CN110964723B - 一种用于预防和治疗流感病毒的质粒运载纳米颗粒及制备方法 - Google Patents

一种用于预防和治疗流感病毒的质粒运载纳米颗粒及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于预防和治疗流感病毒的质粒运载纳米颗粒及制备方法。所述质粒运载纳米颗粒包括运输载体和质粒，所述质粒包括一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1病毒的质粒组合和SP‑dCas9‑VPR质粒，所述运输载体为聚合物类质粒传输载体或脂类质粒传输载体。本发明通过制备的CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达的质粒运载纳米颗粒，可用于提前预防流感病毒感染，以及流感病毒感染初期的治疗，这种针对流感病毒的预防或治疗，对于流感病毒的亚型具有普适性，具有很大的应用价值，值得大力推广。

Description

一种用于预防和治疗流感病毒的质粒运载纳米颗粒及制备 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种用于预防和治疗流感病毒的 质粒运载纳米颗粒及制备方法。
背景技术
流行性感冒病毒简称流感病毒，是一种RNA病毒。它分为甲(A)、乙(B)、 丙(C)三型，近年来才发现的牛流感病毒将归为丁(D)型。流感病毒主要通 过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播。人 流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。甲型流感病毒最容易发生变 异，对人类致病性高，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多 数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。其中， 令人熟知的亚型主要包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等。曾多次引起世界性 大流行，1994年、1997年、1999年和2003年分别在澳大利亚、意大利、中国 香港、荷兰等地暴发，2005年则主要在东南亚和欧洲暴发。每年在世界各地爆 发的流感病毒，导致越300万至500万例重症病例和约25万至50万人死亡。流 感病毒种类多且易变异，会导致疫苗失效和耐药性等问题，疫苗研发的滞后性也 使之难以应对流感的早期爆发，并且缺乏应对多种流感病毒混合感染的有效手 段，这些问题使流感病毒预防和治疗都处于疲于应付的状态，因此，迫切需要利 用新技术来开发新型药物提高流感疾病的预防和治疗效果。
哺乳动物应对病毒等微生物入侵的免疫系统主要有固有免疫(也称天然免疫 系统)和适应性免疫系统。固有免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然 免疫防御功能，即出生后就已具备的非特异性防御功能，也称为非特异性免疫， 是生物在长期进化过程中形成的一系列防御机制。固有免疫的特点包括：1)没 有特异的选择性，作用范围广，不是针对某一特定抗原的；2)反应出现快，首 先与入侵抗原物质起作用，将其排斥与清除，但作用强度较弱；3)有相对的稳 定性，不受抗原性质、抗原刺激强弱或刺激次数的影响。固有免疫是一切免疫应 答的基础。特异性免疫是在天然免疫的基础上建立起来的。增强固有免疫是提高 机体整个免疫力的一个重要方面。因此，以固有免疫为切入点，提高人体免疫的第一道防线，应对多变异的流感病毒。
自1957年从流感病毒感染的鸡胚胎细胞中发现一种可以抵抗流感病毒或其 他病毒感染的糖蛋白，有关干扰素(IFN)的研究就不断深入。干扰素(IFN) 是病毒或其他干扰素诱生剂刺激细胞所产生的一类分泌性蛋白，具有抗病毒、抗 肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。根据同源性及受体特异性的不同，将干扰素 分为三型：α干扰素主要由人白细胞产生，β干扰素主要由人成纤维细胞产生，α 和β干扰素属于Ⅰ型干扰素，抗病毒作用较强；γ干扰素由T细胞产生，为Ⅱ型 干扰素(免疫干扰素)，其免疫调节作用较抗病毒作用强。Ⅲ型INF为2003年发 现的一种新型干扰素，与I型干扰素具有同源性、表达模式、信号级联和抗病毒 功能，包括人类中的4个成员IFNL1(IL-29)、IFNL2(IL-28a)，IFNL3(IL-28b)， IFNL4，以及小鼠中的2个成员IFNL2(IL-28a)，IFNL3(IL-28b)。IFNLs信号 受体为独特的异二聚体受体聚合物，由IFNLR1(IL28Ra)和IL10Rb组成，但 它们诱导的下游信号明显类似于Ⅰ型IFN，驱动干扰素类刺激因子(ISG)的表 达，并诱导抗病毒反应。近些年研究发现，IFNLs是流感病毒感染过程中产生的 最早，最主要的IFNs，并且当病毒量低时，IFNLs在不引发炎症的情况下，具有 强大的抗病毒能力。而Ⅰ型IFN出现较晚，增强抗病毒和促炎反应。Ⅰ型和Ⅲ型 IFN确保最佳的病毒清除和最小的附带损伤。因此，上调肺部上皮细胞的IFNLs 的表达，建立抗病毒免疫的第一道防线，是一种减小附带损伤的预防和治疗流感 病毒的行之有效的方法策略。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9技术是 目前最热门，发展最快的技术之一。利用CRISPR-Cas9系统的机制可以简便地在哺乳动物基因组中创造缺失、插入和替换的基因突变，因此CRISPR-Cas9技 术作为新的基因编辑技术而广泛应用于基因工程领域，同时CRISPR-Cas9技术 的突破也为基因治疗带来了新的希望。CRISPR-Cas9系统中，crRNA和tracrRNA (或sgRNA)加载到Cas9蛋白上形成的一个RNP(ribonucleoprotein，核糖核蛋 白)复合物，扫描DNA找到PAM(protospacer-adjacent motif)(5'-NGG)位点。 识别PAM位点导致DNA解旋，使crRNA(或sgRNA)找到DNA位点相邻的 DNA互补链。PAM位点的识别激活了HNH和RuvC酶切结构域，Cas9蛋白造 成一个双链断裂。如果crRNA(或sgRNA)与靶DNA不互补，Cas9将会释放 出来，寻找新的PAM位点。DNA中的线性靶基因组断裂引起体内细胞修复机制 包括非同源末端连接(non-homologousend joining，NHEJ)或同源重组方式 (homology-directed repair，HDR)。非同源末端连接会引起目的基因突变(插入 会缺失)，可能使目的基因失活。相反地，同源重组往往通过供体DNA与基因 组DNA之间的同源重组造成靶向插入外源基因。在此基础上构建了CRISPRa系统，即dCas9。dCas9是由于D10A和H840A突变使Cas9蛋白的两个核酸内 切酶结构域活性丧失而得到的，但dCas9仍保留了与靶位点特异性结合的能力， 如此将dCas9-sgRNA作为与DNA特异性识别的平台，具有很大的应用价值。 dCas9-sgRNA可以成为基因表达的调控工具。例如，将dCas9与转录抑制结构 域KRAB融合，得到的dCas9-KRAB-sgRNA具有很强的转录抑制效果，可以 替代脱靶效应明显的siRNA技术。将dCas9与转录激活结构域p65AD融合，可获得能激活特定基因转录的转录因子。将dCas9后与转录激活域(VP64)进行 融合，形成的dCas9-VP64-sgRNA靶向内源基因转录起始位点(Transcriptional Start Site(TSS))的-200bp到+100bp处，上调基因表达。CRISPRa系统并不会对 基因组DNA进行切割，即不会对基因组造成突变，相较于CRISPR系统，极大 的降低了脱靶效应带来的生物安全性问题，更有利于临床转化的实际应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于预防和治疗流感病 毒的通过CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达的纳米颗粒制剂及制备方法。
本发明的第一个目的是提供一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1病毒的gR NA靶标序列组合。
本发明的第二个目的是提供一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1的gRNA 组合。
本发明的第三个目的是提供一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1病毒的质 粒组合。
本发明的第四个目的是提供一个用于细胞转染的纳米颗粒。
本发明的第五个目的是提供所述纳米颗粒的制备方法。
本发明的第六个目的是提供所述质粒运载纳米颗粒的制备方法。
本发明的第七个目的是提供所述的gRNA靶标序列组合、所述gRNA组合、 所述质粒组合、或所述纳米颗粒任一在制备抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒 中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明首先要求保护一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1病毒的gRNA靶 标序列组合，所述gRNA靶标序列组合包括gRNA靶标序列1和gRNA靶标序 列2，gRNA靶标序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，gRNA靶标序列2 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或SEQ IDNO:3所示；或者(2)包括gRNA 靶标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:1为：CAGGUAAGACACCGGCCACC；
SEQ ID NO:2为：UUGGGAACAUACCUUCCUGU；
SEQ ID NO:3为：GAGACUCAGGGGUAACCUAC；
SEQ ID NO:4为：GCCUGGGCUCUCCUAGUGGC。
一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1的gRNA组合，所述gRNA组合为所 述gRNA靶标序列组合的各序列分别在下游连接有骨架RNA序列。
优选地，所述骨架RNA序列核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:5为
5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3'
更优选地，所述gRNA组合(1)包括gRNA 1和gRNA 2，gRNA 1的核苷 酸序列如SEQID NO:6所示，gRNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示或SEQ ID NO:8所示；或者(2)包括gRNA，，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
SEQ ID NO:6为：
CAGGUAAGACACCGGCCACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG；
SEQ ID NO:7为：
UUGGGAACAUACCUUCCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG；
SEQ ID NO:8为：
GAGACUCAGGGGUAACCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG；
SEQ ID NO:9为：
GCCUGGGCUCUCCUAGUGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG。
本发明还要求保护一个用于CRISPRa系统的抑制H1N1病毒的质粒组合， 所述质粒组合包括质粒1和质粒2，分别为连接有所述的gRNA组合中的各gRNA 的质粒。
优选地，质粒1和质粒2的用量比为2～0.5：1。
更优选地，质粒1和质粒2的用量比为1：1。
优选地，所述质粒为gRNA表达质粒。
更优选地，所述质粒为phU6-gRNA质粒。
本发明还要求保护一个用于细胞转染的纳米颗粒，所述纳米颗粒为式(1) 所示化合物，
Figure BDA0002266592230000051
peptide的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
SEQ ID NO:10为：
CGRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKPGKRKEQEKKKRRTR。
7.权利要求6所述纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.以天门冬氨酸苄酯与三光气反应，制备天门冬氨酸苄酯环内酸酐 BLA-NCA；
S2.以正丁胺引发BLA-NCA开环聚合聚合物Ba-PBLA。
S3.以Ba-PBLA和乙酰氯为原料，反应得到产物Ba-PBLA-Ac；
S4.加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺(DAE-boc)和N,N-二异丙基乙二胺(DIP) 将聚合物Ba-PBLA-Ac进行混合胺解，得到产物Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac；
S5.用三氟乙酸脱去Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac侧基的boc保护，再与 3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯和三乙胺反应，得到Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac；
S6.MTAS-NLSd多肽先和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐混合，再与 Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac反应，得到产物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac。
优选的，在天门冬氨酸苄酯的制备包括以下步骤：
S11.制备浓硫酸-苯甲醇的混合溶液，加入天冬氨酸，充分反应；
S12.步骤S11的产物与乙醇和吡啶混合，充分反应；
S13.固液分离，溶解固体，热过滤，滤液冷藏过夜，
S14.按照步骤S13重结晶，得到天门冬氨酸苄酯BLA。
更优选的，步骤S11中，无水乙醚-浓硫酸的混合溶液中无水乙醚和浓硫酸 的体积比为(15～5)：1。
进一步优选地，步骤S11中，浓硫酸-苯甲醇的混合溶液中硫酸和苯甲酸的 体积比为10：1。
更优选地，步骤S11中，无水乙醚和浓硫酸混合，充分搅拌，冷却至室温， 加入与苯甲酸，充分混合，蒸发掉乙醚，得到浓硫酸-苯甲醇的混合溶液。
更优选的，步骤S11中，缓慢添加浓硫酸，边滴加边剧烈搅拌，冷却至室温 后，再加入苯甲醇。
更优选地，步骤S11中，天冬氨酸分1～4次加入，室温均匀搅拌反应12～ 48h。
进一步优选地，步骤S11中，天冬氨酸分三次加入，室温均匀搅拌反应24h。
更优选地，步骤S11中，浓硫酸-苯甲醇的混合溶液与天冬氨酸的体积质量 比为110mL：8～25g。
进一步优选地，步骤S11中，浓硫酸-苯甲醇的混合溶液与天冬氨酸的体积 质量比为110mL：13.3g。
更优选的，步骤S12中，步骤S11的的产物、乙醇和吡啶的用量比为 10-15g:100～200mL:30～60mL。
进一步优选地，步骤S12中，步骤S11的产物、乙醇和吡啶的用量比为 13.3g:200mL:50mL。
更优选的，步骤S12中，吡啶用滴液漏斗逐滴加入，边滴边剧烈搅拌。
更优选地，步骤S13中，低温过夜后，抽滤固液分离。
更优选地，步骤S13中，50～95℃下搅拌溶解。
进一步优选地，步骤S13中，80℃下搅拌溶解。
更优选地，步骤S14中，结晶两次。
优选地，步骤S1中，60～90℃回流。
更优选地，步骤S1中，80℃回流。
优选地，步骤S1中，第一次回流10～50分钟。
更优选地，步骤S1中，第一次回流30分钟。
优选地，步骤S1中，惰性气体为氩气。
优选地，步骤S1中，乙酸乙酯和无水石油醚为新蒸的。
优选地，步骤S1中，每毫升无水乙酸乙酯溶解有0.045g三光气。
优选地，步骤S1中，天门冬氨酸苄酯BLA与无水乙酸乙酯混合，用量比为 1.5g：50～200mL。
更优选地，步骤S1中，天门冬氨酸苄酯BLA与无水乙酸乙酯的用量比为 1.5g：100mL。
优选地，步骤S1中，每毫升无水乙酸乙酯溶解有0.02～0.1g三光气。
更优选地，步骤S1中，每毫升无水乙酸乙酯溶解有0.045g三光气。
优选地，步骤S1中，溶解有三光气的乙酸乙酯的用量是是前一次乙酸乙酯 用量的1/10～1/2。
更优选地，步骤S1中，溶解有三光气的乙酸乙酯的用量是是前一次乙酸乙 酯用量的1/5。
优选地，步骤S2中，正丁胺的CH2Cl2溶液中正丁胺与CH2Cl2的用量比为 0.1mmol：50～150ml。
更优选地，步骤S2中，正丁胺的CH2Cl2溶液中正丁胺与CH2Cl2的用量比 为0.1mmol：100ml。
优选地，步骤S2中，BLA-NCA的DMF溶液中BLA-NCA与DMF的用量 比为4mmol：0.5～2ml。
更优选地，步骤S2中，BLA-NCA的DMF溶液中BLA-NCA与DMF的用 量比为4mmol：1ml
优选地，步骤S2中，25～50℃的油浴中加热搅拌反应12～96h。
更优选地，步骤S2中，35℃的油浴中加热搅拌反应72h。
优选地，步骤S2中，正丁胺的CH2Cl2溶液与步骤S1的产物BLA-NCA的 DMF溶液的体积比20～100：3。
更优选地，步骤S2中，正丁胺的CH2Cl2溶液与步骤S1的产物BLA-NCA 的DMF溶液的体积比50：3。
优选的，在步骤S3中，Ba-PBLA的无水二氯甲烷溶液中Ba-PBLA与无水 二氯甲烷的用量比为1g：5～30mL。
更优选的，在步骤S3中，Ba-PBLA的无水二氯甲烷溶液中Ba-PBLA与无 水二氯甲烷的用量比为1g：10mL。
优选的，在步骤S3中，混合溶液中Ba-PBLA和乙酰氯的质量浓度比为1/15～ 1/5。
优选的，在步骤S3中，混合溶液中Ba-PBLA和乙酰氯的质量浓度比为1： 11.1。
优选的，在步骤S3中，纯化的方法为：MWCO不小于3.5kDa的进行透析， 甲醇透析至少1d。
优选的，在步骤S3中，干燥的方法为：为用旋转蒸发仪除去甲醇。
优选的，在步骤S4中，Ba-PBLA-Ac的DMSO溶液中Ba-PBLA-Ac的浓度 为0.001～0.006mol/L。
更优选的，在步骤S4中，Ba-PBLA-Ac的DMSO溶液中Ba-PBLA-Ac的浓 度为0.004mol/L。
优选的，在步骤S4中，Ba-PBLA-Ac、N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺和N,N-二 异丙基乙二胺的用量mol比为0.01：0.01～0.05：6。
更优选的，在步骤S4中，Ba-PBLA-Ac、N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺和N,N- 二异丙基乙二胺的用量mol比为0.01：0.03：6。
优选的，在步骤S4中，纯化的方法为：MWCO不小于3.5kDa的进行透析， 甲醇透析至少1d。
优选的，在步骤S4中，干燥的方法为用旋转蒸发仪除去甲醇。
优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF中 Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的浓度为0.002～0.01mol/L。
更优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF中Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的浓度为0.009mol/L。
优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF溶液与三氟 乙酸混合，室温反应1～3h。
更优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF溶液与三 氟乙酸混合，室温反应2h。
优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF溶液与三氟 乙酸的用量体积比为1～5：10。
更优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF溶液与三 氟乙酸的用量体积比为3：10。
优选的，在步骤S5中，旋转蒸发去除三氟乙酸。
优选的，在步骤S5中，DMF的用量与Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的DMF 溶液的体积比为0.5～2：1。
更优选的，在步骤S5中，DMF的用量与Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的 DMF溶液的体积比为1：1。
优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac、3-马来酰亚胺丙酸琥 珀酰亚胺酯和三乙胺的用量mol比为9：100～500：10。
更优选的，在步骤S5中，Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac、3-马来酰亚胺丙酸 琥珀酰亚胺酯和三乙胺的用量mol比为9：270：10。
优选的，在步骤S5中，纯化的方法为：MWCO不小于3.5kDa的进行透析， 甲醇透析至少1d。
优选的，在步骤S5中，干燥的方法为为用旋转蒸发仪除去甲醇
优选的，在步骤S6中，peptide的DMF溶液中，peptide的浓度为0.01～ 0.05mol/L。
更优选的，在步骤S6中，peptide的DMF溶液中，peptide的浓度为 0.025mol/L。
优选的，在步骤S6中，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的peptide的DMF 溶液与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐混合反应0.5～1h。
更优选的，在步骤S6中，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示的peptide的DMF 溶液与三(2-羰基乙基)磷盐酸盐混合反应0.5h。
优选的，在步骤S6中，Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的DMF溶液中，Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的的浓度为0.002～0.005mol/L。
更优选的，在步骤S6中，Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的DMF溶液中， Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的的浓度为0.0043mol/L。
优选的，在步骤S6中，加入Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的DMF溶液，室温 反应12～48h。
更优选的，在步骤S6中，加入Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的DMF溶液，室 温反应24h。
优选的，在步骤S6中，纯化的方法为：MWCO不小于14kDa的进行透析， 甲醇透析至少1d。
优选的，在步骤S6中，干燥的方法为：冷冻干燥。
本发明还要求保护一个抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒，所述质粒运载 纳米颗粒包括运输载体和质粒，所述质粒包括所述质粒组合和SP-dCas9-VPR质 粒，所述运输载体为聚合物类质粒传输载体或脂类质粒传输载体。
所述的聚合物类质粒传输载体为聚阳离子结合分子、阳离子胶束、阳离子多 肽、具有亲水性基团分枝结构的聚合物、非天然的阳离子聚合物、阳离子聚缩醛 聚合物、具有亲水性基团分枝结构的聚缩醛聚合物、具有功能性基团的阳离子聚 合物和具有功能性基团-亲水性基团-聚合物结构的嵌段式聚合物；所述的脂类质 粒传输载体为阳离子脂质体。
所述的传输载体和质粒形成100～400nm直径的质粒运载纳米颗粒。
优选地，所述运输载体为所述纳米颗粒，
优选地，权利要求5所述质粒组合与SP-dCas9-VPR质粒的质量比为2～0.25： 1。
更优选地，所述质粒组合与SP-dCas9-VPR质粒的质量比为1：1。
本发明还要求保护所述质粒运载纳米颗粒的制备方法为：用于细胞转染的纳 米颗粒与所述质粒组合混合，在静电作用下，组装得到质粒运载纳米颗粒。
优选地，所述纳米颗粒与所述质粒组合的用量比为：20～80：1
更有选的，所述纳米颗粒与所述质粒组合的用量比为：40:1
优选地，用于细胞转染的纳米颗粒(聚合物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac)溶解 于pH＝5.5，0.1M的醋酸和醋酸钠缓冲液至5～20mg/mL，与所述质粒组合进行 混合，常温孵育20-30分钟，组装得到质粒运载纳米颗粒。
更优选地，用于细胞转染的纳米颗粒(聚合物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac)溶 解于pH＝5.5，0.1M的醋酸和醋酸钠缓冲液至5mg/mL，与所述质粒组合进行混 合，常温孵育15分钟，组装得到质粒运载纳米颗粒。
所述的gRNA靶标序列组合、所述gRNA组合、所述质粒组合、或所述纳 米颗粒任一在制备抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过制备的CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达的质粒运载纳米 颗粒，可用于提前预防流感病毒感染，以及流感病毒感染初期的治疗，这种针对 流感病毒的预防或治疗，对于流感病毒的亚型具有普适性，具有很大的应用价值， 值得大力推广。
附图说明
图1为纳米颗粒Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac的合成路线图。
图2为纳米颗粒Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac核磁图。
图3为poly amino acid PAsp(NLS-MTAS-co-DIP)纳米颗粒运载CRISPRa质 粒系统进入A549细胞；YOYO-1染料(绿色)标记的dCas9-VPR质粒被纳米颗 粒递送进A549细胞后6h,12h，24h，利用免疫荧光的方法同时检测dCas9-VPR 蛋白(红色)的表达；6h dCas9-VPR质粒已经充分进入细胞，12h dCas9-VPR蛋 白已经有表达，24h可以观察到较多的dCas9-VPR蛋白表达。
图4为人和小鼠IFNL的gRNA筛选；(A)筛选靶标上调hIFNL1的gRNA； (B)筛选靶标上调hIFNL2和hIFNL3的gRNA；(C)筛选靶标上调hIFNL4 的gRNA；(D)筛选靶标上调hIFNL的最优gRNA组合方式；(E)筛选靶标 上调mIFNL的gRNA。
图5为通过CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达的纳米颗粒制剂抑制病 毒的感染；人A549细胞中抗VSV-GFP病毒的感染效果，其中(A)为荧光显微 镜拍摄照片，(B)为流式细胞技术检测VSV-GFP阳性感染细胞率；小鼠N2a 细胞中抗VSV-GFP病毒的感染效果(C)为VSV-GFP病毒RNA在细胞内的相 对表达量代表了VSV-GFP病毒的拷贝数，CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表 达可以有效的降低VSV-GFP病毒感染率(P<0.05，n＝3)；(D)神经酰胺酶和 (E)血凝素在细胞内的RNA相对表达量代表了H1N1病毒的拷贝数，CRISPRa 质粒系统上调IFNⅢ基因表达可以有效的抗流感病毒感染(P<0.05，n＝3)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实 施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试 验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1纳米颗粒的制备
一、实验方法
纳米颗粒的制备的合成路线图如图1所示。
1、BLA-NCA单体的合成
(1)天门冬氨酸苄酯(BLA)的合成
准备单口瓶(500mL)，添加100mL无水乙醚后，再缓慢添加10mL H2SO4(98％)，边滴加边剧烈搅拌，等冷却至室温后，加入100mL苯甲醇，充分 搅拌后，用旋转蒸发仪旋蒸掉乙醚。然后分三次加天冬氨酸(L-aspartic acid)共 13.3g至反应瓶中。室温均匀搅拌反应24h，再加入200mL 95％乙醇，并用滴 液漏斗逐滴加入50mL吡啶，边滴边剧烈搅拌。然后经冰箱冷冻过夜，抽虑后 的固体，80℃下搅拌，用去离子水溶解，热过滤，滤液冷藏过夜。抽虑，按上述 步骤重结晶两次，冻干后得到纯净的天门冬氨酸苄酯(BLA)。
(2)BLA-NCA的合成
首先将500mL的两口瓶抽真空通氩气来除水除氧，然后添加4.5g的天冬 氨酸苄酯中，在氩气环境中加入300mL新蒸的无水乙酸乙酯，80℃下回流30 分钟。然后用恒压滴液漏斗将60mL溶有2.7g三光气的新蒸乙酸乙酯缓慢滴加 入，80℃继续回流直到溶液变澄清。溶液变清后，利用冰盐浴将反应溶液快速 冷却(半小时)，然后用冷的饱和碳酸氢钠溶液快速洗涤三次，接着反应液用冷 的饱和氯化钠溶液快速洗涤两次，最后将反应液用适量无水硫酸镁室温干燥30 分钟。过滤，滤液经浓缩后，用新蒸的无水石油醚沉淀。冷冻抽滤所得白色沉淀， 用乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行重结晶，最终得到白色针状晶体BLA-NCA。
2、Ba-PBLA-Ac的合成
(1)Ba-PBLA的合成
在手套箱中，将约9.7μL正丁胺(0.1mmol)加至100ml干燥的反应烧瓶 中，再加入50mL干燥的CH2Cl2，摇匀。称取3g BLA-NCA(12mmol)，加入3mL DMF溶解。然后将DMF溶液滴加到CH2Cl2溶液中，充分摇匀。密封反应瓶， 移出手提箱，置于35℃的油浴中加热搅拌反应72h。反应结束后先蒸馏除去绝 大部分二氯甲烷，将混合液滴入过量的冷乙醚(约500mL)中沉淀，经抽滤和 无水乙醚的反复洗涤，真空干燥得到产物Ba-PBLA。
(2)Ba-PBLA-Ac的合成
将2g Ba-PBLA(0.081mmol)溶于20mL无水二氯甲烷中，然后加入0.2mL 的乙酰氯(2.8mmol)，室温反应8小时。反应完后，将溶液在乙醚中沉淀，干 燥，再用二氯甲烷溶解沉淀，溶液转移至透析袋(MWCO：3.5kDa)中，甲醇 透析1d，用旋转蒸发仪除去甲醇，得到产物Ba-PBLA-Ac。
3、Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac的合成
将1g Ba-PBLA-Ac(0.04mmol)溶解在10mL DMSO中。称取19.2mg N-叔丁 氧羰基-1,2-乙二胺(0.12mmol)溶于2mL DMSO中，然后加入到Ba-PBLA-Ac的 聚合物溶液中，室温反应1d。然后加入4.3mL N,N-二异丙基乙二胺(24mmol)， 室温反应6h。反应完后，将反应液转移至透析袋(MWCO：3.5kDa)中，甲醇 透析1d，旋干得到产物Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac。
4、Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac的合成
将0.8g Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac(0.027mmol)溶于3mL DMF，然后加入 10mL三氟乙酸，室温反应2h。反应完后，旋蒸除掉大部分三氟乙酸，将剩下的 溶液转移至透析袋(MWCO：3.5kDa)中，甲醇透析1d，旋干。将旋干得到的 固体全部用5mL DMF溶解，加入216mg3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯 (0.81mmol)，再加入4.1μL三乙胺(0.03mmol)，室温搅拌反应24h。反应完后， 将反应液装入透析袋中(MWCO：3.5kDa)，甲醇透析除去小分子，旋干得到产 物Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac。
5、Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac的合成
称取269mg Peptide(0.05mmol)，其中Peptide序列为： CGRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKPGKRKEQEKKKRRTR(SEQ ID NO:10)，溶于2mL DMF，加入14.3mg三(2-羰基乙基)磷盐酸盐Tcep(0.05mmol)， 搅拌，室温反应半小时。将0.1g Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac(0.0086mmol)溶于2mL DMF中，然后加入到多肽溶液中，室温反应1d。反应完后，将反应液装入透析 袋中(MWCO:14kDa)，纯水透析除去未反应的多肽，冻干得到产物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac。
二、实验结果
制备得到的纳米颗粒Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac核磁图如图2所示，说明成功 制备得到了纳米颗粒Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac。
实施例2纳米颗粒的细胞摄取
一、实验方法
1、标记SP-dCas9-VPR质粒
表达dCas9蛋白的质粒SP-dCas9-VPR质粒与YOYO-1染料(Thermofisher) 共孵育5分钟，孵育比例按照官方说明书进行，随即得到标记有绿色荧光标记的 SP-dCas9-VPR质粒用于后续细胞摄取实验观察。
2、负载SP-dCas9-VPR质粒的纳米颗粒转染
将标记过YOYO-1的SP-dCas9-VPR质粒与实施例1制备 Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac纳米颗粒制备质粒传输载体，具体制备过程如下：
聚合物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac用醋酸和醋酸钠(PH＝5.5，0.1M)的缓冲 液溶解成5mg/mL,聚合物溶液和质粒溶液以40/1的质量比混合，常温孵育15 分钟，组装成复合了质粒的纳米颗粒。
A549细胞种于6孔板中的细胞爬片上，细胞密度约为70％，过夜培养。细 胞完全贴壁后，将上述纳米颗粒按照1μg DNA/孔的剂量与细胞在opti-MEM培 养基(1mL，Thermofisher)中共孵育，4h后换为含10％FBS的DMEM培养基。 分别在共孵育6h，12h，24h后，收取细胞爬片。
3、免疫荧光染色
细胞爬片用PBS清洗3次后，4％多聚甲醛固定15分钟，随后0.15％Triton X-100通透15分钟。PBS清洗3次后，用1％BSA(PBST配置)常温封闭1小 时。之后细胞与稀释的Cas9抗体(CST)在4℃共孵育过夜，稀释比例和方法依 据说明书。PBS清洗3次后，孵育对应Cas9一抗的荧光二抗，37℃条件下2小 时。PBS清洗3次后，细胞用DAPI(1mg/mL)复染细胞核10分钟，再次清洗后， 晾干，封片。之后利用共聚焦显微镜进行观察。所有操作均需要避光。
二、实验结果
结果如图3所示，纳米颗粒可有效的将标记了YOYO-1的质粒(绿色荧光) 运载入细胞，6h dCas9-VPR质粒已经充分进入细胞，12h dCas9-VPR蛋白已经有 表达，24h可以观察到较多的dCas9-VPR蛋白表达。
实施例3上调表达IFNL基因的gRNA质粒的构建
一、实验方法
1、gRNA的设计
在NCBI官网查询靶标目IFNL基因，获得全序列。以获得的全序列的第一 个碱基为TSS位点，向上游查询-600bp，向下游查询+100bp，获得的700bp序列 即gRNA靶标序列。设计gRNA序列，每个基因至少设计5种gRNA。
靶标目的基因为IFNⅢ基因，人类中的4个成员IFNL1(IL-29)、IFNL2 (IL-28a)，IFNL3(IL-28b)，IFNL4，以及小鼠中的2个成员IFNL2(IL-28a)， IFNL3(IL-28b)。
gRNA由与靶标区域特异性识别的RNA序列片段以及固定不变的骨架RNA 序列组成，骨架序列为： 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3'(SEQ ID NO:5)，后续阐述的 gRNA序列皆为与靶标区域特异性识别RNA序列，即插入phU6-gRNA质粒的 DNA序列(U替换T)，省略骨架RNA序列，各特异性识别的RNA序列片段如 表1所示。
表1：
Figure BDA0002266592230000151
Figure BDA0002266592230000161
其中SEQ ID NO:1到4所示核苷酸的靶标区域特异性识别的gRNA靶标序 列对应的gRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6到9所示：
SEQ ID NO:6为：
CAGGUAAGACACCGGCCACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG；
SEQ ID NO:7为：
UUGGGAACAUACCUUCCUGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG；
SEQ ID NO:8为：
GAGACUCAGGGGUAACCUACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG；
SEQ ID NO:9为：
GCCUGGGCUCUCCUAGUGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG。
2、gRNA质粒的构建
phU6-gRNA(Plasmid#53188)质粒经过BbsI(NEB)限制性内切酶37℃过 夜切割完全后，1％琼脂糖(Uhermofisher)电泳跑胶，切胶回收线性质粒。根据 设计的gRNA采用化学合成的方法合成所需前后引物(表2所示)。前后引物配 对退火形成含有粘性末端的DNA双链，与回收的线性质粒连接，连接产物通过 E.coil(DH5a)(Uakara)转化，涂板，条单菌落，测序，构建出含有特异性gRNA序 列的表达质粒。
表2：
Figure BDA0002266592230000171
Figure BDA0002266592230000181
3、负载gRNA质粒的质粒传输载体
将各gRNA质粒与SP-dCas9-VPR质粒按照分别按照质量比1：1比例混合， 与实施例1制备Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac纳米颗粒制备质粒传输载体，具体制备 过程如下：
聚合物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac用醋酸和醋酸钠(PH＝5.5，0.1M)的缓冲 液溶解成5mg/mL，聚合物溶液和质粒溶液以40/1的质量比混合，常温孵育15 分钟，组装成复合了质粒的纳米颗粒。
4、筛选上调表达IFNL基因的gRNA质粒
将制备好的质粒传输载体分别转染细胞以筛选gRNA质粒。人的gRNA筛 选选用A549(人非小细胞肺癌细胞)，小鼠的gRNA筛选选用N2a(神经瘤母细 胞)，细胞培养条件为含10％FBS的DMEM培养基。将细胞种于24孔板中，贴 壁过夜后，将负载质粒的纳米颗粒(1μgDNA/mL)与细胞在opUi-MEM培养基 (500μL)中孵育4h，之后更换为含10％FBS的DMEM培养基。48h后提取细 胞内总RNA，应用RU-PCR的方法分析目的基因的上调表达情况。尝试不同gRNA的不同组合方式，筛选出上调基因效果最好的gRNA组合方式。
二、实验结果
结果如图4所示，上调hIFNL1基因的效果较高的gRNA质粒，为g hIFNL1-1、 ghIFNL1-2和g hIFNL1-3，再对3条g hIFNL1进行排列组合筛选(即1+1，1+2， 1+3，2+3，1+2+3，DNA总量不变，组合内质粒比例为1：1)，进一步发现，其 中g hIFNL1-2与g hIFNL1-3组合，上调hIFNL1基因最明显，上调效果可达上 百倍，选取g hIFNL1-2+g hIFNL1-3组合进行后续筛选。
上调hIFNL2和hIFNL3基因的效果较高的gRNA质粒，为g hIFNL2/3-1、g hIFNL2/3-2和g hIFNL2/3-3，再对3条g hIFNL2/3进行排列组合筛选，进一步 发现，其中g hIFNL2/3-1+g hIFNL2/3-3组合，或者g hIFNL2/3-2+g hIFNL2/3-3 组合，上调hIFNL2/3基因最明显，上调效果可达上千倍。选取这两个组合进行 后续筛选。
上调hIFNL4基因的表达的gRNA质粒，上调效果总体不明显，均未超过10 倍，不用于后续纳米颗粒的制备。
之后，选用hIFNL1-2+g hIFNL1-3组合、g hIFNL2/3-1+g hIFNL2/3-3组合、 和ghIFNL2/3-2+g hIFNL2/3-3g hIFNL2/3组合，彼此之间组合，在总转染DNA 量不变的情况下，组合并不会带来上调基因的优势，因此最终选用g hIFNL2/3-1+g hIFNL2/3-3组合和ghIFNL2/3-2+g hIFNL2/3-3g hIFNL2/3组合进 行后续实验，组合内比例为1：1。
上调mIFNL基因的效果较高的gRNA质粒，为g mIFNL2，选用其进行后续 实验。
实施例3通过CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达的纳米颗粒制剂抑制 VSV-GFP病毒的感染
一、实验方法
水泡性口炎病毒(Vesicular sUomaUiUis virus，VSV)是有囊膜的单股负链 RNA病毒,能感染多种动物模型，包括鱼类、禽类，及非人灵长类等。VSV-GFP 病毒(sUrainIndiana，AUCC)是在VSV病毒的基因组中L聚合酶基因上游插 入一个额外转录单元编码绿色荧光蛋白(GFP)，广泛应用于实验中对病毒进行示 踪。
本实验设计分为五组，一组为空白对照组，二组为不运载质粒的纳米颗粒， 三组为运载了缺少上调原件VPR(VP64-p65-RUa)的SP-dCas9-VPR质粒+g IFNL 质粒的纳米颗粒的质粒传输载体，四组为运载了SP-dCas9-VPR质粒+gRNA空 白骨架质粒的纳米颗粒的质粒传输载体，五组为运载了SP-dCas9-VPR质粒+g IFNL质粒的纳米颗粒的质粒传输载体，其中二组，三组和四组为阴性对照组。
各组纳米颗粒的制备方法同实施例1所述；质粒传输载体的制备方法同实施 例1所述；SP-dCas9-VPR质粒(或缺少上调原件VPR的SP-dCas9-VPR质粒) 和g IFNL质粒(gRNA空白骨架质粒)用量比为质量比1:1；IFNL质粒为实施 例2筛选的三组分别进行实验：(1)ghIFNL2/3-1+g hIFNL2/3-3组合，(2)g hIFNL2/3-2+g hIFNL2/3-3g hIFNL2/3组合，(3)gmIFNL2。
将人的A549细胞和小鼠的N2a神经瘤母细胞分别种于24孔板上进行抗病 毒实验。将制备好的质粒传输载体(或仅是纳米颗粒)分别转染细胞转染人或小 鼠细胞，48h后，感染VSV-GFP病毒(MOI＝100)，24h后用荧光显微镜进行拍 照记录以及用流式细胞仪检测病毒感染阳性细胞比例，或者通过RU-qPCR来定 量VSV-GFP病毒拷贝数，评估细胞抗VSV-GFP病毒的能力。
用到的qPCR引物序列包括
VSV-F：CAAGUCAAAAUGCCCAAGAGUCACA
VSV-R：UUUCCUUGCAUUGUUCUACAGAUGG
二、实验结果
应用g hIFNL2/3-1+g hIFNL2/3-3组合成的CRISPRa质粒体系，通过纳米颗 粒转染人A549细胞后，抗VSV-GFP病毒的感染效果如图5(A)和(B)所示， 荧光显微镜拍摄照片(A)和流式细胞技术检测VSV-GFP阳性感染细胞率(B) 均可得知，相较于空白对照组和阴性对照组，上调表达hIFNL的人A549细胞被 VSV-GFP病毒感染的明显更少。
应用g mIFNL2组合成的CRISPRa质粒体系，通过纳米颗粒转染小鼠N2a 细胞后抗VSV-GFP病毒的感染效果如图5(C)所示，VSV-GFP病毒RNA在细 胞内的相对表达量代表了VSV-GFP病毒的拷贝数，相较于空白对照组和阴性对 照组，上调表达mIFNL的小鼠N2a细胞中VSV-GFP病毒拷贝数明显更少(P< 0.05，n＝3)。
总之，CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达可以有效的降低VSV-GFP病 毒感染率。
实施例4通过CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因表达的纳米颗粒制剂抑制 H1N1病毒的感染
一、实验方法
应用实施例3中的实验方法及分组，人A549细胞在转染CRISPRa质粒系统 48h后，感染H1N1pdm09(A/Guangdong/1101/2009)病毒，24h后提取细胞内总 RNA，应用RU-PCR的方法检测细胞内H1N1的拷贝数，评估细胞抗流感病毒 的能力。
流感病毒，包括H1N1病毒，基因组编码其外膜上的两种特异性蛋白抗原血 凝素(HA)和神经氨酸酶(NP)，通过RU-PCR的方法检测细胞内HA和NP 的拷贝数来定量H1N1的拷贝数。
用到的qPCR引物序列包括
HA-F：5′-UAUUUGGAGCCAUUGCCGGU-3′；
HA-R：5′-GAUCCGCUGCAUAGCCUGAU-3′；
NP-F：5′-AUGCCAUUCUGCCGCAUUUG-3′；
NP-R：5′-GGUCCUUAUGGCCCAGUACC-3′。
二、实验结果
应用g hIFNL2/3-1+g hIFNL2/3-3组合成的CRISPRa质粒体系，通过纳米颗 粒转染人A549细胞后，抗H1N1病毒的感染效果如图5(D)和(E)所示，神 经酰胺酶(D)和血凝素(E)在细胞内的RNA相对表达量代表了H1N1病毒的 拷贝数，相较于空白对照组和阴性对照组，上调表达hIFNL的人A549细胞中 H1N1病毒拷贝数明显更少(P<0.05，n＝3)。CRISPRa质粒系统上调IFNⅢ基因 表达可以有效的抗流感病毒感染。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种用于预防和治疗流感病毒的质粒运载纳米颗粒及制备方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cagguaagac accggccacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uugggaacau accuuccugu 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gagacucagg gguaaccuac 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 4
gccugggcuc uccuaguggc 20
<210> 5
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggug 75
<210> 6
<211> 95
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
cagguaagac accggccacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggug 95
<210> 7
<211> 95
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
uugggaacau accuuccugu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggug 95
<210> 8
<211> 95
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gagacucagg gguaaccuac guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggug 95
<210> 9
<211> 94
<212> RNA
<213> Mus musculus
<400> 9
gccugggcuc uccuaguggc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggug 95
<210> 10
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Cys Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys Val Glu Thr Tyr Lys
1 5 10 15
Glu Gln Pro Leu Lys Thr Pro Gly Lys Lys Lys Lys Gly Lys Pro Gly
20 25 30
Lys Arg Lys Glu Gln Glu Lys Lys Lys Arg Arg Thr Arg
35 40 45

Claims (9)

1.用于CRISPRa系统的gRNA靶标序列在制备抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒中的应用，其特征在于，所述gRNA靶标序列选自(1)或(2)，(1)为gRNA靶标序列1和gRNA靶标序列2，gRNA靶标序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，gRNA靶标序列2的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示或SEQ ID NO:3所示；(2)为核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的gRNA靶标序列。
2.用于CRISPRa系统的gRNA在制备抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒中的应用，其特征在于，所述gRNA选自(1)或(2)，(1)为gRNA靶标序列1和gRNA靶标序列2分别在下游连接有骨架RNA序列，gRNA靶标序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，gRNA靶标序列2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或SEQ ID NO:3所示；(2)为核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的gRNA靶标序列在下游连接有骨架RNA序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述骨架RNA序列核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述gRNA选自(1)或(2)，(1)为gRNA 1和gRNA2，gRNA 1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，gRNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示或SEQ ID NO:8所示；(2)为核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的gRNA。
5.用于CRISPRa系统的抑制H1N1病毒的质粒，其特征在于，所述质粒选自(1)或(2)，(1)为质粒1和质粒2，质粒1含有如SEQ ID NO:1所示的gRNA靶标序列1及骨架RNA序列，质粒2含有如SEQ ID NO:2所示或SEQ ID NO:3所示的gRNA靶标序列2及骨架RNA序列；(2)质粒含有如SEQ ID NO:4所示的gRNA靶标序列及骨架RNA序列；所述骨架RNA序列的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。
6.抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒，其特征在于，所述质粒运载纳米颗粒包括运输载体和质粒，所述质粒包括权利要求5所述质粒和SP-dCas9-VPR质粒，所述运输载体为纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的质粒运载纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为式(1)所示的化合物，
Figure 447979DEST_PATH_IMAGE001
式(1)，
peptide的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，纳米颗粒的制备方法包括以下步骤：
S1. 以天门冬氨酸苄酯与三光气反应，制备天门冬氨酸苄酯环内酸酐BLA-NCA，包括以下步骤：
S11.在容器中加入100mL无水乙醚，再加入10mL浓度为98%的浓硫酸，混匀，冷却至室温；再加入100mL苯甲醇，充分搅拌，蒸发去除乙醚，得到浓硫酸-苯甲醇的混合溶液；分次向浓硫酸-苯甲醇的混合溶液中加入13.3g天冬氨酸，充分搅拌，反应24h；
S12.向步骤S11的产物加入200mL 95％乙醇，加入50mL吡啶，充分搅拌，冷冻过夜；
S13.固液分离，80℃下用去离子水溶解固体，热过滤，滤液冷藏过夜；
S14.按照步骤S13重结晶两次，冻干后得到天门冬氨酸苄酯BLA；
S15.在氩气环境中，添加4.5g的天冬氨酸苄酯，加入300mL新蒸的无水乙酸乙酯，80℃下回流30分钟；
S16.向步骤S15的产物中加入60mL溶有2.7g三光气的新蒸乙酸乙酯，80℃继续回流直到溶液变澄清；
S17.将步骤S16的产物进行快速冷却半小时，用冷的饱和碳酸氢钠溶液快速洗涤三次，用冷的饱和氯化钠溶液快速洗涤两次，室温干燥30分钟；过滤，浓缩，用新蒸的无水石油醚沉淀，用乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行重结晶，最终得到BLA-NCA；
S2. 以正丁胺引发BLA-NCA开环聚合聚合物Ba-PBLA，包括以下步骤：
S21.在容器中加入9.7μL0.1mmol的正丁胺，再加入50mL干燥的CH2Cl2，摇匀，得到溶液1；用3mL DMF溶解3g 12mmol的BLA-NCA，得到溶液2；
S22.将溶液1和溶液2充分混合，密封；35℃加热搅拌，反应72h；蒸馏去除绝大部分二氯甲烷，用冷乙醚沉淀，经抽滤和无水乙醚反复洗涤，真空干燥得到Ba-PBLA；
S3. 以Ba-PBLA和乙酰氯为原料，反应得到产物Ba-PBLA-Ac，包括以下步骤：
S31.将2g为0.081mmol的Ba-PBLA溶于20 mL无水二氯甲烷，加入0.2mL2.8mmol的乙酰氯，室温反应8h，得到溶液3；将溶液3在乙醚中沉淀，干燥；
S32.将S31步骤所得产物用二氯甲烷溶解沉淀，用甲醇透析1d；蒸发除去甲醇，得到产物Ba-PBLA-Ac；
S4. 加入N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺和N,N-二异丙基乙二胺将聚合物Ba-PBLA-Ac进行混合胺解，得到产物Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac，包括以下步骤：
S41.将1g 0.04mmol的Ba-PBLA-Ac溶解于10mL DMSO中，得到溶液4；称取19.2mg0.12mmol的N-叔丁氧羰基-1,2-乙二胺溶于2mL DMSO中，得到溶液5；将溶液4和溶液5混合，室温反应1d；加入4.3mL24mmol的N ,N-二异丙基乙二胺，室温反应6h；
S42. 将S41步骤所得产物经甲醇透析1d，干燥，得到Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac；
S5. 用三氟乙酸脱去Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac侧基的boc保护，再与3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯和三乙胺反应，得到Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac，包括以下步骤：
S51.用3mL DMF溶液溶解0.8g0.027mmol的Ba-PAsp(DAE-boc-co-DIP)-Ac得到溶液6；
S52.向溶液6加入 10mL三氟乙酸，室温反应2h；
S53. 将步骤S52所得产物进行蒸馏除掉大部分三氟乙酸，甲醇透析1d，干燥；
S54.用5mL DMF溶解步骤S53所得产物，216mg0.81mmol的3-马来酰亚胺丙酸琥珀酰亚胺酯，再加入4.1μL0.03mmol的三乙胺，室温搅拌反应24h；
S55. 将步骤S54所得产物经甲醇透析、干燥，得到Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac；
S6.氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的peptide先和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐混合，再与Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac反应，得到产物Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac，包括以下步骤：
S61.用2 mLDMF溶液溶解269mg0.05mmol的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的peptide得到溶液7，加入14.3mg0.05mmol的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐用，搅拌，室温反应半小时，得到溶液8；
S62.用2mL DMF溶液溶解0.1g0.0086mmol的Ba-PAsp(Mal-co-DIP)-Ac得到溶液9；
S63.将溶液8与溶液9混合，室温反应1d；
S64.将步骤S63所得产物经纯水透析、冻干，得到Ba-PAsp(Pep-co-DIP)-Ac。
8.权利要求6所述质粒运载纳米颗粒的制备方法，其特征在于，制备方法为：将纳米颗粒与权利要求5所述质粒混合，在静电作用下，组装得到质粒运载纳米颗粒；所述纳米颗粒为权利要求7中所述的纳米颗粒。
9.权利要求5所述质粒或权利要求6所述质粒运载纳米颗粒任一在制备抑制H1N1病毒的质粒运载纳米颗粒中的应用。
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一文教会你利用CRISPR-dCas9技术调控内源基因的转录激活与抑制;王玉鑫 等;《https://www.sohu.com/a/130881849_653813》;20170329;全文 *

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