JPS6141548B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は粗製ウロキナーゼから、抗原抗体反応
の原理を用いて夾雑蛋白を除去することにより、
きわめて温和な条件で高純度かつ高収率にウロキ
ナーゼを取得する方法に関する。

ウロキナーゼは、血清中に含まれるプラスミノ
ーゲンを活性化してフイブリン溶解能を有するプ
ラスミンを生成させるため、各種血栓症の治療に
有効であるばかりか制癌剤と併用することにより
その効果を増強させることが知られている。

従来、ウロキナーゼの精製には、各種吸着剤に
接触させた後、吸着したウロキナーゼを溶離する
方法や陰イオン又は陽イオン交換樹脂クロマトグ
ラフイー及びゲル濾過法、あるいは各種リガンド
を用いるアフイニテイークロマトグラフイー等の
組み合わせが行なわれている。一般にウロキナー
ゼは不安定な酵素であるため、精製工程はできる
だけ短時間で、しかも、生体に存在するそのまま
の形で分離するためには、温和な条件で精製する
ことが必要とされる。

本発明者らは、ウロキナーゼの分離精製法につ
いて鋭意研究した結果、粗製ウロキナーゼ中の夾
雑蛋白を抗原抗体反応によつて除去することによ
りウロキナーゼを簡単かつ、高収率、高純度に精
製する方法を確立した。

抗原抗体反応を用いるウロキナーゼの精製法に
ついては、すでに特開昭51−9782号において抗ウ
ロキナーゼ抗体を固定化した免疫吸着体が用いら
れている。しかしながら、一般に抗原抗体の結合
は強固であり、吸着したウロキナーゼを解離回収
するには過酷な条件が必要となり酵素の失活を伴
う可能性が高い。

本発明は、生理的条件のPH６〜８でウロキナー
ゼを精製できる利点を有する。

粗製ウロキナーゼ中の夾雑蛋白に対する抗体は
粗製ウロキナーゼよりウロキナーゼを除去した
後、適当な動物に免疫注射を行なつて作製する
か、あるいは、粗製ウロキナーゼを直接、免疫注
射し、産生した抗体から抗ウロキナーゼ抗体を除
去することにより得られるが、動物の抗体産生能
を最大限に生かすには前者の方が好ましい。ま
た、前者の場合に、粗製ウロキナーゼよりウロキ
ナーゼを除去する方法としては抗ウロキナーゼ抗
体を固定化した免疫吸着体が用いられる。

得られた抗夾雑蛋白抗体を用いての粗製ウロキ
ナーゼ中の夾雑蛋白の除去は、簡単には抗夾雑蛋
白抗体自体を粗製ウロキナーゼ溶液に混合し、生
じた抗原抗体反応の沈殿物を遠心分離で除去する
ことにより達成される。

効果的な方法としては、抗夾雑蛋白を水不溶性
担体（例えば、セルロース誘導体、デキストラン
重合体、寒天ゲル、ポリアクリルアミドゲル）に
固定化した免疫吸着体によるアフイニテイークロ
マトグラフイーが好ましい。すなわち、この免疫
吸着体と粗製ウロキナーゼ溶液を混合し、充分の
抗原抗体反応を行なわせた後、水溶液と水不溶性
担体を分離する。これによつて、ウロキナーゼは
水溶液中に残存し、夾雑蛋白は水不溶性担体に吸
着される。

本発明によれば、著るしく比活性の高いウロキ
ナーゼを回収率80％以上で得ることが出来、しか
も、ウロキナーゼの低分子比はほとんど見られな
い。

夾雑蛋白の吸着した免疫吸着体は、PH２〜３又
はPH10〜11の緩衝液、あるいはジオキサン、エチ
レングライコール等の極性を下げる試薬、尿素及
び塩酸グアニジン等の変性剤等により洗浄後、中
性付近の緩衝液で平衡化し、次の使用に備える。

次に実施例をあげて本発明を説明する。

実施例 １ 公知の方法により純粋に精製したウロキナーゼ
１mg／２ml生理食塩水とFreunds complete
adjuvant（Difco）２mlを充分混合し、乳剤を作
製した。これを3.0Kgの白色家兎の筋肉及び皮下
に５部位以上注射し、同様の乳剤を10日後及び20
日後に再注射して感作した。最後の感作後、10日
目に精製したウロキナーゼ約200μｇ／0.25ml生
理食塩水を静注した。13日後、採血、血清分離
し、抗ウロキナーゼ血清を得た。

この抗血清100mlに飽和硫安溶液を40％飽和に
なるよう加え、沈殿物を遠心分離で集め、0.85％
NaClを含む0.1Mリン酸緩衝液PH7.4、110mlに溶
解した。

さらに、この溶液に飽和硫安水溶液を33％飽和
になるよう添加し、沈殿物を遠心分離で集め、
0.15Mトリス−リン酸緩衝液PH8.3、68mlに溶解
し、同緩衝液に対して透析した。

透析後、同一緩衝液で平衡化したDEAE−セル
ロース、50ml（カラム２×15cm）に添加し、非吸
着区分を集め、1100mgのγ−グロブリン画分を抗
ウロキナーゼ抗体として得た。この抗ウロキナー
ゼ抗体は、オクタロニー法〔O.Ouchterlony、
Acta.Path.Microbiol.Scand.、32、231（1953）．〕
により、粗製ウロキナーゼ（比活性27000U/mg蛋
白）及び単一に精製したウロキナーゼのいづれに
ついても、ただ一本の沈降線を形成した。

抗UK抗体を固定化した免疫吸着体は、
Cuatrecasasらの方法｛P.Cuatrecasas、J.Biol.
Chem.、245、3059、（1970）｝に従い作製した。
すなわち、100mlのSepharose 4Bを約1000mlの精
製水で洗浄した後、精製水100mlに懸濁した。こ
の懸濁液に、粉砕したBrCN、30ｇを撹拌下に加
え、８分間、4NNaOHにてPH11、温度20℃に保
ち、その後、直ちにゲルを0.1M炭酸ソーダ緩衝
液PH９で洗浄する。次にゲルを、氷水中にセツト
した抗ウロキナーゼ抗体1000mgを含む70mlの同緩
衝液に投入し、24時間カツプリング反応を行つ
た。

反応終了後、0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩
衝液PH８〔以下「緩衝液（）」と略称する〕で
充分洗浄し、抗ウロキナーゼ抗体−Sepharose
4Bを得た。この免疫吸着体100mlと100mlの粗製
ウロキナーゼ溶液（比活性27000U/mg蛋白、1.1
×10⁶単位）を４℃で24時間反応させ、非吸着の
夾雑蛋白を32mg得た。

この夾雑蛋白に対する抗血清を上述の抗ウロキ
ナーゼ血清の場合と同様にして作製した。ただ
し、使用した抗原蛋白量は、ウロキナーゼの場合
の５倍量用いた。得られた抗夾雑蛋白血清の100
mlは、抗ウロキナーゼ血清と全く同法にて、硫安
塩析、DEAE−セルロースにて精製し、さらに緩
衝液（）で平衡化した15mlのウロキナーゼ−
Sepharose 4B（単一に精製したウロキナーゼ、
８mgをCuatrecasasの方法で15mlのSepharose 4B
に固定したもの）と４℃で24時間反応させ、非吸
着画分を抗夾雑蛋白抗体として1000mg蛋白を得
た。

得られた抗体は、オクタロニー法にてウロキナ
ーゼと沈降線を形成せず、夾雑蛋白と多数の沈降
線を形成した。

抗夾雑蛋白抗体200mgをCuatrecasasの方法に
従い、30mlのSepharose 4Bに固定化して免疫吸
着体を作製した。

この免疫吸着体を緩衝液（）で平衡化後、そ
の15mlに粗製ウロキナーゼ、1.2×10⁵単位（夾雑
蛋白の分離に使つたものと同一試料）を４mlの緩
衝液（）に溶解して添加し４℃で24時間反応さ
せたのち、カラムに充填し100mlの緩衝液（）
で洗浄した。この洗浄液に含まれるウロキナーゼ
の比活性は、81000U/mg蛋白、回収率は90％であ
つた。

夾雑蛋白の吸着した免疫吸着体は、0.17Mグリ
シン−塩酸緩衝液PH2.3の100mlで洗浄後、10％ジ
オキサンを含む緩衝液（）で洗浄し、再度緩衝
液（）で平衡化して次の使用に備えた。

実施例 ２ 実施例１で得た抗夾雑蛋白抗体−Sepharose
4Bを緩衝液（）で平衡化し、その30ml対して
粗製ウロキナーゼ、2.5×10⁵単位（夾雑蛋白の分
離に用たものと同一試料、）を８mlの緩衝液
（）に溶解して添加し、４℃で37時間反応させ
たのち、カラムに充填し、200mlの緩衝液（）
で洗浄した。ウロキナーゼの比活性は85000U/mg
蛋白、回収率93％であつた。この洗浄液を限外濾
過で濃縮後、0.3MNaClを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.0の溶出液でSephadex Ｇ−100によるゲル濾
過を行なつた。

溶出したウロキナーゼは分子量約54000の高分
子ウロキナーゼであり、低分子ウロキナーゼは、
ほとんど見られなかつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 粗製ウロキナーゼ溶液からその中の夾雑蛋白
   を、その夾雑蛋白の免疫抗体又はその免疫抗体を
   固定化した不溶性担体と抗原抗体反応させて、除
   去することを特徴とするウロキナーゼの精製法。