JP2768957B2

JP2768957B2 - 高純度のヒト因子ｉｘ濃縮物および他の血漿蛋白質およびそれらの治療学的使用

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Publication number: JP2768957B2
Application number: JP63267004A
Authority: JP
Inventors: テイエリイ・ビユルヌ; カトリーヌ・ミシヤルスキイ
Original assignee: サントル・レジヨナル・ド・トランスフユジヨン・サンギン・ド・リール
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-22
Publication date: 1998-06-25
Anticipated expiration: 2013-06-25
Also published as: DK173859B1; GR3019900T3; DE3877529T2; DK587788A; NO884688D0; DE3877529D1; EP0317376A1; ES2045167T5; EP0317376B1; EP0317376B2; NO884688L; NO179997C; US5457181A; NO179997B; JPH01207239A; ES2045167T3; GR3006910T3; DK587788D0

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、出発物質として、因子IXを含有するヒト血
漿の分画を使用して、イオン交換クロマトグラフィーお
よびアフィニティークロマトグラフィーによる高純度の
因子IX濃縮物を得ることに関する。本発明によれば、ま
た、アルファー抗トリプシン、蛋白質Ｃおよび蛋白質
Ｓ、プロトロンビンまたは因子IIおよびスチャート因子
または因子Ｘが濃縮した分画を得ることが可能である。
また、この方法によると、アルブミン、抗トロンビンII
Iおよび免疫グロブリンを回収することが可能である。

第１に、因子VII濃縮物および、第２に、剛濃活性を
もつ他の蛋白質を含まない因子IX濃縮物を利用可能とす
ることは、因子VIIおよび因子IXの両者を欠く患者（Ｂ
血友病者）のために極めて有益である。事実、病気のこ
れら２つのカテゴリーは、４種類の凝固蛋白質、すなわ
ち、因子II、因子VII、因子IXおよび因子Ｘを含有する
プロトロンビン複合体（また、PPSBとして知られてい
る）の血漿蛋白質の濃縮物を使用することによって現在
処置されている。出血の出来事の間、PPSBにより処置す
ると、因子VIIを欠く患者および因子IXを欠く患者の両
者は、大きい量の他の凝固因子（因子IIおよび因子Ｘ）
を投与され、これに対して、処置前、患者は正常のレベ
ルを有する。この過剰の凝固蛋白質は、血栓症の危険を
誘発しうる。この危険は、因子VIIを欠く患者において
いっそう起こりうる。なぜなら、生体内において、この
蛋白質は比較的短い半減期（７〜９時間）を有し、正常
の生理学的レベルを再び達成するためには、大量の投与
量のPPSB、すなわち、因子II、因子IXおよび因子Ｘを注
射を必要とするからである。この現象は、、PPSBは因子
VIIにおいて通常劣るという事実によって増幅される
（例えば、20〜45IU/mgの因子Ｘに比較して10〜18IU/m
g）。全血漿を使用する処置は、提案されたが、ウイル
ス汚染のよく知られた危険を誘発する。なぜなら、治療
学的血漿は病原性ウイルスに関して通常不活性化されて
いず、そしてPPSBを使用するときと同一の大量の反復し
た注射を必要とし、そして付随する血漿誘導蛋白質の過
度の配合を生ずるからである。

イオン交換（DEAE）クロマトグラフィーおよびアフィ
ニティークロマトグラフィー［ヘパリン−セファロース
（Sepharose）］の有用性を立証するある種の刊行物が
存在する［アンダーソン（Andersson）ら、トロンボシ
ス・リサーチ（Thrombosis Research）;7、451−459、
1975］が、わずかの治療学的因子VIIおよび因子IXの濃
縮物が存在するだけである。現在、因子VII濃縮物は存
在するが、この誘導体は因子IX、因子IIおよび因子Ｘの
抗原、および大量の投与量のヘパリンを含有する。高純
度の因子IX濃縮物を調製する方法は発表された［メナシ
ェ（Menach）ら、ブラッド（Blood）、64、1220−122
7、1984］；この方法は２種類のクロマトグラフィーの
吸着工程を使用し、第１はDEAE−セファデックス（Seph
adex）の存在下におけるバッチ処理であり、第２は硫酸
デキストランのカラムの通過である。この技術は、ま
ず、PPSBの精製［DEAE−セファデックス（Sephadex）］
および引続く硫酸デキストランへの親和性による因子IX
の単離から成る。しかしながら、バッチの吸着工程（わ
ずかにのみ自動化可能でありかつ再現性に劣る方法）の
ために工業的カラムクロマトグラフィーの利点のすべて
を提供せず、そして他の潜在的に有用な血漿分画の最適
化された回収を損なう。最後に、それはプロコンバーチ
ンの同時回収に好適ではない。

今回、普通のクロマトグラフィー技術を使用する方法
が発見され、この方法は、因子IXを含有するヒト血漿の
任意の分画について使用して、分画を適当に処理した
後、高純度の因子IX、すなわち、120IU/mgより大きい比
活性を有しかつ主として因子II、因子VIIおよび因子Ｘ
を含有しない因子IXを得ることができる。

こうして、本発明は、ヒト血漿の分画を予備精製し
て、脂質および蛋白質の汚染物質を排除し、次いでこの
予備精製した分画をクロマトグラフィー処理し、そして
クロマトグラフィー処理は、なかでも、アニオン交換ク
ロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフ
ィーの組み合わせである、高純度の因子IXを調製する方
法に関する。

上に示したように、本発明の方法は、因子IXを含有す
る任意の分画、とくに、また、因子II、因子Ｘおよび因
子VII、ならびに蛋白質Ｓおよび蛋白質Ｃを含有する分
画に適用することができ、次いで、これらは前記方法に
よって、また、分離することができる。

血漿分画について実施できる処理のうちで、つぎのも
のを記載することができる： − 軟質または硬質のイオン交換樹脂上の吸着、 − リン酸三カルシウムを使用する処理、 − 硫酸バリウムまたは塩化バリウムを使用する処理、 − 硫酸アンモニウムを使用する沈殿、 − アルミニウゲル上の吸着。

これらの処理は、因子IX、ならびに引続くクロマトグラ
フィー工程を実施する前に、脱着される、存在しうる因
子II、因子VIIおよび因子Ｘを吸着する。

予備精製処理は、因子IXの比活性が0.5IU/mgより大き
いかあるいはそれに等しい、分画を得るように設計され
る。一般に、約1IU/mgの比活性は、この方法の満足な使
用を可能とし、そして所望の純度を有する因子IXを得る
ことを可能とする。

この予備精製カラムの溶離物は、アルブミン、免疫グ
ロブリン、抗トロンビンIIIおよびアルファ−抗トリプ
シンを含有する；これらの異なる物質は、引続いて精製
し、そして濃縮することができる。

引続くクロマトグラフィー工程は、好ましくは、イオ
ン交換クロマトグラフィー、例えば、DEAE−セファロー
ス（Sepharose）を使用するクロマトグラフィーを使用
することによって実施し、このクロマトグラフィーはヘ
パリンの存在下に実施することができ、次いでアフィニ
ティークロマトグラフィー、ことに固定化されたヘパリ
ンを使用するアフィニティークロマトグラフィーを実施
する。

本発明の他の面に従い、予備精製の代わりに、透析し
た水を使用して寒冷沈殿を上澄み液を希釈−ろ過してそ
のイオン力を減少させ、そしてクロマトグラフィーゲル
への選択した蛋白質の吸着を可能とすることができる。
有利には、ヘパリンを1IU/mlの最終投与量で添加する。

本発明のこの特定の面に従い、アルファ−抗トリプシ
ンは第１アニオン交換クロマトグラフィーにより保持さ
れる；それは0.13〜0.17モル濃度（M:以下、単に「モ
ル」という）のNaClを含有する、より特定的には0.16モ
ルのNaClに調節された緩衝液により、わずかに酸性のpH
において脱着する。

もちろん、この方法の任意の階段において、この分野
においてよく知られた技術によってウイルスの不活性化
を実施することができる。

しかしながら、とくに満足すべき結果は、予備精製し
た血漿分画を溶媒−洗浄剤処理、例えば、欧州特許出願
０ 131 740号に記載される処理に付することによって
得られた。

本発明による方法は、アニオン交換樹脂、とくにDEAE
−セファロース（Sepharose）ゲルを使用するクロマト
グラフィーを包含する；イオン力が増大する緩衝液を使
用する溶離によって、３つの分画、それぞれ、プロコン
バーチン（因子VII）、プロテインＣおよびプロテイン
Ｓ、およびアルファ−インター−トリプシン阻害剤が濃
縮物された分画、および最後に因子IX、因子IIおよび因
子Ｘを含む分画が回収される。

プロコンバーチンが濃縮物した分画は、0.18〜0.20モ
ル、好ましくは0.19モルのNaClを含有しかつわずかに酸
性のpHにおける緩衝液によって脱着される。それが溶離
されるとすぐに、それに1IU/ml（最終濃度）の投与量の
ヒト抗トロンビンIIIを添加することが好ましい。次い
で、分画を濃縮し、そして、この段階において、ヘパリ
ン濃度を５〜10IU/ml、好ましくは5IU/mlの調節する。

この方法によって、約45％の収率で、少なくとも0.7I
U/mg蛋白質の比活性をもつプロコンバーチンを得ること
ができる。

アニオン交換樹脂上に吸着された他の血漿分画の回収
は、イオン強度を徐々に増大することによって実施す
る。

こうして、プロテインＣおよびプロテインＳを含有す
るが、他の凝固因子（II、VII、IX、Ｘ）を含有しない
分画は、好ましくは、クロマトグラフィーの緩衝液の塩
類濃度を増加することによって実施する。塩類、好まし
くは塩化ナトリウム、の濃度は、0.26〜0.30モル、そし
て、有利には、0.28モルに調節し、そしてわずかに酸性
のpHである。

因子IX、因子IIおよび因子Ｘが濃縮した分画は、クロ
マトグラフィー緩衝液の塩類濃度を新しく増大すること
によって溶離され、この濃度は0.34〜0.38モルの塩化ナ
トリウム、好ましくは0.36モルの塩化ナトリウムであ
り、pHは8.0の調節する。

アニオン交換樹脂を使用するこのクロマトグラフィー
後、本発明による方法は、とくに因子IIおよび因子Ｘの
調製を可能とするアフィニティークロマトグラフィーに
よる、新しい精製工程を包含する。このアフィニティー
クロマトグラフィーは、好ましくは、固定化されたヘパ
リンと、とくにヘパリン−セファロース（Sepharose）
を使用して、クエン酸塩緩衝液中において実施する。

このクロマトグラフィーにより、因子IIを含有するろ
液を分離することができ、これは引続いてトロンビンの
調製のために収集することができる。

クエン酸塩緩衝液中の塩類濃度を増大することによっ
て、より精確には、塩化ナトリウムの量を0.23〜0.27の
範囲に、より好適には0.25モルに調節することによっ
て、因子Ｘに富み、そしてプロテインＣおよびＳ阻害剤
およびアルファ−インター−トリプシン阻害剤を含有す
る分画が溶離される。

最後に、NaCl濃度を0.43〜0.47モル以上、好ましくは
0.45モルに上昇することによって、因子Ｘに富んだ分画
が溶離される。次いで、この分画を限外ろ過によって濃
縮し、そして凍結乾燥する。

例えば、0.014IU/mgの比活性の相当する量で因子IXを
含有する寒冷沈殿の上澄み液を使用して出発することに
よって、この方法に従い、約120IU/mg蛋白質の高純度の
因子IXを得ることができる。

因子IXを安定化するために、因子IXの劣化および凝固
剤活性の損失を防止する、１種または２種以上の安定剤
を準備することができる。好ましくは、これらの安定化
は溶離緩衝液に添加する。

評価する種々の物質のうちで、アルギニンは因子IXを
安定化するためにとくに有効であるように思われる。好
ましくは、少なくとも1g/l、例えば、１〜5g/lは最少投
与として使用する。

その上、因子IXがクロマトグラフィーのカラムから溶
離されるとすぐに、他の安定剤を添加することによっ
て、因子IXを、ことに凍結乾燥に関して、安定化するこ
とが、また、好ましい。この場合において、リジンを少
なくとも0.5g/l、例えば、0.5〜2g/lの濃度で使用する
ことが好ましい。

こうして得られる生成物は、治療学的に、ことに血友
病の処置に、有利に使用することができる。すでに使用
されている同等の物質に比較して、この生成物は他の凝
固因子、血漿蛋白質および脂質の汚染物質を含有しない
という利点を有する。

以下の実施例によって、本発明をさらに説明するが、
これらの実施例は本発明を限定しない。

実施例出発物質として、凍結した新鮮な血漿を融解し、そし
て０〜３℃において遠心することによって得られる寒冷
沈殿の上澄み液を使用する。この物質は因子IX（比活性
0.014IU/mg）を含有する。

１、精製上澄みのバッチを、生理学的血清の存在下にDEAE−セ
ファデックス（Sephadex）A50で処理する。0.01モルの
クエン酸塩pH7.0中の0.2モルの塩化ナトリウムで洗浄し
た後、0.01モルのクエン酸塩pH7.0中の２モルの塩化ナ
トリウムで溶離を実施する。次いで、塩を限外ろ過によ
って排除する。

この予備精製した因子IXの比活性は、1IU/mg蛋白質の
範囲である。

この予備精製カラムの溶離液は、他の蛋白質のなかで
も、アルブミン、免疫グロブリン、抗トロンビンIII、
アルファ−抗トリプシンおよびトランスフェリンを含有
し、これらの蛋白質は引続いて収集し、精製し、そして
濃縮することができる。

あるいは、セファデックスを使用するこの精製の代わ
りに、透析した水で寒冷沈殿の上澄み液を希釈およびろ
過する工程を用いることができる。ヘパリンをろ過後1I
U/mlの最終濃度に添加する。この場合において、アルブ
ミン、免疫グロブリンおよび抗トロンビンIIIは次のカ
ラムのろ液中に回収され、そしてアルファ−抗トリプシ
ンはこのカラム上に吸着されるであろう。それは、ま
た、例えば、0.16モルのNaClを含有する低いイオン強度
の緩衝液で溶離することもできる；次いで、それをセフ
ァクリル（Sehpacryl）Ｓ−200（Pharmacia）によっ
て、欧州特許出願88.400235.3に記載されたプロトコル
に従い、さらに精製することができる。

この希釈／ろ過工程は、セファデックスを使用する予
備精製を実施するとき、精製される因子IXを、この方法
の終りおいて得ることができない。わずかに30％の収率
で、５〜10IU/mg蛋白質の比活性を有する因子IXが得ら
れるであろう。

２、アニオン交換クロマトグラフィー前述のように樹脂から脱着され、そして因子IXおよび
因子II、因子VIIおよび因子Ｘを含有し、1IU/ml（最終
濃度）のヘパリンが多分添加された、予備精製された分
画は、DEAE−セファロース（Sepharose）CL6Bカラム（P
hamacia）（リン酸塩緩衝液pH6.0と平衡化するように充
填している）上に注入する。

ウイルス不活性を確保するために、溶媒−洗浄剤型の
処理は0.3％のトリ−ｎ−ブチルホスフェートおよび１
％のツイーン（Tween）（Merck）を使用することによっ
て実施することができ、この処理は24℃で６時間実施す
る。

異なる分子は、カラムから、イオン強度が増大する緩
衝液を使用する溶離によって脱着される。

因子VII（プロコンバーチン）に富んだ分画の回収 0.19モルの塩化ナトリウムと混合した５ミリモルのク
エン酸塩の存在下に６ミリモルのリン酸塩緩衝液で溶離
することによって、因子IIが濃縮された分画を収集す
る。これに、抗トロンビンIIIを1IU/mlの最終濃度で添
加する。蛋白質濃度を約30g/lに調節するために限外ろ
過を実施した後、ヘパリン濃度を5IU/mlに調節し、そし
てこの濃縮物を20ml/びんの割合に再分配し、そして凍
結乾燥する。

こうして得られた濃縮物を分析すると、プロコンバー
チンは通常1.0〜2.0IU/mg蛋白質の比活性について約25I
U/mgの活性をもってここで存在することが立証される。
また、生成物の血栓形成性を増加する原因となりうる凝
固因子II、因子IXおよびＸの不存在、および蛋白質Ｃの
不存在が確証される。この生成物の弱い血栓形成力は、
さらに、ウサギについての「生体外試験」（NAPTT、TGT
50）および「生体内試験」［有効投与量50（ED50）］
によって、PPSBを使用する約30〜60IU/kgと比較して、5
00IU/kgより高いことによって立証される。

生成物の特性は、プロコンバーチンが欠乏した患者に
ついての抗出血処置に対する有意の改良を提供すること
を確立する。

蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓの分画の回収問題の分画は、pH6.0において５ミルモルのクエン酸
ナトリウムの存在下に0.28モルの塩化ナトリウムを含有
するリン酸塩緩衝液の通過によって、DEAE−セファロー
ス（Sepharose）カラムから脱着する。

溶離液は次の顔料によって特徴づけられる：プロテインC:5IU/ml プロテインS:5IU/ml それは凝固因子II、因子VII、因子IXおよび因子Ｘを
含有しない。

因子II、因子IXおよび因子Ｘを含有する分画の溶離この分画は、pH8,0に調節し、そして0.36モルの酸化
ナトリウムを含有する５ミリモルのクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液の通過によって溶離する。

因子IXは、この溶離液中に、約3IU/mgの比活性に相当
する量で存在する。この分画は因子VII:Cを含有しない
ことが保証されている。

３、固定化されたヘパリンを使用するアフィニティー
クロマトグラフィーおよび因子IX濃縮物の調製前のカラムから溶離された最後の分画は、因子II、因
子IXおよび因子Ｘの混合物を含有する；それを透析して
イオン強度を調節し、そして安定剤を3g/lの濃度に添加
する；次いで、それを20ミリモルのクエン酸塩緩衝液、
pH7.4、で均衡させた、ヘパリン−セファロース（Sepha
rose）クロマトグラフィーゲルを含有するカラム上に注
入する。

因子IIを含有するろ液を集める。次いで、基を0.25モ
ルのNaClを含有するクエン酸塩緩衝液で溶離し、そして
因子Ｘが濃縮物された分画を集める。

0.45モルの塩化ナトリウムを含有する緩衝液でさらに
各々し、これに3.5gのアルギニンを安定剤として添加す
ることによって、因子IX濃縮物を集める。

それが溶離されるとすぐに、安定剤として1g/lのリジ
ン、および必要に応じてヘパリンを5IU/ml最終濃度で添
加する。次いで、生成物を限外ろ過によって濃縮し、ろ
過により滅菌し、そして凍結乾燥する。

生成物の平均の生化学的特性を下に記載する：蛋白質類（g/l） 0.19±0.03 因子IX:C 25±3 因子IXの比活性（IU/mg蛋白質） 130±10 因子II:C（IU/ml） 0.1 因子VII:C（IU/ml） 0.1 因子IXa（％）０ AT III（IU/ml）０この因子IXは濃縮物は、検出可能な因子（因子XI、XI
I、プレカリクレイン HMW キニノゲン）または活性化
因子（トロンビン、Xa、pka....）を含有しない。それ
は、また、プロトロンビン複合体の主要な汚染物質であ
る、他の蛋白質、例えば、インター−アルファ−トリプ
シン阻害剤または因子C₄）を本質的に含有しない。

その血栓形成活性は、ウサギ血行停止モデル（Wessle
r 試験）によって決定して、究めて低い:DE₅₀＞450IU/
kg。

安定剤によって、可溶化後、因子IXの量は、室温にお
いて、活性を損失しないで、少なくとも８時間安定であ
る。

最初のヒト研究は、注射の時間において、非耐性の反
応を示さない。因子Ｖ、フィブリノゲンおよび血小板の
投与は、変動が示さざう、生成物の可能な血栓形成性を
示す。

人間への注射は、因子IXの40〜45％の回収率および20
〜25時間の半減期を示し、こうしてこれらの値はPPSBを
使用して得られるものに匹敵する。

この濃縮は、高品質の生成物であると思われ、そして
Ｂ血友病の出血を処置するとき、増大した安全性を提供
する。

本発明の主な態様および特徴は、次の通りである。

１、因子IXを含有するヒト血漿の分画を、アニオン交換
クロマトグラフィーにかけ、次いで固定化されたヘパリ
ンを使用するアフィニティークロマトグラフィーにかけ
ることを特徴とする、因子IXを含有するヒト血漿の分画
を分離する方法。

２、アニオン交換クロマトグラフィーはヘパリンの存在
下に実施する上記第１項記載の方法。

３、アニオン交換クロマトグラフィーは半硬質DEAEゲル
を使用して実施する上記第１または２方法。

４、アニオン交換クロマトグラフィーはDEAE−セファロ
ース（Sepharose）CL6Bゲルを使用して実施する上記第
３項記載の方法。

５、アフィニティークロマトグラフィーはヘパリン−ア
ガロースを使用して実施する上記第１〜４項のいずれか
に記載の方法。

６、アフィニティークロマトグラフィーはヘパリン−セ
ファロース（Sepharose）CL6Bを使用して実施する上記
第５項記載の方法。７、血漿分画は寒冷沈殿の上澄み液
である上記第１〜６項のいずれかに記載の方法。

８、高純度の因子IX濃縮物を調製するため、寒冷沈殿の
上澄み液を、アニオン交換クロマトグラフィーの前に、
予備精製する上記第１〜７項のいずれかに記載の方法。

９、予備精製はDEAE−セファデックス（Sephadex）を使
用するクロマトグラフィーによって実施する上記第８項
記載の方法。

10、予備精製した分画の因子IXの比活性は少なくとも0.
5IU/mg蛋白質である上記第８または９項記載の方法。

11、予備精製した分画の因子IXの比活性は約1IU/mg蛋白
質である上記第10項記載の方法。

12、因子IXの安定剤を溶離緩衝液に添加する上記第８〜
11項のいずれかに記載の方法。

13、安定剤はアルギニンである上記第12項記載の方法。

14、1g/lの最少量のアルギニンを添加する上記第13項記
載の方法。

15、凍結乾燥の安定剤として、リジンを、溶離直後に、
因子IX濃縮物に添加する上記第８〜14項のいずれかに記
載の方法。

16、予備精製した分画を溶媒−洗浄剤処理によってウイ
ルス不活性化する上記第８〜15項のいずれかに記載の方
法。

17、120IU/mg蛋白質に等しいかあるいはそれより大きい
比活性を有する高純度の因子IX濃縮物。

18、上記第８〜16項のいずれかに記載の方法に従って得
られる上記第17項記載の濃縮物。

19、上記第17または18項記載の因子IX濃縮物を含有する
製薬学的配合物。

20、アニオン交換クロマトグラフィーのろ液を分離した
後、溶離をイオン力が増大する緩衝液を使用して実施し
て、それぞれ、アルファ−１−抗トリプシン（AAT）、
プロコンバーチン（因子VII）、蛋白質Ｃおよび蛋白質
Ｓが濃縮した４種類の分画および最後に因子IXを分離す
る上記第１〜７項のいずれかに記載の方法。

21、アニオン交換クロマトグラフィーより前に、希釈−
ろ過工程を実施する上記第20項記載の方法。

22、AATが濃縮した分画を、0.13〜0.17モル/lの塩化ナ
トリウムを含有する緩衝液により、わずかに酸性のpHに
おいて溶離する上記第20または21項記載の方法。

23、因子VIIが濃縮した分画を、018〜0.20モル/lの塩化
ナトリウムを含有する緩衝液により、わずかに酸性のpH
において溶離する上記第20〜22項のいずれかに記載の方
法。

24、因子VII濃縮物を得るため、溶離した分画を、それ
にヘパリンおよび抗トロンビンIIIを添加することによ
って、処理する上記第20〜23項のいずれかに記載の方
法。

25、蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓが濃縮した分画を、0.26〜
0.30モル/lの塩化ナトリウムを含有する緩衝液により、
わずかに酸性のpHにおいて溶離する上記第20〜24項のい
ずれかに記載の方法。

26、因子IXが濃縮した分画を、0.34〜0.38モル/lの塩化
ナトリウムを含有する緩衝液により、わずかに酸性のpH
において溶離する上記第20〜25項のいずれかに記載の方
法。

27、因子IX濃縮物を得るため、因子IXをリジンの添加に
より安定化する上記第20〜26項のいずれかに記載の方
法。

28、リジンは、アフィニティークロマトグラフィーの前
および後に、添加する上記第27項記載の方法。

29、アルギニンをアフィニティークロマトグラフィーの
ために使用する溶離緩衝液中に添加する上記第27または
28項記載の方法。

30、上記第20〜29項のいずれかに記載の方法によって調
製された血漿誘導体。

31、上記第30項記載の血漿誘導体を含む製薬学的配合
物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 35/14 Ａ６１Ｋ 35/14 Ｂ 38/43 Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｇ０１Ｎ 33/48 ＫＧ０１Ｎ 33/48 Ａ６１Ｋ 37/465 (56)参考文献欧州公開229026（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，253（17) （1978）Ｐ．5946−5951 Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，11 （４）（1981）Ｐ．397−412 Ｔｈｒｏｍ．Ｒｅｓ．，19（６) （1980）Ｐ．743−755 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00 A61K 6/00 - 48/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】寒冷沈殿の上澄み液をクロマトグラフ処理
にかけることにより因子IXを含有するヒト血漿分画の分
離方法において、ａ）クロマトグラフイーによる予備精製工程、ｂ） DEAE−セフアロースおよび段階的にイオン強度が
高められる緩衝液を用いて選択的溶離を行うアニオン交
換クロマトグラフイーによる分離工程、次いでｃ）ヘパリン−セフアロースおよび段階的にイオン強
度が高められる緩衝液を用いて選択的溶離を行うアフイ
ニテイ−クロマトグラフイー工程、の３種のクロマトグラフイー工程からなることを特徴と
する前記分離方法。