JPH04295432A - 血液凝固ix因子を含有する複合体 - Google Patents
血液凝固ix因子を含有する複合体Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
体及びIX因子を含有する医薬調製物の製造方法に関す
る。 血液凝固IX因子は血友病Bの患者の置換療法に有用で
ある。この血友病の原因はIX因子欠乏である。
及びX因子(プロトロンビン複合体)をさらに含有する
IX因子濃縮物によって行われる。このような濃縮物に
含有される血液凝固因子はビタミンK依存性の因子であ
り、それぞれが類似する構造を有しているために相互に
関連し合っている。しかし、IX因子以外の凝固因子が
供給されることは、血友病Bに罹患した出血性素因者に
負荷をかけることになる。そのため、上記の組合わせ調
製物の代替製剤として、IX因子が高度に豊富である濃
縮物を治療に使用しようとの求めがある。
はヒト血漿であるが、それはIX因子をごく僅かしか含
んでいない(4μg/ml)。従って、IX因子を回収
するには、大量の血漿を加工しなければならず、さらに
そればかりか、付随する妨害性のタンパク質を可能な限
り除去することも必要となる。このような付随タンパク
質は物理化学的に性質が類似しているため、その除去は
かなり困難である。
肝炎ウイルス又はHIVを含有しかねないので、検査中
に最終産物から感染性物質を除去しなければならないこ
とが挙げられる。これを行うには、IX因子の生物活性
を可能な限り最も高い程度に保持させる点に配慮しつつ
、各加工工程毎に各ウイルスの不活化操作を行わなばな
らない。これらの要件を最適に満足している方法を究明
すべく、数年来努力が払われている。
せしめIX因子を豊富にすることは当然に、固定相と血
液凝固IX因子との相互作用の特異性が高ければ高いほ
ど、成功を収め易い。
因子を含有する水性混合物からIX因子含有画分を製造
するためのイオン交換及びアフィニティークロマトグラ
フ法は、既に知られている。DE−C−39 14 8
69に記載されている方法によれば、IX因子をまずα
−ヒドロキシルアミノ基を有する吸着剤に吸着させるこ
とにより、IX因子含有画分を得る。吸着されたIX因
子の溶出は、アミン又は塩濃度を増加させることにより
行うが、これはIX因子と吸着剤との間にイオン結合力
が存在することを示している。この第1の豊富化工程の
後、硫酸化炭水化物を担うマトリックスのクロマトグラ
フィーにより精製を行う。
異性をその特徴としている。抗体又は、IX因子に対す
る高い親和性を有する他の基、例えばヘパリンを介して
担体物質にIX因子を吸着させ、洗浄し、溶出する。例
えば、EP−A−317 376の方法によれば、IX
因子を固定化ヘパリンに吸着させる。IX因子の溶出は
、緩衝液中の塩濃度を増大させて行う。そのIX因子は
、アフィニティー担体としてのIX因子に対する抗体に
保持されている。
を疎水性抗体に吸着させ、塩グラジエントで溶出してい
る。 内在する1つの問題は、適用する溶出条件では、IX因
子が解離するばかりでなく、ヘパリン及び抗体をも解離
し、従ってそれらが最終産物に夾雑物として含有される
ことである。
およびX因子を含有する凝固因子濃縮物では、疎水性マ
トリックスのクロマトグラフィーにより該濃縮物から該
ウイルス抗原を除去できることが知られているが、それ
は、凝固因子群がマトリックスを通過しつつ該抗原が疎
水結合によりマトリックスに結合し、そして生物活性が
保存されることに基づく[J.Vir.Meth.,3
,213−228(1981)]。
ーゲン(前駆物質)(plasma zymogens
)又はビタミンK依存タンパク質を同様に含有する水性
混合物からIX因子を効率的に豊富にすることに基づく
、上記の不都合な点を有していないクロマトグラフ法を
提供することを目的とする。
の血漿チモーゲンを含有する水性混合物由来のIX因子
が選択的に結合する疎水性基を有しているポリマー、を
基礎とする担体を含有する血液凝固IX因子複合体を提
供するものである。さらに、IX因子に加えて少なくと
も1つのビタミンK依存タンパク質、例えばプロテイン
C、プロテインS又はII因子、VII因子及びX因子
を含有する水性混合物、又はプロトロンビン複合体を含
有する水性混合物から得られるIX因子は、選択的に結
合する本発明の複合体中に存在することができる。
血液凝固IX因子が、即ち血漿チモーゲン又はビタミン
K依存タンパク質の存在下に、疎水性側鎖を含有するマ
トリックスに選択的に吸着されるという発見を基礎とし
ている。これは、上記のタンパク質が同様の物理化学的
性質を有していることから、驚くべき事項である。IX
因子の選択的吸着は、IX因子の豊富化に適用すること
ができる。
子が、他に存在するビタミンK依存タンパク質よりも少
なくとも5倍高い活性を含有していることが特徴である
。 好ましくは、本発明の複合体を、存在し得る感染物質を
不活化するための処置にかける。
も30mS、好ましくは60から120mSの間の伝導
率を有する、IX因子を含有する上記水性混合物の1つ
を、IX因子を複合化するための疎水性基を含有するポ
リマーと接触させ、要すればそこに形成される複合体を
洗浄し、また要すれば、存在し得る感染物質を不活化さ
せればよい。本発明では、疎水性クロマトグラフ技法に
より、IX因子を豊富にする。複合体の形成を洗浄剤の
存在下に行えば、都合良い。
から溶出させ、IX因子含有溶出液を医薬調製物に加工
することを特徴とする、血液凝固IX因子を含有する医
薬調製物の製造方法をも提供するものである。疎水性ク
ロマトグラフィーを用いて普通に実施しているように、
溶出は、吸着の場合よりも低い伝導率で行う。溶出はせ
いぜい20%程低い伝導率で実施するのが適当である。
を包含する: −血漿又はIX因子含有血漿の画分を、IX因子を結合
する陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、−結合し
たIX因子を溶出し、 −溶出されたIX因子を洗浄剤の存在下にIX因子を結
合する陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、−結合
したIX因子を溶出し、 −IX因子含有溶出液に対し、存在し得る感染物質の不
活化処理を施し、 −疎水性クロマトグラフィーによりIX因子を分離し、
それを加工して医薬調製物とする。
的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を得る
ために使用することができる。以下に実施例を記載し、
本発明をより詳細に説明する。
lasma Protein Fractionati
on,JM Curling編,117頁,Acad.
Press. 1980)の方法に従い、DEAE−セ
ファデックスへの吸着によって、ヒト血漿10リットル
からプロトロンビン複合体(II因子、VII因子、I
X因子及びX因子)を入手した。緩衝液A(1000m
M NaCl、15mM クエン酸ナトリウム,pH7
)の組成物を得るため、プロトロンビン複合体(血液凝
固II因子3669 I.U.、IX因子2858 I
.U.、及びX因子2734 I.U.)50mlを透
析濾過(diafiltered)した。
[フラクトゲル(Fractogel) TSK−ブチ
ル(メルク、ダームスタット)]30ml を含有する
カラムを緩衝液A100mlにより平衡化し、プロトロ
ンビン複合体を流速360ml/時で適用した。緩衝液
A 350ml によって充填ゲルを洗浄した後、IX
因子含有画分を緩衝液B(400mM NaCl)18
0ml により溶出した。
た。IX因子の比活性は19.7 I.U.第IX因子
/mgタンパク質であった。II因子及びX因子は初期
活性の20%よりも低い値でしか検出できなかった。
0ml をクロマトグラフィーにかけた。しかし、カラ
ム材としては、1.4M 硫酸アンモニウムにより平衡
化したフェニル基含有メタクリレートポリマー[トヨピ
アール・フェニル(Toyopearl Phenyl
)650M(TOSOHAAS,スチュットガルト)]
45ml を使用した。IX因子の溶出は0.2M 硫
酸アンモニウムにより行った。IX因子の収率は初期活
性の48%であり、比活性は27.2 I.U.第IX
因子/mgタンパク質であった。
によって前精製した[MiletichらのAnaly
tical Biochemistry 105,30
4(1980)]。溶出液(IX因子912I.U.、
X因子160I.U.)20ml を実施例1と同様に
して、オクチル基を含有するアガロースポリマー[オク
チル−セファロース−CL−4B(ファルマシア、スウ
ェーデン)]20ml のカラムに充填した。その前に
、カラムを緩衝液A 80mlで平衡化しておいた。充
填したゲルを緩衝液A120ml で洗浄した後、25
0mM NaCl溶液80ml でIX因子を含有する
画分を溶出させた。IX因子の収率は初期活性の54%
であった。比活性は186 I.U.第IX因子/mg
タンパク質であった。X因子は痕跡量しか存在していな
かった。
ml を疎水性クロマトグラフィーにより分離した。ブ
チル基を含有する親水性ビニルポリマー[Fracto
gel TSK−ブチル]35ml に適用する直前に
、US−A−4,820,805に記載の方法に従い、
プロトロンビン複合体をさらに2%ポリオキシエチレン
−20−ソルビタン−モノオレエート Tween 8
0及び0.01%トリ−(n−ブチル)−ホスフェート
で処理した。IX因子の収率は初期活性の83%であり
、比活性は24.1 I.U.第IX因子/mgタンパ
ク質であった。
59 311に記載の方法に従い、存在し得る病原体を
不活化するため、凍結乾燥プロトロンビン複合体2gを
60℃で10時間加熱した。次いで、オクチル基を含有
するアガロースゲル(オクチル−セファロース−CL−
4B)20ml の疎水性クロマトグラフィーを行った
。IX因子の収率は初期活性の63%であった。比活性
は32 I.U.第IX因子/mgタンパク質であった
。
Claims (16)
- 【請求項1】 血液凝固IX因子の他に少なくとも1
つの血漿チモーゲンを含有する水性混合物由来の該IX
因子と選択的に結合している疎水性の基を含有するポリ
マーを基礎とする担体からなる血液凝固IX因子複合体
。 - 【請求項2】 血液凝固IX因子の他に少なくとも1
つのビタミンK依存タンパク質を含有する水性混合物由
来の該IX因子と選択的に結合している疎水性の基を含
有するポリマーを基礎とする担体からなる血液凝固IX
因子複合体。 - 【請求項3】 該少なくとも1つのビタミンK依存タ
ンパク質がプロテインC、プロテインS、II因子、V
II因子及びX因子の中から選ばれる請求項2に記載の
血液凝固IX因子複合体。 - 【請求項4】 プロトロンビン複合体を含有する水性
混合物由来のIX因子が結合している請求項2に記載の
複合体。 - 【請求項5】 IX因子が、該水性混合物中に存在す
る別のビタミンK依存タンパク質よりも少なくとも5倍
高い活性を有している請求項2に記載の複合体。 - 【請求項6】 存在し得る感染物質を不活化するため
に処理された請求項1に記載の複合体。 - 【請求項7】 血液凝固IX因子の他に少なくとも1
つの血漿チモーゲンを含有する水性混合物由来のIX因
子が選択的に結合している疎水性の基を含有するポリマ
ーを基礎とする担体を包含する血液凝固IX因子複合体
の調製方法であって、少なくとも30mSの伝導率を有
する該水性混合物を調製し、該水性混合物を疎水性の基
を含有するポリマーを基礎とする担体と接触させてIX
因子と複合化することを特徴とする方法。 - 【請求項8】 該複合化IX因子を洗浄する工程をさ
らに包含する請求項7に記載の方法。 - 【請求項9】 該複合化IX因子に対し、存在し得る
感染物質の不活化処理を施す工程をさらに包含する請求
項7に記載の方法。 - 【請求項10】 該水性混合物の伝導率が60から1
20mSの範囲である請求項7に記載の方法。 - 【請求項11】 該IX因子の複合化を洗浄剤の存在
下に行う請求項7に記載の方法。 - 【請求項12】 血液凝固IX因子の他に少なくとも
1つの血漿チモーゲンを含有する水性混合物由来の該I
X因子と選択的に結合している疎水性の基を含有するポ
リマーを基礎とする担体を含有する血液凝固IX因子複
合体を得る工程、該IX因子複合体からIX因子を溶出
してIX因子を含有する溶出液を入手する工程、及び該
IX因子含有溶出液を医薬調製物に加工する工程からな
ることを特徴とする、血液凝固IX因子を含有する医薬
調製物の製造方法。 - 【請求項13】 該IX因子を含有する水性混合物の
伝導率より最大で20%低い伝導率において溶出を行う
請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 血漿又はIX因子を含有する血漿画
分を得る工程、 該血漿又は血漿画分を陰イオン交換クロマトグラフィー
にかけ、IX因子を結合する工程 該結合IX因子を溶出して溶出IX因子を入手する工程
該溶出IX因子を洗浄剤の存在下に陰イオン交換クロマ
トグラフィーにかけ、IX因子を結合する工程、該結合
IX因子を溶出してIX因子含有溶出液を入手する工程
、 該IX因子含有溶出液に対して存在し得る感染物質の不
活化処理を施す工程、及び 疎水性クロマトグラフィーにより該IX因子含有溶出液
からIX因子を分離し、得られた分離IX因子を医薬調
製物に加工する工程 からなることを特徴とする、血液凝固IX因子を含有す
る医薬調製物の製造方法。 - 【請求項15】 請求項1、2、3、4、5又は6に
記載の血液凝固IX因子複合体を使用し、IX因子に対
するモノクローナル抗体を得るための方法。 - 【請求項16】 請求項1、2、3、4、5又は6に
記載の血液凝固IX因子複合体を使用し、IX因子に対
するポリクローナル抗体を得るための方法。
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