JPH1059866A - 血液凝固第ｖｉｉ因子及び／もしくは活性化血液凝固第ｖｉｉ因子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaのＦＶＩ
Ｉa-ＡＴIII複合体との分離方法及び当該方法に基づく
ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaの製造方法を提供す
る。 【構成】 ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩa含有溶液
を陰イオン交換樹脂に展開し吸着させ、Ｃａ²⁺含有溶液
で溶出することにより、ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩ
ＩaとＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体とを分離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本願発明は、血漿蛋白質の分野に
関する。より詳細には、血液凝固第ＶＩＩ因子(以下、
ＦＶＩＩと称することがある)及び／もしくは活性化血
液凝固第ＶＩＩ因子(以下、ＦＶＩＩaと称することがあ
る)の製造方法に関し、ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩ
Ｉaを含有する血漿画分から陰イオン交換クロマトグラ
フィーで処することによって夾雑蛋白質含量が低減され
たＦＶＩＩaを、極めて簡便に生産し得るＦＶＩＩaの製
造方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】ＦＶ
ＩＩはビタミンＫ依存性の血液凝固因子であり、外因系
血液凝固の開始因子であることは広く知られている。他
のビタミンＫ依存性凝固因子と同様にＮ末端から３５残
基までのアミノ酸配列に１０個のγカルボキシグルタミ
ン酸(以下、Ｇｌａと称することがある)からなるＧｌａ
領域を有している(Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃ
ｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.８３,ｐ.２４１２−２４１６,１９８
６)。ＦＶＩＩは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、活性化血
液凝固第Ｘ因子(以下、ＦＸaと称することがある)、活
性化血液凝固第ＩＸ因子(以下、ＦＩＸaと称することが
ある)またはトロンビン(以下、ＦＩＩaと称することが
ある)によって、152Ａｒｇ−153Ｉｌｅが加水分解さ
れ、一個のＳ−Ｓ結合で架橋されたＨ鎖とＬ鎖から構成
される活性型ＦＶＩＩすなわちＦＶＩＩaに変換される
ことは知られている(Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２
５１,ｐ.４７９７−４８０２,１９７６)。

【０００３】血友病Ａ及び血友病Ｂ患者に対する補充療
法として、血液凝固第ＶIII因子(以下、ＦＶIIIと称す
ることがある)及び血液凝固第ＩＸ因子(以下、ＦＩＸと
称することがある)製剤の投与が行なわれている。しか
し、当該治療法に伴いＦＶIII及びＦＩＸに対する中和
抗体(インヒビターと呼ばれることもある)の出現が問題
視されている。このようなインヒビター患者の治療にＦ
ＶＩＩaが有効であることは既に報告されており、現
在、血漿由来ＦＶＩＩa及び遺伝子組換え技術を応用し
た遺伝子組換え型ＦＶＩＩaの開発が進められている(基
礎と臨床,ｖｏｌ.３０,ｐ.３１５−３２５,１９９６;Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓｉｓ,ｖｏｌ.１９,ｐ.３３５−３４
３,１９８９)

【０００４】ＦＶＩＩの血漿からの単離精製方法は、凍
結血漿を冷融解し沈澱画分を除いた上清を陰イオン交換
樹脂に展開し、Ｇｌａ領域を有する蛋白質画分(ＰＰＳ
Ｂ画分)を分取後、さらにイムノアフィニティークロマ
トグラフィーを用いる方法が一般的である。しかし、こ
のような極めて特異性の高い免疫吸着法を用いた精製法
を行なってもなお、その純化精製は極めて難しい。純化
精製が困難な理由は、不純夾雑蛋白質としてＦＶＩＩa-
ＡＴIII複合体が含有されてくることにあり、イムノア
フィニティークロマトグラフィー溶出液のＦＶＩＩの純
度は８５％を越えることはない。また、血液凝固因子の
活性化を抑制するためには精製工程にヘパリンを添加す
ることが有効であるが、このヘパリンがＦＶＩＩa-ＡＴ
III複合体の産生を促進することは既に報告されている
(Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２６８,ｐ.７６７−７
７０,１９９３)。

【０００５】ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaからの
ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体の分離法として次の二つの方
法が考慮され得る。ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体を認識
しない抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体を用いた免疫アフ
ィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過法に基づく
分離。しかしながら、方策に関しては所望のモノクロ
ーナル抗体の取得に多大の労力が必要とされる。また方
策に関してはＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体の分子量が５
０ｋｄａ〜８０ｋｄａに分布するため、分離を厳密に行
なえば著しい工程間収率の低下が予測される。さらに、
上記方策以外のＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaから
のＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体の分離法はこれまでに報告
されていない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者等はＦＶＩＩ
画分からのＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体の除去を達成すべ
く、鋭意研究を重ね種々の検討を行なった結果本願発明
を完成するに至った。本願発明は、ＦＶＩＩa-ＡＴIII
複合体が混入すると考えられるＦＶＩＩ及び／もしくは
ＦＶＩＩa含有溶液をＣａ²⁺濃度４０ｍＭ以下、ｐＨ１
０.０以下に調整し、これを陰イオン交換樹脂に展開
し、４０ｍＭ以下のＣａ²⁺濃度、ｐＨ１０.０以下の緩
衝溶液を用い溶出することによりＦＶＩＩ及び／もしく
はＦＶＩＩaを純化精製する方法を与える。本願発明に
よってもたらされる分離方法を使用すれば高度に純化さ
れたＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaが調製可能であ
る。

【０００７】以下、本願発明の詳細について説明する。
本願発明で用いられる出発物質は、血漿または血漿を適
当なクロマトグラフィー操作またはコーンのエタノール
分離法もしくはその改良法を用いて調製されたＦＶＩＩ
及び／もしくはＦＶＩＩa含有溶液である。最適な出発
原料としては、血漿を陰イオンクロマトグラフィーで粗
精製したＧｌａ領域を有する蛋白溶液(ＰＰＳＢ画分)を
抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化アフィニティーゲ
ルに展開し溶出した溶液を原料とする。ＦＶＩＩ及び／
もしくはＦＶＩＩaの精製は特に免疫吸着の原理に基づ
く方法に限定されるものではなく、ＦＶＩＩ及び／もし
くはＦＶＩＩaを純化可能な方法であればいずれでもよ
い。

【０００８】ＦＶＩＩ画分からＦＶＩＩa-ＡＴIII複合
体を分離する方法においては、陰イオン交換樹脂にＦＶ
ＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩa含有溶液を展開し、ＦＶ
ＩＩa-ＡＴIII複合体を吸着除去する。この工程では種
々の条件を採用することができ、上記陰イオン交換樹脂
との接触はバッチ法または連続カラム法で実施すること
ができ。ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体が吸着除去されれ
ば、ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaは吸着・非吸着
のいずれでもよい。好適には、ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合
体並びにＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩa共に吸着除
去する。使用する陰イオン交換樹脂は特に限定されるも
のではなく、好適にはＤＥＡＥセファロースファースト
フロウ(ファルマシア社)及びＱセファロースファースト
フロウ(ファルマシア社)等が使用される。ＦＶＩＩa-Ａ
ＴIII複合体並びにＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaの
分離する緩衝液はＣａ²⁺濃度が４０ｍＭ未満であり且つ
ｐＨが１０.０以下であればいずれでもよい。

【０００９】上述の方法でＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体が
除去されたＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩa溶液は製
剤化に向けてさらなる工程に供される。より完全なＦＶ
ＩＩからＦＶＩＩaへの活性化が要求される場合は、例
えば、陰イオン交換樹脂上での活性化工程等を経ること
が推奨される。

【００１０】得られたＦＶＩＩaは、治療、診断または
他の用途のために製薬学的調合剤に処方することができ
る。静脈内投与のための調合剤に対しては、組成物を、
通常、生理学的に適合し得る物質例えば塩化ナトリウ
ム、グリシン等を含み且つ生理学的条件に適合し得る緩
衝されたｐＨを有する水溶液中に溶解する。また、長期
安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍結乾燥製
剤の形態を採ることも考慮され得る。なお、静脈内に投
与される組成物のガイドラインは政府の規則、例えば
「生物学的製剤基準」によって確立されている。

【００１１】かくして、本願発明により、血漿またはＦ
ＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaを含有する血漿画分か
ら工業的スケールで、ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩ
a組成物を簡便に分離調製する方法、並びに該方法に基
づく実質上ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体等夾雑物質を含ま
ないＦＶＩＩa製剤を提供することが可能となった。以
下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、
本願発明は何等これらに限定されるものではない。

【００１２】

【実施例】実施例の記述に先立ち、本願発明において使
用されたＦＶＩＩ活性、ＦＶＩＩa含量及びＦＶＩＩa-
ＡＴIII複合体含量の測定方法について概説する。 １) ＦＶＩＩの生物学的活性 ＦＶＩＩは血液凝固の開始因子である組織因子と結合し
血液凝固を開始する。ＦＶＩＩの定量方法は、検体をＦ
ＶＩＩ欠乏血漿に添加後、一定時間インキュベーション
した後、組織因子、リン脂質及びＣａ²⁺を含有したＰＴ
試薬を添加しその凝固時間から算出した。 ２) ＦＶＩＩa含量の測定 ＦＶＩＩa含量の測定にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用す
る。ＦＶＩＩ(分子量５０ｋｄａ)は活性化すると１個の
Ｓ−Ｓ結合で結合された２本鎖に分かれる。Ｈ鎖は分子
量３０ｋｄａ、Ｌ鎖は分子量２０ｋｄａ。還元系のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥでは未活性体は分子量５０ｋｄａの位置
に、Ｈ鎖は３０ｋｄａ、Ｌ鎖は２０ｋｄａの位置に確認
される。検出されるバンドをデンシトメーターで読み取
り、分子量５０ｋｄａのバンドを未活性化ＦＶＩＩ含量
％、Ｈ鎖とＬ鎖の含量の和をＦＶＩＩa含量％とした。
活性化率はＦＶＩＩa含量をＦＶＩＩ含量とＦＶＩＩa含
量の和で除した値を百分率(％)で表した。 ３) ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体含量の測定 ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体含量の測定には非還元系ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを使用した。ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体は
５０ｋｄａから８０ｋｄａに分布する。非還元系ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで確認される分子量５０ｋｄａ以上の分子、
即ちＦＶＩＩ及びＦＶＩＩaより高分子画分をデンシト
メーターで読み取り、ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体含量と
した。

【００１３】実施例１ 新鮮凍結血漿１００リットルを冷融解し沈澱画分を遠心分離
した上清を、陰イオン交換体(ＤＥＡＥ−セファデック
ス Ａ−４０, ファルマシア社)に添加し、２０ｍＭクエ
ン酸／０.１ＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ７.０)にて充分に洗
浄し、２０ｍＭクエン酸／０.５ＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ
７.０)にてＧｌａドメインを有するＰＰＳＢ画分を溶出
した。溶出液１０リットルを５０ｍＭＴｒｉｓ／１５０ｍＭ
ＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ８.０)で予
め平衡化した抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化アフ
ィニティーゲルに展開し、５０ｍＭＴｒｉｓ／２.５Ｍ
ＮａＣｌ／５.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ８.０)で洗
浄後、５０ｍＭＴｒｉｓ／５０ｍＭＮａＣｌ／５.０ｍ
ＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ８.０)でさらに洗浄し、５０ｍ
ＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ・２
Ｎａ緩衝液(ｐＨ７.４)で溶出してＦＶＩＩ画分を得
た。該ＦＶＩＩ画分を予め４０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭ
ＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.０)で充填されているウイルス
除去膜(ベンベルグマイクロポーラスメンブレン、旭化
成)に展開し濾液を得た。得られた濾液のＦＶＩＩ純度
は８５％であった。

【００１４】上記０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液４０
ｍｌを、予め５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝
液(ｐＨ８.０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０
ｃｍのＱ−セファロースファーストフロウ(ファルマシ
ア社)カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに
同線速下、１.０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ１０.０)で１
０倍カラム容量洗浄し、１.０ｍＭＴｒｉｓ(ｐＨ１０.
０)に各種濃度のＣａＣｌ₂を添加した緩衝液で溶出し
た。溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、ＦＶＩ
Ｉa-ＡＴIII複合体含量を定量した。その結果を表１に
示す。強イオン交換体である"Ｑ"を使用した場合、ＦＶ
ＩＩa-ＡＴIII複合体の除去はｐＨ１０.０の条件下では
Ｃａ²⁺濃度４０ｍＭ以下においてのみ達成された。

【００１５】

【表１】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００１６】実施例２ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液３５ｍｌを、予め
１０ｍＭＴｒｉｓ／１００ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
５)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＱ−
セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)カラム
に線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速下、上
記緩衝液で１０カラム容量洗浄後、１０ｍＭＴｒｉｓ／
１００ｍＭＮａＣｌ／４.０ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液(ｐＨ
８.５)で線速１８０ｃｍ／ｈｒで溶出した。溶出した濃
度１.０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩa混合溶液を液
相中で２５時間熟成させた。熟成後の成績を表２に示
す。本成績は強イオン交換体"Ｑ"を使用した場合、溶出
緩衝液のＣａ²⁺濃度が４０ｍＭ以下及びｐＨが１０.０
以下の条件においてＦＶＩＩa−ＡＴIII複合体の除去が
達成され、なお且つ陰イオン交換樹脂での活性化とそれ
に連続した液相における活性化によりＦＶＩＩがほぼ完
全に活性化されることを示している。また、本実施例は
ＦＶＩＩa−ＡＴIII複合体の分離を強イオン交換体"Ｑ"
を使用し実施してもＦＶＩＩaの工業的生産が可能であ
ることを示すものである。

【００１７】

【表２】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００１８】実施例３ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
された０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液４０ｍｌを予め
５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ５.０ｃｍのＤＥ
ＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)
カラムに線速３００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速
下、１.０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ１０.０)で１０倍カ
ラム容量洗浄し、１.０ｍＭＴｒｉｓ(ｐＨ１０.０)に各
種濃度のＣａＣｌ₂を添加した緩衝液で溶出した。溶出
画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ない、ＦＶＩＩa-ＡＴ
III複合体含量を定量した。その結果を表３に示す。弱
イオン交換体である"ＤＥＡＥ"を使用した場合、ＦＶＩ
Ｉa-ＡＴIII複合体の除去はｐＨ１０.０の条件下ではＣ
ａ²⁺濃度１５ｍＭ以下においてのみ達成された。

【００１９】

【表３】 ＮＤは検出限界以下を意味する

【００２０】実施例４ 実施例１と同様な操作でウイルス除去膜濾液として調製
した０.２ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ溶液７０ｍｌを、予め
５０ｍＭＴｒｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ８.
０)で平衡化した内径５.０ｍｍ、高さ３.３ｃｍのＤＥ
ＡＥ−セファロースファーストフロウ(ファルマシア社)
カラムに線速２００ｃｍ／ｈｒで展開し、さらに同線速
下、上記緩衝液で１０カラム容量洗浄後、５０ｍＭＴｒ
ｉｓ／３０ｍＭＮａＣｌ／１.７５ｍＭＣａＣｌ₂緩衝液
(ｐＨ８.０)で線速１５０ｃｍ／ｈｒで溶出した。溶出
した濃度２.０ｍｇ／ｍｌのＦＶＩＩ及び／もしくはＦ
ＶＩＩa混合溶液を液相中で１０時間熟成させた。熟成
後の成績を表４に示す。本成績は弱イオン交換体"ＤＥ
ＡＥ"を使用した場合、溶出緩衝液のＣａ²⁺濃度が１５
ｍＭ以下、及びｐＨが１０.０以下の条件においてＦＶ
ＩＩa−ＡＴIII複合体の除去が達成され、なお且つ陰イ
オン交換樹脂での活性化とそれに連続した液相における
活性化によりＦＶＩＩがほぼ完全に活性化されることを
示している。また、本実施例はＦＶＩＩa−ＡＴIII複合
体の分離を弱イオン交換体"ＤＥＡＥ"を使用し実施して
もＦＶＩＩaの工業的生産が可能であることを示すもの
である。

【００２１】

【表４】 ＮＤは検出限界以下を意味する

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 丸野 真一 熊本県菊池郡西合志町須屋1733−31 (72)発明者 緒方 洋一 熊本県熊本市帯山７丁目９−142 (72)発明者 寺野 剛 熊本県菊池郡西合志町須屋1548−２

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液凝固第ＶＩＩ因子(以下、ＦＶＩ
   Ｉと称することがある)及び／もしくは活性化血液凝固
   第ＶＩＩ因子(以下、ＦＶＩＩaと称することがある)を
   含有する溶液を陰イオン交換樹脂に展開することを特徴
   とする、ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaの活性化血
   液凝固第ＶＩＩ因子−アンチトロンビンIII複合体(以
   下、ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体と称することがある)との
   分離方法。
2. 【請求項２】 ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体が夾雑する
   ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩa含有溶液を陰イオン
   交換樹脂に展開後、ＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体を陰イオ
   ン交換樹脂に吸着させ、ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩ
   Ｉaを溶出または素通りさせ単離精製する請求項１記載
   の分離方法。
3. 【請求項３】 ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaの
   溶出及び素通りのための緩衝液にＣａ²⁺源を含有し、そ
   の濃度が４０ｍＭ未満である請求項２記載の分離方法。
4. 【請求項４】 ＦＶＩＩ及び／もしくはＦＶＩＩaの
   溶出及び素通りのための緩衝液のｐＨが１０.０以下で
   ある請求項２または請求項３記載の分離方法。
5. 【請求項５】 請求項１から請求項４のいずれかに記
   載の分離方法に基づく工程を含むことを特徴とする血液
   凝固第ＶＩＩ因子及び／もしくは活性化血液凝固第ＶＩ
   Ｉ因子の製造方法。
6. 【請求項６】 実質的にＦＶＩＩa-ＡＴIII複合体を
   含有しない血液凝固第ＶＩＩ因子及び／もしくは活性化
   血液凝固第ＶＩＩ因子組成物。
7. 【請求項７】 請求項５記載の製造方法により得られ
   る請求項６記載の血液凝固第ＶＩＩ因子及び／もしくは
   活性化血液凝固第ＶＩＩ因子組成物。