体粒径大约在90nm。
将实施例6制备得到的多功能载体在加入DTT的情况下，分别在pH=5.0与pH=7.4时测定DOX荧光的强度（所述荧光强度采用本领域常规技术进行检测），以证明纳米金笼的结构，如图6所示，处理（1）到（4）荧光逐渐减弱，说明游离的DOX可以从纳米金笼游离出去，证明了此载体的纳米金笼结构。
实施例8 光热效应的评价
分别以石英比色皿装有一定量载体PBS溶液与空白的胶束PBS溶液，利用激光器进行照射实验，并同时设置几组实验。照射能量为5.4 W，样品距离激光器光纤12 cm，实验结果发现，从图7中可以看出不同结构的纳米金载体，其光热转化能力不同，也说明通过调节纳米金笼的结构可以使得该载体在近红外区，在此区域生物组织穿透能力比较强，光热转换能力比较强，且可以看出空胶束PAsp(DIP)-PAsp(MEA)纳米金笼在紫外可见-近红外808nm有较强的吸收；另外，从图8中还可以看出，空胶束-纳米金笼颗粒1和2在808 nm激光照射的条件下，基本10 min 左右其装有载体PBS溶液温度可以超过50 ℃，而对照组温度仅仅达到30℃，说明该载体具有良好的光热转换效果。
用上述同样的方法对实施例6制备得到的载体溶液进行照射实验，结果如图9，在808 nm激光照射的条件下，大约10 min温度可以升至50℃，而对照组仅有大约30℃。比较图8与图9，可以发现负载DOX对于光热转换并无影响。
实施例9 细胞毒性实验
用四唑盐比色法(MTT)检测样品对Bel-7402细胞增殖能力的影响。所有实验结果重复三次。将Bel-7402细胞以1×103细胞每孔接种于96孔板，然后将Bel-7402细胞在100 μL RPMI 1640（含10%FBS）培养基中37℃培养12h，并加入不同浓度的载体再培养36 h。培养结果如图10所示，从图10可以看出PAsp(MEA)-PAsp(DIP)-Au/LA-bPEI-mPEG 浓度(100μg/mL)载体的细胞毒性比较小，大约有在浓度为300μg/mL的情况下，大约有80 %的存活率。
Claims (7)
1.一种多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，其特征在于，是由PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 聚合物自组装得到的胶束形成的核、纳米金笼形成的壳和甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸形成的冠组成的核-壳-冠结构。
2.根据权利要求1所述的多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，其特征在于，所述纳米金笼的内外径之比由氯金酸与还原剂的用量比控制；当所述氯金酸与还原剂的质量比为1：3，所得纳米金笼的内外径之比为5：7。
3.根据权利要求1所述的多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，其特征在于，所述PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 聚合物的制备方法包括以下步骤：
S1. 以天冬氨酸为原料，无水乙醚为溶剂，加入苯甲醇，以浓硫酸为催化剂，加入吡啶以95%乙醇沉淀获得天冬氨酸苄酯；
S2. 以天冬氨酸苄酯为原料经一系列反应获得BA-PBLA-COOH；
S3. 以 BA-PBLA-COOH为原料，加入N,N-二异丙基乙二胺反应获得BA-PAsp(DIP)-COOH；同时以BA-PBLA-COOH为原料，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺反应获得PAsp(DIP)- PBLA；
S4. 以PAsp(DIP)- PBLA为原料，加入巯基乙二胺，在反应温度为35℃和N2保护下反应，并以甲醇透析得到。
4.根据权利要求1所述的多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，其特征在于，所述冠的制备方法包括以下步骤：
S1. 以单甲醚聚乙二醇（mPEG）为原料经一系列反应得到甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺（mPEG-bPEI）；
S2. 依次加入硫辛酸（LA）、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl）、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解后，加入S1所述mPEG-bPEI室温下反应后沉淀即得。
5.根据权利要求1所述的多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，其特征在于，所述胶束负载药物。
6.根据权利要求5所述的多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体，其特征在于，所述药物的包裹量占胶束质量的5%。
7.权利要求1所述多功能刺激敏感型聚合物-纳米金笼载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 以PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 聚合物自组装形成胶束；
S2. 加入纳米金和还原剂，反应形成纳米金笼；
S3. 加入甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸，形成载体；所述甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸与S2所述纳米金笼形成共价键；
其中所述PAsp(MEA)-PAsp(DIP) 聚合物的制备方法包括以下步骤：
S11. 以天冬氨酸为原料，无水乙醚为溶剂，加入苯甲醇，以浓硫酸为催化剂，加入吡啶以95%乙醇沉淀获得天冬氨酸苄酯；
S12. 以天冬氨酸苄酯为原料经一系列反应获得BA-PBLA-COOH；
S13. 以 BA-PBLA-COOH为原料，加入N,N-二异丙基乙二胺反应获得BA-PAsp(DIP)-COOH；同时以BA-PBLA-COOH为原料，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺反应获得PAsp(DIP)- PBLA；
S14. 以PAsp(DIP)- PBLA为原料，加入巯基乙二胺，在反应温度为35℃和N2保护下反应，并以甲醇透析得到；
甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺-硫辛酸的制备方法包括以下步骤：
S31. 以单甲醚聚乙二醇（mPEG）为原料经一系列反应得到甲氧基聚乙二醇-支化聚乙烯亚胺（mPEG-bPEI）；
S32. 依次加入硫辛酸（LA）、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC.HCl）、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解后，加入S1所述mPEG-bPEI室温下反应后沉淀即得。
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