KR100674325B1 - 단백질 중공 나노 입자 및 이를 이용한 약제 - Google Patents

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Abstract

간세포 등의 특정 세포에 대한 인식능을 가지며, 입자형성능을 가지는 제 1 단백질(예를 들어, B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질)로 이루어지는 중공 나노 입자에 있어서, 상기 제 1 단백질에는, 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질(예를 들어, B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질)과 상호 작용하고 있는 것이 포함되어 있다. 이에 의해, 목적하는 세포나 조직에 특이적으로 물질을 도입하는 중공 나노 입자로서, 안정된 생산량을 얻을 수 있는 중공 나노 입자 및 이를 이용한 약제를 제공할 수 있다.

Description

단백질 중공 나노 입자 및 이를 이용한 약제{Hollow nanoparticles of protein and drug using the same}
본 발명은 질환치료용 세포도입물질을 봉입할 수 있는 중공 나노 입자에 관한 것으로서, 상세하게는 입자 내부에 봉입된 질환치료용 세포도입물질을 특정 세포 또는 조직 내에 특이적으로 도입 가능한 약제에 관한 것이다.
최근, 의학 분야에 있어서 환부에 직접 작용하며, 높은 효과를 나타내는 부작용이 적은 약품의 개발이 활발히 행해지고 있다. 특히, 약물전달체계(DDS)라고 불리는 방법은 목적세포 혹은 목적조직에 대해 특이적으로 약제 등의 유효성분을 운반하고, 목적개소에서 유효성분을 작용시킬 수 있는 방법으로서 주목받고 있다.
목적세포, 혹은 목적조직에 대해 특이적으로 약제가 되는 단백질을 넣어보내는 방법으로서, 종래에는 이 단백질을 코딩하는 유전자가 들어 있는 발현벡터를 일렉트로포레이션(electroporation)법 등에 의해 목적세포에 도입하여, 이 유전자를 세포 내에서 발현시킴으로써 단백질 약제를 세포 내로 넣어보내는 소위 유전자 도입방법이 개발되어 왔다.
이와 같은 기술로서는, 특허문헌 1: 국제공개 제 01/64930호 팜플렛, 비특허문헌1:‘생화학 저널’(“Journal of Biological Chemistry”), (미국), 1992년, 제 267권, 제 3호, p. 1953-1961, 비특허문헌2:‘유전자’(“Gene”), (네덜란드), 1991년, 제 106호, p. 143-149, 비특허문헌3:‘백신’(“Vaccine”), (영국), 2001년, 제 19호, p. 3154-3163, 비특허문헌4: ‘바이러스학 저널’(“Journal of Virology”), (미국), 1994년, 제 68호, p. 1643-1650, 비특허문헌5:‘바이러스학’(“VIROLOGY”), (미국), 1997년, 제 228호, p. 115-120 등을 들 수 있다.
그러나 이러한 종래의 유전자 도입방법으로는, 어느 것도 목적세포 혹은 목적조직에 대해 특이적으로 단백질 약제를 넣어보내는 방법으로서는 불충분한 것이었다.
상기와 같은 상황에 착안하여, 본 발명자들은 특허문헌 1에서, 입자형성능을 가지는 단백질에 생체인식분자가 도입된 중공 나노 입자를 이용하여, 목적하는 세포나 조직에, 물질(유전자, 단백질, 화합물 등)을 특이적으로 그리고 안전하게 운반, 도입하기 위한 방법 등을 제안하고 있으나, 이 방법을 응용하여 상기 중공 나노 입자의 안정된 생산량을 얻기 위한 더 나은 개량이 과제가 되고 있었다.
본 발명은, 상기 과제에 착안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 안정된 생산량을 얻을 수 있는, 목적하는 세포나 조직에 특이적으로 물질을 도입하는 단백질 중공 나노 입자 및 이 중공 나노 입자에 세포도입물질을 포함시킨 약제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 검토를 거듭한 결과, 입자형성능을 가지는 단백질과 함께 캡시드 구조를 형성하는 단백질을 발현함으로써, 입자의 생산량이 비약적으로 높아지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키게 되었다.
즉, 본 발명에 따른 중공 나노 입자는 특정 세포(예를 들어, 간세포 등)에 대한 인식능을 가지며, 입자형성능을 가지는 제 1 단백질로 이루어지는 중공 나노 입자에 있어서, 상기 제 1 단백질에는 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질과 상호작용하고 있는 것이 포함되어 있는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 "입자형성능을 가지는 제 1 단백질"로서는, 예를 들어 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 예로 들 수 있다. 이 단백질은 진핵세포에서 발현시키면, 소포체막 상에 막단백질로서 발현, 축적되고, 입자로서 방출된다.
또한 상기 "캡시드 구조"란, 바이러스 입자에 있어서, 바이러스 게놈을 감싸고, 보호하고 있는 단백질의 껍질을 가리키며, 상기 "캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질"로서는, 예를 들어 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질을 예로 들 수 있다. 상기 제 2 단백질은, 상기 제 1 단백질과 공발현시키면, 상호작용하여 입자형성을 촉진시킨다. 또한, 여기에서 말하는 "상호작용"이란, 제 1 단백질과 제 2 단백질이 직접 접촉하여 서로 작용하고 있는 것을 말한다. 제 1 단백질과 제 2 단백질은 적어도 하나가 직접 접촉하고 있으면 되나, 그 수는 많으면 많을수록 좋다. 또한, 상기 상호작용은 반드시 제 2 단백질이, 제 1 단백질이 형성하는 입자의 내부에 포함되어 행해질 필요는 없으며, 입자 외측의 제 2 단백질과 제 1 단백질이 상호작용하고 있어도 된다. 이에 의해, 제 1 단백질의 입자형성이 촉진되어 입자형성률이 높아짐과 동시에, 그 안에 세포도입물질을 포함시켜서 약제로서 이용하는 것도 가능하게 된다.
본 발명의 중공 나노 입자는 이러한 입자형성능을 가지는 제 1 단백질을 코딩하는 유전자 및 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질을 코딩하는 유전자를 벡터에 의해 동일한 진핵세포(예컨대, 효모)에 도입하고, 이 진핵세포에 유전자 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 제 2 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하는 벡터로서는, 오레오바시딘(Aureobasidin)A감수성유전자를 가지는 벡터(예컨대, 다카라주조사(寶酒造社)제의 pAUR123)에 의해 도입하는 것이 바람직하다.
상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질 및 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질을 발현시켜서 얻은 입자는, 간세포를 인식하고 간세포에 대해 특이적으로 입자 내의 물질을 운반할 수 있으므로, 간장질환 치료용 물질(유전자 등)을 포함시킴으로써, 간세포에 대해 특이적 그리고 효과적으로 작용하는 유효한 치료약이 된다.
또한, 예를 들어 상기 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 본래의 간세포에 대한 감염능을 결실(缺失)하도록 변형하고, 나아가 증식인자나 항체를 제시하도록 변형하여, 이와 같이 변형된 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 이용해서 입자를 형성함으로써, 간세포 이외의 특정 세포에 대해 특이적으로 입자 내의 물질을 운반할 수 있다. 예컨대, 베타셀루린(BTC)을 제시시킴으로써, 췌장β세포를 인식하고, 그 췌장β세포에 대해 특이적으로 입자 내의 물질을 운반할 수 있다. 또한, 염기성선유아(線維芽)세포증식인자(bFGF)를 제시시킴으로써, 혈관내피 혹은 뇌하수체세포를 인식하고, 그 혈관내피 혹은 뇌하수체세포에 대해 특이적으로 입자 내의 물질을 운반할 수 있다.
이러한 변형된 B형 간염 바이러스 표면 항원, 특히 BTC제시형 B형 간염 바이러스 표면 항원, bFGF제시형 B형 간염 바이러스 표면 항원은, B형 간염 바이러스 표면 항원만을 발현시킨 경우에는 입자를 형성하기 매우 어려우나, 상기 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질과 함께 발현함으로써 입자형성률이 비약적으로 향상되므로 그 효과가 특히 높다고 할 수 있다.
또한, 본 발명의 중공 나노 입자에 치료물질을 포함시킨 약제에서는, 정맥주사라는 간편한 방법으로 특정 세포 또는 조직에서의 질환을 효과적으로 치료할 수 있어, 종래의 유전자 치료방법과 크게 다르고, 다량의 약제투여나 유전자 치료 등에 있어서 외과수술을 필요로 하지 않으며, 부작용의 우려도 극히 낮아 그대로 임상응용 가능한 것이다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 약제를 투여하는 것에 의한 질환의 치료방법이다.
본 발명의 또 다른 목적과 특징 및 우수한 점은 이하에 나타내는 기재에 의해서 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 장점은 첨부도면을 참조한 설명으로 명백히 알 수 있을 것이다.
본 발명의 중공 나노 입자는 입자형성능을 가지는 제 1 단백질로 이루어지는 중공나노입자에 있어서, 상기 제 1 단백질에는, 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질과 상호작용하고 있는 것을 포함하여 이루어지는 것이나, 그 입자형성능을 가지는 제 1 단백질에 생체인식분자(바꿔 말하면, 특정 세포를 인식하는 분자)를 도입함으로써, 목적세포 혹은 목적조직에 특이적으로 물질을 운반할 수 있다. 상기 입자형성능을 가지는 제 1 단백질로서는, 다양한 바이러스로부터 얻어지는 서브바이러스 입자를 적용할 수 있다. 구체적으로는, 입자형성능을 가지는 제 1 단백질로서, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus:HBV)표면 항원 단백질 등이 예시된다(이하, 이 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 "HBsAg단백질"로 약칭하는 경우가 있다). 이 경우 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질로서는, B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질(이하, 이 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질을 "HBcAg 단백질"로 약칭하는 경우가 있다)을 이용하면 된다.
먼저, 입자형성능을 가지는 제 1 단백질에 대해 설명한다. 입자형성능을 가지는 단백질로 이루어지는 단백질 입자로서는, 진핵세포에서 상기 제 1 단백질을 발현시킴으로써 얻어지는 것을 들 수 있다. 즉, 진핵세포에서 입자형성능을 가지는 단백질을 발현시키면, 이 단백질은 소포체막 상에 막단백질로서 발현, 축적되고, 입자로서 방출되는 것이다. 이때, 진핵세포로서는 포유류 등의 동물세포, 효모 등이 적용가능하다.
본 발명자들은 유전자 변환 효모에서 상기 HBsAg L단백질을 발현시킴으로써, 발현된 HBsAg L단백질로부터 효모유래의 지질이중막에 다수의 이 단백질이 메워진 단직경 약 20nm, 장직경 약 150nm의 타원상 중공 입자(이하 HBsAg L입자라고 한다)가 형성됨을 발견하고 보고하고 있다(비특허문헌 1 참조). 이러한 입자는 HBV 게놈을 전혀 포함하지 않으므로 바이러스로는 기능하지 않으며 인체 안전성이 매우 높다. 또한 HBV 간세포로의 매우 높은 감염력을 담당하는 간세포 특이적 리셉터를 입자 표면에 제시하고 있어, 간세포에 대해 특이적으로 물질을 운반하는 운반체로서의 효과도 높다.
이와 같이 유전자 변환 효모를 이용하여 단백질 입자를 형성하는 방법은 균체 내의 가용성 단백질로부터 고효율로 입자가 생산된다는 점에서 적합하다.
본 발명자들은 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 상기 HBsAg L단백질을 발현시킬 때에 HBcAg 단백질을 동시에 발현시키면 상기 HBsAg L입자의 형성률이 비약적으로 높아지는 것을 발견하였다. 이것은 HBcAg 단백질이 HBsAg의 L단백질에 작용하여, HBsAg L입자의 형성을 촉진하고 있기 때문으로 생각된다.
HBcAg 단백질은 도 2의 (a)에 도시한 바와 같이, Assembly domain과 RNA-binding protamine domain으로 이루어진다. 상기 Assembly domain은 캡시드 구조를 형성하기 위한 부위로, 본 발명의 중공나노입자의 형성에는 이 부위가 중요하다. HBcAg 단백질은 도 2의 (b)에 도시한 바와 같이 스스로 모여들어 캡시드 구조를 형성하는 능력을 가지고 있으나, 반드시 캡시드 구조를 형성하고 있을 필요는 없으며, 개개의 분자가 HBsAg L단백질에 작용하고 있어도 된다.
HBsAg의 L단백질과 HBcAg를 도입하기 위한 벡터로서는, 다양한 프로모터를 집어 넣은 발현벡터가 있으므로, 목적에 맞는 것을 선택하면 된다. 특히 HBcAg 단백질을 도입하기 위해서는, HBsAg의 L에는, 예를 들어 pAUR123(Takara제)과 같은 오레오바시딘감수성유전자 aurl을 가지는 벡터를 사용하면, HBsAg의 입자형성의 촉진효과가 높아진다는 것이 알려져 있다.
또한, 본 발명의 단백질 중공 나노 입자에서는 상기와 같은 방법에 의해 얻어진 입자 표면의 리셉터를 도 1에 도시한 바와 같이 임의의 생체인식분자로 변형함으로써, 간세포 이외에도 임의의 세포 및 조직에 매우 높은 특이성으로 물질을 운반, 도입하는 것이 가능하게 된다.
물론, 입자형성능을 가지는 제 1 단백질은, 상기의 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질에 한정되는 것은 아니며, 입자를 형성할 수 있는 단백질이라면 어느 것이라도 가능하며, 동물세포, 식물세포, 바이러스, 균류 등에서 유래하는 천연 단백질이나, 다양한 합성 단백질 등이 고려될 수 있다. 또한, 예를 들어 바이러스 유래 항원 단백질 등이 생체 내에서 항체를 야기할 가능성이 있는 경우 등은 변형하여 항원성을 감소시킨 것을 입자형성능을 가지는 단백질로서 이용해도 된다. 예를 들면, 입자형성능을 가지는 단백질로서는 특허문헌 1에 개시되는 항원성을 감소시킨 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이어도 되고, 특허문헌 1에 개시되는 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 유전자조작기술을 이용하여 변형한 단백질이어도 되며, 입자구조가 안정되도록 변형한 것이어도 된다. 또한, B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질이나 이 단백질을 변형한 단백질에 다시 증식인자나 항체 등의 다른 단백질을 부가한 것을, 제 1 단백질로서 이용해도 된다.
입자형성능을 가지는 단백질에 도입되는 생체인식분자로서는, 예를 들어 성장인자, 사이토카인 등의 세포기능조절분자, 세포표면항원, 조직특이적항원, 리셉터 등의 세포 및 조직을 식별하기 위한 분자, 바이러스 및 미생물에서 유래하는 분자, 항체, 당쇄(糖鎖), 지질 등이 바람직하게 이용된다. 구체적으로는, 암세포에 특이적으로 나타나는 EGF 수용체나 IL-2 수용체에 대한 항체나 EGF, 또는 HBV가 제시하는 리셉터도 포함된다. 이것들은 목적하는 세포 혹은 조직에 따라 적절히 선택된다. 여기서, "생체인식분자"란, 특정 세포를 인식하는 분자(바꿔 말하면, 특정 세포에 대한 인식능을 본 발명의 중공 나노 입자에 부여하는 분자)를 말한다. 또한 이 생체인식분자는, 입자형성능을 가지는 제1의 단백질에 생체인식분자가 포함되는 경우와, 제 1 단백질에 생체인식분자를 융합(또는 직접 간접으로 결합)시키는 경우를 모두 포함한다.
상기와 같이 생체인식분자를 HBsAg L단백입자에 부여하는 방법으로서는, HBsAg L단백질이 가지는 간세포인식부위를 임의의 생체인식분자로 변형하여 발현시키는 방법을 생각할 수 있다. 이와 같이 간세포인식부위를 변형한 HBsAg L단백질은, 이것만으로는 입자형성률이 낮으나, 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질과 상호작용함으로써, 입자형성이 효과적으로 촉진된다. 이것은 특히 이 방법에서 BTC나 bFGF를 제시하도록 변형한 HBsAg L단백질 입자에 적합하다. 또한 제 2 단백질은 입자내부로부터가 아닌 외측으로부터 상호작용하고 있어도 된다.
또한, 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질도 상기의 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질에 한정되는 것은 아니며, 캡시드 구조를 형성할 수 있는 단백질이라면 어느 것이라도 가능하며, 동물세포, 식물세포, 바이러스, 균류 등에서 유래하는 천연 단백질이나, 다양한 합성 단백질 등이 고려될 수 있다. 예를 들어 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질을 중공 나노 입자의 입자형성능이 향상되도록 변형한 것이어도 되고, 단백질의 기능이 변하지 않도록 변형한 것이어도 된다.
상기와 같이 제작된 본 발명의 중공 나노 입자는 특정 세포에 대해 특이적으로 세포도입물질을 넣어보내는 것으로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 중공 나노 입자로서, B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질로 이루어지는 입자를 이용하고, 이것에 세포도입물질을 포함한 약제를 정맥주사 등에 의해 체내에 투여하면, 이 입자는 체내를 순환하며 입자표면에 제시된 간세포 특이적 리셉터에 의해 간세포로 유도되고 감염시킨다. 그래서 세포도입물질이 간세포 내로 운송되고, 세포도입물질의 간장 조직 특이적인 도입이 행해진다.
이 단백질 중공 나노 입자에 내포되는 세포도입물질로서는, 예컨대 DNA, RNA 등의 유전자, 천연 혹은 합성 단백질, 올리고 뉴클레오티드, 펩티드, 약제, 천연 혹은 합성 화합물 등 어떠한 것이라도 된다.
이들 세포도입물질을 상기의 중공 나노 입자에 봉입하는 방법으로서는, 통상의 화학적, 분자생물학적 실험방법으로 이용되는 다양한 방법이 적용될 수 있다. 예를 들면, 일렉트로포레이션법, 초음파법, 단순확산법, 혹은 전하를 가지는 지질을 이용하는 방법 등이 바람직하게 예시된다. 또한, 세포도입물질로서 단백질을 이용하는 경우는, 입자형성능을 가지는 단백질에 세포도입물질을 융합시켜서 입자를 형성하는 방법도 상기 세포도입물질의 봉입에 포함된다고 생각된다. 입자형성능을 가지는 단백질에 세포도입물질을 융합시키는 방법이란, 예컨대 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자와, 그 하류측에 상기 단백질 약제를 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드를 제작하여, 이 플라스미드를 이용하여 진핵세포에 입자를 형성시킴으로써, 입자를 형성하는 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질에 단백질 약제가 융합된 약제를 제조하는 방법이다.
여기서, 약제의 투여방법으로서는 정맥주사에 의한 투여 외에 경구투여, 근육내투여, 복강내투여, 피하투여 등을 들 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 약제를 이용한다면, in vivo 혹은 in vitro에서 세포, 또는 조직에 특이적으로 물질을 도입할 수 있으며, 특정 세포 또는 조직에 물질을 도입하는 것을 각종 질환의 치료법 혹은 치료법의 1단계로서 행하는 것도 가능하게 된다.
이하, 첨부된 도면에 따라 실시예를 예시하고, 본 발명의 실시 형태에 관해서 더욱 상세하게 설명한다. 물론 본 발명은 이하의 예에 한정되는 것은 아니며, 세부에 대해는 다양한 양태가 가능하다는 것은 말할 것도 없다.
이하, HBsAg란, HBV의 외피 단백질인 B형 간염 바이러스 표면 항원(Hepatitis B virus surface Antigen)을 나타내고, HBcAg란, HBV 내부에서 캡시드 구조를 형성하는 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원(Hepatitis B virus core Antigen)을 나타낸다.
HBsAg는 226개의 아미노산으로 구성되는 S단백질을 포함하고 있다. S단백질의 N말단측에 55 아미노산(pre-S2 peptide)이 부가된 것이 M단백질, M단백질의 N말단측에 108 혹은 119 아미노산(pre-S1 peptide)이 부가된 것이 L단백질이다. HBsAg L단백질의 염기서열은 서열번호 1에, 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내고 있다.
HBsAg L단백질의 상기 Pre-S 영역(pre-S1, pre-S2)은 HBV가 간세포에 결합할 때에, 각각 중요한 역할을 담당한다는 것이 알려져 있다. pre-S1은 간세포에 직접 결합하는 부위를 가지며, pre-S2는 혈중의 중합알부민을 통해 간세포에 결합하는 중합알부민 리셉터를 가진다.
진핵세포로 HBsAg L단백질을 발현시키면, 이 단백질은 소포체막 상에 막단백질로서 발현, 축적된다. HBsAg L단백질은 분자간에 응집을 일으키고, 소포체막의 식작용에 의해, 출아 형태로 루멘(lumen) 속에 입자로서 방출된다. 이하 이 입자를 B형 간염 바이러스 표면 항원 입자(HBsAg L입자)라고 한다.
상기의 방법으로 대량으로 생산한 HBsAg L입자는, 바이러스 유래의 독성물질을 전혀 포함하지 않는 중공의 서브바이러스 입자이다. 발명자들은 HBsAg L입자가 인간간장특이적으로 감염하는 능력을 가지는 것에 주목하고, 인간간장특이적인 유전자 또는 약제의 도입기술을 개발하였다.
또한, HBsAg L입자표면에 제시되어 있는 pre-S1 펩티드가 인간간장특이적인 인식을 행하는 부위인 점에서, 이 펩티드를 임의의 생체인식분자로 치환한 변형형 HBsAg L입자를 제작하고, 임의의 장기나 세포특이적으로 유전자 및 약제를 도입하는 계(系)를 제작하였다. 이 치환은 pre-S1 펩티드가 상기 HBsAg L단백질의 N말단의 세번째 아미노산 잔기에서 77번째 아미노산 잔기에 해당하기 때문에, pre-S1 펩티드를 임의의 생체인식분자(리간드, 리셉터, 항체 등)를 코딩하는 유전자로 치환함으로써 행해진다. 임의의 생체인식분자가 부가된 HBsAg의 L단백질을 진핵생물로 발현시키면, 임의의 생체인식분자를 제시한 HBsAg L입자가 생산된다.
상기 방법에 의해 인간간세포 특이성을 결실한 간세포인식부위결실형 HBsAg L입자(Null형 HBsAg L입자)나, 혈관내피, 뇌하수체세포에 특이적으로 감염하는 염기성선유아세포성장인자(bFGF)제시형 HBsAg L입자, 악성도가 높은 암조직에 특이적으로 감염하는 상피세포성장인자(EGF)제시형 HBsAg L입자, 베타셀루린(BTC)리셉터를 인식하여, 췌장β세포에 특이적으로 감염하는 베타셀루린(BTC)제시형 HBsAg L입자, 임의의 특이성을 가지는 항체를 HBsAg L입자에 부여한 항체제시형 HBsAg L입자가 제작 가능하다.
그러나 상기의 변형형 HBsAg L입자는 입자형성효율이 좋지 않으며, 야생형의 HBsAg L입자가 주조용 효모를 이용하는 것에 의해 전(全)가용성 단백질의 약 40%에 달하는 대량 발현에 성공하고 있는 것에 비해, 변형형 HBsAg L입자는 대량 발현을 일으키는 것은 드물어서 전가용성 단백질의 수%미만 밖에 발현되고 있지 않다. 특히, bFGF제시형 L단백질은 전가용성 단백질의 1%미만이었다.
이는 일반적인 유전자변형단백질의 생산성과 동등하나, 약물전달체계로서 변형형 HBsAg L입자를 이용하기 위해서는 보다 발현량을 높일 필요가 있다. 또한, HBsAg L입자의 생산량이 부여되는 생체인식분자에 의해 크게 변화되는 것은, 부여되는 생체인식분자가 HBsAg L입자의 생산에 관여하고 있음을 나타내며, 효율적인 생산을 행하는 데 있어서 장애가 되는 불안정한 발현량을 개선할 수 있는 가능성을 나타내고 있다.
그리하여 발명자들은, 변형형 HBsAg L입자의 발현률이 낮은 이유는, 효모균체내에서의 HBsAg L입자형성과정에서 필수인 pre-S영역의 N말단측으로부터의 소포체막투과를, 치환한 생체인식분자가 입체(立體)장애를 일으켜 방해하고 있기 때문으로 생각하였다.
한편, 비특허문헌 4 및 5에 의하면, B형 간염 바이러스의 내부 코어 항원 단백질(HBcAg)이, 바이러스입자형성과정에 있어서, L단백질 pre-S1영역의 C말단부분과 상호작용하여 간세포 중의 입자형성을 촉진한다는 것이 기재되어 있다.
HBcAg는 도 2의 (a)에 도시한 바와 같이 183개의 아미노산으로 구성되며, 1~144(혹은 149)아미노산까지의 Assembly domain과 이 다음의 RNA-binding protamine domain으로 이루어진다. 상기 Assembly domain은 캡시드 구조를 형성하기 위한 부위이고, RNA-binding protamine domain은 바이러스 게놈 DNA와 결합하여 안정적으로 유지하기 위한 부위이다. HBcAg는 도 2의 (b)에 도시한 바와 같이 스스로 모여 들어 캡시드 구조를 형성하는 능력을 가지고 있다. 이 캡시드 구조는 일반적으로, B형 간염 바이러스입자에서는, 도 2의 (c)에 도시한 바와 같이, 바이러스 입자의 내부에 존재하고 있으며, 캡시드 구조 내에 포함된 바이러스 게놈 DNA와 상호작용하여 안정적으로 유지함과 동시에, HBsAg L입자와도 상호작용하여, 바이러스 입자형성을 내측으로부터 촉진하고 있다고 생각되고 있다. 따라서 이하의 실시예에서, HBsAg L단백질과 함께 HBcAg를 발현시켜 입자형성을 함으로써, HBcAg가 HBsAg L입자 형성을 도와, HBsAg L입자가 안정적으로 발현되는 지를 조사하기 위해, HBsAg L단백질 혹은 변형형 HBsAg L단백질과 HBcAg를 효모에 공발현시킨 HBsAg L입자의 입자형성률을 관찰하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 HBsAg L입자의 생체인식분자의 변형을 설명하는 도면이다.
도 2의 (a)는 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자를 구성하는 HBcAg 단백질을 나타내는 도면으로서, HBcAg 단백질의 개략도를 나타내며, 도 2의 (b)는 HBcAg가 구성하는 캡시드 구조를 나타내고, 도 2의 (c)는 캡시드 구조를 가지는 B형 간염 바이러스를 나타내고 있다.
도 3의 (a)는 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자를 제작하기 위한 벡터를 나타낸 도면으로서, HBsAg L단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 벡터를 나타내며, 도 3의 (b)는 HBcAg L단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 벡터를 나타낸다.
도 4는 BTC제시형 HBsAg L입자 및 bFGF제시형 HBsAg L입자의 웨스턴블롯팅도를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자인 HBcAg와 야생형 HBsAg L단백질을 공발현시켜 얻은 HBsAg L입자의 항원성을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자인 HBcAg와 EGF제시형 HBsAg L단백질을 공발현시켜 얻은 EGF제시형 HBsAg L입자의 항원성을 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자인 HBcAg와 Null형 HBsAg L단백질을 공발현시켜 얻은 Null형 HBsAg L입자의 항원성을 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자인 HBcAg와 BTC제시형 HBsAg L단백질을 공발현시켜 얻은 BTC제시형 HBsAg L입자의 항원성을 나타내는 도 면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시형태에 따른 중공 나노 입자인 HBcAg와 bFGF형 HBsAg L HBsAg L단백질을 공발현시켜 얻은 bFGF형 HBsAg L입자의 항원성을 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시형태에 따른 BTC제시형 HBsAg L입자 및 bFGF제시형 HBsAg L입자의 항원성을, 야생형 HBsAg L단백질의 단독발현에 의해 형성된 입자의 항원성을 100으로 했을 때의 상대값으로 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시형태에 따른 bFGF제시형 HBsAg L입자의 웨스턴블롯팅도를 나타내는 도면이다.
도 12의 (a)는 본 발명의 일 실시형태에 따른 bFGF제시형 HBsAg L입자의 CsCl밀도구배원심을 나타내는 도면으로서, CsCl밀도구배튜브를 나타내고 있으며, 12의 (b)는 CsC1밀도구배원심한 후의 분획마다의 항원성을 나타내고 있다.
도 13의 (a)는 본 발명의 일 실시형태에 따른 bFGF제시형 HBsAg L입자를 프로테이나제처리한 후, 웨스턴블롯팅을 행한 결과를 나타내는 도면으로서, 항L단백질항체를, 도 13의 (b)는 항bFGF항체를, 도 13의 (c)는 항HBcAg항체를 사용하여 웨스턴블롯팅을 행한 결과를 나타내고 있다.
도 14의 (a)는 본 발명의 일 실시형태에 따른 BTC제시형 HBsAg L입자의 CsCl밀도구배원심의 결과를 나타내는 도면으로서, CsCl밀도구배튜브를 나타내고 있으며, 도 14의 (b)는 CsC1밀도구배원심한 후의 분획 마다의 항원성을 나타내고 있고, 도 14의 (c)는 조(粗)추출액 또는 밀도구배원심분획의 웨스턴블롯팅의 결과를 나타 내는 도면이다.
도 15의 (a)는 본 발명의 일 실시형태에 따른 HBsAg L입자를 나타내는 도면으로서, HBcAg가 HBsAg L입자의 외측으로부터 HBsAg L단백질과 상호작용하고 있는 모습을 나타내며, 도 15의 (b)는 HBcAg가 HBsAg L입자의 내측에 포함되어 HBsAg L단백질과 상호작용하고 있는 모습을 나타내고 있다.
(실시예 1)
상기 변형형 HBsAg L 단백질의 제작방법을 이하에 나타낸다. 도 3의 (a)에 도시한 바와 같이, 본 발명자들에 의해 보고된 특허문헌 1에 기재된, pGLDL IIP39-RcT의 pre-S1영역(3아미노잔기로부터 77아미노잔기)을 삭제한 pGLDLIIP39-RcT△3-77의 pre-S영역에, 제한효소 NotI를 이용하여, 예컨대 BTC 또는 bFGF를 코딩하는 유전자를 삽입한 HBsAg L단백질 발현벡터를, 효모에 발현시킨다. 이에 의해 생체인식분자로서 BTC를 제시하는 HBsAg의 L단백질, 즉 BTC제시형 HBsAg L입자 혹은 bFGF를 제시하는 bFGF제시형 HBsAg L입자를 얻었다.
(실시예 2) HBcAg의 효모용 발현 플라스미드의 제작
(2-1) 플라스미드로 프로모터 TDH-3 삽입
야생형 HBsAg발현 플라스미드 pRS405-2-LAG에 삽입되어 있는 프로모터 TDH3의 DNA단편을 PCR법에 의해 증폭하였다. PCR법은 표 1에 나타낸 조성의 반응액을 사용하고, 프라이머(+)로서 서열번호 3에, 프라이머(-)로서 서열번호 4에 제시된 서열을 사용하였다.
Figure 112005012691211-pct00001
상기 반응액을 4등분하여, 그 중 3개를 각각 이하의 조건에서 PCR반응을 행하였다. 94℃ 30초 가열 후, 94℃ 1분, 어닐링 1분, 72℃ 1분의 반응 사이클을 30사이클 행하고, 그 후 72℃에서 5분 가열하였다. 어닐링온도는 조건검토를 위해 55℃, 60℃, 65℃의 3종류로 행하였다. 이 PCR에서는, 이들 3종류 모두 동일하게 DNA증폭이 행해졌으므로, 3조건의 PCR산물을 한데 모아 회수하여 TA클로닝을 행하였다. 그리고 4등분 중 나머지 1개는 주형DNA 대신에 동량의 오츠카증류수를 가하여, 어닐링온도 60도에서 네가티브 콘트롤로 하였다.
도 3의 (b)에 도시한 바와 같이, PCR법으로 얻어진 DNA단편을 pGEM-T Easy vector(Promega)에 연결하여 염기서열을 확인한 후, 제한효소 KpnI, XhoI(Takara)로 절단하여 얻어진 DNA단편을 오레오바시딘A내성효모형질전환시스템용의 대장균·효모 셔틀 벡터인 pAUR123(Takara제)에 KpnI, XhoI로 연결하여 pAUR123-TDH3를 얻었다. pAUR123은 오레오바시딘A 감수성유전자 aurl을 가지고 있으며, 이 유전자는 IPC(inositolphosphorylceramide)합성효소를 코딩하고 있다.
(2-2) 플라스미드로 HBcAg 유전자 삽입
이어서, HBV(adr)의 게놈을 주형으로하여 PCR법으로 HBcAg의 DNA단편을 증폭하였다 HBV게놈으로서는, Nucleic Acids Res. 11(6), 1747-1757(1983)기재분의 플라스미드 pHBr330을 사용하였다. 또한 이 게놈 서열은 GenBank 액세션 번호 D00630으로 등록되어 있다. 또한 HBcAg의 아미노산 서열은 액세션번호 BAA00523로 등록되어 있다.
이 PCR법에서는 표 1에 나타내는 조성의 반응액을 사용하고, 프라이머(+)로서 서열번호 5로, 프라이머(-)로서 서열번호 6으로 표시되는 서열을 사용하였다. 여기에서 서열번호 6에는 외래유전자를 삽입할 수 있도록 설계하였기 때문에, AACGCGTCC(ACGCGT가 MluI 사이트)의 여분의 서열이 포함되어 있다.
상기 반응액을 4등분하여, 그 중 3개를 각각 이하의 조건으로 PCR반응을 행다. 94℃ 30초 가열 후, 94℃ 1분, 어닐링 1분, 72℃ 1분의 반응 사이클을 30사이클 행하고, 그 후 72℃에서 5분 가열하였다. 어닐링온도는 조건검토를 위해, 55℃, 60℃, 65℃의 3종류로 행하였다. 이 PCR에서는 60℃ 및 65℃의 2종류에서 동일하게 DNA증폭이 행해졌으므로, 2조건의 PCR산물을 한데 모아 회수하여, TA클로닝을 행하였다. 그리고 4등분 중 나머지 1개는 주형DNA 대신에 등량의 오츠카증류수를 가하여, 어닐링온도 65도에서 네가티브 콘트롤로 하여 PCR을 행하였다.
PCR법으로 얻어진 DNA단편을 pGEM-T Easy vector에 연결하여, 염기서열을 확인한 후, 제한효소 XhoI, SacI(TaKaRa)로 절단하여, 얻어진 DNA단편을 pAUR123-TDH3에 XhoI, SacI로 연결하여 pAUR123-TDH3-HBcAg를 얻었다.
(실시예 3) 효모에서 HBcAg와 HBsAg의 공발현
실시예 1에서 이용한 HBsAg L단백질발현벡터를, 실시예 2의 HBcAg발현벡터와 코트랜스포메이션시켰다. 즉, 상기 벡터를 S. cerevisiaeAH22R-주(株)로 이하의 스페로플라스트(spheroplast)법(Albert et al., 1978)에 의해 형질전환하였다.
S. cerevisiaeAH22R-주(株)를 YPDA한천배지(조성은 표 2 참조)에 접종하고 2~3일 30℃에서 배양하여 얻어진 콜로니를 하룻밤 YPDA배지(조성은 표 2 참조) 50㎖에서 30℃로 전(前)배양하였다. 전 배양 종료 후, 본(本)배양개시 시의 OD600이 0.05정도가 되도록 YPDA배지 50㎖에 식균하고, OD600 이 0.4~0.8이 될 때까지 30℃에서 8시간 정도 배양하였다. 그 후, 배양액 4㎖를 15㎖튜브(IWAKI제)에 분주(分注)하고, 다본가(多本架)냉각원심기(토미공업주식회사제)를 이용하여 2000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 균체를 회수하고, 균체를 4㎖의 용액A(구연산 나트륨 0.1M, EDTA2나트륨 10mM, 솔비톨 1.2M, pH 5.8)로 세정한 후, 용액A 3.6㎖과 자이모레이즈(zymolyase) 100T(생화학공업)용액(1.0㎎/㎖) 0.4㎖를 가하여, 30℃에서 1시간 정도 인큐베이트하여 균체를 스페로플라스트화시켰다.
YPDA 한천배지:
폴리펩톤 2% 분말효모엑기스 1% 아데닌황산염 0.01% 글루코스 2% 아가로스 2%
YPDA 배지:
폴리펩톤 2% 분말효모엑기스 1% 아데닌황산염 0.01% 글루코스 2%
류신무첨가아미노산 용액(10배 농도):
L-이소로이신 0.03% L-발린 0.15% L-아데닌황산염 0.02% L-아르기닌염 0.02% L-히스티딘 0.02% L-리신염산염 0.03% L-메티오닌 0.02% L-페닐알라닌 0.05% L-트레오닌 0.2% L-트립토판 0.02% L-티로신 0.03% L-우라실 0.02%
효모형질전환(Y-Tf) 한천배지:
Yeast nitrogen base without amino acids 0.67% 아가로스 2% 솔비토스 22% 류신무첨가아미노산 용액(10배 농도) 10% 글루코스 2%
중층한천배지:
Yeast nitrogen base without amino acids 0.67% 아가로스 2% 솔비토스 22% 글루코스 2%
류신무첨가 SD한천배지:
Yeast nitrogen base without amino acids 0.67% 아가로스 2% 류신무첨가아미노산 용액(10배 농도) 10%
글루코스 2% 류신무첨가, 오레오바시딘A 첨가 SD한천배지:
Yeast nitrogen base without amino acids 0.67% 아가로스 2% 류신무첨가아미노산 용액(10배 농도) 10% 글루코스 2% 오레오바시딘A 0.5㎍/㎖
그 후, 다본가냉각원심기(토미공업주식회사제)를 이용하여 1900rpm, 20℃에서 5분간 원심분리를 행하여 균체만을 회수하고, 용액B(솔비톨 1.2M, 염화칼슘 10mM, Tris-HCl(pH7.0)10mM) 4㎖로 세정한 후, 용액B 0.1㎖로 균체를 현탁시켜, 야생형 또는 변형형 HBsAg L입자발현용 벡터 7㎍과 pAUR123-TDH3-HBcAg 5㎍을 함께 가하여 실온에서 15분간 방치했다. 어어서 용액C(폴리에틸렌글리콜 4000 20%, Tris(pH7.0) 10mM, 염화칼슘 10mM) 2㎖를 가하여, 15분간 더 방치한 후 1900rpm, 20℃에서 5분간 원심분리를 행하여 균체를 회수하고, 용액D(솔비톨 1.2M, 폴리펩톤 2%, 분말효모엑기스 1%, 글루코스 2%, 아데닌황산염 0.01%) 0.3㎖에 현탁하여 30℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 그 후, 균체현탁액에 55℃로 유지한 중층한천배지 5㎖를 가하여, Y-Tf한천배지(조성은 표 2 참조)에 중층했다. 30℃에서 6~14일간 배양 후, 출현한 콜로니를 류신무첨가, 오레오바시딘A첨가 SD한천배지(조성은 표 2 참조)에 접종하고, 생육된 균체만을 배양하여 발현주(株)의 선발을 행하였다.
(실시예 4) HBcAg와 HBsAg L단백질의 공발현 L입자의 발현량 측정
실시예 3의 형질전환된 균체는, Hi-Pi배지(조성은 표 3 참조) 1㎖에서 3일간 전배양하고, 다본가냉각원심기(토미공업주식회사제)를 이용하여 2000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 균체를 회수하고, 그 후 8S5N-P400배지(조성은 표 3 참조) 1㎖로 배지를 교환하여 3~4일간 본배양을 행하였다. 배양조건은 30℃로 하고, 진탕배양을 행하였다.
High-Pi 배지 (1L):
인산 수소 2 칼륨 1.5g 요오드화 칼륨 0.1㎎ L-아스파라긴 1 수화물 2g L-히스티딘 20㎎ L-트립토판 20㎎ 1% 황산 마그네슘 용액 50㎖ 1% 염화 칼슘 용액 33㎖ Trace 용액 1㎖ 비타민 용액 1㎖ 글루코스 20g
8S5N-P400 배지 (1L):
수크로스 80g 요오드화칼륨 0.1㎎ L-아스파라긴 1 수화물 5g L-히스티딘 300㎎ 염화칼륨 2g 인산 2 수소 칼륨 400㎎ 1% 황산 마그네슘 용액 65㎖ 1% 염화 칼슘 용액 37㎖ Trace 용액 5㎖ 비타민 용액 2㎖ 글루코스 10g 1M Tris-말레인산 용액(pH 6.0) 25㎖
Trace 용액 (1L):
황산동 5 수화물 40㎎ 황산철 7 수화물 250㎎ 황산망간 4 수화물 40㎎ 황산아연 7 수화물 310㎎ 12-몰리브덴(VI) 인산암모늄 3 수화물 20㎎
비타민 용액 (1L):
이노시톨 10g 티아민 200㎎ 피리독신 200㎎ 판토텐산 칼슘 200㎎ 나이아신 200㎎ 비오틴 2㎎
도 4에 bFGF제시형 HBsAg L단백질 및 HBcAg를 공발현하여 얻은 입자를 항bFGF항체 및 항-L단백질항체로 웨스턴블롯팅한 도면을 도 4의 (a)에, BTC제시형 HBsAg L단백질 및 HBcAg를 공발현하여 얻은 입자를 항 BTC항체 및 항-L단백질항체로 웨스턴블롯팅한 도면을 도 4의 (b)에 나타낸다. 이에 따르면, 화살표로 표시하는 바와 같이, BTC 및 L단백질을 가지는 BTC제시형 HBsAg L단백질 및 bFGF 및 L단백질을 가지는 bFGF제시형 HBsAg L입자가 양호하게 형성되어 있음을 알 수 있다.
(A) 1㎖ 스케일 배양의 발현확인
배양액 1㎖를 1.5㎖ 마이크로튜브에 회수하여 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 균체를 회수한 후, 표 4의 완충액A 0.25㎖로 균체를 현탁하여, 글래스 비드(직경 0.5㎜, BioSpec, 카달로그번호 11079105)를 가하고, 4℃에서 25분간 격렬하게 교반(볼텍스)하여 균체를 파괴하였다. 10000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리를 행하여 조추출액을 회수하고, IMxHBsAg·다이나팩(V2)(혈중 HBs항원검출용 키트, Dainabot), IMxHBsAg·다이나팩AX를 이용하여, 각각 각 균체에 있어서의 변형형 HBsAg입자 및 HBcAg의 발현량을 확인하였다.
또한, HBeAg란, HBcAg의 N말단에 여분의 10아미노산이 부가되고, HBcAg의 C말단의 149번째 아미노산잔기 이후의 아미노산잔기가 결실된 159아미노산으로 이루어지는 단백질로 세포로부터 분비된다. 이 HBeAg단백질은 HBcAg와는 달리, 캡시드결합을 취할 필요는 없으나, HBcAg는 N말단 10잔기를 제외한 HBeAg의 서열과 완전히 동일하므로, 이 키트를 이용하여 발현을 측정할 수 있다. 단, 이 키트가 측정한 HBcAg가 단량체인지 2량체인지 혹은 캡시드 구조를 취하고 있는 지는 판단할 수 없다.
또한, 상기 다이나팩을 이용할 때에, 조출출액의 희석이 필요한 경우에는, 표 4의 조성의 PBS를 이용하였다.
완충액A (1L):
요소 450.45g 인산수소 2 나트륨 12 수화물 24.5g 인산 2 수소 나트륨 2 수화물 4.93g EDTA·2Na 5.58g PMSF 0.35g Tween 80 1㎖
PBS (1L)
염화 나트륨 8g 염화 칼륨 0.2g 인산수소 2 나트륨 12 수화물 3.63g 인산 2 수소 칼륨 0.24g (pH 7.4)
상기의 방법을 이용하여 야생형 HBsAg L과 HBcAg를 공발현시킨 경우의 배양액 50배 희석액 1샘플에 대해 HBsAg 항원성을 측정하였다. 비교예로서, HBcAg발현벡터를 가하는 것 이외에는 동일한 조작을 행한 야생형 HBsAg L단백질을 단독으로 발현한 경우의 20배 희석배양액 8샘플에 대해서도 HBsAg항원성을 측정하였다. 결과는 도 5에 도시한 바와 같다. 도 5의 종축은 상기 샘플의 평균 IMxHBsAg(V2)값을 나타내고 있으며, 이는 HBsAg L입자의 입자가 형성되어 있는지 여부를 타나내는 값으로 되어 있다. 이에 따르면, HBsAg L단백질 단독 발현(20배 희석)에서는, IMxHBsAg(V2)값의 평균이 5.27임에 비해, HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 것(50배 희석)에서는 213으로 현저하게 높은 값을 나타냈다. 따라서 HBsAg L단백질을 HBcAg와 공발현시킴으로써 HBsAg L입자의 형성효율이 현저하게 높아졌다고 말할 수 있다.
동일한 실험을 야생형 HBsAg L단백질 대신에 EGF제시형 HBsAg L단백질을 발현시켜서 행한 결과를 도 6에 나타낸다. 이번에는 EGF제시형 HBsAg L단백질을 단독으로 발현한 경우의 20배 희석배양액 3샘플과, EGF제시형 HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 경우의 배양액 50배 희석액 17샘플에 대해, IMxHBsAg(V2)값을 측정하였다. 이에 따르면, HBsAg L단백질 단독발현(20배 희석)에서는 IMxHBsAg(V2)값의 평균이 5.36임에 비해, HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현시킨 것(50배 희석)에서는 163으로 현저하게 높은 값을 나타냈다.
또한, 동일한 실험을 야생형 HBsAg L단백질 대신에 Null형 HBsAg L단백질을 발현시켜서 행한 결과를 도 7에 나타낸다. Null형 HBsAg L단백질을 단독으로 발현한 경우의 20배 희석배양액 4샘플과, Null형 HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 경우의 배양액 100배 희석액 6샘플에 대해, IMxHBsAg(V2)값을 측정하였다. 이에 따르면, HBsAg L단백질 단독발현(20배 희석)에서는 IMxHBsAg(V2)값의 평균이 2.75임에 비해, HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현시킨 것(100배 희석)에서는 151로 매우 높은 값을 나타냈다.
(4-2) 400㎖ 스케일 배양의 발현확인
BTC제시형 HBsAg L단백질 및 HBcAg를 발현한 균체를 배양하고 있는 SD플레이트, bFGF제시형 HBsAg L단백질 및 HBcAg를 발현한 균체를 배양하고 있는 SD플레이트는 2매분의 균체를 모두 Hi-Pi배지 50㎖에 식균하여 3일간 배양한 후, Hi-Pi배지 400㎖에서 1일 배양하고, 그 후 8S5N-P400배지 400㎖에서 3.5일간(86.5시간)배양하였다. 배양종료 후, 각각을 집균하여 균체습중량을 측정하였다. 또한, 배양종료 전일(前日)(8S5N-P400배지로 54시간 배양 후)에, 각 클론의 배양액을 1㎖씩 샘플링하여 균체습중량을 측정한 후, 글래스 비드로 균체를 파쇄하여 HBsAg입자의 발현량을 IMxHBsAg·다이나팩(V2)으로 측정하였다. 파쇄방법 및 발현량의 측정방법은 상기(4-1)의 방법과 같다.
얻어진 BTC제시형 HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 경우의 배양액 100배 희석액 및 비교예로서 HBcAg 발현벡터를 가하는 것 이외에는 동일한 조작을 행한 BTC제시형 HBsAg L단백질을 단독으로 발현한 경우의 배양액 100배 희석배양액의 HBsAg항원성을 측정하였다. 결과는 도 8에 도시한 바와 같다. 이에 따르면, HBsAg L단백질 단독발현에서는, IMxHBsAg(V2)값이 0으로 발현균체를 획득할 수 없었던 데에 비해, HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 것에서는 81.92로 높은 값을 나타내었다.
마찬가지로, bFGF제시형 HBsAg L단백질을 단독으로 발현한 경우의 배양액 100배 희석액과 bFGF제시형 HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 경우의 배양액 100배 희석배양액에 대해서 HBsAg항원성을 측정하였다. 결과는 도 9에 도시한 바와 같다. 이에 따르면, HBsAg L단백질 단독발현에서는, IMxHBsAg(V2)값이 2.77인데 비해, HBsAg L입자와 HBcAg를 공발현한 것에서는 37.4로 높은 값을 나타냈다.
야생형 HBsAg L입자를 100으로 한 경우의 IMxHBsAg값의 상대치는 도 10에 도시한 바와 같다.
상기와 같이 HBcAg와 변형형 HBsAg L단백질을 주조(酒造)효모내에서 공발현함에 의하여, 변형형 HBsAg L입자의 발현량이 수십배나 항진되고 그 양은 전가용성단백질의 수십%에 달하였다.
(실시예 5) HBsAg L입자의 대량정제
우선, 이하의 방법으로 HBcAg L단백질 혹은 변형형 L단백질과 공발현시켜 형성한 야생형 HBsAg L입자, Null형 HBsAg L입자. BTC제시형 HBsAg L입자, bFGF제시형 HBsAg L입자, EGF제시형 HBsAg L입자를 제작하여 조(粗)샘플을 얻는다. 한편, 이하의 HBsAg L입자, L단백질이란, 상기의 5종류의 입자 및 이를 구성하는 L단백질을 말한다.
HBcAg와 변형형 HBsAg L단백질과의 공발현균체를 배양한 배양액 400~1000㎖로부터, 상기 균체를 꺼내어, 100㎖의 완충액 A(표 4 참조)에 현탁하고, 얼음냉각하면서, 비드 비터(BEAD BEATER)를 이용하여 글래스 비드(직경 0.5㎜)로 5분간 파쇄, 얼음 위 방치 5분간이라는 사이클을 3회 반복하여 균체를 파쇄하였다. 그 후 4℃에서, 5000rpm으로 10분간 원심분리를 행해 회수한 상청에, 33%(w/v) 폴리에틸렌글리콜6000(나카라이테스크)을 용액용량의 75%(v/v)를 가해 30분간 얼음냉각하였다. 그리고 로터 No. 17N(토미정공)을 이용하여, 원심분리기CX-250(토미정공)에 의해, 4℃에서 5000rpm의 원심분리를 10분간 행하고 침전을 회수하여 완충액A 15㎖에 현탁한 조샘플을 얻었다.
상기 조샘플로부터 HBsAg L입자를 정제하기 위해, 이하에 나타내는 바와 같이, 염화세슘밀도구배원심분리, 수크로스(sucrose)밀도구배원심분리 및 한외여과(限外濾過)를 행하였다.
먼저, 염화세슘밀도구배원심분리를 행하였다. 이 방법은 밀도구배를 행한 염화세슘용액 내에서 샘플에 초원심을 행함으로써, HBsAg L입자의 부양밀도와 같은 정도의 CsCl용액의 분획에 HBsAg L입자를 모아서 정제를 행하는 것이다.
밀도구배를 행한 염화세슘용액은 도 12의 (a)에 도시한 바와 같이, 40PA튜브(히타치공기제)에 아래쪽부터 40%(w/v)염화세슘용액 8㎖, 30%(w/v)염화세슘용액 8㎖, 20%(w/v)염화세슘용액 7㎖, 10%(w/v)염화세슘용액 7㎖를 중층시킨것으로, 그 후 상기 조샘플을 액 표면에 5~6㎖ 중층하였다. 그 후, 로터 P28SX(히타치공기제)를 사용하여 초원심분리기 55P-72H(히타치공기제)에 의해 24000회전, 16℃에서 12~16시간 밀도구배원심을 행하였다.
염화세슘밀도구배원심을 행한 3~6개의 튜브를 상층에서부터 2㎖씩의 분획으로 나누어 회수하고, 각 분획 별로 하나로 모아, IMxHBsAg 다이나팩(V2)으로 측정하였다. 이 중에서, HBsAg L입자가 검출된 분획을 회수하여, 15㎖ MEDTA·2Na를 포함하는 PBS에 의해 4℃하에서 3~5시간 투석하였다. 투석한 용액은 로터 No. 17N을 이용하여, 원심분리기 CX-250에 의해 5000rpm, 4℃하에서 10분간의 원심분리를 행하여 상청을 회수하였다.
이어서 상기 상청을 수크로스밀도원심구배를 행했다. 이 방법은 밀도구배를 행한 수크로스용액 내에서 샘플에 초원심을 행함으로써, HBsAg L입자는 그 침강계수에 따른 속도로 침강하고, 그 외의 크기가 다른 침강속도가 다른 분자로부터 분리된다. 밀도구배를 행한 수크로스용액은, 40PA튜브에 50%(w/v)수크로스용액 6㎖, 40%(w/v)수크로스용액 5㎖, 30%(w/v)수크로스용액 6㎖, 20%(w/v)수크로스용액 5㎖, 10%(w/v)수크로스용액 5㎖를 중층시킨 것으로, 그 액 표면에 투석 후의 상청을 8~9㎖중충하였다. 그 후, 로터 P28SX를 이용하여 초원심분리기 55P-72H에 의해 24000rpm, 4℃에서 8~10시간 밀도구배초원심을 행하였다.
수크로스밀도구배초원심종료 후, 염화세슘밀도구배원심 시와 마찬가지로, 3~6개의 튜브의 상층부터 2㎖씩의 분획으로 나누어 회수하고, 분획 별로 1개로 모아 IMxHBsAg 다이나팩(V2)으로 측정하여 HBsAg L입자가 존재하는 분획을 회수하였다.
마지막으로, 얻어진 분획을 4℃에서 하룻밤 PBS로 투석하고, ULTRA FILTER UK-200(Advantec사제)을 이용하여 한외여과를 행하여, 용량이 10㎖가 될 때까지 농축하였다.
이상의 조작에 의해, 야생형 HBsAg L입자(L단백질 추정분자량 52kDa), Null형 HBsAg L입자(Null단백질 추정분자량 40.2kDa), BTC제시형 HBsAg L입자(BTC융합형 L단백질 추정분자량 45.7kDa), bFGF제시형 HBsAg L입자(bFGF융합형 L단백질 추정분자량 57.3kDa), EGF제시형 HBsAg L입자(EGF융합형 L단백질 추정분자량 47.2kDa)를 얻을 수 있었다.
(실시예 6) 정제에 의해 얻은 bFGF제시형 L입자의 물성해석
(6-1) 웨스턴블롯팅에 의한 해석
bFGF제시형 HBsAg L입자가 HBcAg 단백질과 상호작용하고 있는 지 여부를 조사하기 위해, bFGF제시형 HBsAg L입자를 S항체로 면역침강시킨 후, bFGF항체와 HBcAg 단백질 항체로 웨스턴블롯팅을 행한 것이 도 11이다. 그 결과 bFGF HBsAg L입자는, 화살표로 가리키는 바와 같이, bFGF항체에 의해 검출되며, HBcAg 단백질항체로도 검출되었다. 따라서, bFGF제시형 HBsAg L입자는, bFGF, HBsAg L영역, HBcAg 단백질을 함께 가지는 것을 알 수 있었다. 즉, HBcAg 단백질은 입자상의 bFGF제시형 HBsAg L단백질과 어떠한 상호작용을 하고 있음을 알 수 있었다.
(6-2) 밀도구배원심법에 의한 HBsAg L입자의 밀도측정
bFGF제시형 HBsAg L입자가 HBcAg 단백질을 포함하고 있는가를 조사하기 위해, 이하의 방법으로 염화세슘밀도구배원심을 행하여 bFGF제시형 HBsAg L입자의 밀도를 추정하였다.
얻어진 bFGF제시형 HBsAg L입자를, 정제 시에 이용한 염화세슘밀도구배원심법과 동일한 방법으로 분리한 결과를 도 12의 (b)에 도시한다. 이는 원심 후의 CsCl밀도구배침전의 각 분획의 50배 희석액의 IMxHBsAg값 및 IMxHBeAg값을 플롯팅한 그래프이다. 상기 CsCl밀도구배침전의 분획이란, 상층부터 2㎖씩 17개의 분획으로 나뉜 것이나, IMxHBsAg값의 피크는 분획 3, 즉 상층부터 4㎖에서 6㎖의 층에 명확히 나타났다. 도 12의 (a)와 같이 중층한 원심관의 상부에서 2㎖씩 회수하였으므로, 분획 3의 샘플은 10% CsCl용액 중에 존재한다고 생각된다. 이 10% CsCl용액의 밀도는 약 1.20g/㎖인 점에서, 분획 3에 모인 bFGF제시형 HBsAg L입자의 밀도는 약 1.20g/㎖로 생각된다. 이는 1.21g/㎖의 야생형 HBsAg L입자의 밀도와 같은 정도이다(비특허문헌 1 참조).
한편, 효모로 S, M, L 및 HBcAg 단백질의 4가지를 동시에 발현시켜, HBcAg 단백질을 HBsAg입자 내에 포함시킨 바이리온 입자(virion particle)의 밀도는 약 1.25g/㎖이다(비특허문헌 2 참조). 따라서 L단백질 및 HBcAg 단백질을 공발현시켜서 얻은 HBsAg L입자가 HBcAg 단백질을 포함하여 형성되어 있다면, 약 1.25g/㎖의 밀도와 같은 분획에 포함될 것이다. 따라서, 추정밀도 약 1.20g/㎖의 bFGF제시형 HBsAg L입자는 HBcAg 단백질을 포함하고 있지 않음이 시사되었다.
(6-3) 프로테이나제에 의한 해석
나아가, bFGF제시형 HBsAg L입자가 HBcAg 단백질을 포함하고 있는가를 프로테이나제 처리에 의해 조사하였다.
bFGF제시형 HBsAg L입자 정제 샘플 720㎕에, 항HBs마우스 모노크로날 항체 고정화 마이크로파티클의 IMx의 항체 240㎕을 가한 합계 960㎕의 용액을 튜브 2개에 나누어, 4℃에서 9시간 진탕하여 면역침강하고, 프로테이나제 저해제와 TritonX-100을 포함하지 않는 라이시스 버퍼로 3회 세정하고 침전물을 4등분, 합계 8등분하였다. 이에 의해, bFGF제시형 HBsAg L입자의 침전물을 얻었다.
10㎍/㎖의 P.K.(프로테이나제K)를 포함하는 버퍼액(50mM 트리스염산, 5mM 염화칼슘, pH 7.6)을 6개의 침전물에 20㎕씩 가하고, 37℃에서 각각 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분간 보온하였다.
참조실험으로서, P.K.를 포함하지 않는 용액(50mM 트리스염산, 5mM 염화칼슘, pH 7.6)을 침전물에 가하고 보온하지 않은 것(참조 샘플 1) 및 30분간 37℃에서 보온한 것(참조샘플 2)을 제작하였다. 또 다른 참조실험으로서, PBS 720㎕에 항체 240㎕을 가한 합계 960㎕의 용액을 원심하고, 항HBsAg마우스 모노크로날 항체 고정화 마이크로파티클에 결합한 침전물에 P.K.를 포함하지 않는 용액(50mM 트리스염산, 5mM 염화칼슘, pH 7.6)을 침전물에 가하고 보온하지 않은 것(참조 샘플 3)도 준비하였다.
이들 샘플을 웨스턴블롯팅한 도면을 도 13에 도시한다. 도 13의 (a)는, 항L단백질Ab에 의한, (b)는 항bFGFAb에 의한, (c)는 항-HBcAgAb에 의한 웨스턴블롯팅이다. 레인 1에 상기의 참조샘플 3, 레인 2에 상기의 참조샘플 1, 레인 3에 참조샘플 2의 참조샘플을, 레인 4부터 레인 9가 P. K.를 가한 샘플이다. 또한, 레인 4부터 레인 9는, 레인 수가 작은 것부터 순서대로, P. K.의 가열시간을 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분으로 한 샘플로 되어 있다.
이에 따르면, 도 13의 (a), (b)에 화살표로 가리키는 bFGF제시형 HBsAg L단백질의 밴드가 도시된다. 또한, 화살표 머리부분이 가리키는 바와 같이, 도 13의 (a)의 20kDa주위 및 도 13의 (c)의 20kDa보다 작은 부분에 PK에 의한 분해산물로 생각되는 밴드가 있다. 이들 밴드는 참조샘플인 레인 1에서 3에서는 발견되지 않으나, 레인 4에서 9에서는 발견된다.
도 13의 (c)의 PK에 의한 분해산물의 밴드는 HBcAg 단백질의 분해물인것으로 생각되나, 프로테이나제K 처리의 시간경과에 따라 밴드가 얇아지고 있으며, 처리시간 30분(레인 9)에서는 거의 완전히 없어졌다. 즉, HBcAg 단백질이 P. K에 단시간에 분해되고 있다.
만약, HBsAg L입자 내에 HBcAg 단백질이 포함되어 있다면, HBcAg 단백질은 외부에 드러나 있지 않으므로, 프로테이나제K에 의한 분해를 받기 어려워질 것으로 생각된다. 따라서, 프로테이나제K에 의해 가온 30분 후에 거의 완전 분해되어 있는 이 결과로부터 판단하면 bFGF제시형 HBsAg L입자 내에 HBcAg 단백질은 포함되어 있지 않은 것으로 생각된다.
(실시예 7) 정제에 의해 얻어진 BTC제시형 L입자의 물성해석
bFGF제시형 HBsAg L입자로 행한 실험과 같은 방법으로, BTC제시형 HBsAg L입자도 염화세슘밀도구배원심법에 의한 분리를 행하였다. 그 결과를 도 14에 도시한다. 도 14에 CsCl밀도구배침전의 각 분획의 200배 희석액의 IMxHBsAg값 및 IMxHBcAg값을 플롯팅한 그래프를 나타내고 있다. IMxHBsAg값의 피크는, 분획 5, 6에 명확히 나타났다. 이와 같이, IMxHBsAg값이 분획의 도중에서 피크를 형성하고 있으므로, BTC제시형 HBsAg L입자가 입자를 형성하고 있다고 말할 수 있다. 또한, IMxHBsAg값의 피크가 이 IMxHBsAg값과 일부 중첩되어 있는 점에서, BTC제시형 HBsAg L입자의 일부가 HBcAg 단백질과 상호작용하고 있을 가능성이 있다.
CsCl밀도구배원심 후는, 도 14의 (a)와 같이 중층된 원심관의 상부에서 2㎖씩 회수하였으므로, 분획 6의 샘플은 10% CsCl(밀도 1.20g/㎖)과 20% CsCl(밀도 1.27g/㎖)의 거의 경계선 부근에 해당한다. 따라서, 이 그래프에서 구한 추정밀도로 HBcAg 단백질이 HBsAg L입자 내에 포함되어 있는 지의 판단은 불가능하다고 생각된다.
상기의 분획 5, 6을 포함한 분획 4~7을 회수하여 PBS(15mM EDTA를 포함)로 투석한 후, 항HBsAg L입자 Ab에 의한 웨스턴블롯팅을 행한 것을 도 14의 (c)의 레인 2에 도시하고 있다. 이것은 BTC제시형 HBsAg L입자의 조추출액을 항HBsAg L입자 Ab에 의해 웨스턴블롯팅한 것(레인 1)과 거의 같은 정도의 농도의 밴드였다.
한편, 마찬가지로 레인 2의 샘플(분획 4~7을 회수하여 투석한 것)을 항HBcAgAb에 의해 웨스턴블롯팅한 것(레인 4)은, BTC제시형 HBsAg L입자의 조추출액을 항HBcAgAb에 의해 웨스턴블롯팅한 것(레인 3)보다 현저히 검출량이 낮았다. 즉, BTC제시형 HBsAg L입자가 분획 4~7에 모여서 존재하고 있는 데 비해, HBcAg는 이 이외의 분획에도 분산되어 있다고 말할 수 있다. 따라서, HBcAg 단백질이, BTC제시형 HBsAg L입자 내에 도 15의 (b)와 같이 내부에 포함되어 있을 가능성은 매우 낮다고 생각되며, 설령 포함되어 있는 HBcAg 단백질이 존재한 경우에 있어서도 그 비율은 극히 낮다고 생각된다. 즉, 얻어진 입자의 대부분은 도 15의 (a)와 같이, 입자 외부로부터 HBsAg L단백질과 상호작용하고 있다고 생각된다.
즉, 얻어진 변형형 HBsAg L입자는 일부에만 HBcAg가 포함되어 있으며, 거의가 중공이었으므로, 본 발명의 중공나노입자는 유전자 등 도입물질의 운반에 적합하게 사용가능한 점이 시사되었다.
한편, 본 명세서에 기재된 구체적인 실시양태 또는 실시예는, 어디까지나, 본 발명의 기술내용을 명확히 하는 것으로, 이와 같은 구체예에만 한정되어 협의로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 정신과 이하에 기재하는 특허청구의 범위 내에서 다양하게 변경하여 실시가 가능하다.
본 발명의 중공 나노 입자는 상술한 바와 같이, 물질을 세포특이적으로 운반하는 기능을 가지면서 입자의 형성을 촉진함으로써 효율적으로 입자를 제조할 수 있는 효과를 가진다.
또한, 본 발명에 따르면, 중공 나노 입자의 생체인식분자를 치환한 경우에도, 입자형성능이 저하되는 일 없이 안정된 입자형성이 가능해진다. 중공 나노 입 자의 형성이 촉진되면, 중공 나노 입자의 안정된 생산이 가능해져, 약제로서 이용하는 등의 응용이 유효해지므로, 본 기술의 폭넓은 보급을 기대할 수 있다.
중공 나노 입자에 물질을 도입한 약제는, 정맥주사 등의 간편한 방법으로 특정 세포 또는 조직에 대해 선택적 그리고 효율적으로 질환치료용의 세포도입물질을 넣어보낼 수 있으므로, 종래의 유전자 치료와 크게 달리 외과수술을 할 필요 없으며, 부작용의 우려도 매우 낮아서 그대로 임상 응용가능한 것이다. 따라서 본 발명은 의료관련산업이나 의약품관련산업 등에 이용할 수 있게 된다.
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Claims (12)

  1. 췌장β세포, 혈관내피세포 및 뇌하수체세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 특정 세포를 인식하는 생체인식분자를 가지며, 입자형성능을 가지는 제 1 단백질인 B형 간염 바이러스 표면 항원 단백질로 이루어지는 중공 나노 입자에 있어서,
    상기 제 1 단백질의 간세포 인식부위가 다른 생체인식분자로 변형하여 이루어지고,
    상기 제 1 단백질에는, 캡시드 구조를 형성하는 제 2 단백질인 B형 간염 바이러스 내부 코어 항원 단백질과 상호작용하고 있는 것이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 다른 생체인식분자는 베타셀루린(Betacellulin) 또는 염기성 선유아세포증식인자인 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
  5. 삭제
  6. 제 1항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 제 1 단백질을 코딩하는 유전자와 제 2 단백질을 코딩하는 유전자가, 벡터에 의해 동일한 효모에 도입되고, 이 효모에 있어서 쌍방의 유전자가 발현됨으로써 형성되는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
  7. 삭제
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 제 2 단백질을 코딩하는 유전자는 오레오바시딘A 감수성유전자를 가지는 벡터에 의해 도입하는 것을 특징으로 하는 중공 나노 입자.
  9. 제 1항 또는 제 4항에 기재된 중공 나노 입자에 세포도입물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 약제.
  10. 삭제
  11. 제 6항에 기재된 중공 나노 입자에 세포도입물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 약제.
  12. 제 8항에 기재된 중공 나노 입자에 세포도입물질이 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 약제.
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