JPS6176422A - 百日ぜきコンポ−ネントワクチンおよび百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は百日ぜきコンポーネントワクチンおよび百日ぜ
き・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの製造方法に関す
る。さらに詳しくは。

本発明はへ後述する特別な方法で百日ぜき菌培養物より
高純度に精製し、得られる？−１１Ａ　（Ｆｉｌａｍｅ
ｎｔｏｕｇ　Ｈｓｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ１線維状赤血
球疑集紫］またはそのトキソイドと、公知または後述す
る方法で百日ぜき菌培養物より高純度に精製し得られる
ＬＰＦ−ＨＡ（Ｉ＋１１ｕ（ｌｏ０７ｔｏｉをｇ−Ｐｒ
ｏｍｏｔｉｎｇ　ＦａａｔｏｒＨａｍａｇｇｌｕｔｉｎ
ｉｎ、リンパ球増多因子）ノトキソイドとを混合するこ
とよりなる改良されり百日ぜきコーポネントワクチンの
製造方法およびこの改良された百日ぜきコーポネントワ
クチンを用いた百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワク
チンにＨする。

百日ぜきは我が国では届出伝染病に指定きれており１乳
児〜幼児に多発する公衆衛生り重要な感染症である。と
くに乳児では重症経過全たどることが多く、時には死亡
例もみられる。この疾病は古くからワクチンによる予防
が効果的であることが知られており、原因菌である百日
ぜき菌Ｉ相菌の全菌体の不活性ワクチンが広く用いられ
ていた。しかし、こＯような菌体不活化ワクチンは副作
用が強くそのため一時期にはワクチンの接種が中止され
ていた。その一方、百日ぜきによる乳幼児の疾病は大き
な問題となっており１副作用のなｐワクチンの製造が熱
望されていた。

〔従来技術〕

先に、佐原らは感染防御抗原に関する基礎的研究をもと
にして画期的なコンポーネントワクチンである沈降百日
ぜき精製ワクチンの製造に成功した（特公昭５７−５２
０３号を参照）。

このワクチンはＦ−ＨＡおよびＩ＋ＰＦ−ＨＡを含んだ
ＨＡ画分を主な感染防御抗原とし、全身反応としての発
熱などの副作用金はとんど示すことなく優れた予防効果
を有するものであってずでに実用化されている。

この実用化きれているワクチンの製造には、百日ぜきＩ
相菌を適当な培地に接種し％　３５’０前後で５日間静
置培養し、培養液全遠心し、そのと清に硫酸アンモニウ
ム全約５０、飽和になるように加えるかアルコール添加
し、生じた沈殿Ｔｔ１０，０００　ｒｐ塩、　３０分間
遠心して分離し、この沈殿全塩化ナトリウム添加緩衝液
にて抽出し、その抽出画分全常法によりショ糖密度勾配
遠心にかけて百日ぜきＨＡ画分全回収し、ホルマリンで
無毒化処理してワクチンにみられるように、この百日ぜ
きワクチン成分は主としてＦ−ＨＡおよびＬＰ０１−Ｈ
Ａ全含マａａａｉｎｅ　ｌと呼ぶにふされしいものと考
えられる。

佐原等の方法は、さらに、これにジフテリアトキソイド
、破傷風トキソイ、ドを加え、さらに必要によりアルミ
ニウムアジュバント処理全行ない、ゼラチン、グルコー
ス等の安定剤’を添加して沈降精製百日ぜき、ジフテリ
ア、破傷風混合ワクチンとしている。ところが、最近に
なって、発赤、腫脹、硬結等の局所反応についての臨床
所見が少なからず報告されており、このワクチンも必ず
しも万全なものでない（水原春部、日本細菌学雑誌、３
８　（１）、１９８３１゜ このようなことから、百日ぜき菌■相菌の産生する物質
又は菌体由来の感染訪問抗原としての’１！−ＨＡおよ
びＩ＋ＰＦ−ＨＡの役割が注目され、最近の研究ではそ
の役＃Ａが極めて重要であることが報告されている（ｌ
ｌｌａｔｏ　Ｙ。

ａを、ａｌ、工ｎｆｅｏを、工ｍｍｕｎ、　、　３１．
１２２３Ｎ１２３１（１９８１）ｉ８ａｔｏ　Ｙ、　ａ
ｔ＋ａｌ、　８ｅｍｉｎａｒａ　１ｎｔｎｆｅｏｔｉｏ
ｕａ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　工Ｖ、　Ｂａｏｔｅｒｉａｌ
Ｖａａａｉｎｅ、　、　３８０〜３８５（１９Ｂ２１）
。

従って、局所反応等副作用のない百日ぜきワクチン成分
としてのＦ−ＨＡおよびＬＰＰ−ＨＡは高純度であるこ
とが重要であり、しかも工業的生産のためには簡単かつ
大量に単離精製することが望まれている。そのようにす
れば、ワクチンとして必要十分量の抗原を所望量調合す
ることが可能となる。

従来知られているｙ−ｍＡｏ採取精製法としては、百日
ぜき菌培養と清を硫安分画し、蔗糖密度勾配遠心にかけ
、さらにゲルろ適音２　回＜　り　返Ｌ　百Ｅｌ　セ１
１　Ｗ　Ｆ　−ＨＡ　ｋ　？Ｉ　ル’１　法がある（　
８ａｔｏ　Ｙ、　ａを、　ａを工ｎｆ＠Ｏを、工ｍｍｕ
ｎ。

９、８０１（１９７４１−）。しかしながらこの方法は
、工程が寥く複雑であり、しかもｙ−ｉｔムの収串が低
い等の欠点があり、工業的な精製法としては採用し難い
。

また同様に百日ぜき菌ＩＦ−ＨＡｉｆＩ！＃製した例と
して、イオン交換りａマドグラフィー、ゲルろ過による
方法〔ムｒａｇ、　Ｈ，＠ｔ＋ａ１ｍ　；工ｎｆａａを
、工ｍｍｕｎ、　、　２５．４６０（１９７９１）があ
るが、この方法によれば％’Ｉ−ＨＡの収率が低いうえ
に、百日ぜき菌内Ｓ素の除去が困難であり、実用には供
し鑑い。

さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト吸着りｐ
マドグラフィー、へプトグロビアンｅアフイ、ニテイク
ｐマドグラフィー、硫安分画、ゲルろ過を組合わせる方
法（０ｏｖｅｌｌ。

Ｊ、Ｌ、ｌ１ｌを、ａｌ；８ｅｍｉｎａｒｓ　　　ｉｎ
　　工ｎｆ＠ｏｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ＋　工Ｖ、
　Ｂａｏｔｅｒｌａｌ　Ｖａｏｏｉｎｅ、　３７゜１（
１９８２））、およびハイドロキシアパタイト吸着クロ
マトグラフィー、特異抗体・アフィニテイクロマトグラ
フイー、蔗糖密度勾配超遠心分離？組合わせる方法〔渡
辺ら；日本細菌学雑誌、ａｓ、４２３（１９８３１）が
あるが、これらの方法は工程が非常に長く複雑であるう
えに、Ｆ−ＨＡの収率が低く、さらにハイドロキシアパ
タイトは高価であり、ｔた上記において用いられている
アフイニテイクロマトグラフイゲルは市販されておらず
、これらの調製は非常に手間がかかるうえに、原材料が
非常に高価である。このような種々の欠点のため、上記
方法もＦ−ＨＡの工業的で安価な採取方法とはなり得な
い。

一方、ＬＰＦ−ＨＡの採取精製法では、百日ぜき菌培養
的全硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの全出発材料
とし、これ全イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過
［Ａｒ＆ｉ。

１１．ｅを、ａｌ；Ｂｉｏｏｈｉｍｉｏａ　　ｅｔ　　
Ｂ１０ｐｈ７８１（１＆Ａｏｔａ、　４４４．７６５（
１９７６））、あるいけショ糖濃度勾配遠心（５ａｔｏ
、　Ｙ、　ａを、　ＩＬをｌｎｆｅｏｔ。

工ｍｍｕｎ、　、　６．８９７〜７０４．　（１９７２
１）などによって精製する方法が採用されている。１５
かしながら、このような方法では、電気泳動法による純
度分析で１本のバンドのＬＰＦ−ＨＡｒ得ることは離し
く、またその１■量も少ない。

高純度の：［、ｐｌＦ−ＨＡをＡｌ的大量に得る方法と
して、百日ぜき菌培養Ｆ清液金７１イドロキシアパタイ
トのカラムに通してＬＰＰ−ＨＡ全吸着させ、洗浄、溶
出後、コンカナノくリンＡ−セファロース（ＯｏｎＡ−
８ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ。

ファルマシア社製）によるアフィニティクロマトグラフ
ィーで精製する方法が提案されている（　Ｙａｊｉｍａ
、　Ｍ、　ａを、　ａｌ、　ｉＪ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ。

８３．２９５〜３０３（１９７８１）。しかしながら、
このフンカナバリンＡｇリガントとするアフイニテイク
ｐマドグラフィーは、Ｉ＋ＰＩＦ−ＨＡのみと親和性全
方するのではなく、糖類や糖脂質さらに池の糖蛋白質な
ども吸着するため、百日せき菌の能の成分、たとえば、
菌体膜成分なども吸着し、所望のＬＰシーＨＡｉ高純度
で単離することが難しい。しかも、そのハイドロキシア
パタイトのカラム操作に長時間？要するため、ＬＰＦ−
ＨＡの活性低下の恐れがあるほかハイドロキシアパタイ
トが高価であるために、ＬＰＦ−ＨＡｉ工業的にかつ安
価に採取するには問題があり、優れたアフィニティクロ
マトグラフィーとはいえない。

最近、ヒト八ブトグロビンがＬＰＦ−ＨＡに特異的に結
合することが発見されて以来、上記の方法におけるコン
カナバリンＡＯ代わりに、このヒトハプトグロビン？リ
ガントとして用いるアフィニティクロマトグラフィーで
ＬＰＦ−ＨＡ全精製する方法が試みられている〔工１”
ＯｎＢ、　ｅ　を、ａ：Ｌｊ、Ｌｉｉ　Ｂｉｏａｈｉｍ
ｉｏａ　＠　ｔｌｌｏｐｈｉｓｉａａ　Ａｏｔａ、　５
８０．１７５〜１８５　（１９７９１％およびＯｏｗｅ
ｌｌ、　−Ｔ、　ｅを、　ａｌ；８ｅｍｉｎａｒｓ　ｉ
ｎ工ｎｆｅｏｔｉｏｕｓ　　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　　工Ｖ
、Ｂａａｔｅｒｉ＆ＩＷａＯＯ１ｎｇ、　３７１〜３７
９（１９８２１）　ｏまた、この方法の変法として、百
日ぜき菌菌体を機械的に破砕して菌体成分からＩＩＰＦ
−ＨＡＱ抽出し、硫安分画したもの全出発材料として用
い、これ全へブトグロビンまたはセルロプラスミンなど
のプラズマシアロプνテインあるいは唾液ムチンなどの
シア四プ四ティン傾ｔリガントとするアフイニテイク四
マドグラフィーにてＬＰＰ−ＨＡｉ採取する方法が提案
されている（英国公開特許第２，０１５，５３１号）。

これらハクトグロビン等をリガントとするアフイニテイ
ク四マドグラフィーによる方法は、現在のところ唯一の
工業的な許容できる確度のＬＰＦ−ＨＡの精製法として
期待されている。

このように、現在まで、Ｆ−ＨＡについては満足できる
高純度製品を工業的に採取精製する方法はなく、ま７１
：ＩＩＰＦ−ＨＡにつイテは上記パブトグロビンリガン
トアフイニテイクロマトグラフィーによる方法のみが唯
一の許容できる方法である。

〔発明の目的〕

本発明は、以下で述べる高純度に精製した？−ＨＡとＬ
　Ｐ’　？　−ＨＡ　を用いて、局所反応等の副作用の
ない改善された百日ぜきコンポーネントワクチンおよび
百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの工業的製
造方法全提供することを目的とする。

〔発明の概要〕

本発明によれは、高純度Ｐ−ＨＡは、百日ぜき菌培養物
音セルロース硫酸エステルのゲル、デキストラン硫酸が
化学的に結合されたポリサッカライドゲル誘導体または
架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルに接触せしめて
！Ｆ−ＨＡ’ｊ−吸着させた後、ゲルから溶出すること
によって得られる。これらの方法は、本発明者等がＰ−
ＨＡ？工業的に簡単かつ高収率できわめて高純度に精製
取得する方法として開発したもので、１−ＨＡの精製方
法としてすでに特許出願している屯のである（特願昭５
９−７５３１４号、特願昭５９−８４７７８号、特願昭
５９−９１６３１号）。

すなわち、百日ぜき菌を通常の培地、たとえば、ツーエ
ン・ウイラー培池や、ステナー・ショルテ培地にて、常
法により静置培養、振盪培養またＦｉ通気攪拌培養して
得られる培養物である。この培養物は、遠心分Ｉ！ＩＫ
より菌体全除去した培養り清、あるいは菌体破壊物遠心
と清、あるいはこれらの部分精製標品の形で本発明方法
に供される。本発明方法によれば、塩析、抽出、超遠心
分離等の前段部分精製処理金あえて行なう必要はなく、
培養１：清等をそのままセルロース硫酸エステルゲル吸
着クロマトグラフィーに付すことができ一工程がきわめ
て簡単である。

本発明で用いられるセルロース硫酸エステルとは、セル
ロースＹｒ硫酸エステル化して得られるのであるが、好
ましくけ結晶セルロースあるいは、結晶領域および非結
晶領域からなるセルロース娶硫醗エステル化したものが
良い。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは原
料の形状、好ましくけ球状を保持し、水性媒質に不溶性
であり、物理的安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用
ゲルとして好適である。これらの原料セルロース類はす
でに市販されており例えば、アビセル（旭化成工業社製
）、セルロファインｅ　ａ　−１５％　同ＧＨ−２５ｂ
同Ｇｏ−１００、同Ｇｏ−２００（チッソ社製）などが
ある。これらのゲル全例えばピリジンなどの有機溶媒の
存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させるこ
とにより所望のセ／Ｉ／シース硫酸エステルのゲルが得
られる。

また、デキストラン硫酸−ｌリサツカライドゲルとけ、
デキストランの硫酸エステル化物をポリサッカライドゲ
ル誘導体に化学的に結合させたものである。このゲ／Ｉ
／Ｔｉｒｓを製するにあたっては、デキストラン硫酸は
種々の製品がすでに市販されており、一般的に生物関連
＃１１として用いられているものｔ使ｎ１することがで
きる。一方ポリサッ力ライドゲル誘導体とは、アガロー
ス、デキストラン、七ルｐ−ス等のポリサッカライドに
１り四マドグラフィー担体として用い得るように、通常
の結晶精製処理、三次元架橋処理、形状成型栖理等全施
したゲル誘導体であり、これらもすでに市販されており
、例えばアガロースゲルとして七７アロース（８ｅｐｈ
ａｒｏａｅ、　７アルマシア社製）、デキストランゲル
としてセファデックス（５ｅｐｈａｄａｘ、ファルマシ
ア社製）、セルロースゲルとしてアビセル（脂化成製）
等がある。

デキストラン硫酸とポリサッカライドゲルとを化学的に
結合させるには種々のか法があるが、例えば臭化シアン
金円いるアンデルソンらの方法（特開昭５２−１１４０
１８号）や、臭化シアン金用い、スペーサーとしてリジ
ンを介して結合させる方法（Ｂｒｙａｎ　Ｍ、　　！ｕ
ｒｎａｒらｉ　Ｂｉｏｏｈｉｍｉｏａ　ａｔ　Ｂｉｏｐ
ｈ７ｇｉｏａ　Ａｏｔａ。

６５９．７〜１４　（１９ｓ　ｌ））等の通常よく用い
られる方法で行なえばよい。

なお、デキストラン硫酸−アガロースゲルについてはす
でに市販されてお＃）、例えばデキストラン硫酸−セフ
ァロースｏ′Ｌ４Ｂ（７アルマシア社製）がある。

さらに、架橋ポリサッカライド硫酸エステルとは、デキ
ストラン、セルロース類、アガリースなどのがりサツカ
ライドを、例えばエビクールヒドリン、ジクロルヒドリ
ン、ジブロムヒドリン、エチレングリコールビスエボキ
シプｐビルエーテル等の架橋剤で架橋して得られろ架橋
ポリサッカライドを硫酸エステル化して得られるもので
ある。架橋ポリサッカライドはすでに市販されており、
例えば架橋デキストランとしてセファデックスｅ−１ｏ
。

Ｇ−２５％Ｇ−５０、Ｇ−１００（ファルマシア社製）
などがあり、架橋アガロースとしてセフ　７　ｏ−ズＧ
　Ｌ　−２Ｂ　％ＯＬ　−４Ｂ　％ＯＩ＋　−６Ｂ（フ
ァルマシア社製）などがあり、架橋セルロースとしてセ
ルロファインＧＯＬ−２５％ＧＯＩ＋−９０（チッソ社
製）などがある。

これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下
り四ルスルホン酸、無水硫酸など全作用させることによ
り所望の架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルが得ら
れる。

本発明において、これらのゲル全円いて、百日ぜき菌培
養物中のＦ−ＨＡ’ｉｉ精−採取するにあたっては、次
のような方法で行なわれる。

セルロース硫酸エステルゲル、デキストラン硫酸−ポリ
サッカライドゲルおよび架橋ポリサッカライド硫酸エス
テルゲルは、あらかじめ例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム
添加０．０１Ｍリン酸綬衝緩衝液、中性付近のｐＨ値（
ｐＨ６〜９）であり、比電導度５〜２５　ｍｓ／ｍ　＠
ｉ！度の適当な緩衝液を用いて平衡化を行なった後にＦ
−ＨＡの吸着操作に供する。

セルレース硫酸エステルゲル等への７−ＨＡの吸着、ゲ
ルの洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製操作は、パッチ
法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられる操作
方法で行なう。パッチ法で行なう場合は、百日ぜき菌培
養物中にセル四−ス硫酸エステルゲル等金・投入し％１
１Ｈ６，０〜９．０程度の範囲において０〜３０°ａ程
度にて１０〜６０分程度緩く攪拌してＦ−ＨＡ全吸着さ
せる。この際、百日ぜき菌培養物の比電導度がｓ、ｏ〜
２５．ＯｍＢＡ−Ｉｎ　程度となるように、適宜濃縮ま
７２：Ｆｉ希釈して吸着操作に付す。

吸着終了後、培養物−ゲル混合波音ろ過器Ｅに充填し、
吸引ろ過してゲルとる液を分離する。分離したゲルを、
比電導度５〜２５ｍ１程度で、ｐＨが５．０〜１０．０
程度である適当な緩衝液例えばｂｏ、２Ｍ塩化ナトリウ
ム添加０刀２Ｍマツキルペン（Ｍｅ工１ｖａｔｎｅ”　
ｓ　）緩衝液、０．３　Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１
　Ｍリン酸緩衝液あるいけ０．３Ｍ塩化ナトリウム添加
０．０１　Ｍトリス塩酸緩衝液等を、注ぎ吸引して洗浄
する。

この後、ｐＨが５．０〜１０．０程度で、比電導度が２
５〜１　ａ　ｏ　ｍｇ／ｃｌｎ＠Ａ　Ｒである（１記洗
浄用緩衝掖の比電導度より大）ＩＷ当な緩衝液、例えば
１．５Ｍ塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液４１．
５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着し
ているＩＦ−ＨＡｆ溶出するＯ カラム法にてこの方法を実施する場合は原材料液、洗浄
用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はパッチ法の場合と同様
でよく、これらの通液速度は、１６　ｔｎｌ／（３ｄ／
　Ｈｒ　〜５００　ｍＪｌｃｄ／　Ｈｒ程度に調整して
行なうとよい。

本発明のこの精製法によれば、百日ぜき菌培養物中のＩ
Ｆ−ＨＡの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−ＨＡの精製度は
数十倍に達し、しかも！−ＨＡの回収率は９０、以と１
００、近くに達する。得られる精製？−ＲＡＯ比活性は
４〜８　Ｘ　１０’　ＨＡ　ｕｎｉｔ／ｍｐ蛋白質：鶏
ヒナ固定血球疑集試験、　　（５ａｔｅ、Ｙ、　ｓｔ　
ａｌ、工ｎ　ｆ　ａ　ａ　ｔ。

工ｍｍｕｎ、　７．９２９−９９９（１９７３））ま２
ｍＴＪ工８Ａ活性で示すト０．９〜１．５　Ｘ　１Ｇ”
　’１！−ＨＡ−Ａｂ−ＩＣＬより　Ａ　ｕｎｉｔ／Ｉ
Ｌ？蛋白質ニア−ＨＡ−ＩＬＩＳ人測定法（８ａｔｏ　
Ｙ、　ａｔ　ａｌ、工ｎｆｅａｔＩｍｍｕｎ、、　４１
．３１３−３２０（１９８３））ときわめて高く、ポリ
アクリルアミドディスク電気泳動（ｐｉ１４．５　）分
析において単一のバンド全形成し、百日ぜき菌内毒素が
ほぼ完全に除去されるＯ Ｅ述のとおり、本発明で用いるこのか法によれに、出発
材料の百日ぜき菌培養物から所望の１−ＨＡｉ高取串、
高純度に採取することができ、その操作もきわめて簡単
で、またその精製用クロマトグラフィー吸着体は、安価
に調製でき、しかもくり返し使用しても劣化が殆んど無
く、きわめて経済性にすぐれている。

したがって、この方法は高純度ＩＦ−ＨＡの工業的精製
法としてきわめてすぐれた方法である０必要ならば、こ
の方法は従来の技術である蔗糖密度勾配超遠心分離法、
あるいけイオン交換り田マドグラフィー法等と組合わせ
ることも可能である。

かくして得られた精製Ｐ−ＨＡはＥ述する如く極めて高
純度であるため、そのままで最終のワクチン原料として
使用できる特長を有するが、必要ならばホルマリンを用
いた通常の方法によりトキソイドとして使用してもよい
口 本発明のワクチンのもう一方の原料である高純度ＬＰ１
！−ＨＡは、前述した英国特許等のハプトグロビンをリ
ガントしたアフィニティクロマトグラフィーによる方法
で精製採取において有利に使用できる。

その第１の方法は、特願昭５８−２０６５９８号として
すてに特許出願しているもので、百日ぜき菌培養物から
Ｔ、＋　Ｐ　Ｆ　−ｊｔ　Ａを“変性セルロプラスミン
？リガントとするアフィニティクロマトグラフィー″　
を用いることにより精製することよりなる。

ここで用いられる変性セルロプラスミンとけ、ヒトまた
は動物由来のセルロプラスミン全種々の方法で変性させ
たものであり、例えばセルロプラスミン全６０〜８５°
０にて１〜２４時間程度加熱処理したもの、または、セ
ルロプラスミンを硫化ナトリウム、硫化アンチニウム等
の硫化物、Ｌ−アスコルビンＨ１ｖ−グルコース、Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、マ
ルトース、ラクトース等の還元糖、アセトアルデヒド、
ギ酸、ショウ酸、メルカプトエタノール、ジエチルジチ
オカルバメート等の還元剤、シアン化ナトリウム、チオ
シアン酸ナトリウム等のシアン化合物、ｍｎ’ｒＡｈニ
トロトリ酢酸（ＮＴＡＩ、トリエチレンテトラミンヘキ
サ酢酸（ＴＴＨＡ）等のキレート剤等で処理して、セル
ロプラスミンに含まれている銅イオン（Ｏｕ＋＋ｌを還
元するかまたは銅イオンの１部ｔｙｔけ全部全遊離、除
失することによって得られるもの等が含まれる。

■−記の変性処理は単独でもまた２′！Ｉ１１以との組
み合わせでもよく、また変性セルロブラスミン全マトリ
ックスに固定化した後に行ってもよい。このような変性
処理は、通常、セルロプラスミン全０．１〜０．５ｗ／
マ％濃度に生面食塩液で調製したもの１容に対し、以下
の緩衝液１０〜２００容に透析するという極めて簡単な
操作によって達成できる。すなわち、硫化ナトリウム、
硫化アンモニウム、シアン化ナトリウム等全使う場合で
は、それらを０，０１〜１．０Ｍ程度全含むｐＨ６，０
〜８．０の０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液全使用し、
θ〜６０°Ｏで１〜１０時間程時間桁するとよい。

ｂ−アスコルビン酸、還元糖等を用いる場合は、それら
全０．Ｏ１〜１．０Ｍ程度含を、ＬＰＦ−０，０１〜０
．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０〜６．０）にθ〜１５０
０で２４〜３６時間透析する。アセトアルデヒド、ギ酸
、シュウ酸、メルカプトエタノール、ジエチルジチオカ
ルバメート等全用いる場合は、それら？α０１〜０．１
Ｍリン酸緩衝液に０〜３０°０で０．５〜３時間透析す
る。チオシアン酸塩全便う場合ＴＩ′ｉ、それ’ｉｏ、
１〜３．０Ｍ含む０．０１〜αＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ
ａ、ｏ　−８，０）に０〜３０°０で０．５〜５．０時
間透析する。ＦＩＤＴＡ％ＨＴ　Ａ　％　Ｔ　Ｔ　ＨＡ
音用いる場合は、それを０．０１〜１．０Ｍ程度含む０
．０１〜０＋ＩＭのリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０＝　８
．０　）に０〜３０°ａでＯ，Ｓ〜５．０時間透析する
。

原料のセルロプラスミンは市販のものがそのまま用いら
れる。また、人血漿全アルコール分画したコーンの７ラ
クシヨン■のほか、ヒトもしくは動物の血液から分離精
製して得ることができる。

上記変性セルロプラスミン′ｆｔ用いて百日ぜき菌培養
物をアフィニティクロマトグラフィーに付すには、下記
のようにして行われる。

変性セルロプラスミン全臭化シアンで活性化したセフ了
り一ス、アガロース、セルロース、デキストラン等のマ
トリックスに固定化させるＡｘｅ’　ｎらＯ方法（Ａｘ
ｅ’　３１１　；　Ｍａｔｕｒｅ、。

２１４．１３０２−１３０４（１９６７１）によりアフ
イニテイゲル全調製し、これ全カラム法、パッチ法等の
クロマトグラフィーにしたがい、百日ぜき菌培養物と接
触させてその中に含まれるＬ　Ｐ　ＩＦ　−１１Ａを吸
着させ、ついで適当な緩衝液で洗浄して池の物質金除去
したのち、溶出液でＬＰＦ−ＨＡ′ｇを溶出単離する。

出発原料として用いる百日ぜき菌培養物はへ前記Ｆ−Ｈ
Ａの精製に用いたものと同様のものが使Ｉｌ■で右、例
えば百日ぜき菌Ｉ相菌（および■相菌）全通常の培＠％
たとえばコーエン拳つイラー培地やステナーφシ目ルテ
培地等の液状培地にて常法により静置培養または振とう
あるいけ通気攪拌培養して得られる培養液があり、好ま
しくは該培養液から遠心または、ろ過によって菌体全除
去したものである。さらに、前記’Ｅ−ＨＡ精製の際の
吸着工程での素通り成分？出発原料として用いてもよい
。この第１の方法によれば、塩析、抽出、透析、超遠心
、濃縮、平衡化等、公知方法にみられる棹々の前段精製
処理を必要とせず、この培養波音そのｔま、アフィニテ
ィクロマトグラフィーに供することができる。このため
工程がきわめて簡単である。

カラム法では、カラムにアフイニテイゲル全充填し、出
発材料の百日ぜき菌培養物を流速１ｏｍＪ／ｍ／ｈ　ｒ
　〜ｓ　ｏ　０ｆｒＬＪ’／ｍ　／ｈ　ｒで通液させて
吸着させる。

パッチ法では、容器中に百日ぜき菌培養−全入れ、これ
に７フイニテイゲル全直接添加し、３０分〜３時間程度
、好ましくは１時間程度攪拌して吸着させる。

アフィニテイゲルの用量はとくに制限されないが、通常
、アフイニテイゲル）Ｆａｆに対し１．ｏｏｏ〜２，０
００μｔの蛋白量のＩ＋ＰＩＦ−ＨＡｔ吸着することが
できる。

該ＬＰＰ−ＨＡ［＆着アフイエテイゲルの洗浄には、ｐ
Ｈ４，０〜９．０の縫衝液、比電導度１０ｍ５　／（ｗ
ｒ　〜１５０　ｍｓ／６ｎの緩衝液等が用いられる。

例えば、０，１〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０゜０
１〜０．１ＭリンｌＩｊ！綬衝液（ｐＨ６，０〜８．Ｏ
１ｔ用い、カラム法では、カラム容積の数１０倍程度の
液ＷＴｈｉｌして行う。またパッチ法ではゲル容積の数
倍の液量で洗浄処理が行われる。

この洗浄操作により、出発材料中に多蓋に含まれる百日
ぜき菌内毒素が効果的に分離除去され、この点において
も、本方法は従来公知の方法に比べてきわめてすぐれた
特徴全盲するＯ ｂ記洗浄処理後、リガントに吸着したＩ＋ＰＦ−ＨＡ全
溶出するには、カオトｐビック塩類（例えば、Ｉ−、０
１０７、０１Ｆ３０００−ｅ　　”Ｎ−ｅ００１３００
０−等Ｏカオトロピックイオンを放出する塩類）、エチ
レングリコール、ジオキサン、尿素、塩酸グアニジン、
ＩＩＩＤＴＡＩのアフィニティクロマトグラフィーにお
いて一般的に用いられる溶出液音用いて常法にしたがっ
て行われる。

本方法の７フイニテイク四マドグラフイーによれば、出
発材料のｐＨが４．０〜１０．０の範囲では安定して９
０、以Ｉｎｏ収率に達する。

本方法によって得られるＬＰＦ−ＨＡの純度は、ポリア
クリルアミドディスク電気泳動法（１）Ｈ４，５１によ
る分析において９０、以と１条件により９５％以りもの
高純度に達する０また比活性値けｏ、ｓ〜１．６　Ｘ　
１Ｇ”ＬＰＦ−ＨＰ。

ｌ　Ｌ　Ｉ　８　Ａ　ｕｎｉｔ／μｙ蛋白質＝ＴＪＰ？
−１（Ａ。

ＥＩｉ工ＳＡ測定法〔佐原等第２８回毒素シンポジウム
予稿集、１４１−１４４（１９８１）　”ｌとなり、従
来公知の方法では望み得ない高品質が達成される。

このことは、得られたＬＰＦ−ＨＡのリムラステストお
よびウサギ発熱試験等の生物活性試験にも明確にあられ
れている。即ち、本方法の場合、内毒素の除去ははｙ完
全である。

また、本方法（第１方法）は、通常ヒト血漿成分？使用
する際に遭遇する肝炎ウィルスその能の感染因子による
問題も解決できる利点も有する。

例えば、本方法においては、加熱処理変性セルロプラス
ミンの場合当加熱処理によりＬＰＦ−ＨＡに対する特異
的吸着能、吸着容量全大幅に向トさせるばかりでなく、
肝炎ウィルスによるＥ記感染等の対策も併せて実施でき
ることは明らかである。さらに、Ｌ−アスコルビン酸や
シアン化ナトリウム等により変性処理全行った変性セル
ロプラスミンに、６０’Ｏ％１０〜１５時間加熱処理を
加えたものをリガントとして用いた場合でも、加熱処理
を加えない場合と同様の精製能力がある。またあらかじ
め６０°０．１０時間の加熱処理を加えたセルｐプラス
ミンに上記Ｌ−アスコルビン酸変性処理あるいはシアン
化ナトリウム変性処理等を加えたものｔ用いた場合も、
未加熱処理の場合と同様ま７？：けそれ以との好成績が
得られる。したがって本方法は〜肝炎ウィルス等の汚染
の懸念がなく、また百日ぜき菌内毒素の除去が充分であ
る点でも、格段にすぐれた方法である。

Ｅ述のとおり、この本出願人の第１のＴＪＰＦ−五ム精
製方法により提供される変性セルロプラスミン全リガン
トとするアフィニティクロマトグラフィーによれば、出
発材料の百日ぜき菌培養物から所望ＬＰＦ−ＨＡを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もきわめて
簡単で、またそのアフイニテイゲルは数１０回操り返し
て使用でき、コスト的にもすぐれており、しかも百日ぜ
き菌内毒素もほとんど分離除去できる利点全盲する。し
たがって、本方法は高純度ＬＰＰ−ＨＡの工業的製法と
してきわめてすぐれた方法である。

本方法で得られるＬＰＦ−ＨＡ＃ｉ高純度で池の蛋白質
、脂質１糖類等を含まず、また内毒素もほとんど完全に
除去されているため、最終の百日ぜきワクチンの６）１
ｊｌｌＫ極めて有利に使用できる◎ さらに、　Ｌｌ”Ｐ−ＨＡを高純度に精製する本出願人
の第２の方法は、前記ＩＦ−ＨＡの精製に用いたセルロ
ース硫酸エステルゲル、デキストラン硫酸が化学的に結
合したポリサッカライド誘導体または架橋ポリサッカラ
イド硫酸エステルゲル全用いる方法である（特願昭５９
−１５０，９４５号等）。即ち、百日ぜき菌培養物ｐＬ
ＰＦ−夏ＩＡをｇＩｋ着する売件下（ＣＬ　Ｉ’ＩＦ−
ＨＡを吸着させた後、吸着したＬＰＦ−ＨＡ金ゲル小ら
溶出させることからなる。

この第２方法で用いる出発原料として用いる百日ぜき菌
培養物は前記ｙ−ｕＡ＃！製の際に用いる出発原料ある
−は第１０Ｉ＋ＰＩＦ−１１人の精製の際に用いる出発
原料して挙けたのと同じ原料全使用できる。ｔた％吸着
するのに用いるセルレース硫酸エステル等のゲルは、前
記Ｆ　−ＨＡ　４９製に用いるのとをく同一のもの全使
用してよい。

この第２の方法において、セルロース硫酸エステル等の
ゲル音用いて、百日ぜき菌が産生するＬＰＦ−ＨＡｆ精
製採取するにあたっては、たとえば、次のような方法で
行なわれるＯ 原材料液であるＬＰＦ−ＨＡ含有液は、百日ぜき菌培養
物の遠心り清ｔ％蒸留水または緩衝液で比電導度が０．
５〜５．０　ｍｓ／ｍとなるように希釈した後、吸着操
作に付すこともできるが、このと清中にはセルロース硫
酸エステル等のゲルに対して同じく親和性全盲する１−
ＨＡが含まれているため、あらかじめ％ＬｐＦ−ＨＡｉ
ｊ吸着せず？−ＨＡ’ｉ吸着する条件にて、セルロース
硫酸エステル等のゲルによるクロマトグラフィーを行な
い（比電導度５．０〜２５．０　ｍ＊／ｃＩｎｂ　ｐＨ
５〜９の緩衝液で平衡化されたセルロース硫酸エステル
等のゲル充填カラムに比電導度５．０〜２５．０　ｍｓ
／ｃＷｈｐＨ５〜９Ｋｍｌ整した原材料液を通液する）
、その素通り画分であるところしＰ−ＨＡを、ＬＰＦ−
含ますＬＩＰ７−ＨＡを大量に含んだ両分全吸着操作に
付してもよい・ 七ルシース硫酸エステル等のゲルへのＴＪＰ７−ＨＡの
吸着、ゲルの洗浄、ＬＰＦ−ＨＡの溶出等一連の精製操
作は、パッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく＃
Ｉいられる操作方法で行なうことができる。カラム法の
場合、セルロース硫酸エステル等のゲルをカラムに充填
し、あらかじめ例えば０．０２Ｍマツキルベン（Ｍｏｌ
ｌｖａｉｎｅ’　ｍ　ｌ緩衝液（ｐＨ５，２１等の比電
導度ａ、５〜５．０ＩＩＩＩＩ／１−ｍでＰＨｆ）：　
５．０〜９．０程度である適当な緩衝液全通液して平衡
化を行った後ｉｃ、ＬＰＦ−ＨＡの吸着操作に移る。

吸着に際しては、ＬＰＦ−ＨＡの含有波音ｐＨが５．０
〜９．０　、比電導度が０．５〜５．０’　Ｋなるよう
に適宜調整して、セルロース硫酸エステル等のゲル充填
カラムに通液し％　Ｌ　Ｐ　Ｆ−ＨＡ？吸着させる。こ
の後、前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し
、ゲル全洗浄し、夾雑物質を洗−出す。

Ｉ、ＰＦ−ＨＡ（り溶出に際シテは、ｐ　Ｈ＃　５．０
〜９．０、比電導度がＳ、Ｏ以とである適当な緩衝液に
通液し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出全行なう。すなわち、原材料液として百日ぜ
き菌培養液の遠心と清の希釈したものＰそのまま用いる
場合は、前述の吸着条件下において、ＩＩＰＦ−ＨＡと
同時にシーＨＡも吸着されてくるので、Ｉ＋ＰＦ−ＨＡ
が溶出され、かつ？−ＨＡが溶出されない条件下で溶出
する必要がある。この条件としてはｐＨ５〜９において
比電導度５〜１００　ｍ　ｓ／ａｎ　＆好ましくけ５０
〜６０　ｍ　ｇ７６Ｂである適当な緩衝液（例えば０．
７Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２？Ａマツキルベン緩衝
液）全最初に通液し％　ＬＰＦ−ＨＡを含む画分全回収
する〇この後にト述の溶出用緩衝液より比電導度０大な
る（　１ｏｏ　〜ａ、ｏｏｍｓ／ｃＩｎ１　ａ衝液全通
液し、Ｆ−ＨＡその能の不純成分を溶出させ、セルロー
ス硫酸エステル等のゲルを平衡化再使用に供する。

最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。原材料液
として、あらかじめＦ−ＨＡを分離しｒｅＩ＋ＰＦ−Ｈ
Ａ含含有液全一る場合においても、比電導度力０，５→
３００　ｍ　ｓ／Ｉ：１ｎとなるような塩濃度勾配緩衝
液（Ｍえは塩化ナトリウム０→４．０Ｍ塩濃度勾配・０
．０２Ｍマツキルベン緩衝液（１１Ｂ５．２１ｉ用いて
溶出全行な＋７２、ＬＰＦ−ＨＡ含有洩分に分取すれば
、きわめて高純度のＬＰＦ−ＨＡｔ得ることができる。

本精製法によればｓ　Ｌ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡの精製度は数
十倍に達し、しかもＬＰＦ−ＨＡの回収率け８０、以ｈ
ｘｏｏ％近くに達する。得られ；ｂ精製ＬＰ’１をＨＡ
ＩＤ比活性Ｉｆ　Ｏ，９〜１．２Ｘ１０’ＬＰ　ＩＦ−
Ｈｐ−Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｂ　Ａ　ｕｎｉｔ／μｐ蛋白質とき
わめて高く、ポリアクリルアミドディスク電気泳動（ｐ
Ｈ４，５）分析において単一のバンドを形成し、百日ぜ
き菌内毒素がほぼ完全に除去される。

と述のとおり本発明の方法によれば、出発材料の百日ぜ
き菌培養物から所望のＬＰＦ−ＨＡを高収率、高純度に
採取することができ、その操作もきわめて簡単で、また
その精製用り四マドグラフィー吸着体＃ｉ、安価に調製
でき、しかもくり返し使用しても劣化が全く無く、きわ
めて経済性にすぐれている。

したがって、この第２の方法も高純度ＬＰ１−ＨＡの工
業的精製法としてきわめてすぐれた方法であり、必要な
らば従来の技術である蔗糖密度勾配超遠心分離法、ある
いはイオン交換り田マドグラフィー法等と組合わせるこ
とも可能である。

本発明の方法で得られるｚｐｙ−ＨＡは高純度で他の蛋
白質、脂質、糖傾等全含まず、また内毒素も′はば完全
に除去されているため、最軽の百日ぜきワクチンの調製
の原料として極めて有利に使用できる。

これらの高純度精製ＬＰＦ−ＨＡは最終ワクチンの製造
に当っては、通常のホルマリン処理によるトキソイドと
して使用する。

本発明の百日ぜきコーポネントワクチンは、と述の如く
して得られた高純度７ｌ−ＨＡｔたはそのトキソイドと
高純度ＬＰＰ−ＨＡのトキソイドと金単に、人体に対し
必要最小鰍の抗原量全もたらすような両成分の含量比を
もつように任意の割合で適当に混合することｋより製造
することができる。ＬＰＦ−ＨＡのトキソイド化は’Ｉ
Ｉ−ＨＡとの混合前または混合後のいずれであってもよ
い。例えば、ＬＰＦ　−ＨＡまたはその？−ＨＡとの混
合物にホルマリンα１〜１．０、全添加し２２°〜４０
°ＯＫ７〜３５日間静置後さらに０．２％にホルマリン
全添加し室温に１〜３日間靜置装置あるいけ時々振盪し
て毒性全低下させる。毒性の低下？確認後適当な蛋白濃
度に調製（通常最終蛋白窒素濃度１０〜２０μｇ／ｍｌ
　ｌする。しかる後、必要ならばアジュバントとして通
常のアルミニウムアジュバント、例えば水酸化アルミニ
ウムまたはリン酸アルミニウムｉ添加し、さらにゼラチ
ン、グリコーズ、チメ四す−ル等全適当社添加してｐ、
Ｈを５，４〜７．４として最終の百日ぜきコンポーネン
トワクチンとする。

勿論、ＬＦＦ、−ＨＡのみ金トキソイド化した場合には
、前記の高純度ＩＦ−ＨＡまたは別個にトキソイド化し
たＦ−ＨＡｉ混合する。

さらに、混合ワクチンを製造する場合には、通常のジフ
テリアトキソイド【最終濃度３０Ｉ＋ｆ／ｍＪ　ｌおよ
び破傷風トキソイド（最終濃度５Ｌｆ／ＷＬ−１）全混
合して作製する。

また、かくして調製したワクチンは、凍結乾燥標品とす
ることもできる。

〔発明の実施例〕

以下、本発明全調製例、実施例により具体的に説明する
。

調製例１ ０°Ｏ以下の温度にてピリジン６００ｍＪ−にクロルス
ルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。

滴下終了後、混液全加熱し、６５〜７０°Ｏに昇温する
。この中にセルロファインａ　ａ　−ｕｓ（チッソ社製
１８０ｇｆ加え、攪拌下６５〜７０°０にて３時間反応
させる。反応終了後、冷却し、１０、水酸化ナトリウム
水容液全波音て中和する。ゲル全濾過分離し、ｏ−０１
Ｍリン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エ
ステルゲル全得る。

このようにして調製した七ルロファインＧＯ−１５の硫
酸エステル化物をカラム（４００ｍｍφＸ１３０ｍｍ１
に充填し、これに０．．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０
１Ｍｊ）＞階緩衝液（ｐＨ７，６、比電導度的１７．５
　ｍｅＺｃｍ　ｌ　全通液して平衡化する。

この方ラムに百日ぜき■相菌東浜株ファーメンター培養
と清３００１　（比電導度的１７．５　ｍｖＥｍ　５ｐ
Ｈ７，６）全通液する。通液後、ｈ記緩衝液にて洗浄し
、夾雑物質全洗い出す。ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）、で溶出し、Ｆ−Ｈ
Ａ娶含む画分３０ｊ’に得る〇培養と清液および、素通
り画分、精製Ｆ−ＨＡＩＩ！ｉＩ分の分析結果全第１表
に記す。

？−ＨＡの回収率は９５蝿で、精製度（精製Ｆ−ＨＡ画
分の比活性／培養Ｅ清の比活性）は２３倍に達した。精
製シー１１Ａ画分のＬＰＦ−ＨＡ活性は、５．０　ＬＰ
Ｆ−Ｈｐ−ＥＬ工８　Ａ　ｕｎｉｔ／ｍ１．以下であっ
た。

第　　１　　表 （注）（ｎ）　ＩＦ　−ＨＡ　−ＩＣＬＩ　８　Ａ　　
ｕｎｉｔ／ｚＪとして表示する。

（２）ＬＰＦ−Ｈｐ−ＩＩ＋ＩＳＡ　　ｕｎｉｔ／−と
して表示する。

（３）　ＨＡ　　ｕｎｉｔ／′ＷＬＬとして表示する。

（４）キルプール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋
白質含量として表示する。

（ｓ）　ｙ　−ｎ人−ＩＣＩＩ工８Ａｕｎｉ％Ａｙ蛋白
質として表示する。

、（６）リムラステスト（プレゲル）Ｋより定量した。

（７）　６．２５μ咄白質ｈａの含量に希釈後、生物学
的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて実施し
た。

調製例２ ０°０以下の温度にてピリジン６ＱＱｚＪ−にり四層ス
ルホン酸１１７ｆ全滴下し、混合する。滴下終了後、混
合液全加熱し、６５〜７０°０に昇温する。この中に結
晶セルロースであるりシマトゲラフイー用アビル（旭化
成工業社製）Ｂｏｇ全加え、攪拌下６５〜７０°ＣＪに
て４時間保持する。反応終了後、冷却し、１０、水酸化
ナトリウム水溶液全加えて中和する。ゲルを濾過分離し
ｂＯ，０１Ｍリン酸綬衝食塩液で充分に洗浄してセルロ
ース硫酸エステルゲルを得る。

このようにして調製したアビセルの硫酸エステル化物全
カラム（４００ｍｍφＸ１３０ｍｍ）Ｋ充填し、これに
０．１４Ｍ塩化ナトリウム添加０゜０１Ｍ　リン酸緩衝
液（ｐｕｙ、６）全進液して平田化する。このカラムに
、百日ぜきＩ相菌東浜株静置培養り渭３００Ｊ全、比電
導度約１５ｍａ／αに希釈し、ｐＨ７，６に合わせた波
音通液する。

通液終了後、上記緩衝液で洗浄し、ついで、１．５Ｍ塩
化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）で溶出し
て精製Ｆ−ＨＡ含有画分３０Ｊ−全得る。

培養り清液むよび、素通り画分、精製Ｆ−Ｈｉｍ分の分
析結果全第２表に記す。

’Ｉ！−ＨＡの回取弔け７５％で、精製度は１４倍に達
した。

第　　２　　表 注＝　（１）、　（２Ｌ　（ａＬ　（４Ｌ　（５Ｌ　（
６Ｌ　（７）は第１表に同じ０調製例３ θ〜５°０の温度にてピリジン５ＱＱＷＬＪにクロルス
ルホン＠　８　’２　ｇを滴下し、混合する。滴下終了
後、混液全加熱し、６５〜７０°０に昇温する。この中
にセルロファインＣｋ　Ｈ−２５（チッソ社製１８０ｐ
Ｔｈ加え、攪拌下６５〜７０°０にて４時間反応させる
。反応終了後、冷却し％１０、水酸化ナトリウム水容液
を徐々に加えて中和する。ゲルを濾過分離し％０．ＯＩ
Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２１で充分に洗浄してセ
ルロース硫酸エステルゲルを得る。

酸緩衝液（ｐＨ７，６）ｆ通液し平衡化する。このカラ
ムに調製例１で用いたものと同−ｐットの百日ぜき■相
菌東浜株ファーメンター培養Ｅ清３００Ｊ−（比電導度
約１７．５　ｍｓ／ｍ％ｐＨｋ７．６）　全通液する。

通液終了後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質全洗い出
す。ついで１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（
ｐＨ７，６）で溶出し、？−ＨＡを含む画分３ｏＪｊを
得る。

培養り清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果全第３表に記す。

Ｆ−ＨＡＣ１回収串ｔ１９３．８％で、精製度は３０倍
に達した。

本精製品全用いて生物学的製剤基準「百日ぜき□ワクチ
ン」（薬発第２８７号、１９８１全参照）に準じ、マウ
ス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易熱性毒素否
定試験およびマウスヒスタミン増感試験全実施したが、
いずれも、生理食塩水を接種した対照群と同等であり、
この基準における副作用は認められなかった。

第　　３　　表 注：　（１）、　（２）、　（３）、　（４）Ｉ　（５
）、　（６）、　（７）は第１表に同じ。

調精例４ デキストラン硫酸ナトリウムｍ５ｔを２０゜？ＦＬＪの
０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液に、
０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で平向化させたセファレ
ース０Ｌ−４Ｂ（ファルマシア・ファインケミカルズ社
製）　２ＯｍＪ　ｆ入れゆるやかに攪拌する。攪拌下に
、１００ｍＪの蒸留水に１０ｆの臭化シアンを溶解した
波音加える。反応液に５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液全添
加しつつｐｕを１１に１５分間保持する。

その後−ｐＨを下降するに任せ、室温にて攪拌下１７時
間保持する。

反応終了後、グラスフィルターとでろ過し、ゲルを０．
１５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
で充分に洗浄して、デキストラン硫酸−アガロースゲル
２０ｔｒＬ１′ｆｔ得る。

上記のようにして調製したデキストラン硫酸アガロース
ゲル全カラム（１６ｍｍφＸ１００ｍｍ１に充填し、こ
れに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐ）Ｉ　７．６．比電導度的１　ｙ、ｓ　ａｓ／ｃ
ｒＲ１’ｆｒ通液して平衡化する。このカラムに百日ぜ
きＩ相菌東浜株７Ｆ−メンター培養と清８０　Ｇ、ｆｉ
ｊ　（比電導度的１７．５　ｍｓ／（２１１、ｐｌ！７
．６）１）通液する。通液後、上記緩衝液全通液してゲ
ル全洗浄し、さらに０．２０Ｍ塩化ナトリウム添加リン
酸緩衝液（ＰＨ７，６％比電導度約１７−５　ｍｓ／／
□）全通液【、−夾雑物質全洗い出す。

ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，８ｂ比電導度約１２０　ｍｅ／（謂）で溶出し
、！−ＨＡを含す画分ｇ９ｍｊ全得た０培養り清液およ
び、素通り画分、精製１−ＨＡ画分の分析結果全第４衷
に記す。

Ｆ−ＨＡの回収車は９０、で、精製度（精製？−ＨＡ画
分の比活性／培養Ｅ清の比活性）は１７倍に達した〇 常・１表 注：　（１）、　（２１，（３）、　（４）、　（５Ｌ
　（ａＬ　（７）は第１表に同じ。

ＩＩＩＩｉｌ１例５ ０°０以下の温度にてピリジン２００ｍｊにりシルスル
ホンｆｉｌ１ｍＪを滴下し、混合する。滴下終了後、混
液全加熱し、６５〜７０００に昇温する。

この中にエピクロルヒドリン架橋デキストランであるセ
ファデックスＧ−５０（７アルマシア社製）　７．５９
　ｆ加え、攪拌下６５〜７０’ＯＩＣテ４時間保持する
。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加え
て中和する。ゲルを一過分離し、０゜ＯＩ　Ｍ　ＩＪン
酸緩衝食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルを得る。

このようにしてＮＩ！！したセファデックスＧ−５０の
硫酸エステル化物全カラム（１６ｍｍφＸ１００ｍｍ）
に充填し、これに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１
Ｍリン酸緩衝液ｔｐＨを、ａ、比電導度約１７．５　ｍ
ｅん）を通液して平衡化する。

この方ラムに百日ぜきＩｌｌ菌東浜株静置培養り清８０
０？ｎ、Ｌｙｔ希釈して、比戒導度約１７．５　ｗｒ　
ａ／ｃｍ％ｐＨ７，６に合わせた液を通液する。通液後
、上記緩衝液にて洗伊し、夾錐物質を洗い出す０ついで
、を、ｓＭａＸ化ナトリウム添加リン酸す動液（ｐＨ７
，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡ全含も画分ａ　ｏ　ｍＡ全得
る。

培養り清液および、素通り画分、精製Ｐ−ＨＡ画分の分
析結果全第５表に記す。

Ｐ−ＨＡの回収車は９３．８％で〜精製度（精製Ｆ−Ｈ
Ａ画分の比活性／培養Ｅ清の比活性）は約２０倍に達し
た。

第　　５　　表 調製例６ 調［ＨｌにおいてＦ−ＨＡ′ｆｒセルロース硫酸エステ
ルゲルに吸着させた時の素通り画分（６４ＨＡ　ｕｎｉ
ｔ／ｍ１．、１７０Ｇ　ＬＰＦ−Ｈｐ−］１ｉＬＩ８ム
価／ｍｌ、　０．４６　ｍｌ蛋白質／ｍｌ、　ｐＨ７，
６）５ｏｏｏｆｉｚ全出発原料として用いた。

′Ｌ、■、工ｒａｎｓ　ａを、　ａｌ　、　Ｂｉｏｏｈ
ｉ塩、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、ムａｔｅ。

５８０、１７５−１８５．１９７９　　記載の方法に従
い。

上記原料ｔ’ｐＨａ、ｏの０．０１　Ｍリン酸緩衝液で
平衡化したへイドａキシルアパタイトカラム全通してＩ
＋ＰＦ−ＨＡＱ吸着させた。０．５Ｍ塩塩化ナトリウム
全台０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，９で溶出して蛋白画
分（部分積［ＬＰＰ−ＨＡ）を得た。この蛋白画分全ハ
プトグロビン−セファ党−スを支持体とするアフィニテ
ィクνマトグラフイーに吸着させ４０．５Ｍ塩化ナトリ
ウムと３Ｍチオシアン酸カリウムを含むＯ，ＯＳＭリン
酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，６で溶離して第６表に示す分析結
果を有する精製ＬＰＰ−ＨＡ全５３％の回収車で得た。

−ＩＩＩＯ− 調装例７ 特願昭５８−２０６５９８号明細書の調製例１ニ従って
精製した結晶ヒトセルロプラスミン全用いて、次の各ｍ
変性セルロブラスミン全調製する。

（１）シアン化ナトリウム変性セルロプラスミン結晶セ
ルロプラスミンのＩ　Ｗ／Ｙ％水溶液５０ｍＪ−２リン
酸緩衝液（ｐＨ７，４，イオン強度０．２）に０．０５
Ｍシアン化ナトリウム金含ませた緩衝液５．０１に４°
０で１２時間透析して、オキシダーゼ活性１に９０、喪
失したシアン化ナトリウム変性セルロプラスミン？得る
。

（２）シアン化ナトリウム変性セルロブラスミンの加熱
処理 （１）と同様の方法でシアン化ナトリウム変性セルロプ
ラスミンの１　ｗ／ｖ％水溶Ｏ５０７７１Ｊ　２調製し
た後、この液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　
ｓ、ｏＪ、に透析する。透析終了後、変性セルロプラス
ミン含有波音６０°Ｏに加熱争昇濡し、１０時間同温度
に保持して加熱処理７行う。

（３）Ｌ−アスコルビン酸変性セルロプラスミン結晶セ
ルロプラスミンの１　ｗ／ｖ％水溶液５〇−１酢酸緩衝
液（ｐＨ５，２，イオン強度１．２）にＬ−アスコルビ
ン酸５　ｍｇ、Ａ−全加えた緩衝ｌｓ、ｏｊに４°０で
３６時間透析して、オキシダーゼ活性が６５．５％とな
ったＬ−アスコルビン酸変性セルロプラスミン全得る。

（４）加熱処理変性上ルａプラスミン ！１ｚ晶セルロプラスミンｆ　５　ｗ／ｖ％含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１００−全、水溶液中で
６０°０．１５時間加熱処理する。

（５）　加Ｍ　ｊＡ　ＩＩセルロプラスミンのＬ−アス
コルビン酸変性 人血漿全アルコール分画して得られるコーンの７ラクシ
ヨンＦ／−１全温浴りで６０６０、ｌＯ時間加熱全０え
る。Ｍａｒａｌｌ等の方法（８ｏ１ｅ’ｌ（１＠＋１２
７．５８８（１９６３）に従って処理し、加熱処理済み
の結晶セルロプラスミンに得る。

この加熱処理済み結晶セルロプラスミンを用い一上記（
３）と同様の処理を加えて、加熱処理セルロプラスミン
のＬ−アスコルビン酸変性物全得る。

アフイニテイゲルの調製 前記、各ｔ１変性セルロブラスミン全リガントとし１以
下のようにして０ＮＢｒ−活性化セ７アロース４Ｂ（フ
ァルマシア社製）にカップリングさせてアフイニテイゲ
ル全調製する。

０ＮＢｒ−活性化セ７アロース４Ｂ１．５ｐＴｈ１．０
　ｍ　Ｍ　ｉＭｒＩＩ３．ＯＪ−に１５分間浸漬して膨
潤させたのち、ガラスフィルター（Ｇｓｌｆ：でＬＯｍ
Ｍ塩酸を吸引除去して膨潤セファロースゲル（５２５展
１）心得る。

別に、リガント（蛋白質１１ｉ１５０ｆｉｆｌ全０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含ｉｙｏ、ＩＭ炭酸ナトリウム緩衝
液（ＰＨ８，３１７５ＷＪ−に溶解させ、これに上記膨
油セファ四−スゲル５２．５　ｍＪ−２加え、室温で椙
やかに攪拌しながら２時間カップリングさせる。カップ
リング終了後、上記と同じ炭酸ナトリウム緩衝液１５０
　ｙｙＬｊで４回洗浄し＊　Ｅｌ）　チ、を、ｏ　Ｍエ
タノールアミン水溶液（ｐＨ８，０１１５０ｍｌを加え
、再び穏やかに攪拌しながら２時間反応させる。反応終
了後、同様に炭酸ナトリウム緩衝液１５０−にて４回洗
浄してエタノールアミン全除失する０イ０られたゲル全
、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸綬食塩（
ｐｌ（８，０）、１５０ｆｉＪ−にて３回洗浄し、さら
にＬＯＭ塩化ナトリウム全含心合、１Ｍホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，０１％１５０−にて３回洗浄する。この酢酸緩
衝液およびホウ酸緩衝液による洗浄全交互に３回繰り返
して、各種のセルロプラスミンーセ７アロースアフイニ
テイゲルを調製する。

カラム法によるＬＰＦ−ＨＡの精製 Ｅ記で得られたアフイニテイゲル２　ｇ　？ＦＬ１．２
充填したカラム（２８ｍｍφＸ１５０ｍｍ１に、調製例
６で用いたのと同じ出発材料ｓ、ｏｔを室温にてｌｓ　
ｏ　ｍｌ／　ｃｄ　／ｈ　ｒの流速で流す。つぎに、１
．０Ｍ塩化ナトリウム金含むリン酸緩衝液（ｐＨ７−０
１，１５０Ｇ？ＦＬＪ　ｆ同流速で通液してカラム全洗
浄する。

上記洗浄処理後、カラムに１．０　Ｍ塩化ナトリウム全
台む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５１に３．０Ｍチ
オシアン酸ナトリウムを加えた溶出液Ｉ　Ｃ１ＯｍＡ　
ｆ　３５．０　ｍｕ／６ｄ／　ｈｒの流速で流してＬＰ
Ｆ−ＨＡ全溶出する。

これらの変性セルｐプラスミン？リガントとするアフイ
ニティゲル全用いて得られた各ＬＰＦ−ＨＡ画分の分析
結果および各実験結果？第７表に示す。

これら各変性セルロプラスミン全リガントとする場合に
は、ＬＰ］Ｆ−ＨＡＯ純度も高く、比活性埴も高い。

調製例８ 前記調製例１と同様にして調製した七ルロファインＧ　
Ｏ−１５の硫酸エステルゲルをカラム（４０ｍｍφＸ２
００ｍｍ１に充填し、これに蒸留水１．０２ｇ通液する
。このカラムに百日ぜき■相菌東浜株静置培養液の遠心
り清５０００ＷＬｌ・全蒸留水で１０倍希釈した液（比
電導度的Ｌ５ａｍ／ｃｍ　）　％ｋ　ｍ液する。約５０
０００ｔｒｔｊの０．０２Ｍマツキルペン緩衝液（ｐＨ
５，２＞全カラムに通液し１ゲルを洗浄した後ｈ　Ｏ，
０２Ｍ塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液（比電導
度的２．０ｍｓ／ｃｍ％ｐＨｓ、’２１２ｏｏｏ７ＦＬ
ｉ２用い、塩化ナトリウムＯ−）　４．０　Ｍの塩濃度
勾配にて溶出を行ない約２０　ｍＪ−ずつ分画して分取
した後−ＬＰＰ−ＨＡｔ”含有するＮ公約１３　Ｑ　ｔ
ｒｃＪ−全プールする。

原材料液および精製ＬＰＦ−ＨＡ崗分の分析結果および
実験成績全第８表に示す。

調製例９ 前記調製例４と同様にして調製したデキストラン硫酸−
アガロースゲルにカラム（４０ｍｍ　　−φＸ２ＧＧｍ
ｍ）に充填し、これに蒸留水１ｇ（１６ｍｊ全通液する
。こＯカラムｉｃ＠製例８と同じ培養遠心と清５０００
？ｙＬｊを−蒸留水で７倍希釈した　。

液（比電堺度約２　＊Ｏｍ　ｍん）１全通液する。

約２００００〆？ＦＬＪの０．０！Ｍマツキルベン緩衝
液（ｐＨ５，２１ｔ”カラムに通渡し、ゲルを洗浄した
後０．０２Ｍ塩化ナトリウム添加マッキルベ＞緩衝液（
Ｉｔ電電導的約２０　ｍｓ／塩、ｐＨ５，２１２０００
ｍｊヲ用い、塩化ナトリウム０−４．０Ｍの塩濃度勾配
にて溶出全行ない、約２０ＷＬ、Ｉ−ずつ分画して分取
した後、ＬＰＦ→ｌ１Ａｔ″含有する一分約２００−ｔ
プールする◎ 原材料液および精１１１ＴＪｐシーＨＡ國分の分析結果
および実験成績全第９衷に示す。

６７一 −６Ｒ＋ ｔＷ製ｆＪｉｌｘ。

Ｏ°Ｏ以下の温度にてピリジン２Ｑ　Ｑ　ｍｌ　Ｋり誼
ルスルホンＩ！ｌ！１１ｍＪ　Ｔｈ滴下し、混合する。

滴下終了後、混液を加熱し、６５〜７　Ｇ’Ｏに昇温す
る。このビリジンーク誼ルスルホン酸混液に、架橋アガ
ν−スゲルであるセファｐ−ス０Ｌ−６Ｂ（ファルマシ
ア社製）のピリジン包含体３　Ｑ　ｙａｊ　ｆ加えＴｈ
　６５〜７　Ｇ’Ｇにて４時間反応させる。反応終了後
、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。

ゲルを一過分離し、０．０１Ｍリン酸ｔＩｆｉｉ食塩液
で充分洗浄して架橋アガロース′ｆＩ１６ａエステルゲ
ル２３　ｍｌを得る。

上記と同様にして調製した架構セル四−ス硫酸エステル
ゲルｔカラＡ（４０ｍｍφＸ２００ｍｍ１に充填し、こ
れに蒸留水１０００　ｍｌ　２通液する。このカラムに
１ｌＪをｔ！！例８と同じ培養遠心Ｆ渭５００　Ｑ　ｗ
ｊ　を−蒸留水で９倍希釈した液（比電導度；ｉｔ′Ｊ
２．Ｏｍｓ／ｍ　）　％　ｋ通液する。約２００００ｍ
！の０．０２■マツキルベン緩衝波（ｐ　Ｈ５，２１を
カラムに通液し、ゲルを洗浄した後１．．０．０２Ｍ塩
化ナトリウム添加マツキルペン緩衝液（比電導度的２．
０　ｍｓ／ｃｍ＆　ＩＩＨ５，２）　２００９ｍｊ　Ｔ
ｈ用い、塩化ナトリウムＯ→４．ＧＭの塩濃度勾配にて
溶出全行ない、約２０　ｗＩ−ずつ分画して分取した後
、ＬＰＦ−ＨＡ）含有する両分的２００？ＦＬＪ−全プ
ールする。

原材料液および精製Ｌ１？１−ＨＡｌｆｉ分の分析結果
および実験成績金弟１０表に示す。

−７１一 実施例１〜７ 置型と１調製例１，２，３．４および５で得た高純度’
１！−ＨＡ′ｆｔそれぞれ、試料ａ、ｂ。

ｏ、６．ｅとし、実施例６，７，８．９および１０で得
た高純度ＬＰＦ−ＨＡ全、それぞれ試料ｖ、Ｗ、Ｘ、ｙ
、ｚとする。

これらの試料を用いて、以下の如くして百日−Ｍｌコン
ポーネントワクチン全調製した。

なお、上記試料は精製の最終工程で０．４５μのメンブ
ランフィルタ−で無菌濾過済である。

先ず、試料Ｖ、Ｗ、Ｘ、ＹおよびｚＨ，それぞれに対し
て最終濃度０．０２マ／マ％ゼラチンおよび最終濃度０
．０５　ｖ／ｖ％Ｔｗ＊ｅｎ　８０　を、ＬＰＦ−添加
したのち、さらに最終濃度０．６マ／Ｖ％のホルマリン
を加え、４０°０で１０日間加温処理して減車化し、各
ＬＰＦ−ＨＡトキソイドとした。

ホルマリンは４°０以下でリン酸緩袖液（ｐＨ６，７）
に対して２日間透析して除去した０次に、試料ａｓ　Ｏ
，ａｔきわめて微量残存するＬＰＦ活性を低減させる目
的で、最終法７２一 度（ＬＯ２ｖ／ｖ％ホルマリン全加え４０°０．１脱加
温処理して減車化しＦ−ＨＡ）キソイドとした。ホルマ
リンは上記と同様にして除去した。

試料す、ａは、そのまま（トキソイド化せず）に以下の
ワクチン調製に供した。

これらのＦ−ＨＡ試料す、ａおよびトキソ　゛イド化Ｐ
−ＨＡ試料ａ、ｏ、ｅと、トキソイド化ＬＰＦ−ＨＡ試
料ｖ、ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚとを、第１１表に示すように、種
々の組合せ、配合にて混合し、さらにＡｉ（ｏｗｌ、　
ｋアルミニウＡＭｇｉ度約（Ｌ２ｍν気１、チメロサー
ルが０．０１ｖ／ｖ％となるように添加し、最終ｐＨＴ
ｌ−６，７〜６．８として７種の（実施例１〜７　）沈
降精製百日ぜきコンポーネントワクチン全調製した。

第　　１１　表 次に実施例１〜７までのすべてのワクチンを国家検定基
準（生物学的製剤基準、薬発第２８７号、１９’８１）
に準じて、−膜性状試験。

マウス毒性試験、マウス力価試験全行った結果、第１２
表の知き結果が得られ、試験項目すべてに適合しており
、良好な結果であることが明らかである。

実施例８ 実施例１〜７で調製したＦＨＡ　）キソイドａとＬＰＦ
　）キソイドＷのそれぞれの最終濃度が５０μを蛋白質
／ｗｄ　、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイ
ドの最終濃度が、それぞれ３３　Ｌｆ／ｄ　、　ＳＬｆ
／ｒｒｄ、さらにＡ２（ｏＨｌ、、ゼラチンおよびチメ
ロサールが、それぞれ、０．２７ＦＬ　ｇ　Ａ　Ｊ／ｍ
ｊ（アルミニウム含量として１０．０２＜Ｗ／１７％、
および０．０１％となるように各成分全混合し、最終ｐ
Ｈ全６．７として、沈降精製百日ぜき・ジフテリア・破
傷風混合ワクチンを得た。

これを前記国家検定基皐に鴎じて自家検定を行った結果
、第１３表の如き結果が得られ、試験項目すべてに適合
していた。

また、上記で調製したワクチンを凍結乾燥したものもｂ
記と同等の結果を有していた。

第　　１３　　表 さらに、本発明方法により調製したワクチンと、従来の
市販ワクチンにおける副作用としての局所反応をマウス
足跳反応試験により比較検討した。

試験はＭｕｎｏｚ　Ｊ、Ｊ、等の方法［（、ｒ、Ｒｅｔ
ｉａｕｘｏｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ　Ｓｏ　ｏｉｅｔｙ
、　２７，２５９−２６８（１９８０１）および渡辺等
の方法〔日本細菌学雑誌、　３８．４２４（１９８３１
）に串じ、４週令のマウス（／Ｙ、各群１０匹死重に各
ワクチンを６．５ｍＬ腹腔内免疫し２週間後、同一ワク
チン全マウス足跡に０．０２５ｆｉＪ−皮下接種（惹起
注射）した。

接種後、Ｄｉａｌ　を、ｈｔｏｋｎｅａｓゲージ全用い
て経時的にマウス足蹟の厚さ全測定し、各群１０匹で得
られた値の平均値全その膨隆度とした。その結果を第１
図に示す。第１図は、惹起注射後１日目、３日目、７日
目、１００日目１４４日目各ワクチン投与群の膨経度全
プロットしたグラフである。これによると、本発明Ｋ　
ヨル７　り４　ン（Ｋ　−Ｇ　）は、旧来品（Ａ）　ｔ
たまたは従来のアセルラーワクチンである現市販品（Ｂ
〜０）に比し、マウス足踵の膨隆度（副反応）が有意に
低いことが明らかである。

使用したワクチンは次のとおりである。

Ａ・−菌体ワクチン（百日ぜき・ジフテリア・混合ワク
チン）　　　（旧市数品） Ｂ−・沈降精製百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワク
チン　　　　　（市販品） ０−　　　　　　　　　　　　　（Ｉ　　ＩＤ・−・　
　　　　　　　　　　　（ｌ　）Ｅ−・実施例１のワク
チン ！・・・　ｌ　４の　ｌ Ｇ−＃　　８の　ｌ Ｈ・・・Ｐ　Ｂ　Ｓ　（０，２ｚｆＡＪ含有、ｐＨ６，
７１（対照１注：現行市販品Ｂ、Ｏ，Ｄけメーカーが異
なるもの〔発明の効果〕 以ｌ：＃述して来７２：ｖｎ＜　ｂ本発明方法は、ワク
チン原料たるＦ−ＨＡおよびＩ、ＰＦ−ＨＡとしてｈ１
１単かつ高収率の方法で得られた極めて高純度のもの全
使用するため、局所反応等の副作用のない改善された百
日ぜきコンポーネントワクチンおよび百日ぜき争ジフテ
リア・破傷風混合ワクチン全安価に工業的に製造できる
ものである。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明によるワクチンと従来のワクチン投与
後のマウス足跡試験（Ｍ起注射後のマウス足踵の膨隆度
経時変化）の比較結果金示すグラフである。 手続補正書（自発） 昭和５９年１２月ｌＤ日 ２、発明の名称 百日ぜきコンポーネントワクチンおよび百日ぜき・ジ７
テリヤ・破傷風混合ワクチンの１１１！造方法 ３、補正する者 事件との関係　　出願人 住所　熊本県熊本市清水町大窪４４Ｊ番地明細書の発明
の詳細な説明の欄

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｆ−ＨＡ含有液をセルロース硫酸エステルのゲル
   、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサッカラ
   イドゲル誘導体または架橋ポリサッカライド硫酸エステ
   ルゲルに接触せしめてＦ−ＨＡを吸着させた後、吸着し
   たＦ−ＨＡをゲルから溶出して得られた精製Ｆ−ＨＡま
   たはそのトキソイドと、高純度精製ＬＰＦ−ＨＡのトキ
   ソイドとを混合することを特徴とする百日ぜきコンポー
   ネントワクチンの製造方法。
2. （２）セルロース硫酸エステルゲル、デキストラン硫酸
   が化学的に結合されたポリサッカライドゲル誘導体また
   は架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルをｐＨ６．９
   〜９．０、比電導度５．０〜２５．０ｍｓ／ｃｍの緩衝
   液であらかじめ処理して平衝化したのちＦ−ＨＡの吸着
   処理を行う特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）上記吸着処理を、ｐＨ６．０〜８．０、温度０〜
   ３０℃、比電導度５．０〜２５．０ｍｓ／ｃｍの条件下
   に行なう特許請求の範囲第（１）または第（２）項記載
   の方法。
4. （４）Ｆ−ＨＡのゲルからの溶出をｐＨ５．０〜１０．
   ０、比電導度２５．０〜１３０ｍｓ／ｃｍの緩衝液を用
   いて行なう特許請求の範囲第（１）〜（３）項いずれか
   記載の方法。
5. （５）上記溶出処理に先だって、Ｆ−ＨＡ吸着ゲルを、
   ｐＨ５．０〜１０．０、比電導度５．０〜２５．０ｍｓ
   ／ｃｍの緩衝液で洗浄する特許請求の範囲第（４）項の
   方法。
6. （６）セルロース硫酸エステルが結晶セルロースまたは
   結晶領域および非結晶領域からなるセルロースの硫酸エ
   ステルである特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
7. （７）上記デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリ
   サッカライドゲル誘導体が、デキストラン硫酸−アガロ
   ースゲル、デキストラン硫酸−デキストランゲルおよび
   デキストラン硫酸−セルロースゲルから選ばれる特許請
   求の範囲第（１）項の方法。
8. （８）架橋ポリサッカライド硫酸エステルが架橋デキス
   トラン硫酸エステルおよび架橋アガロース硫酸エステル
   および架橋セルロース硫酸エステルから選ばれる１種で
   ある特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
9. （９）架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロルヒド
   リン架橋デキストラン硫酸エステルである特許請求の範
   囲第（８）項記載の方法。
10. （１０）架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒド
    リン架橋アガロース硫酸エステルである特許請求の範囲
    第（８）項記載の方法。
11. （１１）架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒド
    リン架橋セルロース硫酸エステルである特許請求の範囲
    第（８）項記載の方法。
12. （１２）高純度ＬＰＦ−ＨＡを、ＬＰＦ−ＨＡ含有液を
    ハプトグロビンまたはセルロプラスミンをリガントとす
    るアフィニティクロマトグラフィーに接触せしめてＬＰ
    Ｆ−ＨＡを吸着させた後、吸着したＬＰＦ−ＨＡを溶出
    することにより得る特許請求の範囲第（１）項記載の方
    法。
13. （１３）ハプトグロビンまたはセルロプラスミンをリガ
    ントとするアフィニティクロマトグラフィーによる処理
    に先だち、ハイドロキシアパタイト処理によるＬＰＦ−
    ＨＡの部分精製を行う特許請求の範囲第（１２）項記載
    の方法。
14. （１４）高純度精製ＬＰＦ−ＨＡを、ＬＰＦ−ＨＡ含有
    液を変性セルロプラスミンをリガントとするアフィニテ
    ィクロマトグラフィーに接触せしめてＬＰＦ−ＨＡを吸
    着させた後、吸着したＬＰＦ−ＨＡを溶出することによ
    り得る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
15. （１５）ＬＰＦ−ＨＡ含有液をｐＨ４．０〜１０．０の
    範囲に調整してアフィニティクロマトグラフィーに付す
    前記第（１４）項記載の方法。
16. （１６）変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由来の
    ものである特許請求の範囲第（１４）項記載の方法。
17. （１７）変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由来の
    セルロプラスミンを加熱処理して得られるものである特
    許請求の範囲第（１４）項記載の方法。
18. （１８）変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由来の
    セルロプラスミンを還元剤処理、シアン化合物処理もし
    くはキレート剤処理に付し、セルロプラスミンに結合す
    る銅イオンを還元またはその銅イオンの一部もしくは全
    部を遊離させたものである特許請求の範囲第（１４）項
    記載の方法。
19. （１９）リガントに嵌着したＬＰＦ−ＨＡをカオトロピ
    ック塩、エチレングリコール、ジオキサン、尿素、塩酸
    グアニジンおよびＥＤＴＡから選ばれる１種もしくは２
    種以上を用いて溶出する特許請求の範囲第（１４）項記
    載の方法。
20. （２０）高純度精製ＬＰＦ−ＨＡを、ＬＰＦ−ＨＡ含有
    液をセルロース硫酸エステルゲル、デキストラン硫酸が
    化学的に結合されたポリサッカライドゲルまたは架橋ポ
    リサッカライド硫酸エステルゲルに接触せしめてＬＰＦ
    −ＨＡを吸着させた後、吸着したＬＰＦ−ＨＡをゲルか
    ら溶出して得る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
21. （２１）ＬＰＦ−ＨＡの吸着処理をｐＨ５．０〜９．０
    、温度０〜３０℃、比電導度０．５〜５．０ｍｓ／ｃｍ
    の条件下に行なう特許請求の範囲第（２０）項記載の方
    法。
22. （２２）ＬＰＦ−ＨＡを吸着したゲルからの溶出を、比
    電導度５．０〜１００．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液を用いて
    行なう特許請求の範囲第（２０）項または第（２１）項
    記載の方法。
23. （２３）該溶出処理に先だって、吸着ゲルを、比電導度
    ０．５〜５．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液で洗浄する特許請求
    の範囲第（２２）項記載の方法。
24. （２４）セルロース硫酸エステルゲルが結晶セルロース
    または結晶領域および非結晶領域からなるセルロースの
    硫酸エステルゲルである特許請求の範囲第（２０）項記
    載の方法。
25. （２５）デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサ
    ッカライドゲル誘導体が、デキストラン硫酸−アガロー
    スゲル、デキストラン硫酸−デキストランゲルおよびデ
    キストラン硫酸−セルロースゲルから選ばれる特許請求
    の範囲第（２０）項の方法。
26. （２６）架橋ポリサッカライド硫酸エステルが架橋セル
    ロース硫酸エステル、架橋アガロース硫酸エステルおよ
    び架橋デキストラン硫酸エステルから選ばれる１種であ
    る特許請求の範囲第（２０）項記載の方法。
27. （２７）架橋セルロース硫酸エステルがエピクロルヒド
    リン架橋セルロース硫酸エステルである特許請求の範囲
    第（２６）項記載の方法。
28. （２８）架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒド
    リン架橋アガロース硫酸エステルである特許請求の範囲
    第（２６）項記載の方法。
29. （２９）架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロルヒ
    ドリン架橋デキストラン硫酸エステルである特許請求の
    範囲第（２６）項記載の方法。
30. （３０）精製Ｆ−ＨＡまたはＬＰＦ−ＨＡのトキソイド
    を通常のホルマリン処理にて得る特許請求の範囲第（１
    ）項記載の方法。
31. （３１）Ｆ−ＨＡ含有液をセルロース硫酸エステルのゲ
    ル、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサッカ
    ライドゲル誘導体または架橋ポリサッカライド硫酸エス
    テルゲルに接触せしめてＦ−ＨＡを吸着させた後、吸着
    したＦ−ＨＡをゲルから溶出して得られた精製Ｆ−ＨＡ
    またはそのトキソイドと、高純度精製ＬＰＦ−ＨＡのト
    キソイドとを混合することにより得られた混合物にさら
    にジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドとを添
    加することからなる百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合
    ワクチン製造方法。