JPH03501085A - 化学的プロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学的プロセス 本発明はビタミンに依存性血液凝固因子を含有した分画中におけるかかる因子の 精製又は豊富化のために改良された方法に関する。

ヒト又は動物起源の血液から得られる血漿はいくつかの有益な生理学的活性物質 、特に様々な血液凝固因子を含有しており、それらの一部はかかる物質の１以上 を欠く個体の治療用医薬として用いられる。血液凝固因子、即ちいわゆる血液凝 固カスケードの構成因子は下記様式で関連した不活性及び活性タンパク質分解酵 素及び修正タンパク質の群からなっている： Ｘｌ＋因子→Ｘｌｌ　ａ因子 ↓ ■因子−Ｘｌａ因子 ↓ ■因子＝ＩＸａ因子 Ｘ因子−−−−ｓ−Ｘ　Ｂ因子−−−−Ｘ因子↓−■因子 （プロトロンビン）■因子→Ｉｌａ因子（トロンビン）↓ フィブリノーゲンー−→フィブリン 付随文字“ａ“は酵素が活性形であることを意味する。

血液凝固因子の一般的カテゴリー内に属するとみなされる更に重要な血漿タンパ ク質としてはプロティンＣ及びプロティンＳがある。プロティンＣはタンパク質 分解酵素活性プロティンＣ（ＡＰＣ，ＰＣａ）の不活性チモーゲンである。上記 凝固因子とは異なり、ＡＰＣはこのように不活性である■因子及び■因子のタン パク質分解を介して機能する抗凝固効果を有している。プロティンＣの活性化は 双方とも凝固プロセスで機能するトロンビン及び内皮結合タンパク質のトロンボ モジュリンを要するフィードバックプロセスによるらしい。その際にＡＰＣの活 性は補因子として作用するらしいプロティンＳの存在によって高められる。

上記因子のいくつか、即ち■、■、■及びＸ因子更にプロティンＣ及びプロティ ンＳはビタミンに依存性であることが示された。活性及び不活柱形双方のこれら 因子（活性化■因子を除く）は末端γ−カルボキシグルタミン酸残基を有するが 、これはビタミンにで媒介される酵素プロセスによって導入される。加えて、プ ロティンＣ１プロテインＳ１Ｘ及びＸ因子は、但しプロトロンビン（■因子）を 除くが、修正されたアスパラギン酸残基、即ちβ−ヒドロキシアスパラギン酸残 基を有することが判明した。

このようにビタミンに依存性血液凝固因子とは、密接に類似した物理化学的性質 を有する関連酸性タンパク質群を表す。これら物質の酸性性質はそれらを一部と して単離することを既に可能としたが、但しそれらの構造的及び化学的類似性は 陰イオン交換クロマトグラフィーのような常法で個々のタンパク質を分離するこ とを困難にした。

プロトロンビン複合体の一部ではない■因子は別として、最も頻繁に投与される 血液凝固因子は■因子である。

伝統的には、■因子はプロトロンビン複合体のすべての因子■、■、■及びＸの 濃縮物として提供されるが、但し５■因子は時々■、■及びＸとは別に提供され る。

このような■因子濃縮物の注入後、静脈血栓症及び散在性向管内凝固（Ｄ　Ｉ　 Ｃ）に関していくつが報告されたケースがあった。これらの望ましくない応答は 、■因子と共に注入された高レベルの不必要な凝固因子及び／又は濃縮物中の望 ましくないトロンボゲン成分によって助長される高凝固状態のせいであろう。■ 因子の強度なかつ長期の投与で■因子のＬ〆ベベル正常よりも非常に高くしてし まい、■因子は等量で注入されて血漿中で長い半減時間を有する。インビトロ研 究又は動物モデルに基づく一部の仮説でも、諸因子の組合せが■因子単独よりも 高いトロンボゲン性であることを示唆している。当然ながら■因子の現投与量レ ベルは、■因子の過剰レベルを避ける必要性から一部制限されている。

更に■因子濃縮物による治療後、一部の血友病Ａ患者では非ウィルス性免疫抑制 の徴候を示す。■因子濃縮物による治療後の血友病Ｂ患者における同様の免疫抑 制からみても、双方のケースの応答が濃縮物中における望ましくない汚染物質の せいらしいことを示唆している。

凝固因子濃縮物が製造されるドナー血漿プールは非Ａ非Ｂ型肝炎の原因物質（お そらくウィルス）を含有しており、ウィルス（例えば、Ｂ型肝炎及びＨＩＶ）汚 染リスクを有すると仮定しなければならない。製品を安全に改善するためには、 濃縮物は殺ウイルス処理をうけねばならないが、これは汚染タンパク質の存在で 複雑化されるであろう。例えば、この殺ウイルス処理は不必要なタンパク質によ る干渉が最少に抑制される高度に精製された濃縮物で考えることが容易であろう 。

一般に、他の因子又は更には望ましくない生理学的効果を示すいかなる汚染物質 のレベルも同時に高めることなくヒト患者の特定凝固因子に代わる又はそれを補 充するように考えられた血液凝固因子を投与することが原則として好ましい。

このため上記問題の一部を緩和又は更に解決するためビタミンに依存性凝固因子 を少なくとも部分的に分離する改良法に関して必要性がある。ビタミンに依存性 血液凝固因子は金属キレートクロマトグラフィーで少なくとも部分的に互いに分 離されうろことがここに発見されたのである。

本発明によれば、ビタミンに依存性血液凝固因子を少なくとも１種のかかる因子 を含有した混合物から少なくとも部分的に分離する方法が提供され、その方法は 上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレートに吸着されしかる 後上記因子の１種に関して富む１以上の分画を得るため溶出されることで特徴付 けられる。

一般に、上記混合物は少なくとの２種のビタミンに依存性血液凝固因子を含有し ている。このため本発明では紹換えＤＮＡ技術を用いて微生物培養物から得られ る十分に機能化された凝固因子の精製及び豊富化を伴うが、凝固因子源は通常血 漿、特にヒト血漿である。

本発明に従い処理される因子の混合物は、最も普通には一部の血漿因子が既に除 去された血漿う〕画濃縮物である。

血漿から混合因子を得る場合、望ましい成分を含有した典型的初期分画としては 凍結沈澱上澄（上澄は■因子濃縮物の凍結沈澱後に残留する）、フラクションＩ 上澄及び様々なアフィニティ試薬、例えばヘパリンセファロース（Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ）で血漿の吸着後に得られる分画がある。

一般に、因子はプロトロンビン複合体濃縮物イ得るためジエチルアミノエチル（ ＤＥＡＥ）セルロース。

ＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）又はＤＥＡＥセファロースのよう な陰イオン交換樹脂への吸着によって更に濃縮されるであろう。

■因子製造用に最適の条件下でＤＥＡＥセルロースは■因子と結合しないが、高 能力イオン交換剤（例えば、ＤＥＡＥセファデックス及びＤＥＡＥセファロース 〕は容認された工業処理条件下で更に効率的に■因子と結合することに注目すべ きである。このためＤＥＡＥセファロースからのプロトロンビン複合体濃縮物は ■因子を含有していない。挙動上のこの差異に基づき主に■因子を含有した濃縮 物を得ることができるが、これは本発明による精製及び豊富化からでも効果的で ある。陰イオン交換樹脂濃縮物は本発明に従い有利に処理されるが、他の組合せ の因子であっても望ましい因子の濃度を高めるため有利に処理される。特に、本 発明に従い得られ２種のろの因子を含有【７た豊富化分画は更に豊富化させるた め第二の処理に付してもよい・ 現在の精製系はいくつかの本質的欠点を有している。

ヘパリン−セファ０−スは工業規模で用いられた場合に分離及び凝固因子活性に 乏しい。硫酸デキストランは非常に短いＮＡＰＴＴ　（後記参照）で■因子を生 成して臨床的使用で血栓症状を発現することがあり、しかも硫酸デキストランは 細胞毒性があって、このようなアフィニティマトリックスからの漏出で生成物を ひどく汚染することがある。本処理法はこれらすべての面に関してかかる精製系 以上の利点を有する。

何らかの効果は初期混合物を固定化された金属キレートでバッチ様式により処理 ししかる後最も容品に溶出する因子を除去するため単に洗浄することで得られる が、最も好ましい操作方式はカラムクロマ）・グラフィーである。このため因子 の混合物はカラムの最上部に適用され、分離された及び部分的に分離された因子 を含有した分画を得るため溶出液が通される。一方、初期混合物はカラムに担持 させる前固定化された金属キレートにバッチ様式で適用してもよい。

本発明のプロセスでの使用のためのキレート化多価金属は通常二価状態であり、 Ｃｕ２＋が特に好ましい。

固定化されたキレート化剤は多価金属をキレート化しうる基を有した慣用的主鎖 又は骨格支持体（例えば、セルロース、ポリスチレン、アクリルアミド、シリカ 、フッ化炭索類、架橋デキストラン又は架橋アガロースに基づく支持体）である 。このような基は周知であって、マーチル（Ｍａｒｔｅｌ　＋）及びカルビン（ Ｃａｌｖｉｎ）、金属キレート化合物の化学、プレンティス・ホール社（Ｐｒｃ ｎｔｉｃｃ　Ｈａｌｌ。

Ｉｎｃ、）　、ニューヨーク、１９５２年のようなテキストブックでみられる。

イミノニ酢酸基−Ｎ　（ＣＨＣ００Ｈ）　２が特に好まま しいキレート化基である。

キレート化基は通常キレート化基及び支持体間で有利には８〜１６の間の原子、 例えば約１２原子を有する場合により置換された炭化水素又は炭水化物鎖のよう な直鎖“スペーサー“基で支持体の主鎖又は骨格から隔たっている。このような スペーサー基は望ましい鎖長の二価試薬との反応で適切な基質中に導入される。

好ましい金属結合マトリックスは下記鎖： でセファロースに結合されたイミノニ酢酸基を有するファルマシア社（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　ＡＢ）市販ビーズ化６％アガロース製品のキレート化セファロース である。

キレート化支持体に対するタンパク質の結合性は下記の少なくとも４つの考慮事 項＝　（１）イオン強度（高イオン強度は見掛上非特異的結合を最小に抑制する ）；（２）担持されるサンプル及び平衡化金属キレートゲルの双方中における緩 衝イオンの存在：　（３）マトリックスの担持能（これは弱く結合するタンパク 質を犠牲にして更に強く結合するタンパク質で十分に飽和されうる有限量である 。このため具体的タンパク質に関するマトリックス能はそれが担持及び吸着接触 時間中に適用されるタンパク質混合物の組成及び濃度に依存している）；（４） 結合性及び溶出の双方、に依存しているが、ｐＨが認識されたエフェクターであ る。

比較的高いイオン強度下においてプロトロンビン（■因子）及びトロンビンのキ レートに対する結合性は低下するが、一方■、Ｘ因子及びプロティンＣの場合は 増加することが発見された。一般に、トロンビン形成の可能性を回避する上で他 の血液凝固因子の濃縮物中におけるプロトロンビンレベルを低下させることが望 ましいため、この発見は特に有用である。このため例えば０３４〜１、ＯＭ、好 ましくは０．４〜０．６Ｍ、最も好ましくは約０．５Ｍの塩化ナトリウム及び／ 又は等イオン強度の溶液を与える１窪以上の他の電解質を含存した比較的高イオ ン強度の水溶液に金属キレートを加えることが好ましい。

異なるビタミンに依存性凝固因子はキレート化ゲルとの結合性に関して異なるｐ Ｈ適性を有しており、したがって添加される緩衝液のｐＨの選定は１種以上のビ タミンに依存性凝固因子のキレート化ゲルに対してもう１つのかかる因子よりも 優先的な結合を促進させるための手段を更に提供することになる。このため例え ばＣυ２＋プライム化キレート化セファロースの場合、■、■、Ｘ因子の至適結 合は各々ｐＨ６，０〜７．Ｑ、ｐＨ７，０以上及びｐ）！６．５〜７．５で起き る。したがって例えばプロトロンビン以上のＸ因子のかかるゲルに対する示差的 な結合性を高めるためには、適用ｐａはｐＨ７，０以上であることが望ましい。

更に１種以上の他のビタミンに依存性凝固因子からプロトロンビンを除去するこ とが望まれる場合、他の血液凝固因子、例えばＸ因子に適したプロトロンビンの 低結合性は吸着接触時間及び担持量チャレンジの適切な選定によって促進される 。このためプロトロンビン複合体濃縮物から出発する場合Ｃｕ２＋プライム化キ レート化セフア０−スによる■因子からＸ因子の分離を最適化するためには、吸 着接触時間は有利には２０分間以上、更に好ましくは約４０分間以上であり、約 ２５０〜４５０Ｆ、ＥＸ；Ａｇ単位／ｍｆゲルのＸ因子担持が達せられるような 担持量チャレンジが望ましい。

カラムクロマトグラフィーが好ましい。因子の初期混合物はカラムの最上部に適 用されることが好ましいが、固定化されたキレートにバッチ様式で初期混合物を 担持させてもよい。洗浄後、高イオン強度の場合にはほとんど、残留因子はバッ チ溶出か又はクロマトグラフィー溶出用カラムにゲルを移すかのいずれかで分離 することができる。

担持は、存在するかもしれないプロトロンビン及びトロンビンを除去するため同 −又は同様のイオン強度及びｐｎの水溶液で直ちに洗浄することが望ましい。有 利には、酸性ｐＨ洗浄ステップがキレート化ゲルからインター−α−トリプシン インヒビターを除去するため更に行われる。このタンパク質は従来技術で製造さ れたＸ因子濃縮物の望ましくない主汚染物質として認識されており、一部の場合 には全タンパク質の３０％もの多くを占めている。しかしながら、インター−α −トリプシンインヒビターはゲルからＸ因子の明白な損失なしにＤＨ約４．５〜 ５．５でＣｕ２＋プライム化キレート化セフアロ−・スから溶出させることがで きることが見出された。最終製品中の電解質レベルを減少させるためには、例え ば１００〜２００ｍＭＮａＣ１に相当する低イオン強度で少洗浄操作ではタンパ ク質が固定された状態における追加洗浄ステップでウィルスを若干除去する。更 に固定化因子はこの段階で界面活性剤のような殺ウイルス剤により処理され、し かる後殺ウイルス剤は溶出ステップ前に更に洗浄することで除去される。金属キ レート物質は本発明による初期吸着前に殺ウイルス剤として用いられる界面活性 剤及び／又は溶媒の存在下で目的のタンパク質因子と容品に結合し、し、かも殺 ウイルス剤が洗浄で除去される場合又は更に殺ウイルス剤の界面活性剤洗浄が因 子の溶出前に適用される場合にこれらの因子を残留させることに注目すべきであ る。これはかかるタンパク質を吸着させるために用いられた多くの従来のアフィ ニティ力ラムと対照をなし、その場合には界面活性剤がタンパク質を溶出させて しまう。

ｎ因子の除去後にカラムに残留する凝固因子又は更にｎ因子の実質的不存在下で カラムに適用されるこのような因子は、得られる豊富分画から塩を除去する必要 性を緩和又は回避するために、望ましくは添加緩衝液よりも有意に低いイオン強 度下においてｐＨの変化及び／又はイミダゾール及びアミノ酸から選択される置 換剤の使用により溶出される。このような溶出に適した好ましいイオン強度は１ ００〜２００１の範囲内である。

望ましい血液凝固因子の溶出がｐＨ勾配に依存している場合、これは増加ｐＨ勾 配でも又は減少ｐ）１勾配でろっでもよいが、いずれの場合でもインター−α− トリプシンインヒビターはＸ因子に富む分画の回収前にキレート化剤から除去さ れることが望ましい。このため溶出に増加ｐＨ勾配適用の場合、出発ｐＨはイン ター−α−トリプシンインヒビターを除去させるためｐＨ約４．５〜５．５の低 さであってもよいが、但し通常望ましい血液凝固因子の溶出のためｐＨの実質的 な段階的増加をこれに続けることは明らかであろう。特に、例えばＸ因子及びＸ 因子に富む分画は例えば１００ｍＭＮａＣ１の比較的低イオン強度下、非アミノ 酸又はイミダゾール含有緩衝系の存在下でｐＨ約７．０からｐＨ約８８０までｐ Ｈを一スから溶出させることが望ましいことが発見された。

例えばプロトロンビン複合体濃縮物の同タイプのゲル血液凝固因子から溶出させ るため減少ｐＨ勾配を適用Ｔる場合、ｎ因子を除去するためｐＨ７，０以上で例 えば５００ｍ）ＩＮａＣｌの高イオン強度下ゲルの洗浄後、実質上インター−ａ −トリプシンを含有しないＸ因子及びＸ因子に富む分画の溶出がｐ　Ｈ約４．０ までの酸性ｐＨ範囲内で溶出緩衝液のｐ、　Ｈの段階的減少により例えば１．０ ０ｗＭＮａＣ１の比較的低イオン強度下で行われることが望ましい。この場合、 下記順序でタンノくり貿溶出が観察される：Ｘ因子／Ｖ因子（ｐＨ約５〜５．６ ）、インター−α−トリプシンインヒビター／プロティンＣ（ｐＨ約４．６）、 ＩＸ因子（ｐＨ約４．１）。

精製された又は豊富なｎ因子を製造することが望まれる場合、これはアミノ酸の 非存在下低イオン強度で金属キレート力ラムから溶出させることも好ましい。

置換剤が用いられる場合、溶出液中におけるイミダゾール又はアミノ酸（特に、 グリシン、メチオニン又はグルタミン酸）の濃度は５〜７０ｍＭの範囲内である ことが好ましい。このような溶出における使用に適したアミノ酸としては例えば アラニン、フェニルアラニン、バリン、リジン、グリシ〉・、メチオニン及びグ ルタミン酸がある。

最後に３つ挙げられたアミノ酸がこの目的にとって特に好ましい。

置換剤含有溶出液は好ましくは４〜９の範囲内、更に好ましくは６〜８、例えば 約７のｐＨに緩衝化される。

適切な緩衝系としてはトリスのようなアミノアルコール緩衝液及びクエン酸−リ ン酸緩衝液がある。トリスは低濃度の置換剤、即ちイミダゾール又はアミノ酸の 存在下ですべての因子を溶出させうろことがわかっている。

一般に、いずれの溶出系が用いられても、結合親和性を反映した溶出順序はＵ　 ／　Ｕ　ｎ因子、Ｘ因子、ＩＸ　／　ＩＸ　ｎ因子／プロティンＣのようである 。

一般に、溶出は溶出タンパク質比活性（純度及び／又は効力）が最大化されるよ うな方法で行われることが好ましい。一般に目的とする主因子、例えばＸ因子の 濃度は少なくとも３０１Ｕ／ｍｌであることが好ましい。

溶出後、溶液は凍結乾燥してもよい。ウィルス感染の不活性化のため凍結乾燥濃 縮物は例えば８０℃で加熱される。本発明者らは、本発明による精製濃縮物が実 質上かかる加熱に耐えて以前の濃縮物よりもかなり各因子の有意の活性化を回避 しうろことを発見した。

本発明の方法を用いて、初めて： （ａ）ｎ因子及びインター−α−トリプシンインヒビターを実質上歯まないＸ因 子； （ｂ）　ＩＪ、■及びＸ因子を実質上歯まないプロティンＣ；（ｃ）ＩＴ因子を 実質上歯まずかつ少なくとも１３１Ｕ／ａｇタンパク質のＸ因子比活性を有する Ｘ因子；及びｃｒ−＋）ｎ因子を実質上歯まずかつ１単位／　ｍｇタンパク質１ 、Ｊ上の■因子比活性を有する■因子；を製造することが可能なことを立証した 。

試験方法： 従来のプロトロンビン複合体濃縮物の注入後における血栓症状の発現に関して報 告された事例は、それらのトロンボゲン性作用に関する製品のインビトロ及びイ ンビボ試験に基づいていた。インビボ試験は注入後に血栓症を評価するため様々 な基準を用いて動物（ウサギ、ブタ及びイヌ）で行われた。インビトロ試験は基 質血漿又はフィブリノーゲンの凝固時間を減少させうる濃縮物の能力に基づいて いる。これらの試験の有意性は示されなかったが、但し大きなウェイトが製品品 質コントロールに関してそれらにかけられている。

３つの主な試験は以下のとおりである：ＮＡＰＴＴ：任意の下限凝固時間１５０ 秒間でサンプル中における活性化凝固因子のレベルについて測定する。

ＮＡＰＴＴは結局いずれの具体的活性化凝固因子の濃度とも関連していなかった が、Ｆ、ＩＸａ及びＦ、Ｘａの存在について示している。

ＦＣＴ：試験物質存在下でフィブリノーゲン溶液が凝固するのに要する時間を測 定する。これはトロンビン（血液凝固“カスケード“において最後から二番目の タンパク質）の直接的測定である。下限凝固時間は３時間であって、これはトロ ンビン５　Ｘ　１０　’ＩＵ／　ｍｌ又は２ｎｇ／ｍｌに相当する。

ＴＧｔ５０：既知量のトロンビンを生成するのに要する時間を測定する。それは 本プロセスで早期に機能する凝固因子の活性化に関する測定である。

下記例は説明のみの目的で示されている。

タンパク質の定量のため例中で用いられるｂ（験機能性生物学的活性及び抗原活 性の双方が目的のタンパク質を定量するため利用された。

■、■及びＸ因子の生物学的活性は確立された凝固アッセイで測定された。凝固 活性（二〇）の単位数は■、■及びＸ因子濃縮物に関する一次国際標準コード８ ４／６８１に対して較正されたワーキング標準８７１５３２を用いて決定された 。

■因子の生物学的活性は確立された凝固アッセイ又は合成基質を用いた発色原ア ッセイで測定された。双方の場合において、単位数はドナー３０例以上のヒト血 漿プールに対して較正され１．　ＯＦ、■：Ｃυ／ｍｌの■因子活性を有すると して規定される自家■因子濃縮物ワーキング標準を用いて決定された。

■、Ｖ、ＩＸ及びＸ因子、プロティンＣ並びにインター−α−トリプシンインヒ ビターに関するすべての抗原活性（：Ａｇ）は標準として正常プール血漿を用い 免疫電気泳動〔ローレルのロケット法（Ｌａｕｒｅｌ　Ｉ　’ｓ　Ｒｏｃｋｅｔ ｍｅｔｈｏｄ）　）で測定された。各場合において、標準は１．０単位／ｍｌの 効力に選定されており、サンプル活性は血漿当量単位／ｍｌとして表された。

本明細書において、凝固活性又は“因子−：Ｃ“は国際単位／ｍｌ又は１０／ｍ ｌで示される。抗原活性又は“因子−：Ａｇ”は単位／ｍｌ　（Ｕ／ｍｌ）又は 血漿当量単位／ｍｌ（ｐｅｕ／ｍｌ　）で示される。

凝固及び抗原活性はタンパク質化学の異なる面の０１定であるため、凝固活性の 国際単位は血漿当量単位と同じではない。典型的には、部分的精製タンパクＩＲ ６縮物中において■因子、Ｘ因子及びＸ因子に関するｌＵ：ｐｃυの比は各々０ ，８６．０．６及び０．６３である。

例１ キレート化セファロースをそれに硫酸銅溶液を通すことで銅イオンによりプライ ム化した。次いでゲルをｐＨ７、０の５００ａ＋ＭＮａＣ１含有クエン酸−リン 酸緩衝液で洗浄した。５００ｍＭＮａＣ１含有ＰＣＣをＸ因子１、００〜２００ １Ｕ／ｍｌゲルの担持量でカラムに適用した。

タンパク質溶出液をモニターし、漏出タンパク質を回収した。これは５〜２５１ Ｌｌ／ｍｌの効力で比活性５１０／ｍｇタンパク質を有するプロトロンビンを含 有していた。この物質は少なくとも７０％のプロトロンビンであった。

例２ ０、■、Ｘ因子及びプロティンＣの銅−キレートゲルへの結合性に関するイオン 強度の効果 ＦＣＣを１００．２５０．５００又は１０００１０００Ｉｎ　ｌ含有ｐｕ’７． ｏのクエン酸−リン酸緩衝液に対して透析した。次いでこれを同一イオン強度緩 衝液で洗浄されたＣｕ２＋プライム化キレート化セフアロースカラムに担持させ た。４３０単位／ｍｌゲルで担持後、カラムを同一緩衝液で更に洗浄し、溶出未 結合タンパク質を■、■、Ｘ因子及びプロティンＣに関して分析した。下記第１ 表はその結果について示している。

第１表 ■因子と比較したＸ因子の最大差結合性は５００１ＮａＣ１で観察された。

例３ ■、ＩＸ及びＸ因子の銅−キレートゲルへの結合性に関する吸着ｐＨの効果 キレート化セファロースを最初銅イオンでプライム化し、しかる後下記レベルに 調整されたｐＨの５００ｍＭＮ　ａ　ＣＩ含有クエン酸−リン酸緩衝系で洗浄し た。

５００ｍＭＮａＣ１含有ｐｃｃを同−ｐＨまで滴定し、しかる後■因子約３００ 単位／ｍ＋ゲルでゲルに担持させた。

カラムを同一緩衝液で更に洗浄し、漏出／未結合タンパク質を回収し、■、■及 びＸ因子に関して測定した。下記第２表はその結果について示している。

第２表 ■因子の至適結合はｐＨ６，０〜７．０で達せられた。

Ｘ因子の至適結合はｐＨ７，０以上で達せられた。

Ｘ因子の至適結合はｐ）！６．５〜７．５で達せられた。

したがって、吸着ｐＨはゲルへの好ましい凝固因子の結合性を最適化させるため に用いることができる。

例４ 低プロトロンビン含有Ｘ因子及びＸ因子濃縮物の製造キレート化セファロースカ ラムを例１のように調製して担持させた。ＰＣＣの適用後、カラムをｐＨ７，０ の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでイオン強 度を１００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液による洗浄で低下させた。

次いでＸ因子分画を１００ａＭ１００ａ及び５ｍＭグリシン含有クエン酸−リン 酸緩衝液で溶出させた。これはＸ因子１５〜４０Ｉｌｌ／ｍｌ及びＸ因子１単位 当たりプロトロンビン０．０１単位以下を含有していた。Ｘ因子比活性は１３１ Ｕ／■タンパク質であり、したがって純度７％であった。この分画はほぼ当モル ｆｆ１（Ｘ因子１単位当たりＸ因子１１ｔＪ）でＸ因子も含有していた。

例５ 低プロトロンビン及びＸ因子含有Ｘ因子の製造キレート化セファロースカラムを 例１で記載されたようにプライム化して担持させた。サンプルの適用後、カラム をｐａ７．０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次 いでＸ因子をｐＨ７，０の５００１ＩＩＭＮａＣ１及び５ＩｎＭグリシン含有ク エン酸−リン酸緩衝液で溶出させた。この物質は比活性１．４１０／　ｍｇタン パク質でＸ因子１５〜３０１０／ｍｌを３何していた。この物質は高プロトロン ビン活性及び低■因子活性を有することがら例４で得られた物質と異なっていた 。ここでは０．２５１Ｕ／単位Ｘ因子でプロトロンビン及びＸ因子双方に関し得 られた。したがフて、プロトロンビンはなお全タンパク質中約４０〜５０重量９ ６であった。

例６ 低プロトロンビン含有Ｘ因子及びＸ因子濃縮物の製造キレート化セファロースカ ラムを例１で記載されたようにプライム化して担持させた。次いでそれを最初５ ００ｍＭＬかる後１００ａＭ１００ａを含有したｐＩ（７，０のクエン酸−リン 酸緩衝液で連続的に洗浄した。

次いでＸ因子及びＸ因子双方を３０１０／ｍｌの効力で１．００ｍＭＮａＣ１含 有トリス−グリシン緩衝液により溶出させた。プロトロンビンはＸ因子及びＸ因 子１単位当たり０．０３１Ｕまで減少した。

例７ 低プロトロンビン及びＸ因子含有Ｘ因子及びプロティンＣ濃縮物の製造 キレート化セファロースカラムを例４で記載されたように調製して洗浄した。５ ｍＭグリシンでタンパク質溶出後、トリス−グリシン緩衝液を用いてＸ因子を溶 出させた。トリスは１０〜３０Ｉｌ１Ｍの範囲、グリシンは４０〜７０吐の範囲 内であってかつＮａＣｌは１００ｍ１１１であることが適切と判明した。これに より３０〜５０１Ｕ／ｍｌの効力でＸ因子を溶出させた。プロトロンビンは検出 されず、Ｘ因子は■因子１単位当たり０，０１単位以下（０，０５重量％以下） でありだ。プロティンＣも２５〜４０血漿当量単位／ｍＩの濃度で溶出した。

例８ プロトロンビン及びＸ因子からプロティンＣの分離プロティンＣの精製はヘパリ ン−セファロース又はデキストラン−サルフェート−セフ７０−スのような慣用 的クロマトグラフィーの場合プロトロンビン及びＸ因子の共溶出によって複雑化 される。しかしながら、これらの系では、■因子汚染はそのタンパク質の強い結 合性のせいで最少である。したがって、前記金属キレート系もプロティンＣの精 製に際しては−ステップとして用いてよい。

キレート化セファロースカラムの調製及び洗浄は例７で記載されたとおりであっ た。タンパク質結合性は濃度依存性であるため、担持量はＸ因子１．６０１１Ｊ ／　ｍｌゲル又はプロトロンビン２４０１Ｕ／ｍｌゲル以内で可能なかぎり高く した。次いでカラムを洗浄し、例７で記載されたように溶出させたところ、プロ ティンＣは最終トリス−グリシン緩衝液溶出液中に溶出して、プロトロンビン及 びＸ因子汚染物から分離された。

例９ キレート化セファロースをカラムに充填し、銅イオンでプライム化し、しかる後 ｐＨ７，０の５００１ＤＭＮ　ａ、　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄し た。

５００ｍＭＮａＣ１含有ＰＣＣをゲルとの接触時間が異なるカラム毎に変わるよ う制御された流速で各カラムに担持させた。カラムに■因子４３０単位／ｍｌゲ ルで担持させ、５００ｍＭＮａＣ１緩衝液、１００ｍＭＮａＣ１緩衝液、しかる 後ｐＨ７，０の１０ｄ）リス、７０ｍＭグリシン、１００ｍＭＮａＣ１緩衝液で 洗浄した。漏出物及びトリス−グリシン溶出液を■因子、Ｘ因子、Ｘ因子及びプ ロティンＣに関して測定した。結果は下記第３表で示されている。

第３表 したがってゲルへのタンパク質結合性は接触時間に依存している。これにより■ 、Ｘ因子及びプロティンＣに関しては４０分間以上の接触時間で最適化させるこ とができる。接触時間が増加するほどゲルへの■因子結合性は低下している。

例１０ Ｃｕ２＋プライム化キレート化セフアロースによる■因子、キレート化セファロ ースをいくつかのカラムに充填し、銅イオンでプライム化し、しかる後ｐＨ７， ０の５００ｍＭＮ　ａ、　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。

５００ｍＭＮａＣ１含有ｐｃｃを異なる量でカラムに担持させ、各カラムに関す る接触時間をカラムからの流速を変えることで４０分間維持した。次いでカラム を例６で記載されたように緩衝液で洗浄した。結果は下記第４表で示されている 。

第４表 担持量が増加するほど優先的に■因子と置き換わる。

担持量チャレンジは他方と比較した場合の１つの特定タンパク質の結合性及び回 収率を高めるために行うことができる。■因子からＸ因子の分離改善は２５８〜 ４３０Ｆ、ＩＸ：Ａｇ単位／ｍｌゲル（約１５０〜２５０Ｆ、Ｄ：ＣＩＵ／ｍｌ ゲルに相当）の担持量で達成された。

例１１ Ｘ因子、Ｘ因子及びプロティンＣの結合性及び回収率に関する■因子濃度の効果 キレート化セファロースを前記例で記載されたように銅イオンでプライム化し、 洗浄した。５００ｍＭＮａＣ＋含有ｐｃｃをｐＩ（７，０の５００ｍＨＮａＣ１ 含有クエン酸−リン酸緩衝液で希釈した。カラムに異なる希釈率で担持させ、例 ６で記載されたように緩衝液で洗浄した。

全担持量チャレンジ（約２５０単位／　ｍｌゲル）及び接触時間は一定に保たれ た。結果は下記第５表で示されている。

第５表 担持される物質の濃度が高いことはキレートとの結合を生じさせる上で好ましい 。

例１２ 等容量の５タイプのキレート化ゲルを５つのカラムに充填し、Ｃｕ２＋イオンで プライム化し、ｐＩ（７，０の５００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液 で洗浄した。５００１ＭＮａＣ１を含有するように調整されたＰＣＣを各カラム に等容量で担持させ、しかる後１００ｍＨＮ　ａ　Ｃ１含有の同一緩衝液で連続 的に洗浄し、次いでｐＨ７，０の１１０ｌ１１トリス、７０ｍＭグリシン緩衝液 で溶出させた。漏出、洗浄及び溶出分画中における■因子を肋１定しｌ二。

用いられたゲルタイプは以下のとおりであった＝１．１２原子（１０炭素）スペ ーサー分子でセファ０−スに結合されたイミノニ酢酸を有するキレート化セファ ロース〔ファルマシア〕　； ２．１と同様であるが、但しファースト・フロー・セファｏ−ス（Ｆａｓｔ　Ｆ ｌｏｗ　５ｅｐｈａｒｏｓｃ）と更に架橋；３．１２原子（１０炭素）スペーサ ー分子で結合されたイミノニ酢酸を有するアガロース〔シグマ〕　；４、スチレ ン−ジビニルベンゼン架橋ポリマーに直接結合されたイミノニ酢酸〔キレックス １００　（Ｃｈｅｌｅｘｌ、００）、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））　；５． ４と同様であるが、但し粗メツシユ非架橋マトリックスと結合〔キレツクスフ０ ．バイオラツド〕　；下記第６表はその結果を示している。

第６表 Ｃυ２＋プライム化イミノニ酢酸基に対する■因子結合量はマトリックス及びキ レート化基間におけるスペーサー分子の形成並びに非架橋キレート化セファロー スの使用によって増加される。

キレート化セファロースを水洗し、しがる後硫酸銅溶液（５＋ｎｇ／ｍｌ）に懸 濁し、２０〜３０分間混合した。

Ｃｕ２”２ライム化ゲルを混合物から遠心で回収し、ｐＨ７，０の５００ｍＭＮ ａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で徹底洗浄した。ゲルを上記のように回収し 、５００ｄＮａＣＩ含有ＰＣＣの溶液に再懸濁し、２０〜３０分間混合した。Ｐ ＣＣ対ゲル比は約１５０１Ｘ因子＝Ｃ単位／ｍ１ゲルであった。ゲルを遠心又は 重力沈降で回収し、上澄を除去した。

ｐＨ７，０の５００ａ＋ＭＮａＣ１、しかる後１０１００ＩＩ　ａ　Ｃ１含有ク エン酸−リン酸緩衝液による連続洗浄で弱結合タンパク質を除去し、イオン強度 を低下させた。

次いでＸ因子をｐ）（７，０の１０ｍＭ）リス、５ｓＭグリシン、１００＋ＭＮ ａＣ１洗浄で除去することができた。次いで■因子をｐＨ７，０の１１０ｆｆ１ トリス、７０１１Ｍグリシン、１００ｍＭＮａＣ１でゲルを洗浄することにより 溶出させた。

例１４ 異なるアミノ酸溶出緩衝液を用いるＣｕ２＋プライム化キレート化セフアロース からの■因子回収 キレート化セファロースのカラムを前記例で記載されたようにＣｕ２＋イオンで プライム化し、洗浄した。ＰＣＣ（５００ｍＭＮａＣ１含有）を各カラムに担持 させ、しかる後ｐＨ７，０のクエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。

■因子を（ａ）非極性アミノ酸（例えば、アラニン、パリ、ン、フェニルアラニ ン、メチオニン）、（ｂ）極性非電荷アミノ酸（例えば、グリシン、セリン、チ ロシン、グルタミン）、（Ｃ）極性負電荷アミノ酸（例えば、グルタミン酸）又 は（ｄ）極性正電荷アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン）から選択されるア ミノ酸を７０ｄで含有したｐＨ７，０の１０Ｉｌｌ）Ｉトリスで溶出させること により回収した。メチオニン、グリシン及びグルタミン酸が特に有利とわかった が、これらは８０％以上の■因子収率及び５１Ｕ／＋ｎｇ以上の■因子比活性を 示す。

Ｃｕ２＋プライム化キレート化セフアロースのカラムをｐＨ７，０の５００ｍＭ ＮａＣ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。ＰＣＣをカラムに適用し、し かる後向−緩衝液で洗浄し、次いで１００ｍＭＮａＣ１含有緩衝液で洗浄するこ とによりイオン強度を低下させた。次いでＸ因子をｐＨ７，０の２〜５ｎＭメチ オニン含有トリス緩衝液で溶出させた。Ｘ因子効力は１５Ｌｌ／ｍ１以上であり 、比活性は約３０単位／　ｖｇであった。■因子はＸ因子分画中で■因子的０． ５単位／単位Ｘ因子まで低下し、プロトロンビンは０．１単位／単位Ｘ因子以下 で存在していた。

■因子は１０〜１５叶メチオニン含有トリス緩衝液による洗浄で溶出することが わかった。Ｘ因子効力は１５［１／ｕ＋１以上であって、それは約２０単位／　 ｕｈＨの比活性を有していた。プロトロンビンは■因子分画中で検出されず、Ｘ 因子はＸ因子０．１単位／単位■因子以下で存在していた。

例１６ Ｃｕ”’ライム化キレート化セファ０−ス力ラムをメチオニン溶出（例１５）で 記載されたように調製し、洗浄し、ｐｃｃで担持させ、洗浄した。

Ｘ因子を５〜１０ｍＭグルタミン酸含有１．０ｍＭトリス緩衝液で溶出させた。

Ｘ因子は１６〜２２単位／　ＩＩＩｇの比活性を有していた。

次いで比活性的１５Ｕ／＋ｎｇのＸ因子を溶出緩衝液中のグルタミン酸濃度を４ ０ａ＋Ｍまで高めることにより溶出させた。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ’４オンでプライム化し、ｐＨ７，Ｏの ５００ｍＭＮａＣ１含有緩衝液で洗浄した。５００ｍＭＮａＣ１含有ＰＣＣをカ ラムに担持させ、しかる後緩衝液で洗浄した。イオン強度をｐＨ７，０の低塩緩 衝液を用いて１００１Ｉ１００１Ｉまで低下させた。一部のＸ因子は比活性１０ ．　５Ｕ／ｍｇでこの緩衝液により溶出した。

カラムをｐＨ７，０〜８．５のｐＨ勾配で段階的に溶出させた。Ｘ因子及びＸ因 子は各々比活性２７ＵノＩ！１ｇ及び６１ｊ／■でｐＨ７，１〜７．９のとき溶 出した。

例１８ 溶出させるためｐＨ及びグリシンを用いる■、Ｘ因子及びプロティンＣの製造 キレート化セファロースのカラムをＣｕ２〜オンでプライム化し、ｐＨ７，，５ のクエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。５００ａＭＮａＣ１含有ｐｃｃをｐＨ７ ，５に調整し、カラムに担持させ、緩衝液で洗浄した。次いでイオン強度をｐＨ ７，５の１００ｍ１ｆＮａＣ１含有クエン酸゛−リン酸緩衝液による洗浄で低下 させた。これにより比活性９０／ｍｇを有するＸ因子との混合物と１７て比活性 １８Ｕ／ｌｌ１ｇのＸ因子を溶出させた。次いで混合プロティンＣ（１５Ｕ／ｍ ｌ　；　６．　５単位／ｌ１１ｇタンパク質）及びＸ因子（１２Ｕノｍｌ　；　 ５単位／ｒｎｇタンパク質）分画をｐＨ８，０の１０＋ｎＭ）リス、５ＩＩＩＭ グリシン、１００ＩＤ１００ＩＤ緩衝液による洗浄で回収した。

キレ−１・化セファロースのカラムをＣｕ２〜オンでプライム化し、ｐＨ−ｚ、 ｓの５００ｍＭＮ　ａ　Ｃ１含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでＰ ＣＣをｐｉ（７，５及びＮＮａＣ１５００ａへの調整後適用し７た。次いで■因 子を除去するため洗液として上記緩衝液を用いた。出発物質中の■因子３０％も この洗液で除去された。次いでイオン強度を１００ｎＭ１００ｎ含有緩衝液によ る洗浄て低下させた。これにより約１５単位／Ｉｎｇタンパク質の比活性でＸ因 子も除去した。クエン酸−リン酸鐸衝液を用いて、ｐＨ勾配をカラムの洗浄中ｐ Ｈ７，５〜４．０に形成し、た。選択されたタンパク質に富む分画は回収しうろ ことがわかった。このため例えばｐＨ約５．５でＸ因子を更に除去し、一方ｐＨ ５〜５．６で更に４０％の結合■因子をカラムから約５血漿当量単位／ｍｌで除 去した。

このｐＨ範囲内でインター−α−トリプシンインヒビターもプロティンＣと同時 に溶出し始めた。緩衝液ｐＨがｐＨ４，６に下がると、インター−α−トリプシ ンインヒビター及びプロティンＣの溶出が各々３．０及び４．６血漿当量単位／ ｌｌ１ｇタンパク質の比活性で続いた。

はんの少量のＸ因子が減少ｐＨ勾配のこれらセグメントに際して溶出した。

ｐＨが例えばｐｌ（４，１まで更に低下したとき、Ｘ因子は効力４０単位／　ｍ １以上及び比活性３０単位／ｒａｇタンパク質以上で溶出した。この分画は検出 可能な■因子又はＸ因子を含有していなかった。プロティンＣは約０．０１単位 ／単位■因子で存在し、■因子は０，０６単位／単位■因子で存在し、インター −α−トリプシンインヒビターは０．０３単位、／単位■囚子で存在した。

■因子１単位におけるそれらの汚染について、これは出発物質（ｐ　ｃ　ｃ）よ りもプロティンＣ，Ｖ因子及びインター−ａ　−ｔ・リブシンインヒビターに関 し各々９５％、６３％及び９０％の減少を示す。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ２〜オンでプライム化し、ｐＨ７，５の ５００ｍＭＮａＣｌ含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。５００＋＋＋ＭＮ ａＣ１含有かつｐＨ７，５に調整されたＰＣＣをカラムに担持させ、しかる後上 記緩衝液で洗浄した。更にｐＨ７，５の１．　ＯＯｌＩＭＮ　ａ　Ｃ１含有クエ ン酸−リン酸緩衝液による洗浄でイオン強度を低下させてＸ因子を除去したが、 これは少なくとも６０７ｍ１の効力及び少なくとも１５単位／　ｍｇタンパク質 の比活性で回収することができた。次いでｐＨを第三の緩衝液、典型的にはｐＨ ４，５の１００ａＭ１００ａ含有クエン酸−リン酸による洗浄で低下さゼた。こ れにより残留結合インター−ａ−トリプシンインヒビターの少なくとも５５２６ 及び残留結合プロティンＣの２４％を除去したが、但し結合Ｘ因子に関しては５ ９６のみであった。次いでカラムをＸ因子溶出に適したｐｎ及び塩濃度を有する 緩衝液、典型的にはｐＨ７，０の１．００ｍＭＮａ、ＣＩで再平衡化１．た。次 いでＸ因子をアミノ酸溶出緩衝液、例えば前記例で記載されたような１００關Ｎ ａＣ１含有トリス緩衝液中グリシンで溶出させた。これにより２Ｃ）０υ／ｍｌ で５０単位／ｉｇタンパク質以上の比活性を有するＸ因子を得た。プロティンＣ も２０血漿当量単位／■タンパク質の比活性で存在していた。

出発ＦＣＣ物質と比較して、■因子分画は有意に低量の汚染タンパク質しか含有 していなかった。■因ｆ−、Ｘ因子、■因子及びインター−α−トリプシンイン ヒビターは■因子１単位当たり各々０．０００５．０．００５．０．００２及び ０．０４単位のレベルで存在していた。

これはＦＣＣ出発物質中各々〕、０．１，０．０．２及び０．４の値に匹敵する 。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ２＋イオンで荷電し、しかる後ｐＨ７， ０の５００ｉＭＮａＣ＋含有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。凍結上澄又は Ｘ因子消失上澄で吸着されたＤ　Ｅ　Ａ、　Ｅ−セファロースの溶出により得ら れた■因子濃縮物を５００ＩＩＭＮａＣ１を含有するようにＸ［し、５０〜１５ ０■因子単位／ｍｌゲルでカラムに担持させた。上記緩衝液で洗浄後、イオン強 度をｐＨ７，０の１００１００１Ｈ，ＣＩ含有クエン酸−リン酸緩衝液による洗 浄で低下させた。■因子を１００ｍＭＮａＣ１含胃ｐＨ７，０の１０口旧・リス 、６０ａＭグリシンでカラムを洗浄することにより１単位／　ｍｇ以上の比活性 で回収した。

キレート化セファロースのカラムをＣｕ’４オンで荷電し、しかる後側１で記載 されたように担持させた。次いでカラムをｐＨ７，０の５００ｍＭＮａＣ１ｆｉ 有クエン酸−リン酸緩衝液で洗浄した。次いでカラムを少なくとも４倍層容量の ドデシル硫酸ナトリウム１重量％含有同一緩衝液で洗浄して、ゲルに結合された 脂質成分を可溶化させた。次いで界面活性剤を１００ｍＭＮａＣ１含有クエン酸 −リン酸緩衝液でゲルから洗い出した。この段階は脱塩でイオン強度を低下させ るためにも役立つ。次いでＸ因子を例７で記載されたようにトリス緩衝液中グリ シンでゲルから溶出させた。同様の操作を用いるが、ドデシル硫酸ナトリウムは 同重量のコール酸又はポリオキシエチレン（２０）モノオレエート〔ツイーン８ ０　（Ｔｗｃｅｎ８０）〕で置き換えてもよい。

上記特定例の溶出物を活性の損失なしに凍結乾燥し、しかる後８０℃で７２時間 加熱して潜在的ウィルス感染力を低下させた。現ＰＣＣとは異なり、トロンビン 生成Ｉよ加熱時に観１察されなかった。■、■及びＸ因子は異なる媒体中での加 熱に対して異なる安定性を示した。溶出物をクエン酸及び水で希釈した場合、非 加熱活性の６５〜９０％の加熱収率が得られた。トリスによる希釈では非常に大 きな活性損失を招いたが、これはプロトロンビンよりもＸ因子に関して大きく、 Ｘ因子よりもＸ因子に関して大きかった。この一般的効果は下記例２４及び２５ で記載されるような利点を得る上で用いることができる。

例２４ Ｘ因子の濃縮物中におけるＸ因子活性の低下前記例４及び例６はＸ因子が共存し たＸ因子濃縮物の製造について記載している。Ｘ因子活性は凍結乾燥前にｐＨ７ ，０の５０１トリス緩衝液による関連Ｘ因子分画の希釈で優先的に低下させるこ とができる。一方、溶出Ｘ因子効力の希釈を避けるため、溶出緩衝液中のトリス はＸ因子がその処方緩衝液中に溶出されるよう５０＋ｎＭまで増加させてもよい 。凍結乾燥後、この物質は８０℃で７．２時間加熱することができる。Ｘ因子活 性はＸ因子濃縮物として大きな特異性をもった生成物が用いられるようＸ因子よ りも低下される。

例２５ 高純度Ｘ因子濃縮物の加熱処理 加熱後できるだけ最大のＸ因子活性収率を達成するため、例７で記載されたＸ因 子溶出物をクエン酸もしくはクエン酸−リン酸緩衝液又は水で望ましい最終効力 まで希釈し、凍結乾燥し、しかる後８０℃で７２時間加熱処理した。溶出緩衝液 はトリスを含をしていたが、但しこの効果は最終緩衝液中のトリス成分を有効に 希釈しつるよう十分に高いＸ因子効力をもつ分画の選択によって最少に抑制した 。一方、溶出緩衝液の処方を修正して、未希釈溶出液を直接凍結乾燥してもよい 。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）゛１乙成　２　年　６　月　２ ２日 １、　特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８８１０１１５０ ２、発明の名称 化学的プロセス ３、特許出願人 住　所　イギリス国ハートフォードシャー、エルスラリー、ダガー、レーン（番 地ない 名　称　セントラル、ブラッド、ラボラトリーズ、オーソリティー ４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の内三丁目２、特許 請求の範囲は第７項、第１０項が補正されております。

１、　請求の範囲を別紙の通りに補正する。

２、　明細書第１頁第１５行目にｒｌＸ因子」とあるをｒＸ］因子」に補正する 。

を「８〜１６の原子」に補正する。

４、　第１０頁第８行目に「約２５０−４５０Ｊとあるをｒ２５０〜４５０」に 補正する。

請求の範囲 １、ビタミンに依存性血液凝固因子を少なくとも１種のかかる因子を含有した混 合物から少なくとも部分的に分離するための方法であって、 上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレートに吸着され、しか る後上記因子の１種に関して富む１以上の分画を得るために溶出されることを特 徴とする方法。

２、　混合物が少なくとも２種のビタミ＞Ｋ依存性血液凝固因子を含有している 、請求項１に記載の方法。

３、　混合物がプロトロンビン複合体濃縮物である、請求項２に記載の方法。

４、　混合物が組換えＤＮＡ技術で産生されるビタミンに依存性血液凝固因子含 有微生物培養物から得られる、請求項１に記載の方法。

５、　不活性支持体がその上にキレート化されたＣυ２＋イオンを固定化してい る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

６、Ｃｕ２宥オニ／がスペーサーを介１．でアガロース支持体に結合されたイミ ノニ酢酸基でキレート化されている、請求項５に記載の方法。

７、　スペーサーが８〜１６の原子を有している、請求項６に記載の方法。

８、　混合物が、０．４〜１．　０１ｖｉ　ＮａＣ１及び／又は等イオン強度の 溶液を与える１種以上の他の電解質を含有したｐＨ７，０以上の緩衝液の存在下 でキレートに吸着される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

９、　緩衝液が０．５Ｍ　ＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種 以上の他の電解質を含有している、請求項８に記載の方法。

１０、プロトロンビン複合体濃縮物が、２５０〜４５０Ｆ、■：Ａｇ単位／　ｍ ｌゲルの■因子担持量とするため２０分間以上にわたり請求項６に記載されたア ガロース支持体に吸着される、請求項８又は９に記載の方法。

１］、　混合物の吸着後に、望ましいビタミンに依存性血液凝固因子に富むいず れかの分画の溶出前に結合■因子を除去するため支持体の洗浄が行なわれる、請 求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。

１２、混合物の吸着後に、少なくとも最終洗浄ステップが１．００〜２００ｉ１ ＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有 した緩衝液で行われる洗浄段階が続けられる、請求項］、−１１のいずれか一項 に記載の方法。

１３、支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンに依存性血液凝固因子の 溶出がｐＨ勾配によって行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法 。

１４、　支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンに依存性血液凝固因子 の溶出がグリシン、メチオニン及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含有 した緩衝液によって行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

１５、特に支持体から結合インター−α−トリプシンインヒビターを除去するた め酸性ｐＨ緩衝液を用いる溶出ステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項 に記載の方法。

１６、溶出ステップ後に、インヒビター及び■因子を実質上含有しないＸ因子に 富む分画の回収が続けられる、請求項１５に記載の方法。

１７、Ｘ因子に富む分画及び／又は■因子に富む分画及び／又はプロティンＣに 富む分画が■因子を実質上含有しないで得られる、請求項１〜１６のいずれか一 項に記載の方法。

１８、　カラムクロマトグラフィーが行われる１、請求項１〜１７のいずれか一 項に記載の方法。

１９、■因子及びインター−α−トリプシンインヒビターを実質上含有しないＸ 因子。

２０、■、■及びＸ因子を実質上含有しないプロティンＣ０ ２１、■因子を実質上含有せずかつ少なくとも１３ＩＵ／ｍｇタンパク質のＸ因 子比活性を有するＸ因子。

２２、■因子を実質上含有せずかつ１単位／ｌ１１ｇタンパク質以上の■因子比 活性を有する■因子。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＧＢ　８Ｂ１０１１５０ ＋＊＋呻ｅ＋＋ａ＋＋ａｌ　Ａｅｅｌｌｃａｌｌｍ　Ｎｏ、２国際調査報告 ＧＢ　８８０１１５０

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．ビタミンＫ依存性血液凝固因子を少なくとも１種のかかる因子を含有した混 合物から少なくとも部分的に分離するための方法であって、 上記混合物が不活性支持体に固定化された多価金属のキレートに吸着され、しか る後上記因子の１種に関して富む１以上の分画を得るために溶出されることを特 徴とする方法。
2. ２．混合物が少なくとも２種のビタミンＫ依存性血液凝固因子を含有している、 請求項１に記載の方法。
3. ３．混合物がプロトロンビン複合体濃縮物である、請求項２に記載の方法。
4. ４．混合物が組換えＤＮＡ技術で産生されるビタミンＫ依存性血液凝固因子含有 微生物培養物から得られる、請求項１に記載の方法。
5. ５．不活性支持体がその上にキレート化されたＣｕ２＋イオンを固定化している 、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ６．Ｃｕ２＋イオンがスペーサーを介してアガロース支持体に結合されたイミノ 二酢酸基でキレート化されている、請求項５に記載の方法。
7. ７．スペーサーが８〜１６の間の原子を有している、請求項６に記載の方法。
8. ８．混合物が、０．４〜１．０ＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与え る１種以上の他の電解質を含有したｐＨ７．０以上の緩衝液の存在下でキレート に吸着される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．緩衝液が０．５ＭＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上 の他の電解質を含有している、請求項８に言己載の方法。
10. １０．プロト。ンピン複合体濃縮物が、約２５０〜４５０Ｆ．ＩＸ：Ａｇ単位／ ｍｌゲルのＩＸ因子担持量とするため２０分間以上にわたり請求項６に記載され たアガロース支持体に吸着される、請求項８又は９に記載の方法。
11. １１．混合物の吸着後に、望ましいビタミンＫ依存性血液凝固因子に富むいずれ かの分画の溶出前に結合ＩＩ因子を除去するため支持体の洗浄が行なわれる、請 求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. １２．混合物の吸着後に、少なくとも最終洗浄ステップが１００〜２００釦ｍＭ ＮａＣ１及び／又は等イオン強度の溶液を与える１種以上の他の電解質を含有し た緩衝液で行われる洗浄段階が続けられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記 載の方法。
13. １３．支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンＫ依存性血液凝固因子の 溶出がｐＨ勾配によって行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法 。
14. １４．支持体に吸着された１種以上の望ましいビタミンＫ依存性血液凝固因子の 溶出がグリシン、メチオニン及びグルタミン酸から選択されるアミノ酸を含有し た緩衝液によって行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. １５．特に支持体から結合インター−α−トリプシンインヒビターを除去するた め酸性ｐＨ緩衝液を用いる溶出ステップを含む、請求項１〜１４のいずれか一項 に記載の方法。
16. １６．溶出ステップ後に、インヒビター及びＩＩ因子を実質上含有しないＩＸ因 子に富む分画の回収が続けられる、請求項１５に記載の方法。
17. １７．Ｘ因子に富む分画及び／又はＷ因子に富む分画及び／又はプロテインＣに 富む分画がＩＩ因子を実質上含有しないで得られる、請求項１〜１６のいずれか 一項に記載の方法。
18. １８．カラムクロマトグラフィーが行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に 記載の方法。
19. １９．口因子及びインター−α−トリプシンインヒビターを実質上含有しないＩ Ｘ因子。
20. ２０．ＩＩ、ＩＸ及びＸ因子を実質上含有しないプロテインＣ。
21. ２１．ＩＩ因子を実質上含有せずかつ少なくとも１３ＩＵ／ｍｇタンパク質のＸ 因子比活性を有するＸ因子。
22. ２２．ＩＩ因子を実質上含有せずかつ１単位／ｍｇタンバク質以上のＶＩＩ因子 比活性を有するＶＩＩ因子。