JPH0279995A - 酵素的精製方法 - Google Patents
酵素的精製方法Info
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- JPH0279995A JPH0279995A JP1139348A JP13934889A JPH0279995A JP H0279995 A JPH0279995 A JP H0279995A JP 1139348 A JP1139348 A JP 1139348A JP 13934889 A JP13934889 A JP 13934889A JP H0279995 A JPH0279995 A JP H0279995A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に生物学的流体中の生成物の精製に関し
、特に必要のない物質を、この望しくない物質の除去を
容易にする大きさ範囲まで選択的に分解する酵素の使用
に関する。
、特に必要のない物質を、この望しくない物質の除去を
容易にする大きさ範囲まで選択的に分解する酵素の使用
に関する。
要するに、本発明によれば望しくない汚染物を、続く分
離工程においてより容易に除去しうる大きさ又は電荷範
囲まで選択的に分解するために、制御された酵素的処理
を使用する。この処理は、望しくない残存核酸を精製す
べき生成物と十分に異なる分子の大きさ又は電荷範囲ま
で分解し、斯くしてこの相違を続く精製工程（例えば沈
殿、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロ
マトグラフィー）で利用するというヌクレアーゼ酵素処
理を用いることにより、γＤＮＡ又はモノクローナル抗
体培養生成物を精製するのに特に有用である。
離工程においてより容易に除去しうる大きさ又は電荷範
囲まで選択的に分解するために、制御された酵素的処理
を使用する。この処理は、望しくない残存核酸を精製す
べき生成物と十分に異なる分子の大きさ又は電荷範囲ま
で分解し、斯くしてこの相違を続く精製工程（例えば沈
殿、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロ
マトグラフィー）で利用するというヌクレアーゼ酵素処
理を用いることにより、γＤＮＡ又はモノクローナル抗
体培養生成物を精製するのに特に有用である。
酵素は生活細胞によって作られ且つ非常に特異的な化学
反応を加速しうる比較的複雑な蛋白質物質である。時に
生物学的触媒として言及される酵素は、長い問いろいろ
な工業的、医学的及び実験室的用途に使用されてきた。
反応を加速しうる比較的複雑な蛋白質物質である。時に
生物学的触媒として言及される酵素は、長い問いろいろ
な工業的、医学的及び実験室的用途に使用されてきた。
例えば蛋白質分解酵素は蛋白質性の汚れの除去を補助す
るために洗たく用洗剤に使用されており、血栓分解酵素
は血の塊りを溶解するのに使用されており、また加水分
解酵素は免疫分析に有用な呈色標識として使用されてい
る。酵素は溶液（遊離形）中で及びイオン又は共有結合
により担体又はマトリックスとして公知の支持材料に捕
捉又は結合させた所謂固定化形で種々の用途に使用され
る。
るために洗たく用洗剤に使用されており、血栓分解酵素
は血の塊りを溶解するのに使用されており、また加水分
解酵素は免疫分析に有用な呈色標識として使用されてい
る。酵素は溶液（遊離形）中で及びイオン又は共有結合
により担体又はマトリックスとして公知の支持材料に捕
捉又は結合させた所謂固定化形で種々の用途に使用され
る。
酵素の使用はその使用条件を制御することによって最適
化しうろことは良く知られている（例えば酵素は典型的
には最適のｐＨ範囲を有する）。
化しうろことは良く知られている（例えば酵素は典型的
には最適のｐＨ範囲を有する）。
また非常に特異的な酵素例えばＤＮＡ−ＡＳＥＳは特に
そのような酵素が正確な点で核酸を正確に切断するため
に使用される生物工学的用途に用いるために市販されて
いるということも良く知られている。しかしながら今日
まで、本発明者は精製工程、特に細胞培養で表わされる
治療学的物質の精製を容易にするｔ；めにそのような酵
素を制御された具合いに使用することに気づかなかった
。驚くことに今回、核酸が汚染物質として存在しうる種
々の細胞培養において生成する種々の物質、特に生物学
的に活性な物質の精製を容易にするために、酵素が比較
的簡単な方法で使用しうろことが発見された。本方法の
詳細を以下に記述する。
そのような酵素が正確な点で核酸を正確に切断するため
に使用される生物工学的用途に用いるために市販されて
いるということも良く知られている。しかしながら今日
まで、本発明者は精製工程、特に細胞培養で表わされる
治療学的物質の精製を容易にするｔ；めにそのような酵
素を制御された具合いに使用することに気づかなかった
。驚くことに今回、核酸が汚染物質として存在しうる種
々の細胞培養において生成する種々の物質、特に生物学
的に活性な物質の精製を容易にするために、酵素が比較
的簡単な方法で使用しうろことが発見された。本方法の
詳細を以下に記述する。
今回型しくない物質を、精製すべき所望の治療学的物質
の大きさ又は電荷範囲と十分に異なる大きさ又は電荷範
囲まで分解するために制御された酵素培養を用いること
により、望しくない物質を細胞培養流体（ｆｌｕｉｄ）
から除去するのを容易にしうろことが発見された。この
酵素的に行なわれる大きさの減少は、少くともある程度
まで、分子の大きさ又は電荷の相違に基づく技術（例え
ばサイズ排除クロマトグラフィー、沈殿工程、調節され
た細孔寸法の膜又は繊維の使用など）を用いる増強され
た分離を容易にするために利用することができる。１つ
の好適な具体例において、ヌクレアーゼ（ＤＮＡ−アー
ゼ又はＲＮＡ−アーゼ）として公知の酵素は、望しくな
い核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び細胞培養流体中に現わ
れる所望の物質（例えばモノクローナル抗体又は組換え
ＤＮＡ技術を用いて発現される生物学的に活性な蛋白質
）の双方を含有する細胞培養流体と共に培養される。
の大きさ又は電荷範囲と十分に異なる大きさ又は電荷範
囲まで分解するために制御された酵素培養を用いること
により、望しくない物質を細胞培養流体（ｆｌｕｉｄ）
から除去するのを容易にしうろことが発見された。この
酵素的に行なわれる大きさの減少は、少くともある程度
まで、分子の大きさ又は電荷の相違に基づく技術（例え
ばサイズ排除クロマトグラフィー、沈殿工程、調節され
た細孔寸法の膜又は繊維の使用など）を用いる増強され
た分離を容易にするために利用することができる。１つ
の好適な具体例において、ヌクレアーゼ（ＤＮＡ−アー
ゼ又はＲＮＡ−アーゼ）として公知の酵素は、望しくな
い核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び細胞培養流体中に現わ
れる所望の物質（例えばモノクローナル抗体又は組換え
ＤＮＡ技術を用いて発現される生物学的に活性な蛋白質
）の双方を含有する細胞培養流体と共に培養される。
培養は制御された条件下に行なわれ、好ましくは所望の
物質に悪影響を及ぼさずに（例えばその物質の生物学的
活性に悪影響を及ぼさずに）酵素活性を高めるのに十分
な量で洗剤を含む。この条件は、続く所望の物質（例え
ば生物学的に活性な治療学的物質）の分離又は精製にお
いて利用することのできる大きさ又は電荷範囲まで核酸
を分解することを保証するのに十分でなければならない
。
物質に悪影響を及ぼさずに（例えばその物質の生物学的
活性に悪影響を及ぼさずに）酵素活性を高めるのに十分
な量で洗剤を含む。この条件は、続く所望の物質（例え
ば生物学的に活性な治療学的物質）の分離又は精製にお
いて利用することのできる大きさ又は電荷範囲まで核酸
を分解することを保証するのに十分でなければならない
。
この方法は望しくない物質の最、初の大きさ及び電荷が
精製すべき所望の物質のそれと（例えば±５０％以内で
）同様である場合に特に有用である。
精製すべき所望の物質のそれと（例えば±５０％以内で
）同様である場合に特に有用である。
これらの場合、統〈１つ又はそれ以上の分離工程におい
て利用しうる有意な差異（例えば少くとも５０％の平均
の分子の大きさ又は電荷の減少）をもたらす具合に望し
くない物質を選択的に変化させ或いは分解するために、
与えられた酵素系の公知の特異性が利用される。本方法
を下記の実施例において例示する。
て利用しうる有意な差異（例えば少くとも５０％の平均
の分子の大きさ又は電荷の減少）をもたらす具合に望し
くない物質を選択的に変化させ或いは分解するために、
与えられた酵素系の公知の特異性が利用される。本方法
を下記の実施例において例示する。
第１図はＤＮＡアーゼ予備処理を行う及び行わない場合
の沈殿及びサイズ排除クロマトグラフィーによるＤＮＡ
の減少を比較する。
の沈殿及びサイズ排除クロマトグラフィーによるＤＮＡ
の減少を比較する。
第２図はＤＮＡアーゼ予備処理を行なう及び行わない場
合の沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーによるＤＮ
Ａの減少を比較する。
合の沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーによるＤＮ
Ａの減少を比較する。
第３図はＤＮＡアーゼ予備処理を行なう及び行わない場
合の沈殿、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィ
ーによるＤＮＡの減少を比較する。
合の沈殿、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィ
ーによるＤＮＡの減少を比較する。
第４図はＤＮＡアーゼを用いる及び用いない場合の沈殿
、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによる
ＤＮＡの減少を比較する。
、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによる
ＤＮＡの減少を比較する。
議論の目的で次の定義を仮定する。分子の大きさは一般
的な実施において用いる如き分子量（ＭＷ）と同等と考
えられる。分子量及び立体配置は分子の大きさを決定す
る。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はゲル濾
過と同等であると考えられる。電荷及び電荷密度はイオ
ン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）に適用した場合と
同等であると考えられる。
的な実施において用いる如き分子量（ＭＷ）と同等と考
えられる。分子量及び立体配置は分子の大きさを決定す
る。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）はゲル濾
過と同等であると考えられる。電荷及び電荷密度はイオ
ン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）に適用した場合と
同等であると考えられる。
本方法は、３０．０００〜３５，０００の分子量範囲を
有するＤＮＡアーゼを、遊離形（溶液）で或いは好まし
くは酵素の生成物からの除去を容易にし且つ酵素の消費
を減少させるための固定化形で用いることにより例示さ
れる。固定化は同業者には良く知られた技術によって達
成することができる。ＤＮＡ−アーゼＩ及び■が使用さ
れる。ＤＮＡ−アーゼ■は５′ホスホジエステル・バン
ドを開裂するエンドヌクレアーゼである。ＤＮＡ−アー
ゼ■は３′ホスホジエステル・バンドを開裂するエンド
ヌクレアーゼである。
有するＤＮＡアーゼを、遊離形（溶液）で或いは好まし
くは酵素の生成物からの除去を容易にし且つ酵素の消費
を減少させるための固定化形で用いることにより例示さ
れる。固定化は同業者には良く知られた技術によって達
成することができる。ＤＮＡ−アーゼＩ及び■が使用さ
れる。ＤＮＡ−アーゼ■は５′ホスホジエステル・バン
ドを開裂するエンドヌクレアーゼである。ＤＮＡ−アー
ゼ■は３′ホスホジエステル・バンドを開裂するエンド
ヌクレアーゼである。
ＤＮＡの消化と続く除去を示すために種々の実験を行な
った。時間、温度、ｐＨ，イオン種、及び成分の濃度の
因子を検討した。最適な活性の条件を定義するためにデ
ータをそろえた。第１の実験はＤＮＡ−アーゼ種（Ｉ、
ＩＩ；遊離、固定化）に露呈した時に分離されるＤＮＡ
の分解の動力学を定義する。続く実験はいくつかの組織
培養流体中のＤＮＡの除去を示す。
った。時間、温度、ｐＨ，イオン種、及び成分の濃度の
因子を検討した。最適な活性の条件を定義するためにデ
ータをそろえた。第１の実験はＤＮＡ−アーゼ種（Ｉ、
ＩＩ；遊離、固定化）に露呈した時に分離されるＤＮＡ
の分解の動力学を定義する。続く実験はいくつかの組織
培養流体中のＤＮＡの除去を示す。
精製されるＤＮＡはフェノール抽出によっテ単離され且
つＳＥＣ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＦＰ
ＬＣスペローズ６、炭水化物マトリックス１で分別され
て、約１億ダルトンの高分子量のＤＮＡを与える。分解
はＳＥＣ及び５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって監視した
。組織培養流体中のＤＮＡはジフェニルアミン。蛍光染
料ヘシュト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３２５８ ［アナル・
バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１４７．２
８９（１９８５）］ 、Ｐ３２標識のニック（ｎｉｃｋ
）翻訳ＤＮＡ及びＲＮＡグローブ・ドツト・プロット交
雑［モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ラボラトリ−・マニュアル（Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ）、１９８２年１によって分析した。
つＳＥＣ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＦＰ
ＬＣスペローズ６、炭水化物マトリックス１で分別され
て、約１億ダルトンの高分子量のＤＮＡを与える。分解
はＳＥＣ及び５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって監視した
。組織培養流体中のＤＮＡはジフェニルアミン。蛍光染
料ヘシュト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３２５８ ［アナル・
バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１４７．２
８９（１９８５）］ 、Ｐ３２標識のニック（ｎｉｃｋ
）翻訳ＤＮＡ及びＲＮＡグローブ・ドツト・プロット交
雑［モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ラボラトリ−・マニュアル（Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ）、１９８２年１によって分析した。
精製したＤＮＡを用いる予備実験
遊離の及び固定化されたＤＮＡ−アーゼによるＤＮＡの
分解 ａ） 遊離の酵素 Ｍ ａ Ｓ Ｏ４０−Ｉ Ｍ 、 Ｎ ａ ＣＱ Ｏ
−１５Ｍ １ｐＨ７，４のＤＮＡ−アーゼＩ ［牛の膵
臓、シグマ（Ｓ ｉ ｇｍａ）Ｄ−４７６３、Ｄ−５０
２５］ ０゜００１ｇの緩衝剤中に精製したＤＮＡ５ｍ
１２を溶解した。ＤＮＡ−アーゼ■（シグマＤ−４１３
８）を添加した。４時間の混合後に試料を５ＥＣで分析
したところ、これは高分子量のピークを示さなかった。
分解 ａ） 遊離の酵素 Ｍ ａ Ｓ Ｏ４０−Ｉ Ｍ 、 Ｎ ａ ＣＱ Ｏ
−１５Ｍ １ｐＨ７，４のＤＮＡ−アーゼＩ ［牛の膵
臓、シグマ（Ｓ ｉ ｇｍａ）Ｄ−４７６３、Ｄ−５０
２５］ ０゜００１ｇの緩衝剤中に精製したＤＮＡ５ｍ
１２を溶解した。ＤＮＡ−アーゼ■（シグマＤ−４１３
８）を添加した。４時間の混合後に試料を５ＥＣで分析
したところ、これは高分子量のピークを示さなかった。
約３０，０００ダルトンＭ、Ｗ、でのピークが見出され
た。ＤＮＡアーゼＩ及び■はそれぞれ３０．０００及び
３２．０００ダルトンのＭ、Ｗ、を有した。
た。ＤＮＡアーゼＩ及び■はそれぞれ３０．０００及び
３２．０００ダルトンのＭ、Ｗ、を有した。
ｂ） 固定化酵素
ＮａＨＣＯｓ・Ｏ，１Ｍ、ｐＨ８−０，４℃の条件で結
合させることによりＤＮＡ−アーゼＩをアガロース・マ
トリックス［ビオ−ラッド・アフイジエル（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ａｆｆｉｇｅｌ）１０．５ 、６ ｍｇ／ゲル
３ ｍＱ］上に固定化した。精製したＤＮＡを通過させ
たところ、ＤＮＡ−アーゼＩのカラム中を通過させるご
とに一定の分子量の低下が見られた。
合させることによりＤＮＡ−アーゼＩをアガロース・マ
トリックス［ビオ−ラッド・アフイジエル（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ａｆｆｉｇｅｌ）１０．５ 、６ ｍｇ／ゲル
３ ｍＱ］上に固定化した。精製したＤＮＡを通過させ
たところ、ＤＮＡ−アーゼＩのカラム中を通過させるご
とに一定の分子量の低下が見られた。
約１億ダルトンにおける１つのピークは、１４回カラム
を通過させると約３０，０００ダルトンＭ、Ｗ、の１つ
のピークまで分解した。この分解断片及び酵素は凡そ同
一の分子量を有するようであった。
を通過させると約３０，０００ダルトンＭ、Ｗ、の１つ
のピークまで分解した。この分解断片及び酵素は凡そ同
一の分子量を有するようであった。
ＤＮＡ−アーゼ■も別にアガロース・マトリックスに固
定化させた。
定化させた。
Ｃ） 洗剤の存在を検討した。非イオン性洗剤のツウイ
ーン（Ｔｗｅ ｅ ｎ）８０は酵素の活性を増加させる
ことがわかった。ツウイーン８０は（２）−ソルビタン
モノー９−オクタデセノエートポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）誘導体に対する商品名である。０．５％
のツウイーン８０は０．１％のツウイーンと比べて５０
％だけ分解を増加させた。
ーン（Ｔｗｅ ｅ ｎ）８０は酵素の活性を増加させる
ことがわかった。ツウイーン８０は（２）−ソルビタン
モノー９−オクタデセノエートポリ（オキシ−１，２−
エタンジイル）誘導体に対する商品名である。０．５％
のツウイーン８０は０．１％のツウイーンと比べて５０
％だけ分解を増加させた。
ｄ） 酵素活性は、溶液をｐＨ４以下に又は温度を６０
°Ｃ以上に露呈することによって減することができた。
°Ｃ以上に露呈することによって減することができた。
濾過した組織培養（ＴＣ）流体を用いる実験実施例１
遊離の酵素を用いるＤＮＡの分解、続く沈殿緑膿菌に特
異的なりラスＭの治療学的モノクロナール抗体（分子量
８００，０００）を含む組織培養流体を、遺伝系（Ｇｅ
ｎｅｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）６Ｆｌｌ Ｅ４として
表示される細胞種で製造した。この細胞種はエプスタイ
ン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）−バール（Ｂａｒｒ）ウィルスで
変形されて、人間及びウィルスのＤＮＡを産生ずる人間
のバイブリド？（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）である。６Ｆ１
１細胞種はＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に預託され、利用番号ＣＲ
Ｌ８５６２をもつ。組織培養媒１体は人間の血清アルブ
ミン及び他の蛋白質の補充されたハナ・バイオロジクス
（Ｈａｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）複合媒体の混合物
であった。
異的なりラスＭの治療学的モノクロナール抗体（分子量
８００，０００）を含む組織培養流体を、遺伝系（Ｇｅ
ｎｅｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）６Ｆｌｌ Ｅ４として
表示される細胞種で製造した。この細胞種はエプスタイ
ン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）−バール（Ｂａｒｒ）ウィルスで
変形されて、人間及びウィルスのＤＮＡを産生ずる人間
のバイブリド？（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）である。６Ｆ１
１細胞種はＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に預託され、利用番号ＣＲ
Ｌ８５６２をもつ。組織培養媒１体は人間の血清アルブ
ミン及び他の蛋白質の補充されたハナ・バイオロジクス
（Ｈａｎａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）複合媒体の混合物
であった。
回分式実験ｉ：オイテ、Ｍｇ Ｓ Ｏ４０、ＯＩ Ｍ
。
。
ＮａＣＱ Ｏ，１５Ｍ、Ｎａ０ＡｃＯ，１ＭＳ ｐＨ
７，４，のＴＣ流体をＤＮＡ−アーゼＩ ０．０２ｍ
ｇ／ｍ（ｌと混合した。試料を経時的に採取し、ｌＯ％
ＰＥＧ、ｐＨ７で沈殿させた。このＰＥＧでの沈殿はＤ
ＮＡの減少値を示し、ＤＮＡ６μｇ／ Ｉ ｇＭｍｇを
もたらした。このＤＮＡは最早や沈殿しなくなる（小分
子量成分として溶液中にとどまる）まで分解した。酵素
処理を含まない同一の方法で精製した対照物はＤＮＡを
約１００μｇ／ Ｉ ｇ Ｍｍｇで含有した。
７，４，のＴＣ流体をＤＮＡ−アーゼＩ ０．０２ｍ
ｇ／ｍ（ｌと混合した。試料を経時的に採取し、ｌＯ％
ＰＥＧ、ｐＨ７で沈殿させた。このＰＥＧでの沈殿はＤ
ＮＡの減少値を示し、ＤＮＡ６μｇ／ Ｉ ｇＭｍｇを
もたらした。このＤＮＡは最早や沈殿しなくなる（小分
子量成分として溶液中にとどまる）まで分解した。酵素
処理を含まない同一の方法で精製した対照物はＤＮＡを
約１００μｇ／ Ｉ ｇ Ｍｍｇで含有した。
第１表
時間 沈殿中のＤＮＡ（μｇ／蛋白質ｍｇ）（時）
酵素処理あり 酵素処理なしＭ ｇ Ｓ
Ｏａ Ｏ−０１Ｍを含むＤＮＡ−アーゼＩＯ、ｌ ｍ
ｇ／ｍＱを用いてこの実験を繰返した。同様の結果が観
察されたが、動力学はより迅速であつＩこ 。
酵素処理あり 酵素処理なしＭ ｇ Ｓ
Ｏａ Ｏ−０１Ｍを含むＤＮＡ−アーゼＩＯ、ｌ ｍ
ｇ／ｍＱを用いてこの実験を繰返した。同様の結果が観
察されたが、動力学はより迅速であつＩこ 。
実施例２
遊離の酵素を用いるＤＮＡの分解、続く沈殿及びサイズ
排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
実施例１に記述した実験を更に延長した。
ＤＮＡ−アーゼと共に２４時間培養し且つ沈殿させたＴ
Ｃ流体（ＤＮＡ６μｇ／蛋白質ｍｇ）を、５ＥＣ（ＦＰ
ＬＣ−スペローズ６、炭水化物マトリックス）上で分割
した。ＤＮＡは生成物ピーク中に検出できなかった（＜
ｌｐｇ／生成物ｍｇ）。酵素処理を行なわない同一の方
法で精製した対照物はＳＥＣピークにおいてＤＮＡ約０
．１−１μｇ／ Ｉ ｇＭｍｇを含有した。
Ｃ流体（ＤＮＡ６μｇ／蛋白質ｍｇ）を、５ＥＣ（ＦＰ
ＬＣ−スペローズ６、炭水化物マトリックス）上で分割
した。ＤＮＡは生成物ピーク中に検出できなかった（＜
ｌｐｇ／生成物ｍｇ）。酵素処理を行なわない同一の方
法で精製した対照物はＳＥＣピークにおいてＤＮＡ約０
．１−１μｇ／ Ｉ ｇＭｍｇを含有した。
実施例３
遊離の酵素を用いるＤＮＡの分解、続く沈殿及びイオン
交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）。
交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）。
実施例１に記述した実験を更に延長した。
ＤＮＡ−アーゼと共に２４時間培養し且つ沈殿させたＴ
Ｃ流体（ＤＮＡ６μｇ／蛋白質ｍｇ）を、イオン交換ク
ロマトグラフィーで分画した。この樹脂はトリス０．０
５Ｍ、ＮａＣＱ ０．０５Ｍ。
Ｃ流体（ＤＮＡ６μｇ／蛋白質ｍｇ）を、イオン交換ク
ロマトグラフィーで分画した。この樹脂はトリス０．０
５Ｍ、ＮａＣＱ ０．０５Ｍ。
ｐＨ８の緩衝液中のファーマシアＤＥＡＥセファローズ
であった。生成物の流出はトリス０．０５Ｍ％ＮａＣ（
１０，１８Ｍ、ｐＨ８を用いて行なった。
であった。生成物の流出はトリス０．０５Ｍ％ＮａＣ（
１０，１８Ｍ、ｐＨ８を用いて行なった。
生成物のピークにはＤＮＡが検出されなかった。
酵素処理を行なわない同一の方法で精製した対照物は１
ＥＣｔ：” −’）においＣＤＮＡ約０．０１−０゜ｌ
ｐｇ／ Ｉ ｇＭｍｇを含有しｔ；。
ＥＣｔ：” −’）においＣＤＮＡ約０．０１−０゜ｌ
ｐｇ／ Ｉ ｇＭｍｇを含有しｔ；。
実施例４
固定化酵素を用いるＤＮＡの分解、続く沈殿クラスＭの
モノクローナル抗体を含む組織培養流体を実施例１に記
述したように製造した。ＤＮＡ−アーゼＩを予備実験に
記述したように固定化した。
モノクローナル抗体を含む組織培養流体を実施例１に記
述したように製造した。ＤＮＡ−アーゼＩを予備実験に
記述したように固定化した。
Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ ０ 、０１ Ｍを含むＴＣ流体を
ＮＤＡ−アーゼ・マトリックスのカラム中を繰返し通過
させ、ｌＯ％ＰＥＧで沈殿させた。この沈殿はＤＮＡ０
．４μｇ／蛋白質ｍｇを含有した。酵素処理を含まない
同一の方法で精製した対照物はＤＮＡ約１００ μｇ／
Ｉ ｇＭｍｇを含んだ。
ＮＤＡ−アーゼ・マトリックスのカラム中を繰返し通過
させ、ｌＯ％ＰＥＧで沈殿させた。この沈殿はＤＮＡ０
．４μｇ／蛋白質ｍｇを含有した。酵素処理を含まない
同一の方法で精製した対照物はＤＮＡ約１００ μｇ／
Ｉ ｇＭｍｇを含んだ。
実施例５
ＤＮＡの固定化酵素での分解、続く沈殿及びサイズ排除
クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。
実施例４の実験を更に延長した。
ＤＮＡ−アーゼのカラム中を通過させ且つ沈殿せしめた
ＴＣ流体をＳＥＣで分画した。ＤＮＡは生成物ピーク中
に検出できなかった。酵素処理を含まない同一の方法に
よって精製した対照物はＳＥＣピークにおいてＤＮＡ約
０．１−１μｇ／生成物ｍｇを含んだ。
ＴＣ流体をＳＥＣで分画した。ＤＮＡは生成物ピーク中
に検出できなかった。酵素処理を含まない同一の方法に
よって精製した対照物はＳＥＣピークにおいてＤＮＡ約
０．１−１μｇ／生成物ｍｇを含んだ。
上記開示を与えられれば、同業者には本方法の多くの変
化が想起されると思われる。従って、上記実施例は例示
として見なすべきであり、またここに開示した本発明の
範囲は特許請求の範囲によってだけ限定されるべきであ
るということが意図される。
化が想起されると思われる。従って、上記実施例は例示
として見なすべきであり、またここに開示した本発明の
範囲は特許請求の範囲によってだけ限定されるべきであ
るということが意図される。
本発明の特徴及び態様は以下の通りである：１、所望の
治療学的物質と望しくない物質の双方を含有する流体に
おいて、所望の治療学的物質から望しくない物質を分離
する際に、 （ａ） 望しくない物質を、所望の物質の分子の大き
さ又は電荷と有意に異なる分子の大きさ又は電荷範囲ま
で分解しうる酵素と流体を接触させ、そして （ｂ） 工程（ａ）から得られた分解生成物の分子の
大きさ又は電荷範囲における相違に基づいて望しくない
物質を所望の物質から分離することのできる少くとも１
つの分離工程に流体を供する、工程を含んでなる該分離
法。
治療学的物質と望しくない物質の双方を含有する流体に
おいて、所望の治療学的物質から望しくない物質を分離
する際に、 （ａ） 望しくない物質を、所望の物質の分子の大き
さ又は電荷と有意に異なる分子の大きさ又は電荷範囲ま
で分解しうる酵素と流体を接触させ、そして （ｂ） 工程（ａ）から得られた分解生成物の分子の
大きさ又は電荷範囲における相違に基づいて望しくない
物質を所望の物質から分離することのできる少くとも１
つの分離工程に流体を供する、工程を含んでなる該分離
法。
２、流体が細胞培養流体であり、望しくない物質が核酸
であり、そして酵素がこの核酸を分解しうるヌクレアー
ゼである上記ｌの方法。
であり、そして酵素がこの核酸を分解しうるヌクレアー
ゼである上記ｌの方法。
３、酵素が固定化されている上記ｌの方法。
４、工程（ｂ）の分離が沈殿工程を含んでなる上記ｌの
方法。
方法。
５、工程（ｂ）の分離がサイズ排除クロマトグラフィー
の使用を含んでなる上記ｌの方法。
の使用を含んでなる上記ｌの方法。
６、工程（ｂ）の分離がイオン交換クロマトグラフィー
の使用を含んでなる上記ｌの方法。
の使用を含んでなる上記ｌの方法。
７、精製すべき所望の治療学的物質及び望しくない核酸
を含有する細胞培養流体からの核酸の除去を高める際に
、所望の物質の分子の大きさと有意に異なる分子の大き
さの範囲まで核酸を分離することを保証するのに十分な
条件下に流体をヌクレアーゼ酵素と接触させ、そして流
体を、流体から核酸を除去するのに十分な少くとも１つ
の分離工程に供する、工程を含んでなる該核酸の除去を
高める方法。
を含有する細胞培養流体からの核酸の除去を高める際に
、所望の物質の分子の大きさと有意に異なる分子の大き
さの範囲まで核酸を分離することを保証するのに十分な
条件下に流体をヌクレアーゼ酵素と接触させ、そして流
体を、流体から核酸を除去するのに十分な少くとも１つ
の分離工程に供する、工程を含んでなる該核酸の除去を
高める方法。
８、核酸がＤＮＡであり、そして酵素が、ＤＮＡをその
元の平均分子量の約５０％以下まで分解しうるＤＮＡ−
アーゼである上記７の方法。
元の平均分子量の約５０％以下まで分解しうるＤＮＡ−
アーゼである上記７の方法。
９、酵素が固定化され、そして酵素活性を洗剤の存在下
に増大せしめる上記７の方法。
に増大せしめる上記７の方法。
１０、工程（ｂ）の分離工程が沈殿、イオン交換又はサ
イズ排除クロマトグラフィーの使用を含んでなる上記７
の方法。
イズ排除クロマトグラフィーの使用を含んでなる上記７
の方法。
１１、細胞によって発現される生物学的に活性な治療学
的物質を含有する細胞培養流体からＤＮＡを除去する際
に、 （ａ） 流体中のＤＮＡの少くともいくつかを分解す
るのに十分な条件下に、流体を、ＤＮＡ−アーゼを存在
させて培養し：そして （ｂ） この流体を、工程（ａ）で生成した分解生成
物の少くともいくつかを除去しうる分離工程に供する、 工程を含んでなるＤＮＡを除去する方法。
的物質を含有する細胞培養流体からＤＮＡを除去する際
に、 （ａ） 流体中のＤＮＡの少くともいくつかを分解す
るのに十分な条件下に、流体を、ＤＮＡ−アーゼを存在
させて培養し：そして （ｂ） この流体を、工程（ａ）で生成した分解生成
物の少くともいくつかを除去しうる分離工程に供する、 工程を含んでなるＤＮＡを除去する方法。
１２、ＤＮＡ−アーゼが固定化されている上記１１の方
法。
法。
１３．ＤＮＡ−アーゼが炭水化物支持体材料上に固定化
されている上記１２の方法。
されている上記１２の方法。
１４、細胞培養流体がモノクローナル抗体又は組換えＤ
ＮＡ発現生成物を含む上記１１の方法。
ＮＡ発現生成物を含む上記１１の方法。
１５、ＤＮＡ含量を少くとも１０，０００倍減する上記
１１の方法。
１１の方法。
１６、ＤＮＡの元の分子量が細胞によって発現された物
質の分子量の５０％以内である上記１１の方法。
質の分子量の５０％以内である上記１１の方法。
１７、工程（ａ）の培養が酵素の活性を高めるのに十分
な量で洗剤を含む上記１１の方法。
な量で洗剤を含む上記１１の方法。
１８、洗剤が非イオン性である上記１７の方法。
１９、洗剤が（Ｚ）−ソルビタンモノ−９−オクタデセ
ノエートポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体
である上記１８の方法。
ノエートポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体
である上記１８の方法。
第１図はＤＮＡアーゼ予備処理を行う及び行わない場合
の沈殿及びサイズ排除クロマトグラフィーによるＤＮＡ
の減少を比較し、 第２図はＤＮＡアーゼ予備処理を行なう及び行わない場
合の沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーによるＤＮ
Ａの減少を比較し、 第３図はＤＮＡアーゼ予備処理を行なう及び行わない場
合の沈殿、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィ
ーによるＤＮＡの減少を比較し、そして 第４図はＤＮＡアーゼを用いる及び用いない場合の沈殿
、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによる
ＤＮＡの減少を比較する。
の沈殿及びサイズ排除クロマトグラフィーによるＤＮＡ
の減少を比較し、 第２図はＤＮＡアーゼ予備処理を行なう及び行わない場
合の沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーによるＤＮ
Ａの減少を比較し、 第３図はＤＮＡアーゼ予備処理を行なう及び行わない場
合の沈殿、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィ
ーによるＤＮＡの減少を比較し、そして 第４図はＤＮＡアーゼを用いる及び用いない場合の沈殿
、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーによる
ＤＮＡの減少を比較する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、所望の治療学的物質と望しくない物質の双方を含有
する流体において、所望の治療学的物質から望しくない
物質を分離する際に、 （ａ）望しくない物質を、所望の物質の分子の大きさ又
は電荷と有意に異なる分子の大きさ又は電荷範囲まで分
解しうる酵素と流体を接触させ、そして （ｂ）工程（ａ）から得られた分解生成物の分子の大き
さ又は電荷範囲における相違に基づいて望しくない物質
を所望の物質から分離することのできる少くとも１つの
分離工程に流体を供する、工程を含んでなる該分離法。 ２、精製すべき所望の治療学的物質及び望しくない核酸
を含有する細胞培養流体からの核酸の除去を高める際に
、所望の物質の分子の大きさと有意に異なる分子の大き
さの範囲まで核酸を分離することを保証するのに十分な
条件下に流体をヌクレアーゼ酵素と接触させ、そして流
体を、流体から核酸を除去するのに十分な少くとも１つ
の分離工程に供する、工程を含んでなる該核酸の除去を
高める方法。 ３、細胞によつて発現される生物学的に活性な治療学的
物質を含有する細胞培養流体からＤＮＡを除去する際に
、 （ａ）流体中のＤＮＡの少くともいくつかを分解するの
に十分な条件下に、流体を、ＤＮＡ−アーゼを存在させ
て培養し；そして （ｂ）この流体を、工程（ａ）で生成した分解生成物の
少くともいくつかを除去しうる分離工程に供する、 工程を含んでなるＤＮＡを除去する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/202,726 US5006472A (en) | 1988-06-03 | 1988-06-03 | Enzymatic purification process |
| US202726 | 1988-06-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0279995A true JPH0279995A (ja) | 1990-03-20 |
| JP2847755B2 JP2847755B2 (ja) | 1999-01-20 |
Family
ID=22751009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1139348A Expired - Lifetime JP2847755B2 (ja) | 1988-06-03 | 1989-06-02 | 酵素的精製方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5006472A (ja) |
| EP (1) | EP0370163B1 (ja) |
| JP (1) | JP2847755B2 (ja) |
| AT (1) | ATE175206T1 (ja) |
| CA (1) | CA1334948C (ja) |
| DE (1) | DE68928889T2 (ja) |
| ES (1) | ES2125217T3 (ja) |
| GR (1) | GR3029574T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|---|---|---|---|
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| DE3939771A1 (de) * | 1989-12-01 | 1991-06-06 | Behringwerke Ag | Verfahren zur biologischen inaktivierung von nukleinsaeuren |
| DE69714069T2 (de) | 1996-09-16 | 2003-04-03 | Novozymes As | Enzymatischer kohlenhydratabbau bei verfahren der proteinisolierung |
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| US20060270843A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods for isolation of nucleic acids |
| WO2013121228A1 (en) | 2012-02-17 | 2013-08-22 | Biotec Pharmacon Asa | Endonucleases |
| EP3353525B1 (en) * | 2016-02-29 | 2020-04-01 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Enzymatic sample purification |
| CN108369164B (zh) * | 2016-02-29 | 2021-06-15 | 惠普发展公司，有限责任合伙企业 | 酶促样品纯化 |
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| US3867255A (en) * | 1972-11-29 | 1975-02-18 | Anheuser Busch | Process of making yeast protein isolate having reduced nucleic acid content |
| FR2474828B1 (fr) * | 1980-02-01 | 1983-09-09 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de traitement d'une matiere premiere a base de caseine, contenant des phosphocaseinates de cations bivalents, produits obtenus et application |
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| GB8431653D0 (en) * | 1984-12-14 | 1985-01-30 | Shell Int Research | Filterability of microbial broth |
-
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- 1988-06-03 US US07/202,726 patent/US5006472A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-23 EP EP89109212A patent/EP0370163B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-23 ES ES89109212T patent/ES2125217T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-23 AT AT89109212T patent/ATE175206T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-23 DE DE68928889T patent/DE68928889T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 JP JP1139348A patent/JP2847755B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-02 CA CA000601567A patent/CA1334948C/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010174987A (ja) * | 2009-01-29 | 2010-08-12 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | 制振装置及び観覧車 |
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