JPH03168097A - 人工ｂ型肝炎ウイルス粒子およびその製法 - Google Patents
人工ｂ型肝炎ウイルス粒子およびその製法Info
- Publication number
- JPH03168097A JPH03168097A JP30978689A JP30978689A JPH03168097A JP H03168097 A JPH03168097 A JP H03168097A JP 30978689 A JP30978689 A JP 30978689A JP 30978689 A JP30978689 A JP 30978689A JP H03168097 A JPH03168097 A JP H03168097A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbs
- peptide
- hbc
- antigen
- artificial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 title abstract 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 89
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 27
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 26
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N hepatitis b vaccine Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1N=CN=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 SPSXSWRZQFPVTJ-ZQQKUFEYSA-N 0.000 description 3
- 229940124736 hepatitis-B vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101100417166 Caenorhabditis elegans rpi-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100501444 Escherichia phage P1 17 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- XDFCIPNJCBUZJN-UHFFFAOYSA-N barium(2+) Chemical compound [Ba+2] XDFCIPNJCBUZJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- -1 phenylmethylsulfonyl Chemical group 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- GOLXNESZZPUPJE-UHFFFAOYSA-N spiromesifen Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1C(C(O1)=O)=C(OC(=O)CC(C)(C)C)C11CCCC1 GOLXNESZZPUPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子組換えにより発現された、感染性のな
いＨＢデーン粒子様抗原およびその製法に関する。
いＨＢデーン粒子様抗原およびその製法に関する。
さらに詳細には、天然のＨＢＶ粒子が有する長さの異な
る３種のＨＢｓ関連ペプチドおよび｝｛ＢＣペプチドか
ら構成され、構造的にもデーン粒子に極めて類似した形
態を有し、感染性を有さないことを特徴とする人工ＨＢ
Ｖ粒子およびその製法に関する。
る３種のＨＢｓ関連ペプチドおよび｝｛ＢＣペプチドか
ら構成され、構造的にもデーン粒子に極めて類似した形
態を有し、感染性を有さないことを特徴とする人工ＨＢ
Ｖ粒子およびその製法に関する。
遺伝子組換え技術の進歩に伴って、遺伝子組換えを利用
した有用物質の生産が近年急速に進められてきている。
した有用物質の生産が近年急速に進められてきている。
Ｂ型肝炎に関するワクチンおよび臨床検査試薬において
も、遺伝子組換え技術は効果的に活用され、既に形質転
換酵母を利用した遺伝子組換えワクチンおよび、これら
の抗原を用いた臨床検査試薬が広く市販されている。
も、遺伝子組換え技術は効果的に活用され、既に形質転
換酵母を利用した遺伝子組換えワクチンおよび、これら
の抗原を用いた臨床検査試薬が広く市販されている。
現在用いられている遺伝子組換えＢ型肝炎ワクチンは、
遺伝子組換えによりＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ
抗原〉のみを発現させたものであり、Ｂ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）由来の他の蛋白質や血清由来の未知物質等を
全く含まない安全なコンポーネントワクチンとして利用
されている。
遺伝子組換えによりＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ
抗原〉のみを発現させたものであり、Ｂ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）由来の他の蛋白質や血清由来の未知物質等を
全く含まない安全なコンポーネントワクチンとして利用
されている。
しかしながら、現行のＢ型肝炎ワクチンでは極一部に抗
体価の上がらないノンレスボンダーと呼ばれる非免疫反
応者がワクチン接種対象者中に存在することが知られて
おり、これらの対象者に対しても有効な新しいＢ型肝炎
ワクチンの開発が望まれている。
体価の上がらないノンレスボンダーと呼ばれる非免疫反
応者がワクチン接種対象者中に存在することが知られて
おり、これらの対象者に対しても有効な新しいＢ型肝炎
ワクチンの開発が望まれている。
最近、ＨＢｓ抗原に対して抗体反応を示さないヌードマ
ウスを用いた興味のある免疫実験の結果が報告された［
Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏ＋． ３２９ Ｐ５４７−５４９
１’９８７年ｌＯ月８日発行］。これによれば、通常
のＨＢｓ抗原に対しては遺伝的に免疫反応ができないＩ
｛−２ハブロタイプを持ったマウスに、ＨＢｃ抗原で初
回免疫を行い、さらにＨＢＶ（デーン粒子）で２次免疫
を行ったところ、ＨＢｓ抗原に対する抗体が誘導された
という結果を示している。比較実験として、上記の２次
免疫においてＨＢＶの代わりに、ＨＢＣ抗原とＨ Ｂ
ｓ抗原を混合した抗原を用いて免疫したところ、この場
合にはＨＢｓ抗体は誘導されないことを示している。
ウスを用いた興味のある免疫実験の結果が報告された［
Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏ＋． ３２９ Ｐ５４７−５４９
１’９８７年ｌＯ月８日発行］。これによれば、通常
のＨＢｓ抗原に対しては遺伝的に免疫反応ができないＩ
｛−２ハブロタイプを持ったマウスに、ＨＢｃ抗原で初
回免疫を行い、さらにＨＢＶ（デーン粒子）で２次免疫
を行ったところ、ＨＢｓ抗原に対する抗体が誘導された
という結果を示している。比較実験として、上記の２次
免疫においてＨＢＶの代わりに、ＨＢＣ抗原とＨ Ｂ
ｓ抗原を混合した抗原を用いて免疫したところ、この場
合にはＨＢｓ抗体は誘導されないことを示している。
一方、最近九州大学の笹月らは．ＨＢｓワクチンに対し
て免疫反応を示さない人のＨ Ｌ Ａ （ Ｈｕｍａｎ
Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ
：ヒト白血球抗原〉に共通のハブロタイプがあることを
報告した。
て免疫反応を示さない人のＨ Ｌ Ａ （ Ｈｕｍａｎ
Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ
：ヒト白血球抗原〉に共通のハブロタイプがあることを
報告した。
このことから、ＨＢｓ抗原に対して遺伝的に免疫反応を
示し得ないノンレスボンダーに対しては、ＨＢＶのよう
な物理的構造の抗原、すなわち同一・分子内の表面にＨ
Ｂｓ抗原がそして内部にＨ Ｂ ｃ抗原が存在する抗原
がＢ型肝炎予防ワクチンとして有効であると考えられる
。しかしながら、天然のＨＢＶを使用することは、安全
性の面からも好ましくなく、また、これまでの技術では
人工的にＨＢＶ （デーン粒子）様の抗原を調製するこ
とは困難とされてきた。
示し得ないノンレスボンダーに対しては、ＨＢＶのよう
な物理的構造の抗原、すなわち同一・分子内の表面にＨ
Ｂｓ抗原がそして内部にＨ Ｂ ｃ抗原が存在する抗原
がＢ型肝炎予防ワクチンとして有効であると考えられる
。しかしながら、天然のＨＢＶを使用することは、安全
性の面からも好ましくなく、また、これまでの技術では
人工的にＨＢＶ （デーン粒子）様の抗原を調製するこ
とは困難とされてきた。
免里曵且旬
本発明者らは、ＨＢＶの構造遺伝子を発現できる形質転
換体を用いてその発現産物の研究を進めたところ、形状
的に天然のＢ型肝炎ウイルス粒子（デーン粒子）に極め
て類似した、ＨＢｓ関連抗原およびＨＢｃ抗原から楕成
される感染生を有さない人工ＨＢＶ粒子を遺伝子組換え
技術により得ることに成功した。
換体を用いてその発現産物の研究を進めたところ、形状
的に天然のＢ型肝炎ウイルス粒子（デーン粒子）に極め
て類似した、ＨＢｓ関連抗原およびＨＢｃ抗原から楕成
される感染生を有さない人工ＨＢＶ粒子を遺伝子組換え
技術により得ることに成功した。
すなわち、本発明は、遺伝子組換えにより得られる抗原
であって、数種のＨＢｓ関連ペプチドとＨＢｃペプチド
から構成される、形状的にデーン粒子に極めて類似した
感染性のない人工ＨＢＶ粒子およびその製法を提供する
ものである。
であって、数種のＨＢｓ関連ペプチドとＨＢｃペプチド
から構成される、形状的にデーン粒子に極めて類似した
感染性のない人工ＨＢＶ粒子およびその製法を提供する
ものである。
本発明の人工ＨＢＶ粒子は、構造上｝｛ＢＶに極めて類
似していることがら、これまでの組換えＨＢｓ抗原から
なるワクチンでは免疫効果が得られなかった非免疫反応
者に対しても、十分な免疫効果を有することが期待でき
る。
似していることがら、これまでの組換えＨＢｓ抗原から
なるワクチンでは免疫効果が得られなかった非免疫反応
者に対しても、十分な免疫効果を有することが期待でき
る。
一
−ＲＬこＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス、別名テーン粒子）
は、表面にＨＢｓｖＬ原を露出し、中心にＨＢＶ−ＤＮ
Ａゲノムを取り込んだＨＢｃ抗原を有していることが知
られている。また、ＨＢＶ−ＤＮＡは、約３． ２ｋｂ
ｐの２本＠ＤＮＡがらなる環状の遺伝子であり、この遺
伝子にはＨＢｓペプチド、ＨＢｃペプチド及びＤＮＡポ
リメラーゼ等がコードされている。
は、表面にＨＢｓｖＬ原を露出し、中心にＨＢＶ−ＤＮ
Ａゲノムを取り込んだＨＢｃ抗原を有していることが知
られている。また、ＨＢＶ−ＤＮＡは、約３． ２ｋｂ
ｐの２本＠ＤＮＡがらなる環状の遺伝子であり、この遺
伝子にはＨＢｓペプチド、ＨＢｃペプチド及びＤＮＡポ
リメラーゼ等がコードされている。
本発明の人工ＨＢＶ粒子は、アミノ酸２２６個からなる
メジャーＨＢｓペプチド、メジャーＨＢｓペプチドのア
ミノ末端にさらに５５個のアミノ酸からなるブレＳ２ペ
プチドが続くミドルＨＢｓペプチド、メジャーＨＢｓペ
プチドのアミノ末端にさらに１７４個のアミノ酸からな
るプレＳ１ペプチドカく続くラージＨＢｓペプチドおよ
びアミノ酸１８３個からなるＨＢｃペプチドを同一宿主
細胞内で共発現させることにより得ることができる。
メジャーＨＢｓペプチド、メジャーＨＢｓペプチドのア
ミノ末端にさらに５５個のアミノ酸からなるブレＳ２ペ
プチドが続くミドルＨＢｓペプチド、メジャーＨＢｓペ
プチドのアミノ末端にさらに１７４個のアミノ酸からな
るプレＳ１ペプチドカく続くラージＨＢｓペプチドおよ
びアミノ酸１８３個からなるＨＢｃペプチドを同一宿主
細胞内で共発現させることにより得ることができる。
このようなペプチドを発現させる宿主細胞としては、通
常遺伝子組換えに使用されている一般の宿主細胞が用い
られるが、特に真核細胞を用〜１ることが好ましく、酵
母や動物細胞等が一例として挙げられる。
常遺伝子組換えに使用されている一般の宿主細胞が用い
られるが、特に真核細胞を用〜１ることが好ましく、酵
母や動物細胞等が一例として挙げられる。
それぞれのべブチドを発現させるためには、それぞれの
ペプチドの発現を目的とした発現カセ・ント遺伝子が使
用される。この発現カセ・ント遺伝子とは、プロモータ
ー、目的のペプチドの構造遺伝子さらに好ましくはター
ミネーター配列を組換え遺伝子の基本構造として有する
組換え遺伝子断片を意味する。天然の遺伝子単位で言え
ばオベロンに相当する構造ユニットからなる遺伝子断片
である。すなわち、本発明で言う４種の発現カセット遺
伝子とは、 （Ａ）メジャーＨＢｓペプチドを発現させるための発現
遺伝子カセット、 （Ｂ）ミドルＨＢｓペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット、 （Ｃ）ラージＨＢｓペプチドを発現させるための発現遺
伝子力セツ１〜及び （Ｄ）ＨＢｃペプチドを発現させるための発現遺伝子カ
セットを言う。
ペプチドの発現を目的とした発現カセ・ント遺伝子が使
用される。この発現カセ・ント遺伝子とは、プロモータ
ー、目的のペプチドの構造遺伝子さらに好ましくはター
ミネーター配列を組換え遺伝子の基本構造として有する
組換え遺伝子断片を意味する。天然の遺伝子単位で言え
ばオベロンに相当する構造ユニットからなる遺伝子断片
である。すなわち、本発明で言う４種の発現カセット遺
伝子とは、 （Ａ）メジャーＨＢｓペプチドを発現させるための発現
遺伝子カセット、 （Ｂ）ミドルＨＢｓペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット、 （Ｃ）ラージＨＢｓペプチドを発現させるための発現遺
伝子力セツ１〜及び （Ｄ）ＨＢｃペプチドを発現させるための発現遺伝子カ
セットを言う。
このような４種の遺伝子カセットを用いて宿主細胞の形
質転換を行うが、その際の手法としては、通常の遺伝子
導入法が使用され、一般にはプラスミドを用いる方法等
が広く使用される。プラスミドを用いて遺伝子の導入を
行う場合には、１種または複数の発現カセットをひとつ
のプラスミドに組み込むことができ、これを宿主細胞に
公知の方法により遺伝子導入を行うことができる。尚、
複数の種類のプラスミドを上記４種のべブチドの発現の
ために使用する場合には、使用したすべてのブラスミド
を有している形質転換体を選択することが必要であり、
そのためには各プラスミドに異なる選択マーカー遺伝子
を組み込むこともできる，また、ブラスミドの脱落を防
止する意味では、上記の４種の発現カセットの一部また
は全部を宿主細胞の染色体遺伝子に直接組み込ませるこ
とも可能である。
質転換を行うが、その際の手法としては、通常の遺伝子
導入法が使用され、一般にはプラスミドを用いる方法等
が広く使用される。プラスミドを用いて遺伝子の導入を
行う場合には、１種または複数の発現カセットをひとつ
のプラスミドに組み込むことができ、これを宿主細胞に
公知の方法により遺伝子導入を行うことができる。尚、
複数の種類のプラスミドを上記４種のべブチドの発現の
ために使用する場合には、使用したすべてのブラスミド
を有している形質転換体を選択することが必要であり、
そのためには各プラスミドに異なる選択マーカー遺伝子
を組み込むこともできる，また、ブラスミドの脱落を防
止する意味では、上記の４種の発現カセットの一部また
は全部を宿主細胞の染色体遺伝子に直接組み込ませるこ
とも可能である。
このようにして構築し選択された、上記４種の発現カセ
ット逍伝子が組み込まれた形質転換体を培養することに
より、本発明のデーン粒子様抗原が発現される。形質転
換体から産生された本発明の人工ＨＢＶ粒子を、通常の
精製方法に従い精製回収する。
ット逍伝子が組み込まれた形質転換体を培養することに
より、本発明のデーン粒子様抗原が発現される。形質転
換体から産生された本発明の人工ＨＢＶ粒子を、通常の
精製方法に従い精製回収する。
このようにして得られる人工ＨＢＶ粒子は、電子顕微鏡
写真により、粒径もほぼ４２ｎｍとデーン粒子に極めて
形状的に類似していること確認され、また、この抗原を
ＳＤＳ−２ＭＦ．処理することに−９− より、３種の長さの異なるＨＢｓ関連ペプチドおよびＨ
Ｂｃペプチドが検出された。このことにより、本発明に
おいては、形質転換体の構築に用いた４種の発現カセッ
トにより発現される４種のべブチドが会合して粒子を形
成していることが確認された。
写真により、粒径もほぼ４２ｎｍとデーン粒子に極めて
形状的に類似していること確認され、また、この抗原を
ＳＤＳ−２ＭＦ．処理することに−９− より、３種の長さの異なるＨＢｓ関連ペプチドおよびＨ
Ｂｃペプチドが検出された。このことにより、本発明に
おいては、形質転換体の構築に用いた４種の発現カセッ
トにより発現される４種のべブチドが会合して粒子を形
成していることが確認された。
すなわち、組み込んだ４種のＨＢＶ関連ペプチド発現カ
セットから目的のペプチドが発現され、しかも発現され
た４種のＨＢＶ関連ペプチドが本来有している会合能に
よりＨＢＶデーン粒子に物理的構造が極めて類似した人
工ＨＢＶ粒子が発現されることが確認された６ 本発明者らは、上記４種の発現カセットのうち３種もし
くは２種のみの遺伝子を用いて同様の実験を行った。す
なわち、メジャーＨＢｓ発現カセットおよびＨＢｃ発現
カセットのみを用いて構築した形質転換体、メジャーＨ
Ｂｓ発現カセット、ミドルＨＢｓ発現カセットおよびＨ
Ｂｃ発現力セントのみを用いて構築した形質転換体なら
びにメジャーＨＢｓ発現カセット、ラージＨＢｓ発現力
１〇一 セットおよびＨＢｃ発現カセットのみを用いて構築した
形質転換体を用いて同様の発現実験および解析を行った
が、これらにおいては、デーン粒子様抗原の発現は確認
されず、本発明に従い３種のＨＢｓ関連ペプチド発現カ
セットおよびＨ Ｂ ｃペプチド発現カセットの合計４
種の発現遺伝子を同一の宿主細胞に導入することによっ
てのみ、本発明のデーン粒子様ＨＢ抗原が得られること
が明らかになった。
セットから目的のペプチドが発現され、しかも発現され
た４種のＨＢＶ関連ペプチドが本来有している会合能に
よりＨＢＶデーン粒子に物理的構造が極めて類似した人
工ＨＢＶ粒子が発現されることが確認された６ 本発明者らは、上記４種の発現カセットのうち３種もし
くは２種のみの遺伝子を用いて同様の実験を行った。す
なわち、メジャーＨＢｓ発現カセットおよびＨＢｃ発現
カセットのみを用いて構築した形質転換体、メジャーＨ
Ｂｓ発現カセット、ミドルＨＢｓ発現カセットおよびＨ
Ｂｃ発現力セントのみを用いて構築した形質転換体なら
びにメジャーＨＢｓ発現カセット、ラージＨＢｓ発現力
１〇一 セットおよびＨＢｃ発現カセットのみを用いて構築した
形質転換体を用いて同様の発現実験および解析を行った
が、これらにおいては、デーン粒子様抗原の発現は確認
されず、本発明に従い３種のＨＢｓ関連ペプチド発現カ
セットおよびＨ Ｂ ｃペプチド発現カセットの合計４
種の発現遺伝子を同一の宿主細胞に導入することによっ
てのみ、本発明のデーン粒子様ＨＢ抗原が得られること
が明らかになった。
以下、実施例に従い本発明を更に詳細に説明する。
ブラスミドｐＹＧ１００−Ｓ．ｐＹＧ１００−Ｍ並びに
ｐＹＧ１００−Ｌ［今村ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．６１ Ｎｏ．１１ｐ３５４３
−３５４９ （１９８７）］を制限酵素旧ｎｄｌｌ＋で
処理することにより、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコー
ドする遺伝子であるＨＢｓ（メジャーＨＢｓ）３１１伝
１１− 子 ［アミノ酸２２６個をコードする］、１レＳをコー
ドする遺伝子であるブレＳ２−ＨＢｓ（ミドルＨＢｓ）
遺伝子［ＨＢｓ遺伝子に加えさらに５′端に５５個のア
ミノ酸をコードする遺伝子コ、並びにプレＳｌ−ＨＢｓ
（ラージＨＢｓ）遺伝子［ＨＢｓ３ｌｔ伝子に加えさら
に５“端に１７４個のアミノ酸をコードする遺伝子］を
調製した。これをＤＮＡポリメラーゼ１ （Ｈｅｎｏｗ
ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｍｎｔ）を用いて平滑末端
とし、プラスミドｐＡＪ５０ ［Ｎａｔｕｒｅ ２８７
， ｐ８６９−８７１（１９８０） ］のＢａｍＨ １
部位を同様に平滑末端としたものと混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてライゲーションした。このようにして
、メジャーＨＢｓ遺伝子、ミドルＨＢｓ遺伝子ならびに
ラージＨＢｓ遺伝子の発現を目的とした自律増殖型プラ
スミドｐＡＪ５０ｓ−Ｓ．ｐＡＪ５０Ｍ−Ｓ並びにブラ
スミドｐＡＪ５０Ｌ−Ｓ （第１図参照）を調製した。
ｐＹＧ１００−Ｌ［今村ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．６１ Ｎｏ．１１ｐ３５４３
−３５４９ （１９８７）］を制限酵素旧ｎｄｌｌ＋で
処理することにより、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコー
ドする遺伝子であるＨＢｓ（メジャーＨＢｓ）３１１伝
１１− 子 ［アミノ酸２２６個をコードする］、１レＳをコー
ドする遺伝子であるブレＳ２−ＨＢｓ（ミドルＨＢｓ）
遺伝子［ＨＢｓ遺伝子に加えさらに５′端に５５個のア
ミノ酸をコードする遺伝子コ、並びにプレＳｌ−ＨＢｓ
（ラージＨＢｓ）遺伝子［ＨＢｓ３ｌｔ伝子に加えさら
に５“端に１７４個のアミノ酸をコードする遺伝子］を
調製した。これをＤＮＡポリメラーゼ１ （Ｈｅｎｏｗ
ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｍｎｔ）を用いて平滑末端
とし、プラスミドｐＡＪ５０ ［Ｎａｔｕｒｅ ２８７
， ｐ８６９−８７１（１９８０） ］のＢａｍＨ １
部位を同様に平滑末端としたものと混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いてライゲーションした。このようにして
、メジャーＨＢｓ遺伝子、ミドルＨＢｓ遺伝子ならびに
ラージＨＢｓ遺伝子の発現を目的とした自律増殖型プラ
スミドｐＡＪ５０ｓ−Ｓ．ｐＡＪ５０Ｍ−Ｓ並びにブラ
スミドｐＡＪ５０Ｌ−Ｓ （第１図参照）を調製した。
同様に、ブラスミドｐＹＧ，７０１ｃ ［Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８． ｐｌ４
９−１６２ （１９８８）コを制限酵素旧ｎｄｍで処理
することにより、１８３個のアミノ酸からなるＨＢｃ抗
原をコードするＨＢｃ発現遺伝子断１２− 片を調製した。これを同様にＤＮＡ・ポリメラーゼ■を
用いて平滑末端とし、プラスミドｐＡＪ５０のＢａＩＩ
ＩＨ１部位にＨＢｃ発現遺伝子を組み込み、プラスミド
ｐＡＪ５０ｃを得た。
ｌ ｏｆ Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８． ｐｌ４
９−１６２ （１９８８）コを制限酵素旧ｎｄｍで処理
することにより、１８３個のアミノ酸からなるＨＢｃ抗
原をコードするＨＢｃ発現遺伝子断１２− 片を調製した。これを同様にＤＮＡ・ポリメラーゼ■を
用いて平滑末端とし、プラスミドｐＡＪ５０のＢａＩＩ
ＩＨ１部位にＨＢｃ発現遺伝子を組み込み、プラスミド
ｐＡＪ５０ｃを得た。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
Ａ■２２ （ａ Ｉｅｕ２， Ｈｉｓ４， ｃａｎｌ／
ｃｉｒ＋）を宿主細胞として、上記４種のブラスミドを
酢酸リチウム法により導入することにより形質転換を行
った。形質転換体の選択は、１ｍｇ／ｄ Ｇ４１８ネオ
マイシン誘導体（ＧＴＢＣＯ ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ社製
）含有ＹＰＤ培地を用い、ネオマイシン耐性に形質転換
された酵母菌を選択することにより行った。
Ａ■２２ （ａ Ｉｅｕ２， Ｈｉｓ４， ｃａｎｌ／
ｃｉｒ＋）を宿主細胞として、上記４種のブラスミドを
酢酸リチウム法により導入することにより形質転換を行
った。形質転換体の選択は、１ｍｇ／ｄ Ｇ４１８ネオ
マイシン誘導体（ＧＴＢＣＯ ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ社製
）含有ＹＰＤ培地を用い、ネオマイシン耐性に形質転換
された酵母菌を選択することにより行った。
Ｕ ス ▼ −二ゝネオマイシ
ン耐性の形質転換体を、１０ｍｌのｌｍｇ／Ｉｌｌの６
４１８ネオマイシン誘導体を含む完全栄養培地ＹＰＤに
植菌し、休数増殖期後期まで３０℃で振とう培養した。
ン耐性の形質転換体を、１０ｍｌのｌｍｇ／Ｉｌｌの６
４１８ネオマイシン誘導体を含む完全栄養培地ＹＰＤに
植菌し、休数増殖期後期まで３０℃で振とう培養した。
培養後、この培養液を３０００ｒｐＩ１で５分間遠心す
ることにより酵母菌を再び回収した後、１３ー １ｃＩＩ１３のグラスビーズ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を含む５０ｍＭリン酸Ｍ衝液（ｐＨ７．２
）を加え、５分間これを振動させることにより菌体を破
砕し、１５０００ｒｐＩＩ１で５分間遠心し、その破砕
上清（ライセー１− ）を回収した。
ることにより酵母菌を再び回収した後、１３ー １ｃＩＩ１３のグラスビーズ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を含む５０ｍＭリン酸Ｍ衝液（ｐＨ７．２
）を加え、５分間これを振動させることにより菌体を破
砕し、１５０００ｒｐＩＩ１で５分間遠心し、その破砕
上清（ライセー１− ）を回収した。
このライセートは、まずＨＢｃ抗原を検出する下記のＥ
ＬＩＳＡ（酵素標識免疫測定法〉に共された。
ＬＩＳＡ（酵素標識免疫測定法〉に共された。
まず、９６穴マイクロタイタープレートに抗ＨＢＣヤギ
ＩｇＧをコートし、次にこれをＢＳＡ （牛血清アルブ
ミン〉でコートした後、測定の対象となる酵母ライセー
トを反応させた。これに、抗ＨＢｃウサギＩｇＧをコー
トし、さらにバーオキシダーゼコン・ジュゲート抗ウサ
ギＩｇＧヤギ血清（バイオラット社製〉を反応させた。
ＩｇＧをコートし、次にこれをＢＳＡ （牛血清アルブ
ミン〉でコートした後、測定の対象となる酵母ライセー
トを反応させた。これに、抗ＨＢｃウサギＩｇＧをコー
トし、さらにバーオキシダーゼコン・ジュゲート抗ウサ
ギＩｇＧヤギ血清（バイオラット社製〉を反応させた。
これに基質としてＡＢＴＳ（アジノジエチルベンゾチア
ゾリンスルホン酸）を加え発色させた後、４０５ｎＩＩ
１の発色を測定することによりＨＢｃ抗原活性を測定し
た。
ゾリンスルホン酸）を加え発色させた後、４０５ｎＩＩ
１の発色を測定することによりＨＢｃ抗原活性を測定し
た。
これによりＨ Ｂ ｃ抗原を発現している形質転換体を
スクリーニングする。次に、これらＨＢｃ抗１４一 原を発現している形質転換体のライセートを下記のスク
リーニング系に共した。
スクリーニングする。次に、これらＨＢｃ抗１４一 原を発現している形質転換体のライセートを下記のスク
リーニング系に共した。
ヒト重合アルブミンをコートしたＥＬｒＳＡ用マイクロ
タイタープレートを用意し、これに上記ライセートを５
０縛ずつ加え、１時間インキユベーションした後にこの
プレートをＴｗｅｅｎ２０ （ ０． ０５％）を含む
トリス緩衝液（ＴＢＳ： Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ−ｓ
ａｌｉｎｅ）でよく洗浄し、Ｓｌ）Ｓ−２ＭＥ （２−
メルカプトエタノール）を含む電気泳動用の変性緩衝液
で抗原複合体を回収し、上記と同様に１５％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルにより電気泳動を行ったあと、Ｈ
Ｂｓに対する抗体を用いてウエスタンプロットを行った
このような抗原粒子の精製法および免疫吸着を利用した
ウエスタンプロットの方法に関しては、先に今村らによ
る報告の中で詳細に記載されている［ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，’ Ｖｏｌ．６１， Ｎｏ
．１１，ｐ３６４３３５４９ （１９８７）］。
タイタープレートを用意し、これに上記ライセートを５
０縛ずつ加え、１時間インキユベーションした後にこの
プレートをＴｗｅｅｎ２０ （ ０． ０５％）を含む
トリス緩衝液（ＴＢＳ： Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ−ｓ
ａｌｉｎｅ）でよく洗浄し、Ｓｌ）Ｓ−２ＭＥ （２−
メルカプトエタノール）を含む電気泳動用の変性緩衝液
で抗原複合体を回収し、上記と同様に１５％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルにより電気泳動を行ったあと、Ｈ
Ｂｓに対する抗体を用いてウエスタンプロットを行った
このような抗原粒子の精製法および免疫吸着を利用した
ウエスタンプロットの方法に関しては、先に今村らによ
る報告の中で詳細に記載されている［ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，’ Ｖｏｌ．６１， Ｎｏ
．１１，ｐ３６４３３５４９ （１９８７）］。
上記のウエスタンブロッテイングで、２３Ｋのメジャー
ＨＢｓのバンド、３３ＫのミドルＨＢｓのバンドおよび
４３ＫのラージＨＢｓのバンドを検出できた１５− 形質転換体がＨＢｃ抗原および３種のＨＢｓ関連抗原（
メジャーＨＢｓ、ミドルＨＢｓ、ラージＨＢｓ）を発現
している形質転換体である。このようにしてスクリーニ
ングされた形質転換体を本発明の人工ＨＢＶデーン様粒
子調製用のシードストレイン（種菌）とした。
ＨＢｓのバンド、３３ＫのミドルＨＢｓのバンドおよび
４３ＫのラージＨＢｓのバンドを検出できた１５− 形質転換体がＨＢｃ抗原および３種のＨＢｓ関連抗原（
メジャーＨＢｓ、ミドルＨＢｓ、ラージＨＢｓ）を発現
している形質転換体である。このようにしてスクリーニ
ングされた形質転換体を本発明の人工ＨＢＶデーン様粒
子調製用のシードストレイン（種菌）とした。
上記スクリーニングにより選択して得られたＨＢｃ抗原
と３種のＨＢｓ関連抗原とを発現するネオマイシン耐性
の形質転換体を、それぞれ１ＱのＹ Ｐ Ｄ （ ｌｍ
ｇ／ｍｌのＧ４１８を含む）培地で培養し、遠心分離に
よりぞれぞれ約３０ｇの菌体を得た。この菌体を５０ｍ
Ｍリン酸（ ｐｌ｛７． ２ ’Ｉおよび１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆ
ｌｕｏｒｉｄｏ）からなる溶解液により２０％菌体液と
して懸濁し、超音波破砕機（ソニケーター〉を用いて菌
体破砕し、発現された抗原粒子を溶出した。このように
して得られた酵母抽出液を遠心分離処理することにより
沈澱物を除去しライセートとした。目的のＨＢＶデーン
様粒子を１６− 精製するために、この抽出液を５ｘ〜２０％のショ糖密
度勾配遠心、塩化セシウム密度勾配遠心を行い抗原粒子
を精製した。
と３種のＨＢｓ関連抗原とを発現するネオマイシン耐性
の形質転換体を、それぞれ１ＱのＹ Ｐ Ｄ （ ｌｍ
ｇ／ｍｌのＧ４１８を含む）培地で培養し、遠心分離に
よりぞれぞれ約３０ｇの菌体を得た。この菌体を５０ｍ
Ｍリン酸（ ｐｌ｛７． ２ ’Ｉおよび１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆ
ｌｕｏｒｉｄｏ）からなる溶解液により２０％菌体液と
して懸濁し、超音波破砕機（ソニケーター〉を用いて菌
体破砕し、発現された抗原粒子を溶出した。このように
して得られた酵母抽出液を遠心分離処理することにより
沈澱物を除去しライセートとした。目的のＨＢＶデーン
様粒子を１６− 精製するために、この抽出液を５ｘ〜２０％のショ糖密
度勾配遠心、塩化セシウム密度勾配遠心を行い抗原粒子
を精製した。
シヨ糖密度勾配遠心後の各フラクションについてＨＢｓ
抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を測定した。 酵素標識
測定法によるＨＢｓ抗原測定キ・ジト（化血研製〉を用
いたＨＢｓ抗原測定の結果、ＨＢｃ抗原活性のピーク位
置にＨＢｓ抗原活性を示すショルダーが認められた（第
２Ａ図参照）。また、このショルダーは、ＨＢｃ及び３
ＭのＨＢｓ関連抗原を共発現させた場合に限り検出され
た，このショルダ一部分をプールし、ＰＢＳに透析後、
塩化セシウム密度勾配遠心分離に共した。これにより得
られた各フラクションについて先と同様ＨＢｓ抗原測定
およびＨＢｃ抗原測定を行った。さらに各フラクション
を３％ＮＰ４０ （界面活性剤）で処理した後に、ＨＢ
ｃ抗原活性を測定した。 その結果、１． ２５ｇ／ｃ
ｍ’のショルダーと、１． ２３ｇ／ｃｍ８においてＨ
Ｂｓ抗原活性を示した。ＨＢｃ活性については、１．
２５ｇ／ｃｍ３のピークを３％ＮＰ４ ０で室温一１７
一 １時間処理した場合にのみ処理前では陰性だった両分か
ら陽性反応が見いだされた（第２Ｂ図参照）。すなわち
、この１． ２５ｇ／ｃｍ３のショルダーの抗原は、表
面にＨＢｓ抗原のみが露出しＨＢｃ抗原を粒子内部に有
するＨＢＶデーン粒子に極めて類似した抗原であること
が推測された。
抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を測定した。 酵素標識
測定法によるＨＢｓ抗原測定キ・ジト（化血研製〉を用
いたＨＢｓ抗原測定の結果、ＨＢｃ抗原活性のピーク位
置にＨＢｓ抗原活性を示すショルダーが認められた（第
２Ａ図参照）。また、このショルダーは、ＨＢｃ及び３
ＭのＨＢｓ関連抗原を共発現させた場合に限り検出され
た，このショルダ一部分をプールし、ＰＢＳに透析後、
塩化セシウム密度勾配遠心分離に共した。これにより得
られた各フラクションについて先と同様ＨＢｓ抗原測定
およびＨＢｃ抗原測定を行った。さらに各フラクション
を３％ＮＰ４０ （界面活性剤）で処理した後に、ＨＢ
ｃ抗原活性を測定した。 その結果、１． ２５ｇ／ｃ
ｍ’のショルダーと、１． ２３ｇ／ｃｍ８においてＨ
Ｂｓ抗原活性を示した。ＨＢｃ活性については、１．
２５ｇ／ｃｍ３のピークを３％ＮＰ４ ０で室温一１７
一 １時間処理した場合にのみ処理前では陰性だった両分か
ら陽性反応が見いだされた（第２Ｂ図参照）。すなわち
、この１． ２５ｇ／ｃｍ３のショルダーの抗原は、表
面にＨＢｓ抗原のみが露出しＨＢｃ抗原を粒子内部に有
するＨＢＶデーン粒子に極めて類似した抗原であること
が推測された。
そこで、この画分をネガティブ染色法による電子顕微鏡
観察を行ったところ、Ｂ型肝炎患者血清中に存在するデ
ーン粒子（ＨＢＶ）と同じ大きさおよび形状の球状粒子
であることが確認された（第６図Ｂ参照）。尚、ヒト血
清中に存在する天然のデーン粒子も本発明に於て人工Ｈ
ＢＶ粒子が得られた画分（ １． ２５ｇ／ｃｍ’ ）
の密度を有することが知られている。
観察を行ったところ、Ｂ型肝炎患者血清中に存在するデ
ーン粒子（ＨＢＶ）と同じ大きさおよび形状の球状粒子
であることが確認された（第６図Ｂ参照）。尚、ヒト血
清中に存在する天然のデーン粒子も本発明に於て人工Ｈ
ＢＶ粒子が得られた画分（ １． ２５ｇ／ｃｍ’ ）
の密度を有することが知られている。
上記と同様の実験を、メジャーＨＢｓ発現遠伝子および
ＨＢｃ発現遺伝子のみを導入した形質転換体（Ｓ＋Ｃ）
（第３Ａ図、第３Ｂ図参照）、メジャー Ｈ Ｂ
ｓ発現遺伝子、ミドルＨＢｓ発現遺伝子およびＨＢｃ発
現遺伝子を導入した形質転換体（Ｓ＋Ｍ＋Ｃ） （第
４Ａ図、第４Ｂ図参照）並びにメジャー１８〜 ＨＢｓ発現遺伝子、ラージＨＢｓ発現遺伝子およびＨＢ
ｃ発現遺伝子を導入した形質転換体（ ３＋ｌ十Ｃ）〈
第５Ａ図、第５Ｂ図参照〉についても行ったが、３％Ｎ
Ｐ４０による処理後にＨＢｃ抗原活性を示すデーン粒子
溶抗原を発現しているものはなく、３種のＨＢｓ関連抗
原発現遺伝子およびＭＢＣ抗原発現遺伝子を導入した場
合（ Ｓ＋Ｍ＋Ｌ＋Ｃ ）にのみ、本発明のＨＢＶ様デ
ーン粒子が産生されることが確認された。
ＨＢｃ発現遺伝子のみを導入した形質転換体（Ｓ＋Ｃ）
（第３Ａ図、第３Ｂ図参照）、メジャー Ｈ Ｂ
ｓ発現遺伝子、ミドルＨＢｓ発現遺伝子およびＨＢｃ発
現遺伝子を導入した形質転換体（Ｓ＋Ｍ＋Ｃ） （第
４Ａ図、第４Ｂ図参照）並びにメジャー１８〜 ＨＢｓ発現遺伝子、ラージＨＢｓ発現遺伝子およびＨＢ
ｃ発現遺伝子を導入した形質転換体（ ３＋ｌ十Ｃ）〈
第５Ａ図、第５Ｂ図参照〉についても行ったが、３％Ｎ
Ｐ４０による処理後にＨＢｃ抗原活性を示すデーン粒子
溶抗原を発現しているものはなく、３種のＨＢｓ関連抗
原発現遺伝子およびＭＢＣ抗原発現遺伝子を導入した場
合（ Ｓ＋Ｍ＋Ｌ＋Ｃ ）にのみ、本発明のＨＢＶ様デ
ーン粒子が産生されることが確認された。
第１図は、実施例（１〉で構築した４種の発現プラスミ
ドの構造を示す。 第２Ａ図は、メジャーＨＢｓ、ミドルＨ Ｂ ｓ、ラー
ジＨＢｓおよびＨＢｃの４種の発現プラスミドを導入し
た形質転換体ライセートをシュークロース密度勾配遠心
により分離した各フラクションのＨＢｓ抗原活性および
ＨＢｃ抗原活性を示す。 第２Ｂ図は、第２Ａ図の一一画分くシュークロース密度
勾配遠心によりデーン粒子が集まる両分）のみを回収し
、これをさらに塩化セシウム密−１９＝ 度勾配遠心した各フラクションのＨＢｓ抗原活性及びＨ
Ｂｃ抗原活性を示す。 第３Ａ図は、メジャーＨＢｓおよびＨＢｃの２種の発現
ブラスミドを導入した形質転換体ライセートをシューク
ロース密度勾配遠心により分離した各フラクションのＨ
Ｂｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 第３Ｂ図は、第３Ａ図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
ＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 第４Ａ図は、メジャーＨＢｓ、ミドルＨＢｓおよびＨＢ
ｃの３種の発現ブラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示
す。 第４Ｂ図は、第４Ａ図の一一画分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
ＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 −２０− 第５Ａ図は、メジャーＨＢｓ、ラージＨＢｓおよびＨＢ
ｃの３種の発現プラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示
す。 第５Ｂ図は、第５Ａ図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
ＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 第６図は、本発明のデーン粒子様抗原の粒子構造を示す
電子顕微鏡写真である〈Ｂ〉．尚、Ａは、粒径を比較す
るためにＨＢｓ抗原粒子の電子顕微鏡写真を示す。
ドの構造を示す。 第２Ａ図は、メジャーＨＢｓ、ミドルＨ Ｂ ｓ、ラー
ジＨＢｓおよびＨＢｃの４種の発現プラスミドを導入し
た形質転換体ライセートをシュークロース密度勾配遠心
により分離した各フラクションのＨＢｓ抗原活性および
ＨＢｃ抗原活性を示す。 第２Ｂ図は、第２Ａ図の一一画分くシュークロース密度
勾配遠心によりデーン粒子が集まる両分）のみを回収し
、これをさらに塩化セシウム密−１９＝ 度勾配遠心した各フラクションのＨＢｓ抗原活性及びＨ
Ｂｃ抗原活性を示す。 第３Ａ図は、メジャーＨＢｓおよびＨＢｃの２種の発現
ブラスミドを導入した形質転換体ライセートをシューク
ロース密度勾配遠心により分離した各フラクションのＨ
Ｂｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 第３Ｂ図は、第３Ａ図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
ＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 第４Ａ図は、メジャーＨＢｓ、ミドルＨＢｓおよびＨＢ
ｃの３種の発現ブラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示
す。 第４Ｂ図は、第４Ａ図の一一画分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
ＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 −２０− 第５Ａ図は、メジャーＨＢｓ、ラージＨＢｓおよびＨＢ
ｃの３種の発現プラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示
す。 第５Ｂ図は、第５Ａ図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
ＨＢｓ抗原活性およびＨＢｃ抗原活性を示す。 第６図は、本発明のデーン粒子様抗原の粒子構造を示す
電子顕微鏡写真である〈Ｂ〉．尚、Ａは、粒径を比較す
るためにＨＢｓ抗原粒子の電子顕微鏡写真を示す。
Claims (6)
- （１）ＨＢｓ関連抗原およびＨＢｃ関連抗原から構成さ
れるデーン粒子様の形状を有する遺伝子組換えにより調
製された感染性を有さない人工ＨＢＶ粒子。 - （２）ＳＤＳ−２ＭＥ処理することで、メジャーＨＢｓ
ペプチド、ミドルＨＢｓペプチド、ラージＨＢｓペプチ
ドおよびＨＢｃペプチドが得られる抗原粒子である前記
第（１）項記載の人工ＨＢＶ粒子。 - （３）真核細胞を宿主細胞として発現された抗原である
前記第（１）項記載の人工ＨＢＶ粒子。 - （４）下記の（Ａ）〜（Ｄ）の４種の発現遺伝子カセッ
トを同一宿主細胞に導入して得られた形質転換体を培養
することを特徴とする、ＨＢｓ関連抗原およびＨＢｃ関
連抗原から構成されるデーン粒子様の形状を有する感染
性を有さない人工ＨＢＶ粒子の製法。 （Ａ）メジャーＨＢｓペプチドを発現させるための発現
遺伝子カセット （Ｂ）ミドルＨＢｓペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット （Ｃ）ラージＨＢｓペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット （Ｄ）ＨＢｃペプチドを発現させるための発現遺伝子カ
セット - （５）該各発現遺伝子カセットが、少なくとも真核細胞
内で機能するプロモーターおよびそれぞれのペプチドを
コードする構造遺伝子からなり、宿主細胞が真核細胞で
ある前記第（４）項記載の人工ＨＢＶ粒子の製法。 - （６）該各発現遺伝子カセットをプラスミドにより宿主
細胞へ導入する前記（４）項記載の人工ＨＢＶ粒子の製
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30978689A JPH03168097A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 人工ｂ型肝炎ウイルス粒子およびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30978689A JPH03168097A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 人工ｂ型肝炎ウイルス粒子およびその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03168097A true JPH03168097A (ja) | 1991-07-19 |
Family
ID=17997228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30978689A Pending JPH03168097A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 人工ｂ型肝炎ウイルス粒子およびその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03168097A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004047812A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Japan Science And Technology Agency | タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
-
1989
- 1989-11-28 JP JP30978689A patent/JPH03168097A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004047812A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Japan Science And Technology Agency | タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Strauss Jr et al. | Identification of the membrane protein and" core" protein of Sindbis virus. | |
| Waters et al. | Loss of the common | |
| Ernst et al. | Reovirus hemagglutinin mRNA codes for two polypeptides in overlapping reading frames. | |
| Philipson et al. | Translation of MuLV and MSV RNAs in nuclease-treated reticulocyte extracts: enhancement of the gag-pol polypeptide with yeast suppressor tRNA | |
| Klingmüller et al. | Hepadnavirus infection requires interaction between the viral pre-S domain and a specific hepatocellular receptor | |
| JP2755817B2 (ja) | パルボウイルスキャプシド | |
| JP2726641B2 (ja) | 形質転換脊椎動物細胞の製造方法およびその細胞 | |
| JP2758184B2 (ja) | 肝炎ｂ表面抗原ワクチン | |
| US5591638A (en) | Method for the transformation of cells, particularly eukaryotes by a DNA originating from viruses of hepatitis, more particularly from virus of B viral hepatitis, and preparations containing the expression products of said DNAs | |
| US4442205A (en) | Simian virus recombinant that directs the synthesis of hepatitis B surface antigen | |
| US4778761A (en) | Recombinant plasmid inserted with hepatitis B virus gene, yeast transformed with said recombinant plasmid, and production of hepatitis B virus surface antigen | |
| Jung et al. | Efficient and rapid purification of drug-and gene-carrying bio-nanocapsules, hepatitis B virus surface antigen L particles, from Saccharomyces cerevisiae | |
| JPS5936698A (ja) | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 | |
| CN115850396B (zh) | 一种rsv纳米颗粒疫苗及其制备方法与应用 | |
| KR880002586B1 (ko) | B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 | |
| Stephenson et al. | Isolation and characterization of C-type viral gene products of virus-negative mouse cells | |
| US4738926A (en) | Method for purification of HBs antigen | |
| JP2603312B2 (ja) | 酵母中でｂ型肝炎ウイルス蛋白質を生産するための方法 | |
| JPH0314840B2 (ja) | ||
| KR910008643B1 (ko) | B형 간염 비루스 표면항원(HBs 항원)의 정제 방법 | |
| EP2198020B1 (en) | Polynucleotides allowing the expression and secretion of recombinant pseudo-virus containing foreign epitopes, their production, and use | |
| Sitrin et al. | Survey of licensed hepatitis B vaccines and their production processes | |
| EP0105141A2 (en) | Recombinant DNA molecules, process for their production, their use for production of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and pharmaceutical compositions containing this HBsAg | |
| JPH03168097A (ja) | 人工ｂ型肝炎ウイルス粒子およびその製法 | |
| EP0205625A1 (en) | Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation |