JPS6167483A - 制限酵素Ａａｔ２の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアセトバクター・アセティ（Ａｃｅｔｏ−ｂａ
ｃｔｏｒ　ａｃｅｔｉ　）　（ＩＦ０３２８１　）の生
産する制限酵素ＡａｔＩＩの精製法に関するものである
。制限酵素は今日、約９１種類が発見され、種々のＤＮ
Ａの塩基配列の決定、遺伝子組換え体の作成等、近年極
めて活発な研究開発が行なわ几でいる遺伝子操作技術に
おいて、不可欠の手段を提供している。

本発明において記載さ几るＡａｔＩＩもかような制限酵
素の１種であり、高分子ＤＮＡの塩基配列中Ｇ　Ａ　Ｃ
Ｇ　Ｔ’Ｃを認識切断する特異的な酵素であり、塩基配
列の決定、組換え体作成等に有用である、（従来技術と
の関係） 従来制限酵素の精製は、制限酵素生産菌を適当な培養条
件下に培養し、得られた菌体を破砕した後、破砕抽出液
より、除核酸法、塩析法、ゲル口過法、イオン交換クロ
マトグラフィー法等の種々の方法の組合せにより実施さ
れ、満足のいく品質の標品が得られることが明らかにさ
れている。

このような制限酵素の精製法については「遺伝子操作実
験法」（高木東歌編著、講談社サイエンティフィック出
版）Ｐ１４〜２３、及び、月刊雑誌「ニュークレイツク
争アシッズ・リサーチ（Ｎｕ−ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　）、「ジャーナル・オブ拳モレキ
ュラー・バイオロジーＪ　（Ｊ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇ３’　）等多数の文献に記載されている。

これら文献による記載では、例えば上記の「遺伝子操作
実験法」では菌体破砕後の抽出液にポリエチレンイミン
を添加して除核酸全行ない、つづイテ硫安による塩析・
透析後、ホスホセルロース、ヘハリンアガロース、ＤＥ
ＡＥセルロース、ヒドロキシルアパタイト、バイオレッ
クス−７０等のカラムクロマトグラフィーにより夾雑物
質を除去する方法によジ多くの制限酵素の精製が行ない
うろことが示されている。然るに本発明者等は、制限酵
素ＡａｔＩＩを精製するに当ジ、制限酵素（Ａａｔ■）
の発見が記載されている雑誌、ニュークレイツク　アシ
ッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅ
ａｒ−ｃｈ　）第１０巻１９号（１９８２）Ｐ５７４７
〜５７５２に記載されている精製法に従って、ＡａｔＩ
Ｉの精製を試みたが、満足のいく精製品を得ることがで
きなかった。また他種制限酵素と同様に、従来法に従っ
て各種クロマトグラフィーの組合せ、除核酸、塩析等を
試みたが、混在する夾雑タンパクのうち、特に同じく本
菌によって生産される制限酵素の１種であるＡａｔｌタ
ンパクの除去が困難であり、精製工程を繰返しても、Ａ
ａｔＩ［の純度を上昇させることができないばかりか、
収率も低下し、満足のいく品質のＡａｔＩＩ標品を調製
することが困難であるという問題に直面した。

一方、共存する他種制限酵素のＡａｔ　Ｉ及びフォスフ
ァターゼ、非特異的ＤＮａｓｅ　ｓエキソヌクレアーゼ
等のＡａｔＩＩｔ＝産業上に使用する上において品質上
問題となる夾雑タンパクｉｊ、Ａａｔ　Ｉｆタンパクを
含まない状態で調製することが容易であることがＡａｔ
ＩＩ精製中に明らかとなっ念。

そこで本発明者等は逆にこれら品質上夾雑して問題とな
るタンパクを含み、かつＡａｔＩＩを含まないタンパク
液を調製し、これ全適当な温血動物に注射・免疫し、そ
几ら動物の面前中に生成した抗体？用いて、抗原−抗体
反応により夾雑タンパク全除去することによりＡａｔＩ
Ｉを精製することができるのではないかと考え、鋭意研
究を行なった結果、夾雑タンパクに対する抗体を適当な
不溶性相体に固定化し、該抗体−担体固定化物と、未精
製ＡａｔＴＩ溶液を適当な条件下に接触させると、夾雑
するＡａｔ　Ｉ　、フォスファターゼ、非特異的ＤＮａ
−３ｅ、エキソヌクレアーゼ等の夾雑タンパクが選択的
に抗体−担体固定化物に吸着不溶化さｎ１溶液中には、
これら夾雑物を含まないＡａｔ　Ｕが得られ、品質上７
ｒ！１４足のい＜　Ａａｔ　［［標品が精製されること
を見出し、本発明全完成するに至った。

（発明の目的） 本発明は制限酵３　Ａａｔ　Ｉｆ　ｆ　Ａａｔ　ＩＩ生
産菌体より抽出して得られる未精製ＡａｔＩＩ溶液から
効率よく、高純度に精製することを目的とするものであ
る。

すなわち、制限酵素を前項記載の産業上の利用目的で使
用するためには、最低限次の４つの条件を満足する必要
がある。

（１）他種の制限酵素を含まない。

（２）　　７寸スファターゼ全含ま々い。

（３）非特異的ＤＮａｓｅを含まない。

（４）　　３’ま友は／および５′−エキソヌクレアー
ゼを含１ない。

然るにＡａｔ　ＩＩ生産菌は、同時に、他種制限酵素で
あるＡａｔＩのみならず、フォスファターゼ、非４？　
ｉ４　的ＤＮａｓｅ　、エキソヌクレアーゼ等の夾雑タ
ンパクを菌体内に生産含有する。従って、ＡａｔｌＩｅ
前記目的に使用するためには、こ几ら夾雑タンパクを除
去することが不可欠であり、本発明は、これら夾雑タン
パクの効率的除去により、高純度のＡａｔ　Ｕ精製標品
を得ること全目的とするものである０ （発明の構成） 本発明（−ｒアセトバクター・アセティ（Ａｃｅｔｏｂ
ａ−ｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　）　（ＩＦ０３２８１　）
の生産する制限酵素Ａａｔ　Ｉｆの精製法に関し、アセ
トバク４−・アセティ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａｃ
ｅｔｉ　）　（ＩＦＯ３２８１）の菌体全破砕して得ら
れる菌体内蛋白成分から、制限酵素ＡａｔＩＩ以外の菌
体内蛋白成分を得、該成分に対する抗体ヲ調製し、該抗
体全不溶性担体に固冗化後、該抗体固定化不溶性担体に
末梢製制限酵素Ａａｔ　ＩＩ含含有溶液指接触せ、未精
製制限酵素Ａａｔ■才有浴液中に含１７′Ｌる制限酵素
ＡａｔＩＩ以外の蛋白成分金該抗体に結合不溶化するこ
とにより、制限酵素Ａａｔ［Ｉを精製すること全特徴と
する制限酵素ＡａｔＩＩの精製法である。

更に詳しくは、該微生物全適当な栄養培地中で培養し、
得ら几た菌体より菌体内タンパク成分全抽出し、該抽出
物からＡａｔＩＩｆｆｉ梢製するに際し、該抽出物中に
Ａａｔ　ＩＩと混在するＡａｔＩ［以外のタンパク成分
、特にＡａｔｌｓホスファターゼ、非特異的ＤＮａｓｅ
　％　エキソヌクレアーゼ等の夾雑タンパクに対する抗
体Ｋｌ製し、該抗体を適当な不溶性担体に結合固だ化後
、該固定化抗体と未精製ＡａｔＩ［含有溶液ｒ接触させ
ることにより、ＡａｔＩｌ米以外の菌体内タンパク成分
葡該固定化抗体に結合不溶化させ、ＡａｔＩＩｋ溶液中
に得る。

本発明Ｃ（おいて使用１几るＡａｔＩＩ生産閑及びＡａ
ｔＩＩ以外の菌体内タンパク成分生産菌と＋ｙ＝４はア
セトバクター・アセティ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ａ
ｃｅｔｉ　）（ＩＦＯ３２８１）である。この菌体は、
適当な寒天培地上で培養さｆしたコミニーの１白金耳全
適当な栄養培地中に接種し、生育に好−ましい温度（３
０℃ｆ＋１Ｔ後）の下に適当な時間、培養（振とう培養
、通気攪拌培養等）し之後、遠心分離等の方法を用いて
集菌、調製式几る。

また本発明において用いら几るＡａｔＩＩ以外の菌体内
タンパクとは、上記調製の菌体全適当な緩衝液中で破砕
して、破砕残渣全遠心分離して得らｎる菌体抽出液より
副製さｎるものでＡａｔ　Ｕ　ｋ含１ス、逆にＡａｔｌ
、フォスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、非特異的Ｄ
Ｎａｓｅ　％エキソヌクレアーゼのｌＮ１ｆｃ−は２種
以上を含むものならばどのようなものでも良い。しかし
ながら、菌体の破砕抽出物中には、実１層にはその菌体
が生育していくために必要な多くの高分子、低分子物質
が混在しているので、それらの成分物質を可能な限り除
去しｔ４ｒンパク成分、すなわち、Ａａｔｌｘ　エキソ
ヌクレアーゼ、フォスファターゼ、非特異的ＤＮａｓｅ
　（７）１種′−１之は２種以上の含有率の高いものを
用いることが望ましい。

このようなＡａｔ　［１以外の菌体内タンパク成分の調
製法について１例を示せば以下の通りである。

すなわち、適当な培地中で培養した本発明の菌体１００
？ｉ、１０　ｍＭ　ＭｇＣ１、，７ｍＭ２−メルカプト
エタノールを含有する２０ｆｆｉＭ）リス−ＨＣＩ（Ｐ
Ｈ７，５）の緩衝液に懸濁し、低温下（水冷下）、３Ａ
で５〜１０分間超音波破砕した後、１００００ｘ２で１
時間遠心分、５”准して得られる上清に硫安粉末を添加
し、４０〜５０条飽和度で沈澱する沈殿を回収し、２ｔ
ｒＬＭメルカプトエタノール、５％クリセリン含有の１
０　ｍＭＫＰＯ，（ＰＩ−１７，５）の緩衝液（緩衝液
の）に溶解し、透析ｌ−た後、ＡａｔｌＩを完全に吸着
しく９％る能力を有する適当７ｘサイズのホスホセルロ
ースカラム（ベッド答量約ＩＬが必要）にアプライした
後、ＫＣＩ　＋ｆ１％Ｆ’；ｃｏｒｎ１ｙＩから１００
０ｆｆ！Ｍ−１で上昇てせてクロマトグラフィーを行な
うことによって調製てれる。

すなわち、このホスホセルロースカラムクロマトグラフ
ィーにおいて、先ずアプライした液の成分のうち、ホス
ホセルロースに吸着することなく通過した両分を回収す
ればエキソヌクレアーゼ及び非特異的ＤＮａｓｅが濃縮
さｉｔて得られ、浴出画分のうち、ＫＣＩ濃度１００　
ｒｎＭ〜３００　ｍＭの両分全回収すれば、Ａ＋１Ｌｔ
Ｉ及びホスファターゼ含有率の高い溶液ケ得ることが可
能である。

このようにして調製されたＡａｔ　Ｕ金倉ブない溶液は
その１−ｊまたけ濃縮されて、あるいは必要ならば更に
適当なりロマトグラフィーの組合せによって濃縮またげ
純度を上昇さ亡て、本発明のＡａｔ■タンパク以外の菌
体内タンパク成分として用いらｔ’ｔあ。

次に、前記Ａａｔ　Ｉｆ以外の菌体内タンパクに対する
抗体の五、、￥製法に関しては、該４ンバク濃度が０．
５〜１０　’９／　ｍｅ！　（好−！ｅ　Ｌ＜　ｉｔｌ
　〜３ｖｑ／ａｔ、　）になるように生理食塩水（０，
９％ＮａＣｌ　−１０ｍＭ　Ｔ’ｒ　ｉ　ｓ　・）ＩＣ
１（ＰＩ（７，５）　）にて希釈溶解後、ウサギ、ウマ
、ウシ、モルモット等の抗体産生能を有する温血動物に
注射し、適当な期ｆＨＩ飼育後該動物より血清全採取し
該血清全その１１あるいは含有抗体濃度を高めるために
塩析、クロマトグラフィー等の手段によＶ濃縮または精
製することにより調製されるもので、公知の方法が有効
である。

本発明においては、更に、上記において調製場′ｎた抗
体は、不溶付押体に固定化さｎ、るが、本発明において
使用てれる抗体結合担体及び、固定化法としては、公知
担体及び公知の方法が使用可能である。担体としては、
アフィゲル−１０、アフィゲル−１５、シアンブロマイ
ドセファロース等が用いられ、公知の方法に準じて使用
すればよい。

次に本発明において使用される未精製Ａａｔ　ＩＩタン
パク溶液としては、Ａａｔ　ＩＩ生産菌体から前記の方
法で破砕抽出した狛田液をその１亨用いても良いが、Ａ
ａｔ　Ｕ含イず率が低く、また、夾雑する成分片いるこ
とが望ましい。すな−Ｉ−・ち・本発明に用いらｒる未
ＬＭ　’１２　Ａａ　ｔ　■タンパク液としては、菌体
破砕沿より塩析、除核酸、イオンクロマトグラフィー、
ゲル読過等の方法の１種または２種以上を組合わせて、
調製されるＡａｔＩＩ含有率の高い未Ｎ製Ａａｔ■タン
パク液であジ、１例を上げ几ば、前記のＡａｔ　Ｉｆ　
ｆ含まない菌体内タンパク液のＡ製において示したホス
ホセルロースクロマトグラフィーにおいてＫＣＩで溶出
されるＡａｔ　Ｕ含有画分１ｆｃは、該両分を更に適当
なりロマトグラフィーの１種ｌ之は２１以上を用いて部
分精製式ｎた未精製Ａａｔ■タンパク液である。

次に、上記によ？）調製された未＋’ｌｌ製ＡａｔＩＩ
タンパク液を前記の不溶性抗体固定化担体と接触させる
方法としては、ＡａｔＩＩの制限酵素活性を失なうこと
なく効率的に未精製Ａａｔ　ＩＩタンパク液中にあって
抗体と結合し得る成分を吸着きせ得るものならはどのよ
うな方法でも用いられる。一般的には抗体固定化担体と
未精製ＡａｔＩＩタンパク液を０〜５℃で混合、攪拌す
ることによって接触させる方法と抗体固定化担体全適当
な大きさのカラムに充填した後、低温下（２℃〜５℃）
に該カラムに未精製ＡａｔＩＩタンパク液をアプライし
、カラム全通発明の目的全達成するためにより効率的で
ある。

（発明の効果） 本発明はＡａｔＩＩ梢＋Ｕｔ高度に行ない得るものであ
るが、本発明の精製では少なくとも制限酵素として遺伝
子操作に使用４几る場合に問題となる非特異的ＤＮａｓ
ｅ　％　エキソヌクレアーゼ、フォスファターゼ、Ａａ
ｔＩタンパク及びそれらの活性をほとんど官有しないＡ
ａｔ　Ｕ全調製することが可能である○ すなわち本発明の方法による効果を従来のクロマトグラ
フィーの組合せによって精製した場合と比較すると第１
表の通りとなり％　Ａａｔ　ＩＩの純度の点でも、工程
の短縮による経済性の点でも極めて効果的であることが
明らかである。

以下余白 （実施例） 本発明を実施例により更に詳しく説明する。

実施例Ｉ ＣＡｌ　　ｍ体の調製 アセトバクター・アセティ−（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ａｃｅｔｉ　）　Ｉ　ＩＦ’０３２８１　）株の１白金
耳をポリペプトン２％、酵母エキス１．５％、グリセリ
ン１．５％、麦芽エキス０．１％、ＫＨ，Ｐｏ、　０．
１％、Ｋ、ＨＰｏ、　０．５チ、ポテトデキストロース
０．１％、Ｍｇ５Ｏ１・７Ｈ８０ピ ０．０２５％全含有する栄養培地（Ｇ’Ｈ７，２）に接
種し、３０℃で２０時間、好気的条件下に培養し、これ
全シードとした。次に、同上の組成の培地を２００を発
酵槽に１４０を仕込み、前記シードを１％濃度で接種し
通気、攪拌条件下に３０℃で２０時間培養した後、連続
遠心分離機を用いて集菌し、生菌体約１９００Ｆ　（湿
重）を得た。

〔Ａ〕で得た菌体１００　？　ｆ　１０　ｍＭ　ＭｇＣ
１，，２０ｍＭトリス舎ＨＣＩ　（ＰＨ７，５１７ｍＭ
メリカブトエタンール含−胃緩価液４００　ｍｌに懸濁
しｔ後、３Ａで１０分間超音波処理して菌体全破砕した
。この破砕液’６ｉｏｏｏｏｏｘ　ｙで９０分間超遠心
分離した後、上清液を得た。

Ｂｕｆｆｅｒ■：　１（ｌｔＭＫＰＯ，（ＰＨ７，５）
、２ｆｆＬＭメルカプトエタノール、５％グリセロー ル含有緩衝液。

次に本上清液に硫安粉末全水冷下添加溶解し、硫安飽和
度で４０％〜５０％で沈殿する両分を遠心分離回収した
。この回収沈殿ｆ　Ｂｕｆｆｅｒ■の１０〇−に溶解し
、透析チューブに入れて１００倍量のＢｕｆｆｅｒ■に
対して１夜透析した、透析後チユーブ内容物を遠心除濁
し、上清を得た。続いて、Ｂｕｆｆｅｒ■で平衡化した
ホスホセルロースカラム（ベッド容量５００ｍ）に上記
で得た上清をアプライした。

アプライ後、カラムに吸着されない画分全カラム流出液
から回収しく回収液を回収−■とする）た後、Ｂｕｆｆ
ｅｒ■２ｔでカラムを洗浄した。洗浄終了後ＫＣＩ　Ｏ
ｍＭ　〜１０００ｆｆ！Ｍ’！でのＫＣＩ　９度上昇法
によりグラジェント溶出を行なった。

溶出した両分は各フラクシ目ンについて＾−ＤＮＡ全基
質として酵素活性ヲ」す定した。

、　全反応液（ａ：　：　５０μを 反応時間　：１時間 反応温度　：３７℃ 上記測定においてＡａｔ　Ｉ活性金示すフラクションを
回収し、こｎ１回収−■とじた−また、Ａａｔ■活性金
示すフラクション全回収し、こｎｆ回収−■とじた。上
記で得た回収−■、回収−■はそ几ぞｎＡａｔＩＩ以外
の菌体内タンパク成分として、次の抗体調製用に供した
。

前述で得た回収−■及び回収−■をポリエチレングリコ
ール＃６０００’ｉ用いて乙１縮し、０．９％・ＮａＣ
１−１０＋ｎＭφＴｒｉｓ・ＨＣｌ　＋　ＰＨ７，５）
の緩衝液に対して透析した後、同じ緩衝液でタンパク濃
度２．５■／２−に調製した後、等量のコンプリートフ
ロインドアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ　Ａｄｊｕ　−ｖａｎｔ　：　ＣＦＡ　Ｄｔｆｃ
ｏ社製品）に懸濁し、該懸濁液’ｔ２羽の家兎の各背部
皮肉１０ケ所に分割して注射した。さらに初回注射より
２週および４週後に同様の操作全繰返し、最後の注射よ
り１０日後に耳静脈および心臓よジ全採血して抗血清を
得た。

こうして得らｎた抗血清量は、液量的１０５−で抗体価
（タイター：　ｔｉｔｅｒ　）はｌｏｇ＊８　（＝　３
　）であった。尚、ｔｉｔｅｒの測定はリングテス）（
Ｒｉｎｇｔｅｓｔ　）法により行なっ之〇 この血清は一８０℃に保存する一方、そのうちの５０Ｗ
Ｉｔｉ分取し、水冷下硫安粉末を攪拌しながら飽和＆３
５％’Ｊで添加溶解し、完全溶解後更に１０分間攪拌後
、遠心分離し沈殿を回収した。この沈殿を２０　ｍｔの
Ｂｕｆｆｅｒ■に溶解し、透析チューブに入れて、１ｔ
のＢｕｆｆｅｒ［有］に対して１５時間透析し友。透析
後チユーブ内容物をと９出し遠心分離して不溶性物質を
除去し、得られた上清’１Ｂｕ−ｆｆｅｒ■で５０ｍ／
とじ部分精製抗体液とした。

■〕　抗体カラムの調製 抗体結合用担体として「アフィゲル１ｏ」（バイオラン
ド社製品）の懸濁液５ｏ−をとり、これに〔Ｃ〕でイ：
ｔｆｒ：、部分情調抗体液５０ｍ１混合し、低温下（４
℃）に１昼夜ゆるやかに攪拌しながら「アフィゲル１０
」への抗体の結合を行なった○続いて「抗体結合−アフ
ィゲルＩＯＪをρ２．０ｍＸ２０口のガラス製カラムに
充填しくベッド各量約５０ｙｄ　）　、充ｆｉＮ後１０
　ｑ　／　ｍｅのウシ血清アルブミン（Ｂｕｆｆｅｒ■
に溶解）俗腹５０’ｍｌｋカラムにアプライし、通過さ
せ、更にその後４Ｍの塩化ナトリウム含有のＢｕｆｆｅ
ｒ■１００ｄ’ｉアプライしてカラム全洗浄した後、更
に２００−のＢｕｆｆｅｒ■全アプライしてカラムを洗
浄畳平衡化した。

〔Ｅ〕　　未精製Ａａｔ　ＩＩ言有溶液がらのＡｄｊｕ
の精製ＣＤＩで調製したカラムに、低温下（４℃）に〔
Ｂ〕で回収したＡａｔＩＩ含有画分（回収−■）の溶液
（２００ｍ）全アゲライし、１０ｒｎｊ／時間の流速で
カラムを通過させ、通過液全プール回収した。

得られた回収液は続いて透析チューブに入れた後、ポリ
エチレングリコール（＃６０００　）Ｔｈ用いて、チュ
ーブ内液量が約２０　ｍｅになるまで脱水濃縮した後、
ｌｔのＢｕｆｆｅｒ■に対して１５時間透析した。

透析後、チューブ内容物をとり出し、ＡａｔＩＩ活性及
び夾雑酵素活性（）オスファターゼ、非特異的ＤＮａｓ
ｅｓ−’−キソヌクレアーゼ、Ａａｔ　Ｉ活性）を測定
した。その結果は第２表に示す通りであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アセトバクター・アセテイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
   ｒａｃｅｔｉ）（ＩＦＯ３２８１）の菌体を破砕して得
   られる菌体内タンパク成分から、制限酵素ＡａｔII以外
   の菌体内タンパク成分を得、該成分に対する抗体を調整
   し、該抗体を不溶性担体に固定化後、該抗体固定化不溶
   性担体と未精製制限酵素ＡａｔII含有溶液とを接触させ
   、未精製制限酵素ＡａｔII含有溶液中に含まれる制限酵
   素ＡａｔII以外のタンパク成分を該抗体に結合不溶化す
   ることにより、制限酵素ＡａｔIIを精製することを特徴
   とする制限酵素ＡａｔIIの精製法。 ２）制限酵素ＡａｔII以外の菌体内タンパク成分がＡａ
   ｔ I を含む菌体内タンパク成分であることを特徴とす
   る特許請求範囲第１項記載の制限酵素ＡａｔIIの精製法
   。 ３）制限酵素ＡａｔII以外の菌体内タンパク成分が、フ
   ォスファターゼを含む菌体内タンパク成分であることを
   特徴とする特許請求範囲第１項記載の制限酵素ＡａｔI
   Iの精製法。 ４）制限酵素ＡａｔII以外の菌体内タンパク成分が非特
   異的ＤＮａｓｅを含む菌体内タンパク成分であることを
   特徴とする特許請求第１項記載の制限酵素ＡａｔIIの精
   製法。