WO2004002459A1

WO2004002459A1 - システイン残基を改変したタンパク質からなる中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤

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Publication number: WO2004002459A1
Application number: PCT/JP2003/008244
Authority: WO
Inventors: Shunichi Kuroda; Katsuyuki Tanizawa; Akihiko Kondo; Masakazu Ueda; Masaharu Seno; Hiroko Tada
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2004-01-08
Also published as: EP1541135A4; KR100632073B1; KR20050024420A; EP1541135A1; JP2004081210A; US20060141042A1

Description

明細書システィン残基を改変したタンパク質からなる中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤技術分野

本発明は、疾患治療用の細胞導入物質を封入することができる中空ナノ粒子に関し、より詳細には、粒子内部に封入された疾患治療用の細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤に関するものである。背景技術

近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ D D S ) と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。

目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤となるタンパク質を送り込む方法としては、従来、当該タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた発現べクタ一をエレクト口ポレーション法等により目的細胞に導入して、この遺伝子を細胞内で発現させることによりタンパク質薬剤を細胞内に送り込むいわゆる遺伝子導入方法が開発されてきた。しかし、このような従来の遺伝子導入方法では、何れも、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的にタンパク質薬剤を送 2 り込む方法としては不十分なものであった。

以上のような状況に鑑み、本発明者らは、国際公開番号 W〇 0 1 / 6 4 9 3 0の国際出願（公開日 2 0 0 1年 9月 2 7 日。以下、「国際出願 W O 0 1 6 4 9 3 0」とレ、う）において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を応用しつつ目的の細胞または組織に対して物質をより効率的に導入するだめのさらなる改良が課題となっていた。

本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、目的の細胞や組織に特異的に効率よく物質を導入するタンパク質中空ナノ粒子、およびこの中空ナノ粒子に細胞導入物質を包含させた薬剤を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、粒子を形成するタンパク質のシスティン残基を改変することにより、粒子による物質の細胞特異的導入効率が飛躍的に高まることを見出し、本発明を完成させるに至つた。

即ち、本発明に係る中空ナノ粒子は、特定の細胞（例えば肝細胞など）に対する認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子において、当該タンパク質におけるシスティン残基を改変した中空ナノ粒子である。

上記「粒子形成能を有するタンパク質」としては、例えば B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体腠上.に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。本発明の中空ナノ粒子は、このような粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むべクター.によって真核細胞（例えば哺乳類等の動物細胞または酵母）を形質転換させ、当該真核細胞に遺伝子発現させることにより製造することができる。

上記 B型肝炎ゥィルス表面抗原タンパク質を用いて形成された粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、肝臓疾患治療用の物質（遣伝子等）を包含させることにより、肝細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。

また、例えば上記 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに増殖因子ゃ抗体を提示するように改変し、このように改変された B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を用いて粒子を形成することで、肝細胞以外の特定の細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。例えば、ある癌細胞を特異的に認識する抗体を提示させることで、その癌細胞を認識し、その癌細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。

上記 B型肝炎ゥィルス表面抗原タンパク質における後述の Sタンパク質は、タンパク質の酸化還元に関与するシスティン（Cys) 残基を合計 1 4個有している。これらの Cys 残基は形成された粒子の構造を制御していると考えられるが、粒子の精製過程あるいは保存中に Cys 残 4 基同士の過剰なジスルフィド結合により、タンパク質の分子間および分子内に不規則なジスルフイド架橋が生じてポリマー化し安定性に欠ける。そこで、これら Cys 残基のうち上記構造の制御に重要でないものを改変することによって（あるいは、これら Cy s 残基以外で粒子形成能や細胞認識能に実質的な影響を与えない Cys 残基を改変することによって）ポリマー化を防ぎ、これにより、粒子に安定性が付与され、また、中空ナノ粒子への物質の封入効率が向上するので、包含する物質を効率よく細胞に導入することができる。

具体的には、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の、 S タンパク質アミノ酸配列における N 末端部分から数えて 76， 90, 139 , 147 , 149 , 22 1 番目のシスティン残基を置換し、かつ、 137 , 138番目のシスティン残基から選ばれる少なくとも 1つを置換するのが好ましい。

Cys残基の改変は、他のアミノ酸への置換が好ましいが、 Cy s残基を欠失させるような改変を行ってもよい。 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は膜貫通型の膜タンパク質であるので、粒子外、脂質二重層膜内部および粒子内の各部にまたがって存在するが、 Cy s 残基を置換するアミノ酸は、脂質二重層膜内部に存在すると予測される Cy s 残基は疎水性のアミノ酸（例えばァラニン（Al a) 残基）に、粒子外部および内部に存在すると予測される Cy s 残基は親水性のアミノ酸（例えばセリン（S er) 残基）に置換するのが好ましい。

システィン残基の改変は、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、例えば、変異遺伝子を含むベクターにて真核細胞を形質転換させ、当該寘核細胞において上記変異遺伝子を発現させる等の方法で改変された中空ナノ粒子を作製することができる。

また、本発明の中空ナノ粒子に治療物質を包含させた薬剤では、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞または組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与や遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。図面の簡単な説明

図 1 は、本発明に係る中空ナノ粒子を構成する H B s A g Lタンパク質であって、 Cys 残基が置換される前の状態のタンパク質の概略模式図である。

図 2は、本発明に係る中空ナノ粒子を構成する H B s A g S タンパク質であって、 Cys 残基が置換される前の状態のタンパク質のァミノ酸配列を示している。

図 3は、本発明に係る中空ナノ粒子を構成する H B s A g Lタンパク質をコードする遣伝子プラスミドの作成方法を示している。

図 4 ( a ), 図 4 ( b ) は、本発明に係る中空ナノ粒子を構成する H B s A g タンパク質の 1 次構造を直線で表した模式図であり、図 4

(a) は Cys 残基を 1箇所置換した H B s A g タンパク質を、図 4 ( b ) は 2 ケ所以上置換した H B s A gタンパク質を示している。図 5は、本発明に係る中空ナノ粒子の抗原性を野生型を 1 0 0 として算出した相対値として示している。図 6 ( a ) 〜図 6 ( h ) 〖ま、本発明に係る H B s A g粒子を還元条件（図 6 (a)〜図 6 (d))、または非還元条件（図 6 (e)〜図 6 (h) )でゥュスタンプ口ッティングした電気泳動写真を示している。

図 7 ( a ) 図 7 ( b ) は、本発明に係る H B s A g粒子を用いて H e p G 2細胞へ遣伝子を導入した場合の導入効率を示している。

図 8 ( a ) 〜図 8 ( f ) は、本発明に係る H B s A g粒子である B N P— L m 8 を用いて H e p G 2細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示している。

図 9 ( a ) 〜図 9 ( c ) は、本発明に係る H B s A g粒子である B N P— Lm 8 を用いて H e p G 2細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示し、図 8 ( a ), ( e ), ( f ) を拡大した図面である。

図 1 0 ( a ) 〜図 1 0 ( d ) は、本癸明に係る H B s A g粒子である B N P— L m 8 を 1週間 4 °Cで保存したものを用いて H e p G 2細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示している。

111 1 ( a ) 〜図 1 1 ( d ) は、本発明に係る HB s A g粒子である B N P— L ni 8 を用いて H e p G 2細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示している。

図 1 2 ( a ) 〜図 1 2 ( d ) は、本発明に係る H B s A g粒子である B N P— L m 8 を用いて W i D r細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を示している。

図 1 3 ( a ) 〜図 1 3 ( h ) は、本発明に係る H B s A g粒子である B N P— L m 8 と、 B N P— L m 7 b と用いて H e p G 2細胞へ遺伝子を導入した場合の導入効率を比較したものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質のシステイン残基を改変してなるものであるが、その粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子（換言すれば、特定の細胞を認識する分子）を導入することによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、 B型肝炎ウィルス（Hepatitis B Virus: H B V ) 表面抗原タンパク質等が例示される（以下、この B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質を「HB s A g」と略記する場合がある）。

また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、哺乳類等の動物細胞、酵母等が適用できる。

本発明者らは、遺伝子組換え酵母で上記 H B s A gの Lタンパク質 (後述の実施例参照）を発現させることにより、発現された H B s A gの Lタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約 2 O n m、長径約 1 5 O n mの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（J. Biol. Chem.， Vol.267, No.3, 1953-1961, 1992)。このような粒子は、 H B Vゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高レ、。また、 H B Vの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。.

このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。

上記 H B s A gの Sタンパク質（後述の実施例参照）は、タンパク質の酸化還元に関与するシスティン（Cys ) 残基を合計 1 4個有している。これらの Cys 残基は形成された粒子の構造を制御していると考えられるが、粒子の精製過程あるいは保存中に Cys 残基同士の過剰なジスルフイド結合によりポリマー化し安定性に欠ける。そこで、これら Cys 残基のうち上記構造の制御に重要でないものを改変することによつて、粒子に安定性を付与して保存を容易にし、また、中空ナノ粒子への物質の封入効率が向上するので、包含する物質を効率よく細胞に導入することができる。

改変される Cys 残基の部位は特に限定されるものではないが、 H B s A g粒子の機能を損なわないように改変する必要がある。 H B s A gの Lタンパク質は肝細胞認識部位である PreS l や PreS2 と、 S タンパク質とからなるが、 S タンパク質においてはアミノ酸を改変しても H B s A g粒子の機能への影響が少ないと考えられる。そこで、 S タンパク質に含まれているシスティン（Cys ) 残基 1 4個（図 1 の模式図中に「C」でその位置が示されている）の一部を改変することによって H B s A g粒子がその肝細胞認識能や粒子形成能を失わずにジスルフィド結合を解くことができると考えられる。

S タンパク質に含まれる 1 4個の Cys残基は、 S タンパク質のアミノ酸配列の N末端部分から数えて、 48， 65, 69, 76, 90， 107, 121， 124, 137, 13 8, 139, 147, 149, 221 番目に位置する（図 2下線部）。図 1 の模式図に示すとおり、 H B s A g タンパク質は膜貫通タンパク質であり、 N 末端側の PreS領域が粒子外部にあり、それに続く S タンパク質部分では膜を貫通して粒子内部へ入った後、再び膜を貫通して粒子外部に出、もう一度膜に入って C 末端部分は膜内に留まっている。つまり、 S タンパク質は、 3 つの膜貫通部位と粒子内部分と粒子外に露出した部分からなる。上述した 1 4個の Cys 残基は、 48, 65, 69 番目が粒子内に存在し、 76,90, 107 番目が第 2の膜貫通領域に位置し、 121, 124, 137, 138， 1 39, 147 番目が粒子外部に露出し、 149, 221 番目が第 3の膜貫通部位に位置すると予測されている。

この 1 4個の Cys 残基の中で改変される Cys 残基は特に限定されるものではないが、膜貫通部位および粒子外部に存在する Cys 残基で C 末端に近い位置にあるものが好ましい。具体的には、 76, 90, 137, 138, 1 39, 147, 149, 221 番目を置換したものが好ましく、これらの 8つの Cys 残基から選ばれた複数の Cys 残基を置換したものがより好ましい。その中でも、上記 8つの Cys 残基をすベて置換したもの、あるいは上記 8つの Cys残基のうち 137番目以外または 138番目の Cys残基以外を置換したものが特に好ましい。

上記 Cys 残基を置換する場合に、 Cys 残基を置換するアミノ酸は特に限定しないが、膜貫通部位に存在するァミノ酸は脂質 2重膜の疎水性の層に存在することとなるので疎水性であることが好ましい。疎水性のアミノ酸は、ァラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチォニン、フエ二ルァラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンバリンがあり、この中でもァラニン残基に置換するのが好ましレ、。一方、粒子外部および内部に存在すると予測される Cys 残基は親水性のアミノ酸に置換することが好ましい。親水性のアミノ酸は、アルギニン、ァスパラギン、ァスノ、"ラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、スレオニンがあり、この中でもセリン残基に置換するのが好ましい。

Cys 残基の改変は、一般的に用いられる、部位特異的突然変異導入法を用いることができる。例えば、 P C R法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto- Gotoh, Gene 152, 271- 275 (1995)他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊新細胞工学実験プロトコ一ル秀潤社 241-248 (1993) J に記载の方法、さらには、市販のキット（例えは、 Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit ストフタシーン社製）を利用する方法も可能である。

この中でも、アミノ酸置換には、特に P C R法を用いて変異を導入する方法が好ましい。これは具体的に説明すると、置換したい Cys 残基をコードする塩基配列部分に、変異を導入したプライマーをハイブリダイズさせて P C R法によって増幅させる方法である。これにより， Cys 残基が他のアミノ酸に置換された Lタンパク質をコードする遺伝子を増幅することができる。この遺伝子を上述したように、真核生物等を用いて発現させることで、 Cys 残基が置換されたタンパク質からなる中空ナノ粒子を作成することができる。

また、本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような方法によって得られた粒子表面のレセプターを任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。

もちろん、粒子形成能を有するタンパク質は、上記の B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、国際出願 W O O 1 / 6 4 9 3 0 に開示される抗原性を減少させた B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質であってもよいし、同国際出願に開示されるその他の改変型タンパク質（ B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質）であってもよい。また、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質や同タンパク質を改変した改変型タンパク質に、さらに增殖因子や抗体などの他のタンパク質を付加したものを、粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。

粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子（粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が含まれる場合と、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を融合（または直接間接に結合）させる場合とを両方含む）としては、例えば成長因子、サイト力イン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞および組織を識別するための分子、ウィルスおよび微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。具体的には、癌細胞に特異的に現れる E G F受容体や I L— 2受容体に対する抗体や E G F、また H B Vの提示するレセプターも含まれる。これらは、目的とする細胞、あるいは組織に応じて適宜選択される。なお、ここで「生体認識分子」とは、特定の細胞を認識する分子（換言すれば、特定の細胞に対する認識能を本発明の中空ナノ粒子に付与する分子）のことをいう。

以上のように作製された本発明の中空ナノ粒子は、特定の細胞に対して特異的に細胞導入物質を送り込むものとして有用である。例えば、本発明の中空ナノ粒子として、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなる粒子を用い、これに細胞導入物質を包含した薬剤を静脈注射などによって体内に投与すれば、当該粒子は体内を循環し、粒子表面に提示した肝細胞特異的レセプターにより肝細胞に導かれ、感染するそして、細胞導入物質が肝細胞中に送り込まれ、細胞導入物質の肝臓組織特異的な導入が行われる。

このタンパク質中空ナノ粒子に内包される細胞導入物質としては、例えば D N A、 R N Aなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ペプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など. どのようなものであってもよレ、。

これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に封入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーシヨン法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。また、細胞導入物質としてタンパク質を用いる場合は、粒子形 3 成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させて粒子形成する方法もある。粒子形成能を有するタンパク質に細胞導入物質を融合させる方法とは、例えば、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質をコードする遺伝子と、その下流側に上記タンパク質薬剤をコードする遺伝子とが挿入されたプラスミドを作製し、このプラスミドを用いて真核細胞に粒子を形成させることによって、粒子を形成する B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質にタンパク質薬剤が融合した薬剤を製造する方法である。

なお、薬剤の投与方法としては、静脈注射による投与のほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。

このように、本発明の薬剤を用いれば、 in vivo あるいは in vitro で細胞、または組織に特異的に物質を導入することができ、特定細胞または組織に物質を尊入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の 1 ステップとして行うことも可能になるのである。

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。

(実施例）

以下の実施例において、 H B s A g とは、 H B Vの外被タンパク質である B型肝炎ウィルス表面抗原 ( Hepatitis B virus surface Antigen) を示す。 H B s A gは、図 2に示すように 2 2 6個のアミノ酸から構成される Sタンパク質を含んでいる。 Sタンパク質の N末端側に 5 5アミノ酸（pre- S2 peptide) が付加したものが Mタンパク質. 4

Mタンパク質の N末端側に、 1 0 8 もしくは 1 1 9アミノ酸（pre - SI peptide) が付加したものが Lタンパク質である。

H B s A g Lタンパク質の上記 Pre- S領域（pre- Sl， pre-S2) は、 H B Vが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。 Pre- S1 は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、 pre- S2 は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。

真核細胞で H B s A gを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。 H B s A gの Lタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でル一メン側に粒子として放出される。

以下の実施例では、 HB s A gの Lタンパク質を用いた。

(実施例 1 ) Cys 残基が置換された HB s A g Lタンパク質をコ一ドする遺伝子プラスミドの作成

発明者らによって報告された J. Biotechnol. , Vol.33：, No.2, 157-

174, 1994記載の方法に基づいて、 p G L D L II P 3 9— R c Tに組み込まれた H B s A g Lタンパク質をコードする遺伝子断片を、動物細胞発現用プラスミド PTB1455 の SRa ' プロモーターの下流に組み込んで、 pB0442 プラスミドを得た。 H B s A g Lタンパク質の塩基配列は配列番号 1 に示され、アミノ酸配列は配列番号 2に示されている _t 得られた pB0442 プラスミドにより、 DNA をメチル化する大腸菌 K12株 (DH 5aまたは XL - 1 Blue) を形質転換し、メチル化された pB0442 プラスミドを精製した。

PB0442 プラスミドの H B s A g Lタンパク質をコードする镇域において、 Cys残基をコードする塩基配列を、 Ala残基もしくは Ser残基をコードする塩基配列に改変するために、 pB0442 プラスミドを錶型として P C R法を用いた部位特異的突然変異導入法により変異を導入した。以下に図 3を用いて 4 8番目の Cys 残基が Ser 残基に置換された H B s A g Lタンパク質遺伝子プラスミドの作成方法を例に挙げて詳細に説明する。

鎳型プラスミドとしての pB0442 プラスミドは図 3に示すように、 SR ' プロモーターとその下流に H B s A g Lタンパク質をコードする領域を有している。このプラスミドにおける H B s A g Lタンパク質の 4 8番目の Cys残基をコードするコドン（t_gt) を含む領域に、変異を導入した合成オリゴヌクレオチド（プライマー）をハイプリダイズさせて、当該プラスミドを铸型として P C R反応により、鎖を伸長させた。ここで、変異を導入したプライマーは、铸型の 4 S番目の Cys 残基のコドンとミスマッチ（鎗型が tgt、プライマーが aga) となるように設計した。これによつて、 4 8番目の Cys コドン（tgt)が Ser コドン (tct) に置換されたプラスミドを増幅することができる。

表 1 に、以上と同様の方法で、 1 4個の各 Cys 残基を 1つ置換することができるミスマッチプライマーセット（ 1 〜 1 4行目）、および近隣の 2 つまたは 3つの Cys 残基を同時に置換するミスマッチプライマ —セット（ 1 5 〜 1 7行目）の塩基配列を示す。置換位置は置換される Cys 残基の位置（S タンパク質アミノ酸の N 末端から数えた数）を示し、対応するプライマー（センス側とアンチセンス側との一組）のサイズと配列、および P C R反応におけるァニーリング温度を示した _t 置換位置の表記は、「C/48/S」が 48番目の Cys 残基を Ser残基に置換させることを意味し、「C/76/AJ が 76番目の Cys 残基を Al a残基棒させるとを意眛するものとする

in (表 1 )

ど νκΛ

m

< また、これら 1 7組 3 4個のプライマーの塩基配列は、表 1 の順番どおりに配列番号 3 ~ 3 6 に示されている。すなわち、配列番号 1および 2には 48番目の Cys残基を 1つ置換するプライマーセットの塩基配列が示され、以下同様に、配列番号 3および 4が 65番目、配列番号 5および 6が 69 番目、配列番号 7および 8が 76 番目、配列番号 9および 1 0力 S 90番目、配列番号 1 1および 1 2カ 107番目、配列番号 1 3および 1 4力 S 121 番目、配列番号 1 5および 1 6力 S 124番目、配列番号 1 7および 1 8力 S 137 番目、配列番号 1 9および 2 0が 138 番目、配列番号 2 1および 2 2力 S 139 番目、配列番号 2 3および 2 4が 147 番目、配列番号 2 5および 2 6力 S 149 番目、配列番号 2 7および 2 8 が 221 番目の Cys 残基を 1つ置換するプライマーセットの塩基配列を示している。そして、配列番号 2 9および 3 0が 147, 149 番目、配列番号 3 1および 3 2が 138, 139 番目の Cys 残基、配列番号 3 3および 3 4が 137， 138， 139 番目の Cys 残基を置換するプライマーセットの塩基配列を示している。

P C R反応は、 50 /i 1 中に鍚型 DNA 50nmol、合成 DNA プライマー (変異導入プライマ一）各 15pmol、 dATP 40nraol, dCTP 40nmol, dGTP 40nmol, dTTP 40nmol, Pfu turbo DNA polymerase 2.5 単位、 10 mM KC1、 10 mM (NH4)2S04 20 mM Tris-Cl (pH 8.75)、 2 mM MgS04、 0.1% Triton® X—100, 100 g/ml BSA 中で、 9 5。C 3 0秒力 D熱後、 9 5。C 3

0秒、アニーリング 1分、 6 8 °C 2 0分の反応を 1 8サイクル行なつた。アニーリングの温度はプライマーにより異なり、表 1に記載したとおりとした。

反応終了後、メチル化された DNA を消化する制限酵素 Dpnl (10, 000 単位/ mL) を 1μ 1加えて 37°Cで 1時間処理した。鏡型として用いた、 Cys 残基が置換されていないブラスミド DNA は、上記したように DNA をメチル化する大腸菌を形質転換して得ているので、铸型 DNA はメチル化されている。一方、 Cys 残基が置換されたものはメチル化されていない。したがって、制限酵素 Dpnl処理により、鎳型 DNAのみが消化される。残った DNA、即ち Cys 残基が置換された Lタンパク質 DNA により大腸菌 XL— 1 Blue を形質転換し、得られたコロニーからプラスミド DNA を抽出した。得られたプラスミド DNA は、制限酵素地図および塩基配列により、目的の変異が導入されていることを確認した。

また、以上のようにして作成した Cys 残基置換型 Lタンパク質ブラスミドを铸型として再度他のミスマッチプライマーによって P C R反応を行うことにより、さらに多くの Cys 残基を置換した Lタンパク質遺伝子プラスミドを作成した。

このようにして、 1〜 9個の Cys 残基が改変された、 2 7個のプラスミドを作成した。 2 7個のプラスミド番号（No. ) および名前 (pB0***)、その発現タンパク質における置換位置を表 2に示した。また、図 4に H B s A g Lタンパク質の 1次構造を直線で示し、 S タンパク質におけるシスティンの位置（矢印）と、各プラスミドの遺伝子がコードする S タンパク質のァミノ酸置換位置（S (セリン〉または A (ァラニン）が示す位置）を図示した樓式図を示した。 9

(表 2 ) プラスミドプラスミド名

No pBO No. 置換位置

1 454 C/48/S

2 497 C/65/S

3 498 C/69/S

*

468 C/76/A

455 C/90/A

6 456 C/107/A

/ 460 C/121/S

8 461 C/124/S

9 465 C/137/S

10 466 C/138/S

11 467 C/139/S

12 499 C/147/S

13 469 C/149/A

14 470 C/Z21/A

15 511 C/76,90/A

16 514 C/90/A, C/139/S

17 518 C/90/A, C/147/S

18 513 C/90.149/A

19 512 C/90.221/A

20 519 C/76,90_r221/A

21 520 C/76,90,149,221 /A

22 528 C/76,90,149,221 /A, C/139/S

23 529 C/76.90,149,221/A, C/147/S

24 533 C/76,90,149.221 /A, C/139.147/S

25 539 C/76,90,149,221 /A, C/138,139,147/S

26 540 C/76,90,1 9,221 /A, C/137,138,139,147/S

27 541 C/76,90,149,221 /A, C/107,137,138,139,147/S

(実施例 2 ) 変異導入 HB s A g粒子の C0S7細胞による発現と検出 ( 1 ) 変異導入 H B s A g粒子の C0S7細胞による発現サル腎由来細胞株 C0S7 をゥシ胎児血清（FBS) 5 %を含むダルべッコ改変イーグル培地（DMEM) 中で 3 7 °C, 5 %C02下で培養し、 T- 75 フラスコ（ファルコン社製） 1枚あたり 4 X 1 0 6個の細胞を得た。一方、 RPMI1640 ±咅地 1 0 Ml にグルコース 18.5 m gを加え、さらにこの溶液 1 Ml に 2 μ 1 の 50mMのジチオスレィトール（DTT) を加えた溶液を用意した。この溶液 0.3M 1 に上記の 4 1 0 6個の C0S7 細胞と実施例 1で得られたプラスミド DNA 5 μ gを懸濁し、エレクト口ポレーシヨンキュベット（電極間距離 4 mm) に移した後、エレクト口ポレーター（バイオラッド社製）を用いて 9 5 0 /i F、 0.3kV の条件で遺伝子導入を行なった。キュベット中の細胞を 6 0 mmディッシュ（フアルコン社製）へ移し、 5 %FBS を含む DMEM 6 Ml 中にて 3 7。C, 5 % C02 の条件下で 14から 15時間培養を行なった後、培地を 6 Ml の無血清培地 CHO-SFM II (インビトロジユン社製）に交換し、さらに 4 日間培養を継続して培地を回収した。

( 2 ) 変異導入 H B s A g粒子の抗原性による検出

回収した培地 9 0 μ 1 に 1 % FBS を含むダルべッコリン酸緩衝液 (PBS) 9 0 1 を加えて、 IMX H B s A gアツセィシステム（ダイナボット社製）により抗原性を検出した。ここで、抗原性を有している場合、 H B s A g粒子が形成されたと判断し、これにより培養液中に変異型 H B s A g粒子の存在を確認した。図 5 にプラスミド番号 1 ~ 2 5のプラスミドにより変異を導入された 2 5個の変異型 H B s A gの発現を検出した結果を示した。抗原性は野生型を 1 0 0 とした場合の相对値で示しており、プラスミドによる形質転換を行わず、粒子形成が行われていない培養液を検出した結果を陰性対照（ネガティブ）とした。なお、 3回以上行なった実験に関しては偏差値をバーで示してある。

1 4個の各 Cys 残基を 1箇所置換した結果（ 1〜 1 4行目）によると膜貫通領域に存在する Cys 残基を置換したものが良好な抗原性を有していた。特に、 76, 90， 149, 221 番目を置換したものが野生型と同等かそれ以上の抗原性を有していた。また、粒子外部に存在する Cys 残基でも C 末端に近い部位を置換したものは、良好な抗原性が保たれていた。特に、 139, 147 番目を置換したものが野生型と同等かそれ以上の抗原性を有していた。以上の特に抗原性が良好な Cys 残基置換位置をさらに組み合わせた、 2〜 9個の Cys 残基を置換した H B s A g Lタンパク質を作成した（ 1 5〜 2 5行目）。これについては、すべて野生型と同等かそれ以上の抗原性を有していた。

( 3 ) 変異導入 H B s A g粒子のウェスタンプロッティングによる検出

ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルァミドゲル電気泳動（ S D S— P AG E ) とウェスタンブロット法（Western Blotting) を用レ、て、変異型粒子分子量および二量体化した粒子の有無を検討した。

詳しくは、回収した培地 1 8 0 1 に IMX H B s A gアツセィシステムの抗 H B s マウスモノクローナ /レ抗体固定化マイクロパーテイクノレを 6 0 μ ·1 加えて、ゆっくりチューブを回転させながら 1 晚、 4 °C においた。 3分間卓上型高速遠心機を用いてマイク口パーティクルと共に培地中の粒子を沈降させ、得られた沈澱を 0.5M 1 の TBST ( 1 0 m Tris-HCl 緩衝液 pH7.5, 150mM NaCl, 0.1 Tween20) を加えて懸濁し、さらに遠心を行なって沈澱を回収する洗浄操作を 5回くり返した, この沈澱を 2等分して、 1つは還元条件下、もう 1つは非還元条件で SDS - PAGE を行なった。還元条件下とは、上記沈殿をメルカプトエタノールを加えて 9 5 °C、 5分間処理してから SDS-PAGE を行つたものでシスティン残基同士のジスルフィド結合は防がれ、タンパク質がポリマー化されていない状態で検出される。一方、非還元条件とはメルカプトェタノールを加えず熱処理もしない沈殿で SDS- PAGE を行ったもので、タンパク質はポリマー化された状態で検出される。得られた電気泳動ゲルを 1次抗体に IMX H B s A gアツセィシステムの抗 H B s ャギ抗体 . ピオチン結合体、 2次抗体にアルカリホスファターゼ標識抗ビォチンゥサギ抗体を用いてウェスタンプロッティングを行なった（図 6 ( a ) 〜 ( h ) )。（a)〜（は還元条件での結果を、（e)〜（： h)は非還元条件での結果を示し、レーン上の数字は Cys 置換位置を示している _c これによれば、すべての変異導入 H B s A g粒子において、還元条件では 53kDa付近にバンドが見られ、非還元条件においては lOOkDa付近にパンドが見られた。よって、変異型 H B s A g力 S 5 3 kDa の分子量を持ち、粒子形成時には 2量体で存在していることが確認された。 H B _S A gが 2量体で存在することは、粒子形成能と相関すると考えられる。

(実施例 3 ) 変異導入 H B s A g粒子を用いた H e p G 2細胞への遣伝子導入

p G L D L II P 3 9— R c Tに組み込まれた H B s A g Lタンパク質をコードする遺伝子断片を、実施例 1 で作成された変異型 H B s A g遺伝子と入れ換えて、酵母での発現のための変異型 H B s A g遣伝子プラスミドを作成した。この変異型 H B s A g遺伝子プラスミドの酵母による発現（粒子作成方法）は国際出願 WO O 1 X 6 4 9 3 0 に開示される方法に従った。

以下に、得られた変異型 H B s A g粒子を用いて、 G F P遺伝子をヒト肝癌細胞 H e p G 2に導入する方法を説明する。まず、 3. 5 c mガラス底皿シャーレにヒト肝癌細胞 H e p G 2を 1 X 1 0 5 cells/well になるように植菌し、 3 7で、 5 % C O 2存在下で 1 0 %ゥシ胎児血清を含む D- MEM を用いてー晚培養し、指数増殖期となるようにした。変異導入型 HB s A g粒子は、緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（G F P expression plasmid _PTB70l-hGFP) と混合して、間隔 4 mmのキュベットを使用して、 1 1 0 V、 9 5 0 Fの条件でエレクトロポレーシヨンを行なうことで、 G F P発現プラスミドを封入された。 G F P発現プラスミドを包含する H B s A g粒子を H e p G 2培養液へ混合し、 3 7 °C、 5 % C O 2 存在下で D— M E M を用いて 4 B間培養した後、 H e p G 2内での G F Pの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した（図 7 ( a ))。比較例として、野生型 H B s A g粒子についても、同様の方法でほぼ同数の H e p G 2細胞が培養されたシャーレに、等量の G F P遺伝子プラスミドを包含させた粒子を等量 H e p G 2培養液に混合し、 3 7 °C、 5 % C O 2 存在下で D— ME Mを用いて 4 日間培養した後、 H e p G 2内での G F Pの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した（図 7 ( b ))。

図 7によると、変異導入型 H B s A gによる物質導入を行った方が蛍光を発する細胞が多く、つまり、 H B s A g粒子を形成するタンパク質に変異を導入することで、細胞に遣伝子を導入する効率が向上したと言える。

以上より、この発明の Cys 残基を置換した HB s A g粒子を用いて. 培養細胞レベルで、ヒト肝細胞に対してより高い効率で特異的に遺伝子を導入できることが示された。 (実施例 4 ) Cys 残基 7個および 8個を変異させた変異型 H B s A g遺伝子による、変異型 H B s A g粒子を用いた H e p G 2細胞への遺伝子導入

さらに、変異型 H B s A g遣伝子のうち、 7個、または 8個のシスティンを置換したものを使用して、 H e p G 2細胞への遺伝子導入を試みた。変異型 H B s A g遺伝子としては、野生型の H B s A g遺伝子のうち、 76, 90, 149, 221番目の Cys残基を Ala残基に置換し、 138, 1 39, 147番目の Cys残基を Ser残基に置換したプラスミド pBO 539 と、 76, 90, 149， 221番目の Cys残基を Ala残基に置換し、 137， 139， 147番目の Cys残基を Ser残基に置換したプラスミド pBO 552 と、 76, 90, 149, 2 21 番目の Cys 残基を Ala残基に置換し、 137， 138, 139, 147 番目の Cys 残基を Ser 残基に置換したプラスミド pBO 540 とを使用した（表 3 )。なお、それぞれプラスミド pBO 539 、 pBO 552 、 pBO 540 から生成される H B s A g粒子は、それぞれ B N P— L m 7 a 、 B N P— L m 7 b、 B N P— L m 8 と称する。

(表 3 )

( 1 ) 変異型 H B s A g粒子の作製

変異型 H B s A g粒子を得るために、エレクトロポレーシヨン法で C O S 7細胞に変異型 H B s A g粒子発現べクタ一 D N Aを導入し、 4 曰間培養後、細胞培養上清を集め、遠心濾過濃縮し、粒子を回収した。実験操作を以下に詳しく説明する。

まず、サンプル数に合わせて、 5 % F C S — M E M培地で C O S 7 細胞を培養しておき、 8 0 %コンフルエレトに達した細胞を用意する。培地を新しいものに交換し、 6 〜 8時間後にトリプシン処理して細胞を集め血球計算盤で計算した。計数後、 1 . 5 m l チューブ 1本につき細胞が 4 X I 0 6個になるように分注し遠心した。遠心条件は、 3 0秒、 1 2 0 0 0 r p mである。遠心後、上清を吸引除去し、エレクトロポレーシヨン溶液 (Epmedium:RPMI- 1 6 4 0 + 1 0 mM グノレコース + 0 . 1 mM D D T ) を 3 0 0 /i 1加え細胞を懸濁した。

この細胞懸濁液に上述した表 3のプラスミド D N A pBO 539 、 pBO 552 、あるいは pBO 540 を 5 μ gを加え、氷上であらかじめ冷やしておいたキュベット（ 4 m mギャップ）に移した。これに 0 . 3 K V、 9 5 0 // Fの条件で電圧を印加（エレクト口ポレーシヨン）後、すぐに氷冷した。そして、キュベット内の細胞を 8ral の培地に再懸濁し、 6 c πιシャーレ 2枚に二等分して播種した。

3 7 °Cで 1 4 〜 1 5時間培養した後、培地を 6 c mシヤーレー枚につき C H O— S — S F M II ( G I B C O ) 3 m l に交換し、さらに 4 日間培養した。 4 日後、細胞と培養上淸を別々に回収し、細胞は一 2 0でで保存し、培養上清は 4 °Cで保存した。それぞれのプラスミド D N Aについて 4回ずつエレクトロポレーションを行った。

( 2 ) I M x H B s A gアツセィシステムによる粒子濃度の測定上記培養上清を用いて以下の I M Xによる解析を行った。 I M x H B s A gアツセィシステム（ダイナボット社）は、サンドイッチ法を利用した E I Aにより培養上清中の H B s抗原を検出する全自動ィムノアッセィシステムである。これを用いて培養上清中に検出された抗原性は「 RATE 値」として表現されるが、必要に応じてシステムに添付されている標準 H B s A g (ヒト血清由来 H B s A g粒子 ) が示す抗原性と比較して、発現した粒子濃度を H B s A g 当量に換算した。測定試料は、培養上清 9 0 μ 1 と 1 %牛胎児血清含有ダルべッコリン酸緩衝生食塩水（希釈液） 9 0 1 を混合したものを使用した。測定する時は、常にポジティブコントロール（すなわち、標準 H B s A g ) と、ネガテイブコント口ール（すなわち、希釈液のみ）と、をセットし、検量線を作成して HB s A g 当量を算出した。また、野生型 H B s A 遺伝子べクタ一（pB0411)を導入した C O S 7細胞の培養液上清とも比較した。その結果を表 4に示す。

(表 4 )

この結果より、粒子の標準 H B s A g 当量（RAT E値）が B N P

— L m 7 aで 1 5. 7、 B N P— L m 7 b で 1 5. 4、 B N P— L in 8で 1 0. 6 と、ネガティブコントロールと比べて高い値を示しており、全ての変異導入 HB s A g蛋白質が、培養上清へ分泌発現されていることが確認されたと言える。 ( 3 ) 遠心限外濾過濃縮法による濃縮

しかし、この I M x H B s A g アツセィシステムら求めたシスティン置換型の粒子濃度は低く、粒子発現量が少量であるため、使用の際には濃縮する必要があると考えられる。そこで、以下に示す遠心限外濾過濃縮を行った。

培養上清 1 6 m l を遠心濾過濃縮用デバイス（Viva spin 1， 000, 000 MW C O、 Sartor i us) に移し、 3 5 0 0 r p m、 4 5分、 4 °Cの遠心条件で液量が 8 0 0 μ 1 になるまで濃縮した。 8 0 0 1 のうち 9 0 μ 1 分を用いて Ι Μ χで H B s A g 当量を測定し、検量線から算出された抗原量をもとに回収率を計算したところ、回収率は 4 0 %前後であった。

( 4 ) L , S共発現粒子の I M Xによる S抗原性の測定

5 % F C S — M E M培地で C O S 7細胞を培養しておき、 8 0 %コンフルェントに達した細胞を用意する。培地を新しいものに交換し、 6〜 8時間後にトリプシン処理して細胞を集め、 1 . 5 m 1 チューブ 1本につき細胞が 4 X 1 0 ⁶個になるうに分注し遠心した。遠心条件は、 3 0秒、 1 2 0 0 0 r p mである。遠心後、上清を吸引除去し、エレクト口ポレーシヨン溶液 (Ep medium: RPMI- 1 6 4 0 + l O mM グルコース + 0 . 1 mM D D T ) を 3 カ卩ぇ細胞を懸濁したこの細胞懸濁液に野生型の L 粒子（H B s A g Lタンパク質からなる粒子）発現用プラスミド D N A (pB0441) あるいはシスティン改変型の L 粒子発現用プラスミド D N A 5 μ g と野生型 S 粒子（H B s A g S タンパク質からなる粒子）発現用プラスミド D N A (pB0603) あるいはシスティン改変型の S 粒子発現用プラスミド D NA 1 μ g とを同時に加え、キュベット（ 4 m mギャップ）に移した。これに 0. 3 KV、 9 5 0 Fの条件で電圧を印加（エレクト口ポレーシヨン）後、すぐに氷冷した。そして、キュベット内の細胞を 8 m 1 の培地に再懸濁し、 6 c mシャーレ 2枚に二等分して播種した。

3 7 °Cで 1 4〜 1 5時間培養した後、培地を 6 c mシャーレ一枚につき CHO— S— S FM II (G I B C O) 3 m l に交換し、さらに 4 日間培養した。 4 日後、細胞と培養上清を別々に回収し、細胞は一 2 0 °Cで保存し、培養上淸は 4 °Cで保存した。培養上清の粒子濃度（H B s A g当量）を I M X HBsAgアツセィシステムを用いて測定した。

(表 5 )

この結果より、粒子の H B s A g当量（R A T E値）が、 B N P— 111 7 1₃で 5 8. 0、 B N P — L πl 8で 4 7. 6であり、変異導入 H B s A g粒子において（ 2 ) の実験より飛躍的に高い粒子濃度（H B s

A g当量）を示した。

( 5 ) 変異型 H B s A g粒子への D N A導入

( 3 ) で得た、濃縮した変異型 H B s A g粒子（ B N P— L m 8 ) と、 G F P発現ベクター D NA 5 0 0 n g とを加え、すべてについて全量を 5 0 0 1 に調整した。エレクトロボレ—シヨン用 4 mmギヤップキュベット中、 5 0 V、 7 5 0 /i Fでエレクト口ポレーシヨンし、 5分間室温で放置した。これにより、 G F P発現ベクター D N Aが封入された変異導入 H B s A g粒子が作製された。

( 6 ) G F P発現べクタ一 D N Aを封入した L粒子による H e p G

2細胞への遺伝子導入

6 c mシャーレ 1枚分の H e p G 2細胞をトリプシン処理して細胞を集め、血球計算盤で計数した。細胞数を確認し、 8 wellチャンバ一スライドに 9 0 0 0個 /well となるように分注し、 3 7 °Cで一晚培養した。この H e p G 2細胞に、（ 5 ) の G F P発現ベクター D N Aを封入した変異型 H B s A g粒子（G F P— B N P— Lm 8 )、および G F P発現ベクター D NAを封入した野生型 H B s A g粒子を添加した。また、ポジティブコントロールとして H e p G 2細胞に G F P発現べクタ一 D NAと FuGene 6 (Roche 社）との複合体を添加したもの、ネガティブコントロールとして粒子もベクターも含まないエレクトロポレ一ション用緩衝液のみ、あるいは G F P発現べクター D NAのみを添加したものを用意した。 3 日後、共焦点顕微鏡で細胞の蛍光を観察した。なお、 G F P発現ベクター D NAを封入した H B s A g粒子は. 種々の割合の G F P発現ベクターを内包したものを作製した。

図 8は、その共焦点顕微鏡図を示し、各図面の上の写真が透過像であり、下の写真が蛍光像である。（ a ) はポジティブコントロール、 ( b ) は粒子もベクターも含まないエレクトロポレーション用緩衝液のみのネガティブコントロール（ c ) は G F P発現ベクター D NAのみのネガティブコントロール、（ d ) は野生型 H B s A g粒子（ H B s A g粒子（69 n g ) + G F P発現ベクター D N A (200 n g ) を添加したもの、（ e ) は G F P— B N P— L m 8粒子（B N P— Lm 8 ( 1 2 n g ) + G F P発現ベクター（ 2 0 0 n g ) ) を添カ卩したもの、 ( f ) は G F P — B N P— L ni 8粒子（B N P— L m S ( 2 4 n g ) + G F P発現ベクター（ 2 0 0 n g ) を添加したものである。

また図 9 は、図 8 を拡大した図面である。なお、図 9 ( a ) が図 8 ( a ) を拡大したものであり、図 9 ( b ) が図 8 ( e ) を拡大したものであり、図 9 ( c ) が図 8 ( f ) を拡大したものである。

これによれば、 G F P発現ベクターを封入した野生型粒子よりも G F P— B N P— L m 8粒子を添加した方が細胞にはるかに強い緑色蛍光が認められ、 G F P— B N P— L m 8粒子を添加したものは、添加した粒子量が 1 0 n g と少量でも蛍光を観察することができた。また, 実験を繰り返し、 B N P— L m 8粒子の D NA導入効率の再現性を確 p/、し/こ

( 7 ) B N P—： L m 8粒子の保存性

次に、回収直後の粒子の遺伝子導入能力が長期間保持されるのかを確認するために、粒子を回収した後 1週間 4 °Cで保存したあと、 G F P発現ベクター D NAを導入し、 H e p G 2細胞の培地中に添加して. 3 日後共焦点顕微鏡で蛍光を観察した。結果を図 1 0に示す。各図面の左の写真が透過像であり、右の写真が蛍光像である。

図 1 0は、（ a ) がポジティブコントロール（G F P発現ベクター D NA (200n_g)と FuGene 6 (0.5 μ 1)との複合体を添加したもの）、（ b ) がネガティブコントロール（G F P発現ベクター D NA 200ngのみを添加したもの）、（ c ) が回収直後の（左側の 2つ）、または 1週間後の (右側 2つ）、野生型 H B s A g粒子に G F P発現べクタ一を導入して (野生型 H B s A g (WT ) 6. 4 n g + G F P発現べクタ一 2 0 0 n g ) 添加したもの、（ d ) は回収直後の（左側 2つ）、または 1週間後の（右側 2つ）、 B N P _ Lm 8粒子に G F P発現ベクターを導入して、（B N P— L m 8 ( 6. 4 n g ) + G F P発現ベクター（ 2 0 0 η g )) 添加したものである。

これによれば、 1週間 4 °Cで保存した B N P— L m 8粒子に G F P 発現ベクターを導入したものを添加しても、細胞に G F P発現べクタ一による緑色の蛍光を確認することができ、 G F P発現べクタ一を細胞内に良好に導入できた。つまり、 B N P— L m 8 は良好な保存性を有していた。

( 8 ) B N P— Lm 8の肝細胞特異的な遺伝子導入

また、同様の実験を H e p G 2細胞に対して行つたもの（図 1 1 ) と、 H e p G 2細胞の代わりにヒト大腸ガン由来細胞 W i r D r を用いて行ったもの（図 1 2 ) とで比べた。ここで、図 1 1 、図 1 2の各図面の左が位相差像であり、右が蛍光像である。また、（ a ) はポジテイブコント口ール（G F P発現べクター D N A (200ng)と FuGene 6 (0.5 μ 1)との複合体を添加したもの）、 ( b ) はネガティブコントロール（ G F P発現ベクター D NAのみを添加したもの）、（ c ) は G F P発現べクタ一を内包する野生型 H B s A g粒子（野生型 H B s A g (WT ) 1 4 n g + G F P発現ベクター 2 0 0 n g ) を添加したもの、（ d ) は GF P発現ベクターを内包する B N P— L m 8粒子（B N P— L m 8 ( 5 n g ) + G F P発現べクタ一（ 2 0 0 n g )) を添加したものである。これによれば、 G F P発現べクターを内包する野生型 H B s A g粒子を添加した H e p G 2細胞、 G F P発現ベクターを內包する B N P — Lni 8粒子を添加した H e p G 2細胞では、 G F Pが導入されたが、ヒト大腸ガン由来細胞 W i r D r には導入されなかった。したがって、 B N P— L m 8粒子でもヒト肝細胞特異的な遺伝子導入が行われることが分かった。

( 9 ) B N P— L m 8 と B N P _ L m 7 b との遺伝子導入効率次に、 G F P— B N P— L m 8 と G F P— B N P— L m 7 b とにおける G F Pの細胞への導入効率を調べるため、同様の実験を G F P— B N P— L m 8を用いて行ったものと、 G F P— B N P— L m 7 b を用いて行ったものとで比べた（図 1 3 )。ここで、図 1 3の（ a ) はポジティブコントロール（G F P発現べクタ一 D NA (200ng)と FuGene 6 (0· 5μ 1)との複合体を添加したもの）、 ( b ) はネガティブコントロール（G F P発現ベクター D N Aのみを添加したもの）、（ c ) は G F P発現ベクター D N Aを内包する野生型 H B s A g粒子（野生型 H B s A g (W T ) 3. 2 n g + G F P発現ベクター D NA 2 0 0 n g ) を添カロしたもの、（ d ) は G F P発現べクタ一 D NAを内包する野生型 HB s A g粒子（野生型 H B s A g (WT ) 6. 4 n g + G F P発現べクター D NA 2 0 0 n g ) を添加したもの、（ e ) は G F P発現ベクター D N Aを内包する B N P— L m 8粒子（ B N P— L m 8 ( 3 . 2 n g ) + G F P発現ベクター D N A ( 2 0 0 n g ) を添加したもの、 ( f ) は G F P発現ベクター D NAを内包する B N P— L m 7 b粒子 ( B N P - L m 8 ( 6 . 4 n g ) + G F P発現べクタ一 D N A ( 2 0 0 n g ) を添加したもの、（ g ) は G F P発現ベクター D N Aを内包する B N P— L m 7 b粒子（B N P— L m 8 ( 3. 2 n g ) + G F P発現ベクター（ 2 0 0 n g ) を添加したもの、（ h) は G F P発現べクタ一 D N Aを内包する B N P— L m 8粒子（ B N P— L m 8 ( 6. 4 n g ) + G F P発現べクタ一（ 2 0 0 n g ) を添加したものである。これによれば、 G F P発現べクタ一 D NAを内包する B N P— L m

7 b粒子の添加によっても細胞内に強い蛍光が観察されたが、 G F P 発現べクタ一 D NAを内包する B N P— L m 8粒子の添加で、より強い蛍光が観察された。

以上の結果をまとめると、システィンを置換した H B s A g粒子、特に、 B N P— L m 8が、野生型 H B s A g粒子より蛍光が強く観察され、ヒト肝細胞、動物細胞等の細胞への D N A導入効率あるいは粒子内包能が高いということが分かった。さらに、肝細胞特異性も保持されていた。また、 7個のシスティンを置換した B N P— L m 7 b粒子と、 B N P _ L m 8 とは、共に野生型粒子より蛍光が強く観察されたが、 B N P— L m 8の方が B N P— L m 7 b粒子より強い蛍光が観察された。つまり、粒子形成に不要と考えられるシスティンを全て置換した B N P— L m 8は野生型粒子よりも細胞への D NA導入効率が高レ、事力 Sわ力: ^つた。産業上の利用の可能性

本発明の中空ナノ粒子は、以上のように、物質を細胞特異的に運搬するという機能を保ちつつ、粒子構造を安定化し、さらに効率よく物質を細胞へ導入させることができるという効果を奏する。

このようにして作成した薬剤は、静脈注射などといった簡便な方法で、特定の細胞または組織に対して選択的かつ効率的に疾患治療用の細胞導入物質を送り込むことができるので、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。

Claims

求の範囲

1 . 特定の細胞に対する認識能を有し、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子において、当該タンパク質に含まれる少なくとも 1つのシスティン残基が改変されてなる中空ナノ粒子。

2 . 上記タンパク質は、 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質である請求項 1記載の中空ナノ粒子。

3 . 膜貫通領域に存在する少なくとも 1 つのシスティン残基が疎水性アミノ酸に置換され、及び又は、粒子外部または内部に存在する少なくとも 1つのシスティン残基が親水性アミノ酸に置換されている請求項 1または 2記載の中空ナノ粒子。

4 . 膜貫通領域に存在する少なくとも 1 つのシスティン残基がァラ二ン残基に置換され、及び又は、粒子外部または内部に存在する少なくとも 1つのシスティン残基がセリン残基に置換されている請求項 3 記載の中空ナノ粒子。

5 . 上記 B型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の、 S タンパク質アミノ酸配列における N 末端部分から数えて 76, 90, 139， 147, 149, 221 番目のシスティン残基が置換され、かつ、 137, 138 番目のシスティン残基から選ばれる少なくとも 1つが置換されている請求項 2〜 4 の何れか 1項に記載の中空ナノ粒子。

6 . 上記システィン残基の改変は、上記粒子形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入し、この変異遣伝子を発現させることにより行われることを特徴とする請求項 1 〜 5の何れか 1項に記载の中空ナノ粒子。

7 . 上記変異遺伝子を含むベクタ一にて真核細胞を形質転換させ、当該真核細胞において上記変異遺伝子を発現させることにより得られることを特徴とする請求項 6記載の中空ナノ粒子。

8 . 上記真核細胞は、動物細胞または酵母であることを特徴とする請求項 7記载の中空ナノ粒子。

9 . 請求項 1 〜 8の何れか 1項に記載の中空ナノ粒子に細胞導入物質が封入されていることを特徴とする薬剤。

1 0 . 上記細胞導入物質は、遺伝子であることを特徴とする請求項 9 記載の薬剤。

1 1 . 請求項 9または 1 0に記載の薬剤を用いる疾患の治療方法。