KR880002586B1 - B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 - Google Patents
B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법 Download PDFInfo
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Description
본 발명은 B형 간염 바이러스 표면항원(이하 HBs항원으로 칭한다)의 정제방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 가교 폴리사카라이드 또는 셀룰로즈를 설페이트화 반응시켜 제조되는 가교 폴리사카리이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르를 사용하는 칼람 크로마토그래피 분리에 의하여 HBs항원을 고도로 정제하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염은 통상 혈액을 통하여 감염하는 DNA형의 핵산을 갖는 직경 42nm의 B형 간염 바이러스에 의해 유발된다. 이 B형 간염바이러스는 급성간염을 유발시킬뿐만 아니라 바이러스의 계속 감염에 의한 만성간염, 간경변증과 또한 간암을 유발시킬 수 있다. B형 간염은 세계적으로 널리 분포되어 있고 또 전혀 자각증상없이 장기간 체내에 바이러스를 보유하고 있는 잠재적 바이러스 보균자(이하 단순히 "보균자"로 칭한다)로 아주 많이 존재하고 있다. 보균자의 수는 일본인 총인구의 2내지 3% 즉, 200내지 300만인으로 알려져 있으며, 동남아시아, 아프리카에서는 주민의 약 10 내지 15%에 달하며, 세계적으로 이 바이러스 보균자가 약 2억명에 이르는 것으로 추정되고 있다.
B형 간염의 효과적인 예방법은 통상 고도로 정제된 HBs항원을 불활성화시켜 제조되는 B형 간염 바이러스 왁진을 투여하는 방법이다. 이와같은 B형 간염 바이러스 왁진은 의료종사자 등과 같이 바이러스에 감염될 위험이 큰 환경에서 일하는 사람들이 바이러스에 감염 되는 것을 방지하는데 효과적일 뿐만 아니라 새로운 보균자의 발생을 방지하고 종국적으로는 지상에서 B형 간염을 완전히 소멸시킬 것으로 기대된다.
이 HBs 항원은 3종류의 B형 간염 바이러스 2 또는 바이러스 관련 입자, 즉 직경 42nm로서 핵산을 함유하는 직경 27nm의 코아를 내부에 갖는 B형 간염 바이러스 그 자체인 데인(Dane)입자 ; 핵산을 함유하지 않는 직경 22nm로서 길이 수십 내지 수백 nm의 간상체(稈狀體)입자 ; 및 직경 22nm의 구형입자 표면에 보유된다. 이 HBs 항원에 대한 항체가 이 B형 간염 바이러스이 방어 항체로 된다. 체내에서 HBs항원에 대한 항체가 생성되는 작용기구를 이용해서 이 불활성 HBs항원이 B형 간염 왁진으로 사용되고 있다.
B형 간염 바이러스 왁진은 통상 B형 간염 바이러스 보균자의 혈장, 또는 유전자공학으로 제조된 B형 간염 바이러스 유전자를 갖는 미생물을 배양시켜 수득되는 배양액 또는 그 상등액으로 부터 HBs항원을 분리하고 또 정제하여 제조하게 되지만(HBs항원을 분리하고 또 정제하여 제조하게 되지만) HBs항원의 정제는 아주 고도의 정제를 요하게 됨으로서 조작상 고도의 숙련을 요구하게 되고 따라서 필요로 하는 B형 간염 바이러스 왁진을 대규모로 제조한다는 것은 대단히 어려운 일이었다.
현재 HBs항원의 가장 일반적인 정제법은 밀도변화 원심법[Vyas, G. N. 등, J. Immunology, 108, 1114(1972) ; Hirshman S.Z. Proceeding of National Academy of Science USA, 71, 3345(1974) 참조]이 있다. 그러나 이 방법은 다량의 염화세슘과 슈크로즈를 필요로 하는 이외에, 초원심분리기와 정제단계 및 정제규모에 따라서 여러 종류의 회전자를 필요로 하게 됨으로서, 이 방법은 경비가 많이 든다는 관점에서 적합치 못하다.
또한 항원-항체반응을 사용한 친화 크로마토그라피 분리에 의해 HBs항원을 정제하는 방법[Houwen, B, 등, Journal of Immunological Method, 8, 185(1975)]이 제안되었다. 이 방법은 정제효율은 극히 양호한 반면, 왁진을 대규모로 생산하는 경우에는 크로마토그래피용 HBs항체를 얻기 위해서 대량의 HBs항체 양성인의 혈청이 필요로 하게 되는 이외에 HBs항체를 고도로 정제하고 또 시아노겐브로마이드 등을 사용하여 겔 메트릭스에 결합시켜 친화겔을 형성하지 않으면 아니된다. 이밖에, 이 친화겔을 사용하여 칼람 크로마토그라피에서는 HBs 항체와 겔과의 결합이 비교적 약하기 때문에 HBs항체와 HBs항체-항원 반응생성물이 용출시에 겔로 부터 달리할 염려가 아주 증대되며, 이것이 왁진에 혼입되는 경우에는 자기면역질환이나 신장병증을 유발시킬 염려가 있다.
이밖에 덱스트란설페이트, 콘드로이틴설페이트 또는 헤파린 등 과 같은 설포닐기 함유 폴리사카리이드를 시아노겐브로마이드를 사용하여 세파로즈 CL-4B(스웨덴Ppharmacia 사 제품) 또는 세파로즈 CL-6B(스웨덴 Pharmacia 사 제품)에 결합시켜 제조되는 친화겔을 사용하는 HBs항원 정제법이 제안되어 있다[M. Anderssen 등, Vox Sang, 41, 91 내지 97(1981) ; 미합중국 특허 제4,138,287호 ; 와 일본국 특허 공개공보 제114018/1977호 참조]. 그러나 이 방법에서 사용되는 친화겔은 그 제조공정이 번잡하고 또 시아노겐브로마이드를 취급하는데에는 위험이 수반되는 관계로 이 방법은 왁진을 대규모로 제조하는데 적합하지 못하다. 또 이에 사용되는 덱스트란셀페이트, 콘드로이틴설파이트 또는 헤파닌 등이 고가인 이외에도 이같은 설포닐기 함유 폴리사카라이드를 세파로즈 등의 담체겔에 결합시키는데에는 한계가 있고 따라서 HBs항원을 고도로 정제할 수 있는 균일한 품질의 친화겔을 얻는다는 것을 거의 불가능하다. 더구나 설포닐기 함유 폴리사카라이드와 담체겔을 시아노겐브로 마이드로서 결합시킬 경우, 그 결합이 비교적 약하기 때문에 폴리사카라이드가 겔로 부터 탈리되어 정제 HBs항원에 혼입될 우려도 있다.
본 발명자 등은 칼람 크로마토그래피 분리에 의한 보다 간단하게 또 보다 저렴한 비용으로 HBs항원을 정제하는 방법을 찾아내기 위하여 연구에 집중한 결과로, 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르가 HBs항원과 특별한 친화성을 갖게 되며, 또 이 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르가 혈청 및 혈장과 같은 생화학물질로 부터 HBs항원을 고순도 고수율 및 용이하게 분리 정제하는데 아주 효과적이라는 사실을 발견하게 되었다.
본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스 왁진의 공업적인 제조에 유용한 HBs항원의 개량된 정체방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르를 사용하는 칼람 크로마토 그래피 분리에 의하여 HBs항원의 고도 정제방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 이밖의 목적은 B형 간염 바이러스 왁진으로 유용한 고도 정제 HBs항원을 제공하는데 있다. 본 발명의 이들 및 기타 목적과 장점은 본 기술 분야에 숙련된 자라면 다음 기재사항으로 부터 명백하게 알 수 있다.
본 발명 제법은 B형 간염 바이러스 보균자의 혈청, 유전자공학을 이용해서 제조된 B형 간염 바이러스 유전자를 갖는 미생물의 배양액 또는 이 비양액의 상등액과 같은 HBs항원 함유액을 칼람 크로마토그래피 분리 정제하는 방법에 있어서 크로마토그래피용 겔로서 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르를 사용함을 특징으로 하고 있다.
가교 폴리사카라이드의 황산 에스테르의 예로는 에피클로로히드린, 디클로로히드린, 디브로모히드린, 에틸렌글리콜 비스에폭시 프로필에테르와 같은 가교결합제로서 가교시켜 수득된 덱스트란, 셀루로즈, 아가로즈와 같은 폴리사카라이드의 황산 에스트르를 들 수 있다. 가교 폴리사카라이드의 예로는 시판되고 있는 세파덱스 G-10, G-25 와 G-100(스웨덴의 Pharmacia 사 제품)과 같은 가교 덱스트란 ; 세파로즈 C1-2B, C1-4B와 C1-6B(스웨덴의 Pharmacia 사제품)와 같은 가교 아가로즈 ; 와 셀루로핀 GCL-25, GCL-90(일본의 짓소 코오포레숀 제품)과 같은 가교 셀루로즈를 들수 있다. 셀루로즈의 황산 에스테르의 예로는 결정 셀루로즈의 황산 에스테르 또는 결정부위와 비결정부위를 갖는 셀루로즈의 황산 에스테르를 들수 있다. 이들 출발 셀루로즈는 아비셀(일본의 아사히 가세히 제품), 셀루로파인 GC-15, CH-25, GC-100 또는 GC-200(일본국 짓소 코오포레숀 제품)등으로 시판되고 있다. 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 설페이트화 반응은 예를 들어 겔상의 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈를 클로로설폰산, 무수황산 도는 기타 설페이트화제와 함께 유기용매(예 : 피리딘)중에서 반응 시키는 통상방법에 따라 진행시킬 수 있다. 가교 폴리사카라이드의 설페이트화도(설포닐기의 함량)는 통상 가교 폴리사카라이드 중량기준 0.1% 내지 10%범위이고, 또 셀루로즈의 설페이트화도는 셀루로즈의 중량기준으로 통상 0.1 내지 7.0%, 바람직하게는 0.1 내지 5.0%이다. 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르는 수불용성 겔물질로서 물리적으로 안정되며 또 크로마토그래피용 겔로서 유용하다. 이 황산 에스테르는 과립제, 세과립제, 세립제와 같은 각종 형태로 사용되며 구상입자 형태로 바람직하게 사용된다.
가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르를 사용하는 칼람 크로마토그래피에 의한 HBs항체의 정제방법은 선행칼람 크로마토그래피에서 사용한 것과 유사한 방법으로 진행된다. 예를들어, 이 방법은 다음과 같이 진행시킨다. 우선, 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르(바람직하게는 구형입자 형태)를 칼람내에 충전시키고 이온강도 약 0.001 내지 1.0, 바람직하게는 0.05 내지 0.2이고 또 PH범위 4 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9인 적합한 완충용액, 즉 McIlvaine) 완충용액(PH 5.0), 0.01 M 인산염 완충 식염수용액 (PH 7.2)와 0.1M 염화나트륨 함유 사이트레이트 완충용액(PH 7.2)으로 평형시킨다. 평형이 되게 한 후, 처리하고저 하는 HBs 항원 함유용액을 칼람을 통과시켜 HBs항원을 겔에 흡착시키고 이어 상기 평형조작용으로 사용한 동일한 완충용액으로 세척한다. 세척후, 전술한 평형조작으로 사용되는 완충용액 보다 이온강도가 더 큰 적합한 완충용액, 즉 0.6M 염화나트륨 함유 McIlvaine 완충용액(PH 4 내지 8) 또는 0.6M 염화나트륨 함유 인산염 완충용액(PH 6내지 9)와 같은 이온강도가 0.1 내지 5.0 바람직하게는 0.4 내지 3.0을 갖고 또 PH범위 4 내지 10 바람직하게는 6 내지 9인 완충용액을 칼람을 통해주어 칼람으로부터 필요로 하는 고도 정제 HBs항원을 수득한다.
본 발명의 정제방법에서는 생화학물질(예 : B형 간염 바이러스 보균자로부터 채취한 혈청 또는 혈장), 유전자공학에 의거 제조된 B형 간염 바이러스 유전자를 갖는 미생물을 배양해서 스득되는 배양액[A. Miyanohara 등 proc. Natl. Acad. Sci. 미합중국 Vol. 80, pp 1 내지 5 1983년 1월 ; W.J. McAleer 등, Nature, Vol. 307 12, 1984년 1월 ; 등]또는 이 비양액의 상등액과 같은 HBs 항원 함유물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 정제방법에 따라 가교 폴리사카라이드 셀루로즈의 황산 에스테르에서 설포닐기가 직접 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈에 결합되어 있고 또 이 때문에 설포닐기 함량도 놓고 또 HBs 항원의 특이한 흡착능이 탁월하기 때문에 HBs항원의 정제도는 출발 HBs 항원 순도의 수십배로 되는 등의 고순도로 정제 가능하고 또 90%이상 거의 100%에 가까울 정도의 높은 수율로 회수될 수 있다.
본 발명의 정제방법은 공업적 규모에 있어서도 간단한 조작으로 쉽게 행할 수 있는 이외에 특별히 고가의 시약도 필요없으며 또 극히 저렴한 가격으로 HBs항원의 공업적 정제를 행할 수 있게 만들었다. 이밖에, 본 발명에서 사용되는 겔이 매우 안정되며, 또 이같이 수득된 생성물에는 종래의 생성물에서와 같이 항원-항체 반응 생성물 등의 불순물이 혼입할 염려가 없게 되었다.
본 발명의 정제방법은 또한 종래의 기술인 초원심분리법 또는 이온교환 크로마토그래피와 결합 사용할 수 있으며, 이 경우에 종래 결과보다 아주 탁월한 결과를 얻을 수가 있었다.
본 발명은 다음의 제법과 실시예에 의해 설명되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
제법 1
0℃이하 온도에서 200ml 피리딘에 11ml의 클로로설폰산을 적가한다. 적가 종료후, 혼합물을 65 내지 70℃로 가열한다. 이 혼합물에 7.5g의 에피클로로히드린 가교덱스트란(세파덱스 G-50, Rharmacia 제조)을 첨가하고 또 이 혼합물을 65 내지 70℃에서 4시간 동안 교반한다. 반응후, 반응혼합물을 냉각하고 또 이어 수산화나트륨 수용액으로 중화시킨다. 이같이 수득된 겔물질은 여과분리하여 0.01M 인산염 완충 식염수용액으로 충분히 세척해서 가교 덱스트란 설페이트를 수득한다.
제법 2
상기 제법1에 기술한 것과 동일방식에 따라 제조된 210 ml 피리딘-클로로설폰산 혼합물에 7.5g의 가교 셀루로즈겔(셀루로파인 GCL-25 ; 짓소 코오포레이숀 제품)의 건조생성물을 첨가하고 또 이 혼합물을 65 내지 70℃로 4시간동안 반응시킨다. 반응 종료후, 반응혼합물을 냉각하고 또 수산화나트륨 수용액으로 중화시킨다. 이같이 수득된 겔을 여과분리하고 또 0.01M 인산염 완충 식염수용액으로 잘 세척해서 7.2g의 가교 셀루로즈 설페이트를 수득한다.
제법 3
상기 제법 1에 기술한 것과 동일방식에 따라 제조된 210ml의 피리딘-클로로설폰산 혼합물에 피리딘으로 함침시킨 30ml의 가교 아가로즈겔(세파로즈 CL-6B, Pharmacia 제품)을 첨가하고 또 이 혼합물을 65 내지 70℃에서 4시간동안 반응시켰다. 반응종료후, 반응혼합물을 냉각하고 또 수산화나트륨 수용액으로 중화시킨다. 이같이 수득된 겔은 여과해서 분리하고 또 0.01M 인산염 완충 식염수용액으로 잘 세척해서 23ml의 가교 아가로즈 설페이트를 수득한다.
제법 4
0℃이하에서 600ml 피리딘에 117g의 클로로설폰산을 적가한다. 적가종료후 혼합물 65 내지 70℃로 가열한다. 이혼합물에 80g의 결정 셀루로즈(아사히 가세이 제품크로마토그래피용 아비셀)를 첨가하고 또 이 혼합물을 4시간동안 65 내지 70℃로 교반한다. 반응종료후, 반응혼합물을 냉각하고 또 이어 10% 수산화나트륨 수용액으로 중화시킨다. 이같이 수득된 겔은 여과하여 분리하고 또 0.01M 인산염-염화나트륨 수용액 완충혼합물로 잘 세척하여 셀루로즈 설페이트 겔을 수득한다.
제법 5
0℃이하에서 600ml 피리딘에 117g의 클로로설폰산을 적가한다. 적가종료후 혼합물을 65 내지 70℃로 가열한다. 이 혼합물에 80g의 결정 셀루로즈 겔(짓소 코오포레이숀제품 셀루로파인 GC-15)을 첨가하고 또 이 혼합물을 65 내지 70℃에서 3시간동안 교반한다. 반응종료후, 반응혼합물을 냉각하고 또 10%수산화나트륨수용액으로 중화시킨다. 이같이 수득된 겔을 여과하여 분리하고 또 0.01M 인산염-염화나트륨 수용액 완충혼합물로 잘 세척하여 셀루로즈 설페이트겔을 수득한다.
[실시예 1]
제법1에서 기술한 것과 동일한 방법으로 수득된 가교 덱스트란 설페이트 겔을 칼람(26.4mm×182mm)내에 충진 하고 또 이를 0.05M 염화나트륨 함유 0.027M McIlvaine 완충용액(PH 7.41)으로 평형시킨다. HBs 항체 양성 인간혈청[HBs 항체 함량, 31.3μg/ml(레디오 이무노에세이(다이나보트사 제품 AUSRIA II-125)(마사미 구로가와, 세이이찌 사이도 ; 일본국 J.Med. Sci. Biol. 32, 47 내지 52, 1979)), 단백질 함량 70.0mg/ml(로우리 방법), 비활성(HBs 항체 함량/단백질 함량) : 0.447]30ml를 칼람에 통해준 뒤에, 전술한 동일 완충용액으로 말람을 충분히 세척하고, 흡착물질은 0.6M 염화나트륨 함유 0.027M McIlvaine 완충용액(PH 7.38)으로 용출시켜 용출분획 43.2ml를 수득한다. 이 용출분획의 HBs 항원 함량은 2.0μm/ml, 단백질 함량 0.41 mg/ml이고 또 활성비 4.88이었다. HBs항원의 회수율은 92.2%이고 또 정제도(용출분획의 비활성/원료혈청의 비활성)는 10.9배에 달하였다.
[실시예 2]
앞의 제법 3에서 기술한 바와 동일한 방법으로 제조된 가교 아가로즈 설페이트 겔을 칼람(26.4mm×47.0mm)에 충진하고 또 이를 0.05M 염화나트륨 함유 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 7.36)으로 평형화시킨다. HBs항원 양성 인간혈청[HBs 항원 함량, 62.5μg/ml, 비활성 : 0.893]0.5ml를 칼람에 통해준 뒤에, 전술한 동일 완충용액으로 칼람을 충분히 세척한다. 통과액과 세척액(합계 10.75 ml)은 HBs항원함량 0.06μg/ml, 단백질함량 1.118mg/ml와 비활성 5.4×10-5을 갖는다. 흡착물질은 0.6M 함유, 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 7.23)으로 용출하여 8.00ml의 용출분획을 수득한다.
이 용출분액은 HBs항원 함량 4.0μm, 단백질 함량 0.217 mg/ml와 비활성 18.43을 갖는다. HBs 항원의 회수율은 102.4% 이고 또 정제도는 20.6배에 달하였다.
[실시예 3]
제법 2에서 기술한 바와 동일한 방법으로 제조된 가교 셀루로즈 설페이트 겔을 칼람(26.4mm×105mm)에 충진 하고 또 이를 0.05M 사이트레이트 완충용액(PH 7.39)으로 평형화시킨다. 전술한 완충용액으로 2배 부피가 되게 희석한 HBs 항원 양성 인간혈청 20ml를 칼람을 통해준다. 전술한 동일 완충용액으로 칼람을 충분히 세척한후에 흡착물질을 0.6M 염화나트륨 함유 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 7.39)으로 용출시킨다. 결과는 표1에 기재하였다.
표1에 기재한 바와 같이, HBs항원은 용출분획으로 거의 회수되며 또 비활성과 정제도가 약 17배 상승하였다.
[표 1]
* 1) 레디오 이무노에세이(다이나보트사 제품 AUSRIA II-125)로 측정 [마사미 구로가와, 세이이찌 사이도 ; 일본국 J. Med. Sci. Biol., 32, 47 내지 52(1979)를 참조].
* 2) 비활성=항체의 양(μ g)/단백질의 양(mg)
* 3) 유출액은 HBs 항원을 함유하는 통과액의 일부와 세척액의 일부를 합친 것이다.
이때 제조된 정제 HBs 항원의 일부를 초원심분석 하였다. 즉, 히다찌 70- P-72 초원심분리기와 RPS 40T회전자를 사용해서 세슘클로라이드 밀도변화를 형성하면서 여기에 시료를 가하여 40,000rpm으로 15시간 원심분리한 결과 이 HBs항원은 P=1.2부근에 예리한 피-크를 나타내었다. 이것은 HBs 항원이 순수하고 또 단일물질임을 나타내는 것이다.
[비교예 1]
가교 셀루로즈 겔(셀루로파인 GCL-25)을 칼람(26.4mm×120mm)에 충진하고 또 이를 0.05M 염화나트륨 함유 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 7.40)으로 평형화시킨다. 전술한 완충용액으로 2배 부피가 되게 희석한 HBs 항원 양성 인간혈장(실시예 3에서 사용한 혈정과 동일 롯트) 20ml를 칼람에 통해주고 이어 전술한 완충용액으로 칼람을 충분히 세척한다. 흡착물질을 0.6M 염화나트륨 함유 0.027M사이트레이트 완충용액(PH 7.40)으로 용출한다. 98.2%의 HBs항원이 통과 분획으로 회수되며 또 단백질의 거의 모든량(96.7%)이 또한 이 통과분획에 존재하게 된다. 용출 분획에서는 흡광도의 피-크치가 관찰되지 않았으며, 또 HBs 항원역가는 1 : 2 RPHA(역수신 혈구응집반응) 이하로서 HBs 항원은 전혀 정제되지 않았다.
[실시예 4]
제법 2에서 기술된 것과 동일한 방법으로 수득된 가교 셀루로즈 설페이트 겔을 칼람(26.4mm×125mm)내에 충진하고 또 이를 0.01M인산염 완충 식염수용액(PH 7.20)으로 평형화시킨다. 이와 별도로, HBs항원 양성 인간혈청을 황산암모늄으로 염석한 후 밀도 변화 대역 원심분리기를 사용해서 정제하고(히다찌 70P-72)를 사용해서 정제하고(히다찌 RPZ-35-T 회전자 사용, 슈크로즈 밀도변화 10 내지 45W/W%, 30,000rpm, 20시간 및 히다찌 RPZ-48T 회전자 사용, 슈크로즈 밀도변화 25 내지 50 W/W%, 42,000 rpm, 20시간 조건하에서 정제), 또이어 0.01M 인산염 완충 식염수용액에 투석해서 HBs항원 함유용액 40ml를 수득한다.[HBs항원 함량, 62.5μ g/ml정상인 혈청 : 면역전기 교차법에서 양성]. 이같이 처리한 HBs항원을 상기 칼럼에 통해주고 0.01M 인산염 완충용액(PH 7.20)으로 칼럼을 세척한후, 흡착물질을 0.6M 염화나트륨 함유 0.01M 인산염 완충용액(PH 7.20)으로 용출시켜 12.0ml의 용출분획을 수득한다. 이 용출분획은 HBs 항원 함량 200μ g/ml를 갖고 면역전기교차법으로는 HBs 항원 이외의 혈장 단백질을 전혀 발견할 수 없었다. 따라서 HBs 항원은 거의 완전하게 정제되었으며 또 이의 회수율은 96.0%에 달하였다.
[실시예 5]
제법 4에 기술된 것과 동일한 방법으로 제조된 셀루로즈 설페이트 겔을 칼람(26.4mm×105mm)내에 충진하고 또 이를 0.05M 염화나트륨 함유 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 7.40)으로 평형화시킨다. 전술한 완충용액으로 3배 부피가 되게 희석한 HBs항원 양성 인간혈청[HBs항원 함량, 50.78 μ g/ml, 단백질 함량 74.5mg/ml, 비활성 0.68]10ml를 칼람에 통해준다. 이 칼람을 전술한 완충용액으로 충분히 세척한 후 흡착물질을 0.6M 염화나트륨 함유 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 7.20)으로 용출해서 45.0ml의 용출분획을 수득한다. 이 용출분획은 HBs 항원 함량 10μg/ml, 단백질 함량 1.25 mg/ml와 비활성 8.0을 갖고, HBs 항원의 회수율은 88.6% 이며 또 정제도(용출분획의 비활성/원료혈청의 비활성)는 11.7배에 달하였다.
[실시예 6]
제법 5에서 기술된 방법에 따라 제조된 셀루로즈 설페이트 겔을 칼람(26.4mm×105mm)내에 충진하고 이를 0.05M 염화나트륨 함유 0.027M 사이ㅡ레이트 완충용액(PH 5.00)으로 평형화시킨다. 전술한 완충용액으로 3배 부피가 되게 희석한 HBs 항원 양성 인간혈청(HBs 캇함량 50.78 μ g/ml, 단백질 함량 74.5mg/ml, 비활성 : 0.68)16ml를 칼람에 통해준다. 이 칼람을 전술한 완충용액으로 충분히 세척한후, 흡착물질을 0.6M 염화나트륨 함유 0.027M 사이트레이트 완충용액(PH 5.00)으로 용출해서 52ml의 용출분획을 수득한다. 이 용출분획은 HBs 항원 함량 15μg/ml, 단백질 함량 2.21mg/ml 와 비활성 7.08을 갖는다. HBs 항원의 회수율은 96.0%이고 또 정제도는 104배에 달하였다.
[실시예 7]
제법 5에 기술된 방법에 따라 제조된 셀루로즈 설페이트 겔을 칼람내에 충진하고 또 이를 0.05M 염화나트륨 함유 0.027M MCIlbaine 완충용액(PH 7.20)으로 평형화시킨다. 전술한 완충용액으로 3배 부피가 되게 희석한 HBs항원 양성 인간혈장20ml를 칼람에 통해준다. 이 칼람을 전술한 완충용액으로 충분히 세척한 후 흡착물질을 0.6H 염화나트륨 함유 0.027M McIlvaine 완충용액(pH7.20)으로 용출한다. 그 결과는 다음 표 2에 수록한다. 표 2에 기재된 바와 같이, HBs 항원은 용출분획에서 거의 회수되었으며, 또 정제도는 약 16배에 달하였다.
[표 2]
* 1) 레디오 이무노에세이(다이나보트사 제품 AUSRIA II-125)로 측정 [마사미 구로가와, 세이이찌 사이도 ; 일본국 J. Med. Sci. Biol., 32, 47 내지 52(1979)를 참조].
* 2) 비활성=항체의 양(μg)/단백질의 양(mg)
* 3) 유출액은 HBs항원을 함유하는 통과액의 일부와 세척액의 일부를 합친 것이다.
Claims (7)
- B형 간염 바이러스 표면항원 함유용액을 칼람 크로마토그래피 분리를 행하여 B형 간염 바이러스 표면항원을 정제하는 방법에 있어서, 크로마토그래피 분리용 겔로시 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르를 사용함을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법.
- 제 1항에 있어서, 가교 폴리사카라이드의 황산 에스테르가 가교 셀루로즈 설페이트, 가교 아가로즈 설페이트와 가교 덱스트란 설페이트로 구성되는 군으로 부터 선정되는 B형 간염 바이러스 표면항원의 정제방법.
- 제2항에 있어서, 가교 셀루로즈 설페이트가 에피클로로히드린 가교 셀루로즈 설페이트인 B형 간염 바이러스 표면항원의 정제방법.
- 제2항에 있어서, 가교 아가로즈 설페이트가 에피클로로히드린 가교 아가로즈 설페이트인 B형 간염바이러스 표면 항원의 정제방법.
- 제2항에 있어서, 가교 덱스트란 설페이트가 에피클로로히드린 가교 덱스트란 설페이트인 B형 간염바이러스 표면항원의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 셀룰로즈의 황산 에스테르가 결정 셀룰로즈와 결정부위와 비결정부위를 갖는 셀루로즈로 부터 선정된 셀루로즈의 황산 에스테르인 B형 간염 바이러스 표면 항원의 정제방법.
- 가교 폴리사카라이드 또는 셀루로즈의 황산 에스테르 겔을 칼람 내에 충진하고 ; 이 칼럼을 이온강도 0.001 내지 1.0 및 PH 범위 4 내지 10의 완충용액으로 평형화시키며 ; B형 간염 바이러스 표면항원 함유용액을 이칼람에 통해 주고: 또 흡착 B형 간염 바이러스 표면항원을 평형화용 완충용액의 이온강도 보다 큰 0.1낸지 0.5이온 강도와 pH범위 4내지 10의 완충용액으로 용출시키는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 표면항원의 정제방법.
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