JPH03168097A - 人工b型肝炎ウイルス粒子およびその製法 - Google Patents
人工b型肝炎ウイルス粒子およびその製法Info
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- JPH03168097A JPH03168097A JP30978689A JP30978689A JPH03168097A JP H03168097 A JPH03168097 A JP H03168097A JP 30978689 A JP30978689 A JP 30978689A JP 30978689 A JP30978689 A JP 30978689A JP H03168097 A JPH03168097 A JP H03168097A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子組換えにより発現された、感染性のな
いHBデーン粒子様抗原およびその製法に関する。
いHBデーン粒子様抗原およびその製法に関する。
さらに詳細には、天然のHBV粒子が有する長さの異な
る3種のHBs関連ペプチドおよび}{BCペプチドか
ら構成され、構造的にもデーン粒子に極めて類似した形
態を有し、感染性を有さないことを特徴とする人工HB
V粒子およびその製法に関する。
る3種のHBs関連ペプチドおよび}{BCペプチドか
ら構成され、構造的にもデーン粒子に極めて類似した形
態を有し、感染性を有さないことを特徴とする人工HB
V粒子およびその製法に関する。
遺伝子組換え技術の進歩に伴って、遺伝子組換えを利用
した有用物質の生産が近年急速に進められてきている。
した有用物質の生産が近年急速に進められてきている。
B型肝炎に関するワクチンおよび臨床検査試薬において
も、遺伝子組換え技術は効果的に活用され、既に形質転
換酵母を利用した遺伝子組換えワクチンおよび、これら
の抗原を用いた臨床検査試薬が広く市販されている。
も、遺伝子組換え技術は効果的に活用され、既に形質転
換酵母を利用した遺伝子組換えワクチンおよび、これら
の抗原を用いた臨床検査試薬が広く市販されている。
現在用いられている遺伝子組換えB型肝炎ワクチンは、
遺伝子組換えによりB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs
抗原〉のみを発現させたものであり、B型肝炎ウイルス
(HBV)由来の他の蛋白質や血清由来の未知物質等を
全く含まない安全なコンポーネントワクチンとして利用
されている。
遺伝子組換えによりB型肝炎ウイルス表面抗原(HBs
抗原〉のみを発現させたものであり、B型肝炎ウイルス
(HBV)由来の他の蛋白質や血清由来の未知物質等を
全く含まない安全なコンポーネントワクチンとして利用
されている。
しかしながら、現行のB型肝炎ワクチンでは極一部に抗
体価の上がらないノンレスボンダーと呼ばれる非免疫反
応者がワクチン接種対象者中に存在することが知られて
おり、これらの対象者に対しても有効な新しいB型肝炎
ワクチンの開発が望まれている。
体価の上がらないノンレスボンダーと呼ばれる非免疫反
応者がワクチン接種対象者中に存在することが知られて
おり、これらの対象者に対しても有効な新しいB型肝炎
ワクチンの開発が望まれている。
最近、HBs抗原に対して抗体反応を示さないヌードマ
ウスを用いた興味のある免疫実験の結果が報告された[
Nature Vo+. 329 P547−549
1’987年lO月8日発行]。これによれば、通常
のHBs抗原に対しては遺伝的に免疫反応ができないI
{−2ハブロタイプを持ったマウスに、HBc抗原で初
回免疫を行い、さらにHBV(デーン粒子)で2次免疫
を行ったところ、HBs抗原に対する抗体が誘導された
という結果を示している。比較実験として、上記の2次
免疫においてHBVの代わりに、HBC抗原とH B
s抗原を混合した抗原を用いて免疫したところ、この場
合にはHBs抗体は誘導されないことを示している。
ウスを用いた興味のある免疫実験の結果が報告された[
Nature Vo+. 329 P547−549
1’987年lO月8日発行]。これによれば、通常
のHBs抗原に対しては遺伝的に免疫反応ができないI
{−2ハブロタイプを持ったマウスに、HBc抗原で初
回免疫を行い、さらにHBV(デーン粒子)で2次免疫
を行ったところ、HBs抗原に対する抗体が誘導された
という結果を示している。比較実験として、上記の2次
免疫においてHBVの代わりに、HBC抗原とH B
s抗原を混合した抗原を用いて免疫したところ、この場
合にはHBs抗体は誘導されないことを示している。
一方、最近九州大学の笹月らは.HBsワクチンに対し
て免疫反応を示さない人のH L A ( Human
Leukocyte Antigen Complex
:ヒト白血球抗原〉に共通のハブロタイプがあることを
報告した。
て免疫反応を示さない人のH L A ( Human
Leukocyte Antigen Complex
:ヒト白血球抗原〉に共通のハブロタイプがあることを
報告した。
このことから、HBs抗原に対して遺伝的に免疫反応を
示し得ないノンレスボンダーに対しては、HBVのよう
な物理的構造の抗原、すなわち同一・分子内の表面にH
Bs抗原がそして内部にH B c抗原が存在する抗原
がB型肝炎予防ワクチンとして有効であると考えられる
。しかしながら、天然のHBVを使用することは、安全
性の面からも好ましくなく、また、これまでの技術では
人工的にHBV (デーン粒子)様の抗原を調製するこ
とは困難とされてきた。
示し得ないノンレスボンダーに対しては、HBVのよう
な物理的構造の抗原、すなわち同一・分子内の表面にH
Bs抗原がそして内部にH B c抗原が存在する抗原
がB型肝炎予防ワクチンとして有効であると考えられる
。しかしながら、天然のHBVを使用することは、安全
性の面からも好ましくなく、また、これまでの技術では
人工的にHBV (デーン粒子)様の抗原を調製するこ
とは困難とされてきた。
免里曵且旬
本発明者らは、HBVの構造遺伝子を発現できる形質転
換体を用いてその発現産物の研究を進めたところ、形状
的に天然のB型肝炎ウイルス粒子(デーン粒子)に極め
て類似した、HBs関連抗原およびHBc抗原から楕成
される感染生を有さない人工HBV粒子を遺伝子組換え
技術により得ることに成功した。
換体を用いてその発現産物の研究を進めたところ、形状
的に天然のB型肝炎ウイルス粒子(デーン粒子)に極め
て類似した、HBs関連抗原およびHBc抗原から楕成
される感染生を有さない人工HBV粒子を遺伝子組換え
技術により得ることに成功した。
すなわち、本発明は、遺伝子組換えにより得られる抗原
であって、数種のHBs関連ペプチドとHBcペプチド
から構成される、形状的にデーン粒子に極めて類似した
感染性のない人工HBV粒子およびその製法を提供する
ものである。
であって、数種のHBs関連ペプチドとHBcペプチド
から構成される、形状的にデーン粒子に極めて類似した
感染性のない人工HBV粒子およびその製法を提供する
ものである。
本発明の人工HBV粒子は、構造上}{BVに極めて類
似していることがら、これまでの組換えHBs抗原から
なるワクチンでは免疫効果が得られなかった非免疫反応
者に対しても、十分な免疫効果を有することが期待でき
る。
似していることがら、これまでの組換えHBs抗原から
なるワクチンでは免疫効果が得られなかった非免疫反応
者に対しても、十分な免疫効果を有することが期待でき
る。
一
−RLこHBV(B型肝炎ウイルス、別名テーン粒子)
は、表面にHBsvL原を露出し、中心にHBV−DN
Aゲノムを取り込んだHBc抗原を有していることが知
られている。また、HBV−DNAは、約3. 2kb
pの2本@DNAがらなる環状の遺伝子であり、この遺
伝子にはHBsペプチド、HBcペプチド及びDNAポ
リメラーゼ等がコードされている。
は、表面にHBsvL原を露出し、中心にHBV−DN
Aゲノムを取り込んだHBc抗原を有していることが知
られている。また、HBV−DNAは、約3. 2kb
pの2本@DNAがらなる環状の遺伝子であり、この遺
伝子にはHBsペプチド、HBcペプチド及びDNAポ
リメラーゼ等がコードされている。
本発明の人工HBV粒子は、アミノ酸226個からなる
メジャーHBsペプチド、メジャーHBsペプチドのア
ミノ末端にさらに55個のアミノ酸からなるブレS2ペ
プチドが続くミドルHBsペプチド、メジャーHBsペ
プチドのアミノ末端にさらに174個のアミノ酸からな
るプレS1ペプチドカく続くラージHBsペプチドおよ
びアミノ酸183個からなるHBcペプチドを同一宿主
細胞内で共発現させることにより得ることができる。
メジャーHBsペプチド、メジャーHBsペプチドのア
ミノ末端にさらに55個のアミノ酸からなるブレS2ペ
プチドが続くミドルHBsペプチド、メジャーHBsペ
プチドのアミノ末端にさらに174個のアミノ酸からな
るプレS1ペプチドカく続くラージHBsペプチドおよ
びアミノ酸183個からなるHBcペプチドを同一宿主
細胞内で共発現させることにより得ることができる。
このようなペプチドを発現させる宿主細胞としては、通
常遺伝子組換えに使用されている一般の宿主細胞が用い
られるが、特に真核細胞を用〜1ることが好ましく、酵
母や動物細胞等が一例として挙げられる。
常遺伝子組換えに使用されている一般の宿主細胞が用い
られるが、特に真核細胞を用〜1ることが好ましく、酵
母や動物細胞等が一例として挙げられる。
それぞれのべブチドを発現させるためには、それぞれの
ペプチドの発現を目的とした発現カセ・ント遺伝子が使
用される。この発現カセ・ント遺伝子とは、プロモータ
ー、目的のペプチドの構造遺伝子さらに好ましくはター
ミネーター配列を組換え遺伝子の基本構造として有する
組換え遺伝子断片を意味する。天然の遺伝子単位で言え
ばオベロンに相当する構造ユニットからなる遺伝子断片
である。すなわち、本発明で言う4種の発現カセット遺
伝子とは、 (A)メジャーHBsペプチドを発現させるための発現
遺伝子カセット、 (B)ミドルHBsペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット、 (C)ラージHBsペプチドを発現させるための発現遺
伝子力セツ1〜及び (D)HBcペプチドを発現させるための発現遺伝子カ
セットを言う。
ペプチドの発現を目的とした発現カセ・ント遺伝子が使
用される。この発現カセ・ント遺伝子とは、プロモータ
ー、目的のペプチドの構造遺伝子さらに好ましくはター
ミネーター配列を組換え遺伝子の基本構造として有する
組換え遺伝子断片を意味する。天然の遺伝子単位で言え
ばオベロンに相当する構造ユニットからなる遺伝子断片
である。すなわち、本発明で言う4種の発現カセット遺
伝子とは、 (A)メジャーHBsペプチドを発現させるための発現
遺伝子カセット、 (B)ミドルHBsペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット、 (C)ラージHBsペプチドを発現させるための発現遺
伝子力セツ1〜及び (D)HBcペプチドを発現させるための発現遺伝子カ
セットを言う。
このような4種の遺伝子カセットを用いて宿主細胞の形
質転換を行うが、その際の手法としては、通常の遺伝子
導入法が使用され、一般にはプラスミドを用いる方法等
が広く使用される。プラスミドを用いて遺伝子の導入を
行う場合には、1種または複数の発現カセットをひとつ
のプラスミドに組み込むことができ、これを宿主細胞に
公知の方法により遺伝子導入を行うことができる。尚、
複数の種類のプラスミドを上記4種のべブチドの発現の
ために使用する場合には、使用したすべてのブラスミド
を有している形質転換体を選択することが必要であり、
そのためには各プラスミドに異なる選択マーカー遺伝子
を組み込むこともできる,また、ブラスミドの脱落を防
止する意味では、上記の4種の発現カセットの一部また
は全部を宿主細胞の染色体遺伝子に直接組み込ませるこ
とも可能である。
質転換を行うが、その際の手法としては、通常の遺伝子
導入法が使用され、一般にはプラスミドを用いる方法等
が広く使用される。プラスミドを用いて遺伝子の導入を
行う場合には、1種または複数の発現カセットをひとつ
のプラスミドに組み込むことができ、これを宿主細胞に
公知の方法により遺伝子導入を行うことができる。尚、
複数の種類のプラスミドを上記4種のべブチドの発現の
ために使用する場合には、使用したすべてのブラスミド
を有している形質転換体を選択することが必要であり、
そのためには各プラスミドに異なる選択マーカー遺伝子
を組み込むこともできる,また、ブラスミドの脱落を防
止する意味では、上記の4種の発現カセットの一部また
は全部を宿主細胞の染色体遺伝子に直接組み込ませるこ
とも可能である。
このようにして構築し選択された、上記4種の発現カセ
ット逍伝子が組み込まれた形質転換体を培養することに
より、本発明のデーン粒子様抗原が発現される。形質転
換体から産生された本発明の人工HBV粒子を、通常の
精製方法に従い精製回収する。
ット逍伝子が組み込まれた形質転換体を培養することに
より、本発明のデーン粒子様抗原が発現される。形質転
換体から産生された本発明の人工HBV粒子を、通常の
精製方法に従い精製回収する。
このようにして得られる人工HBV粒子は、電子顕微鏡
写真により、粒径もほぼ42nmとデーン粒子に極めて
形状的に類似していること確認され、また、この抗原を
SDS−2MF.処理することに−9− より、3種の長さの異なるHBs関連ペプチドおよびH
Bcペプチドが検出された。このことにより、本発明に
おいては、形質転換体の構築に用いた4種の発現カセッ
トにより発現される4種のべブチドが会合して粒子を形
成していることが確認された。
写真により、粒径もほぼ42nmとデーン粒子に極めて
形状的に類似していること確認され、また、この抗原を
SDS−2MF.処理することに−9− より、3種の長さの異なるHBs関連ペプチドおよびH
Bcペプチドが検出された。このことにより、本発明に
おいては、形質転換体の構築に用いた4種の発現カセッ
トにより発現される4種のべブチドが会合して粒子を形
成していることが確認された。
すなわち、組み込んだ4種のHBV関連ペプチド発現カ
セットから目的のペプチドが発現され、しかも発現され
た4種のHBV関連ペプチドが本来有している会合能に
よりHBVデーン粒子に物理的構造が極めて類似した人
工HBV粒子が発現されることが確認された6 本発明者らは、上記4種の発現カセットのうち3種もし
くは2種のみの遺伝子を用いて同様の実験を行った。す
なわち、メジャーHBs発現カセットおよびHBc発現
カセットのみを用いて構築した形質転換体、メジャーH
Bs発現カセット、ミドルHBs発現カセットおよびH
Bc発現力セントのみを用いて構築した形質転換体なら
びにメジャーHBs発現カセット、ラージHBs発現力
1〇一 セットおよびHBc発現カセットのみを用いて構築した
形質転換体を用いて同様の発現実験および解析を行った
が、これらにおいては、デーン粒子様抗原の発現は確認
されず、本発明に従い3種のHBs関連ペプチド発現カ
セットおよびH B cペプチド発現カセットの合計4
種の発現遺伝子を同一の宿主細胞に導入することによっ
てのみ、本発明のデーン粒子様HB抗原が得られること
が明らかになった。
セットから目的のペプチドが発現され、しかも発現され
た4種のHBV関連ペプチドが本来有している会合能に
よりHBVデーン粒子に物理的構造が極めて類似した人
工HBV粒子が発現されることが確認された6 本発明者らは、上記4種の発現カセットのうち3種もし
くは2種のみの遺伝子を用いて同様の実験を行った。す
なわち、メジャーHBs発現カセットおよびHBc発現
カセットのみを用いて構築した形質転換体、メジャーH
Bs発現カセット、ミドルHBs発現カセットおよびH
Bc発現力セントのみを用いて構築した形質転換体なら
びにメジャーHBs発現カセット、ラージHBs発現力
1〇一 セットおよびHBc発現カセットのみを用いて構築した
形質転換体を用いて同様の発現実験および解析を行った
が、これらにおいては、デーン粒子様抗原の発現は確認
されず、本発明に従い3種のHBs関連ペプチド発現カ
セットおよびH B cペプチド発現カセットの合計4
種の発現遺伝子を同一の宿主細胞に導入することによっ
てのみ、本発明のデーン粒子様HB抗原が得られること
が明らかになった。
以下、実施例に従い本発明を更に詳細に説明する。
ブラスミドpYG100−S.pYG100−M並びに
pYG100−L[今村ら、Journal of V
irology Vo1.61 No.11p3543
−3549 (1987)]を制限酵素旧ndll+で
処理することにより、B型肝炎ウイルス表面抗原をコー
ドする遺伝子であるHBs(メジャーHBs)311伝
11− 子 [アミノ酸226個をコードする]、1レSをコー
ドする遺伝子であるブレS2−HBs(ミドルHBs)
遺伝子[HBs遺伝子に加えさらに5′端に55個のア
ミノ酸をコードする遺伝子コ、並びにプレSl−HBs
(ラージHBs)遺伝子[HBs3lt伝子に加えさら
に5“端に174個のアミノ酸をコードする遺伝子]を
調製した。これをDNAポリメラーゼ1 (Henow
large fragmemnt)を用いて平滑末端
とし、プラスミドpAJ50 [Nature 287
, p869−871(1980) ]のBamH 1
部位を同様に平滑末端としたものと混合し、T4DNA
リガーゼを用いてライゲーションした。このようにして
、メジャーHBs遺伝子、ミドルHBs遺伝子ならびに
ラージHBs遺伝子の発現を目的とした自律増殖型プラ
スミドpAJ50s−S.pAJ50M−S並びにブラ
スミドpAJ50L−S (第1図参照)を調製した。
pYG100−L[今村ら、Journal of V
irology Vo1.61 No.11p3543
−3549 (1987)]を制限酵素旧ndll+で
処理することにより、B型肝炎ウイルス表面抗原をコー
ドする遺伝子であるHBs(メジャーHBs)311伝
11− 子 [アミノ酸226個をコードする]、1レSをコー
ドする遺伝子であるブレS2−HBs(ミドルHBs)
遺伝子[HBs遺伝子に加えさらに5′端に55個のア
ミノ酸をコードする遺伝子コ、並びにプレSl−HBs
(ラージHBs)遺伝子[HBs3lt伝子に加えさら
に5“端に174個のアミノ酸をコードする遺伝子]を
調製した。これをDNAポリメラーゼ1 (Henow
large fragmemnt)を用いて平滑末端
とし、プラスミドpAJ50 [Nature 287
, p869−871(1980) ]のBamH 1
部位を同様に平滑末端としたものと混合し、T4DNA
リガーゼを用いてライゲーションした。このようにして
、メジャーHBs遺伝子、ミドルHBs遺伝子ならびに
ラージHBs遺伝子の発現を目的とした自律増殖型プラ
スミドpAJ50s−S.pAJ50M−S並びにブラ
スミドpAJ50L−S (第1図参照)を調製した。
同様に、ブラスミドpYG,701c [Journa
l of Bjotechnology 8. pl4
9−162 (1988)コを制限酵素旧ndmで処理
することにより、183個のアミノ酸からなるHBc抗
原をコードするHBc発現遺伝子断12− 片を調製した。これを同様にDNA・ポリメラーゼ■を
用いて平滑末端とし、プラスミドpAJ50のBaII
IH1部位にHBc発現遺伝子を組み込み、プラスミド
pAJ50cを得た。
l of Bjotechnology 8. pl4
9−162 (1988)コを制限酵素旧ndmで処理
することにより、183個のアミノ酸からなるHBc抗
原をコードするHBc発現遺伝子断12− 片を調製した。これを同様にDNA・ポリメラーゼ■を
用いて平滑末端とし、プラスミドpAJ50のBaII
IH1部位にHBc発現遺伝子を組み込み、プラスミド
pAJ50cを得た。
Saccharomyces cerevisiae
A■22 (a Ieu2, His4, canl/
cir+)を宿主細胞として、上記4種のブラスミドを
酢酸リチウム法により導入することにより形質転換を行
った。形質転換体の選択は、1mg/d G418ネオ
マイシン誘導体(GTBCO GENETICIN社製
)含有YPD培地を用い、ネオマイシン耐性に形質転換
された酵母菌を選択することにより行った。
A■22 (a Ieu2, His4, canl/
cir+)を宿主細胞として、上記4種のブラスミドを
酢酸リチウム法により導入することにより形質転換を行
った。形質転換体の選択は、1mg/d G418ネオ
マイシン誘導体(GTBCO GENETICIN社製
)含有YPD培地を用い、ネオマイシン耐性に形質転換
された酵母菌を選択することにより行った。
U ス ▼ −二ゝネオマイシ
ン耐性の形質転換体を、10mlのlmg/Illの6
418ネオマイシン誘導体を含む完全栄養培地YPDに
植菌し、休数増殖期後期まで30℃で振とう培養した。
ン耐性の形質転換体を、10mlのlmg/Illの6
418ネオマイシン誘導体を含む完全栄養培地YPDに
植菌し、休数増殖期後期まで30℃で振とう培養した。
培養後、この培養液を3000rpI1で5分間遠心す
ることにより酵母菌を再び回収した後、13ー 1cII13のグラスビーズ及び0.1%Triton
X−100を含む50mMリン酸M衝液(pH7.2
)を加え、5分間これを振動させることにより菌体を破
砕し、15000rpII1で5分間遠心し、その破砕
上清(ライセー1− )を回収した。
ることにより酵母菌を再び回収した後、13ー 1cII13のグラスビーズ及び0.1%Triton
X−100を含む50mMリン酸M衝液(pH7.2
)を加え、5分間これを振動させることにより菌体を破
砕し、15000rpII1で5分間遠心し、その破砕
上清(ライセー1− )を回収した。
このライセートは、まずHBc抗原を検出する下記のE
LISA(酵素標識免疫測定法〉に共された。
LISA(酵素標識免疫測定法〉に共された。
まず、96穴マイクロタイタープレートに抗HBCヤギ
IgGをコートし、次にこれをBSA (牛血清アルブ
ミン〉でコートした後、測定の対象となる酵母ライセー
トを反応させた。これに、抗HBcウサギIgGをコー
トし、さらにバーオキシダーゼコン・ジュゲート抗ウサ
ギIgGヤギ血清(バイオラット社製〉を反応させた。
IgGをコートし、次にこれをBSA (牛血清アルブ
ミン〉でコートした後、測定の対象となる酵母ライセー
トを反応させた。これに、抗HBcウサギIgGをコー
トし、さらにバーオキシダーゼコン・ジュゲート抗ウサ
ギIgGヤギ血清(バイオラット社製〉を反応させた。
これに基質としてABTS(アジノジエチルベンゾチア
ゾリンスルホン酸)を加え発色させた後、405nII
1の発色を測定することによりHBc抗原活性を測定し
た。
ゾリンスルホン酸)を加え発色させた後、405nII
1の発色を測定することによりHBc抗原活性を測定し
た。
これによりH B c抗原を発現している形質転換体を
スクリーニングする。次に、これらHBc抗14一 原を発現している形質転換体のライセートを下記のスク
リーニング系に共した。
スクリーニングする。次に、これらHBc抗14一 原を発現している形質転換体のライセートを下記のスク
リーニング系に共した。
ヒト重合アルブミンをコートしたELrSA用マイクロ
タイタープレートを用意し、これに上記ライセートを5
0縛ずつ加え、1時間インキユベーションした後にこの
プレートをTween20 ( 0. 05%)を含む
トリス緩衝液(TBS: Tris−buffer−s
aline)でよく洗浄し、Sl)S−2ME (2−
メルカプトエタノール)を含む電気泳動用の変性緩衝液
で抗原複合体を回収し、上記と同様に15%SDS−ポ
リアクリルアミドゲルにより電気泳動を行ったあと、H
Bsに対する抗体を用いてウエスタンプロットを行った
このような抗原粒子の精製法および免疫吸着を利用した
ウエスタンプロットの方法に関しては、先に今村らによ
る報告の中で詳細に記載されている[ Journal
of Virology,’ Vol.61, No
.11,p36433549 (1987)]。
タイタープレートを用意し、これに上記ライセートを5
0縛ずつ加え、1時間インキユベーションした後にこの
プレートをTween20 ( 0. 05%)を含む
トリス緩衝液(TBS: Tris−buffer−s
aline)でよく洗浄し、Sl)S−2ME (2−
メルカプトエタノール)を含む電気泳動用の変性緩衝液
で抗原複合体を回収し、上記と同様に15%SDS−ポ
リアクリルアミドゲルにより電気泳動を行ったあと、H
Bsに対する抗体を用いてウエスタンプロットを行った
このような抗原粒子の精製法および免疫吸着を利用した
ウエスタンプロットの方法に関しては、先に今村らによ
る報告の中で詳細に記載されている[ Journal
of Virology,’ Vol.61, No
.11,p36433549 (1987)]。
上記のウエスタンブロッテイングで、23Kのメジャー
HBsのバンド、33KのミドルHBsのバンドおよび
43KのラージHBsのバンドを検出できた15− 形質転換体がHBc抗原および3種のHBs関連抗原(
メジャーHBs、ミドルHBs、ラージHBs)を発現
している形質転換体である。このようにしてスクリーニ
ングされた形質転換体を本発明の人工HBVデーン様粒
子調製用のシードストレイン(種菌)とした。
HBsのバンド、33KのミドルHBsのバンドおよび
43KのラージHBsのバンドを検出できた15− 形質転換体がHBc抗原および3種のHBs関連抗原(
メジャーHBs、ミドルHBs、ラージHBs)を発現
している形質転換体である。このようにしてスクリーニ
ングされた形質転換体を本発明の人工HBVデーン様粒
子調製用のシードストレイン(種菌)とした。
上記スクリーニングにより選択して得られたHBc抗原
と3種のHBs関連抗原とを発現するネオマイシン耐性
の形質転換体を、それぞれ1QのY P D ( lm
g/mlのG418を含む)培地で培養し、遠心分離に
よりぞれぞれ約30gの菌体を得た。この菌体を50m
Mリン酸( pl{7. 2 ’Iおよび1mM PM
SF(phenylmethylsulfonyl f
luorido)からなる溶解液により20%菌体液と
して懸濁し、超音波破砕機(ソニケーター〉を用いて菌
体破砕し、発現された抗原粒子を溶出した。このように
して得られた酵母抽出液を遠心分離処理することにより
沈澱物を除去しライセートとした。目的のHBVデーン
様粒子を16− 精製するために、この抽出液を5x〜20%のショ糖密
度勾配遠心、塩化セシウム密度勾配遠心を行い抗原粒子
を精製した。
と3種のHBs関連抗原とを発現するネオマイシン耐性
の形質転換体を、それぞれ1QのY P D ( lm
g/mlのG418を含む)培地で培養し、遠心分離に
よりぞれぞれ約30gの菌体を得た。この菌体を50m
Mリン酸( pl{7. 2 ’Iおよび1mM PM
SF(phenylmethylsulfonyl f
luorido)からなる溶解液により20%菌体液と
して懸濁し、超音波破砕機(ソニケーター〉を用いて菌
体破砕し、発現された抗原粒子を溶出した。このように
して得られた酵母抽出液を遠心分離処理することにより
沈澱物を除去しライセートとした。目的のHBVデーン
様粒子を16− 精製するために、この抽出液を5x〜20%のショ糖密
度勾配遠心、塩化セシウム密度勾配遠心を行い抗原粒子
を精製した。
シヨ糖密度勾配遠心後の各フラクションについてHBs
抗原活性およびHBc抗原活性を測定した。 酵素標識
測定法によるHBs抗原測定キ・ジト(化血研製〉を用
いたHBs抗原測定の結果、HBc抗原活性のピーク位
置にHBs抗原活性を示すショルダーが認められた(第
2A図参照)。また、このショルダーは、HBc及び3
MのHBs関連抗原を共発現させた場合に限り検出され
た,このショルダ一部分をプールし、PBSに透析後、
塩化セシウム密度勾配遠心分離に共した。これにより得
られた各フラクションについて先と同様HBs抗原測定
およびHBc抗原測定を行った。さらに各フラクション
を3%NP40 (界面活性剤)で処理した後に、HB
c抗原活性を測定した。 その結果、1. 25g/c
m’のショルダーと、1. 23g/cm8においてH
Bs抗原活性を示した。HBc活性については、1.
25g/cm3のピークを3%NP4 0で室温一17
一 1時間処理した場合にのみ処理前では陰性だった両分か
ら陽性反応が見いだされた(第2B図参照)。すなわち
、この1. 25g/cm3のショルダーの抗原は、表
面にHBs抗原のみが露出しHBc抗原を粒子内部に有
するHBVデーン粒子に極めて類似した抗原であること
が推測された。
抗原活性およびHBc抗原活性を測定した。 酵素標識
測定法によるHBs抗原測定キ・ジト(化血研製〉を用
いたHBs抗原測定の結果、HBc抗原活性のピーク位
置にHBs抗原活性を示すショルダーが認められた(第
2A図参照)。また、このショルダーは、HBc及び3
MのHBs関連抗原を共発現させた場合に限り検出され
た,このショルダ一部分をプールし、PBSに透析後、
塩化セシウム密度勾配遠心分離に共した。これにより得
られた各フラクションについて先と同様HBs抗原測定
およびHBc抗原測定を行った。さらに各フラクション
を3%NP40 (界面活性剤)で処理した後に、HB
c抗原活性を測定した。 その結果、1. 25g/c
m’のショルダーと、1. 23g/cm8においてH
Bs抗原活性を示した。HBc活性については、1.
25g/cm3のピークを3%NP4 0で室温一17
一 1時間処理した場合にのみ処理前では陰性だった両分か
ら陽性反応が見いだされた(第2B図参照)。すなわち
、この1. 25g/cm3のショルダーの抗原は、表
面にHBs抗原のみが露出しHBc抗原を粒子内部に有
するHBVデーン粒子に極めて類似した抗原であること
が推測された。
そこで、この画分をネガティブ染色法による電子顕微鏡
観察を行ったところ、B型肝炎患者血清中に存在するデ
ーン粒子(HBV)と同じ大きさおよび形状の球状粒子
であることが確認された(第6図B参照)。尚、ヒト血
清中に存在する天然のデーン粒子も本発明に於て人工H
BV粒子が得られた画分( 1. 25g/cm’ )
の密度を有することが知られている。
観察を行ったところ、B型肝炎患者血清中に存在するデ
ーン粒子(HBV)と同じ大きさおよび形状の球状粒子
であることが確認された(第6図B参照)。尚、ヒト血
清中に存在する天然のデーン粒子も本発明に於て人工H
BV粒子が得られた画分( 1. 25g/cm’ )
の密度を有することが知られている。
上記と同様の実験を、メジャーHBs発現遠伝子および
HBc発現遺伝子のみを導入した形質転換体(S+C)
(第3A図、第3B図参照)、メジャー H B
s発現遺伝子、ミドルHBs発現遺伝子およびHBc発
現遺伝子を導入した形質転換体(S+M+C) (第
4A図、第4B図参照)並びにメジャー18〜 HBs発現遺伝子、ラージHBs発現遺伝子およびHB
c発現遺伝子を導入した形質転換体( 3+l十C)〈
第5A図、第5B図参照〉についても行ったが、3%N
P40による処理後にHBc抗原活性を示すデーン粒子
溶抗原を発現しているものはなく、3種のHBs関連抗
原発現遺伝子およびMBC抗原発現遺伝子を導入した場
合( S+M+L+C )にのみ、本発明のHBV様デ
ーン粒子が産生されることが確認された。
HBc発現遺伝子のみを導入した形質転換体(S+C)
(第3A図、第3B図参照)、メジャー H B
s発現遺伝子、ミドルHBs発現遺伝子およびHBc発
現遺伝子を導入した形質転換体(S+M+C) (第
4A図、第4B図参照)並びにメジャー18〜 HBs発現遺伝子、ラージHBs発現遺伝子およびHB
c発現遺伝子を導入した形質転換体( 3+l十C)〈
第5A図、第5B図参照〉についても行ったが、3%N
P40による処理後にHBc抗原活性を示すデーン粒子
溶抗原を発現しているものはなく、3種のHBs関連抗
原発現遺伝子およびMBC抗原発現遺伝子を導入した場
合( S+M+L+C )にのみ、本発明のHBV様デ
ーン粒子が産生されることが確認された。
第1図は、実施例(1〉で構築した4種の発現プラスミ
ドの構造を示す。 第2A図は、メジャーHBs、ミドルH B s、ラー
ジHBsおよびHBcの4種の発現プラスミドを導入し
た形質転換体ライセートをシュークロース密度勾配遠心
により分離した各フラクションのHBs抗原活性および
HBc抗原活性を示す。 第2B図は、第2A図の一一画分くシュークロース密度
勾配遠心によりデーン粒子が集まる両分)のみを回収し
、これをさらに塩化セシウム密−19= 度勾配遠心した各フラクションのHBs抗原活性及びH
Bc抗原活性を示す。 第3A図は、メジャーHBsおよびHBcの2種の発現
ブラスミドを導入した形質転換体ライセートをシューク
ロース密度勾配遠心により分離した各フラクションのH
Bs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 第3B図は、第3A図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
HBs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 第4A図は、メジャーHBs、ミドルHBsおよびHB
cの3種の発現ブラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのHBs抗原活性およびHBc抗原活性を示
す。 第4B図は、第4A図の一一画分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
HBs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 −20− 第5A図は、メジャーHBs、ラージHBsおよびHB
cの3種の発現プラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのHBs抗原活性およびHBc抗原活性を示
す。 第5B図は、第5A図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
HBs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 第6図は、本発明のデーン粒子様抗原の粒子構造を示す
電子顕微鏡写真である〈B〉.尚、Aは、粒径を比較す
るためにHBs抗原粒子の電子顕微鏡写真を示す。
ドの構造を示す。 第2A図は、メジャーHBs、ミドルH B s、ラー
ジHBsおよびHBcの4種の発現プラスミドを導入し
た形質転換体ライセートをシュークロース密度勾配遠心
により分離した各フラクションのHBs抗原活性および
HBc抗原活性を示す。 第2B図は、第2A図の一一画分くシュークロース密度
勾配遠心によりデーン粒子が集まる両分)のみを回収し
、これをさらに塩化セシウム密−19= 度勾配遠心した各フラクションのHBs抗原活性及びH
Bc抗原活性を示す。 第3A図は、メジャーHBsおよびHBcの2種の発現
ブラスミドを導入した形質転換体ライセートをシューク
ロース密度勾配遠心により分離した各フラクションのH
Bs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 第3B図は、第3A図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
HBs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 第4A図は、メジャーHBs、ミドルHBsおよびHB
cの3種の発現ブラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのHBs抗原活性およびHBc抗原活性を示
す。 第4B図は、第4A図の一一画分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
HBs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 −20− 第5A図は、メジャーHBs、ラージHBsおよびHB
cの3種の発現プラスミドを導入した形質転換体ライセ
ートをシュークロース密度勾配遠心により分離した各フ
ラクションのHBs抗原活性およびHBc抗原活性を示
す。 第5B図は、第5A図の一一両分のみを回収し、これを
さらに塩化セシウム密度勾配遠心した各フラクションの
HBs抗原活性およびHBc抗原活性を示す。 第6図は、本発明のデーン粒子様抗原の粒子構造を示す
電子顕微鏡写真である〈B〉.尚、Aは、粒径を比較す
るためにHBs抗原粒子の電子顕微鏡写真を示す。
Claims (6)
- (1)HBs関連抗原およびHBc関連抗原から構成さ
れるデーン粒子様の形状を有する遺伝子組換えにより調
製された感染性を有さない人工HBV粒子。 - (2)SDS−2ME処理することで、メジャーHBs
ペプチド、ミドルHBsペプチド、ラージHBsペプチ
ドおよびHBcペプチドが得られる抗原粒子である前記
第(1)項記載の人工HBV粒子。 - (3)真核細胞を宿主細胞として発現された抗原である
前記第(1)項記載の人工HBV粒子。 - (4)下記の(A)〜(D)の4種の発現遺伝子カセッ
トを同一宿主細胞に導入して得られた形質転換体を培養
することを特徴とする、HBs関連抗原およびHBc関
連抗原から構成されるデーン粒子様の形状を有する感染
性を有さない人工HBV粒子の製法。 (A)メジャーHBsペプチドを発現させるための発現
遺伝子カセット (B)ミドルHBsペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット (C)ラージHBsペプチドを発現させるための発現遺
伝子カセット (D)HBcペプチドを発現させるための発現遺伝子カ
セット - (5)該各発現遺伝子カセットが、少なくとも真核細胞
内で機能するプロモーターおよびそれぞれのペプチドを
コードする構造遺伝子からなり、宿主細胞が真核細胞で
ある前記第(4)項記載の人工HBV粒子の製法。 - (6)該各発現遺伝子カセットをプラスミドにより宿主
細胞へ導入する前記(4)項記載の人工HBV粒子の製
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30978689A JPH03168097A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 人工b型肝炎ウイルス粒子およびその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30978689A JPH03168097A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 人工b型肝炎ウイルス粒子およびその製法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03168097A true JPH03168097A (ja) | 1991-07-19 |
Family
ID=17997228
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP30978689A Pending JPH03168097A (ja) | 1989-11-28 | 1989-11-28 | 人工b型肝炎ウイルス粒子およびその製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03168097A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004047812A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Japan Science And Technology Agency | タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
-
1989
- 1989-11-28 JP JP30978689A patent/JPH03168097A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004047812A1 (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Japan Science And Technology Agency | タンパク質中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤 |
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