DK173859B1

DK173859B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et højrenset humant faktor IX koncentrat og andre plasmaproteiner

Info

Publication number: DK173859B1
Application number: DK198805877A
Authority: DK
Inventors: Thierry Burnouf; Catherine Michalski
Original assignee: Ct Regional De Transfusion San
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 2001-12-31
Also published as: DK587788D0; NO884688L; DE3877529D1; GR3006910T3; JP2768957B2; EP0317376A1; DE3877529T2; EP0317376B1; NO884688D0; NO179997C; ES2045167T5; ES2045167T3; JPH01207239A; GR3019900T3; EP0317376B2; NO179997B; US5457181A; DK587788A

Description

i DK 173859 B1

Den foreliggende opfindelse angår fremstilling af højrenset faktor IX koncentrat ved hjælp af ionbytterchromato-grafiske- og affinitetschromatografiske metoder under anvendelse som udgangsmateriale af en fraktion af humant 5 plasma indeholdende faktor IX; den omhandlede fremgangsmåde gør det også muligt at opnå fraktioner beriget med a-antitrypsin, protein c og protein S, proconvertin eller faktor VII, prothrombin eller faktor II og Stuart faktor eller faktor X. Fremgangsmåden gør det også muligt at 10 udvinde albumin, antithrombin III og immunoglobuliner.

Muligheden er for det første at kunne fremstille faktor VII koncentrater og for det andet faktor IX koncentrater uden andre proteiner med koagulerende virkninger af umå-15 delig betydning for patienter, der mangler både. faktor VII og faktor IX (B hæmophiler) . Faktisk behandles disse to kategorier af sygdom for øjeblikket under anvendelse af koncentrater af plasmaproteiner af et prothrombint kompleks (også betegnet PPSB), der indeholder 4 koagule-20 rende proteiner, nemlig faktor II, VII, IX og X. Patienter, der mangler faktor vil, og patienter, der mangler IX, behandles under deres blødningsperioder med PPSB, modtager begge arter patienter andre koagulerende faktorer (faktor II og faktor X), hvor de inden behandlingen 25 havde normale niveauer heraf. Dette overskud af koagulerende proteiner kan bevirke en risiko for thrombose. Denne fare er mere sandsynlig hos de patienter, der mangler faktor VII, da dette protein in vivo har en forholdsvis kort halveringstid (7 til 9 timer), der, for at reetable-30 re normale fysiologiske niveauer, indebærer injektion af massive doser af PPSB og således af faktor II, faktor IX og X. Dette fænomen forstærkes af den kendsgerning, at PPSB sædvanligvis er fattige på faktor VII (10 til 18 IU/ml i forhold til f.eks. 30 til 45 IU/ml af faktor X).

2 DK 173859 B1

Behandlinger med totalt plasma er blevet foreslået, men disse inducerer velkendt risiko for viral kontamination, da den terapeutiske plasma sædvanligvis ikke er inaktive-ret med hensyn til pathogene vira og kræver de samme mas-5 sive og gentagende injektioner som med PPSB og bevirker en overbelastning med medfølgende plasma-afledte proteiner .

Skønt der findes visse publikationer der beskriver anven-10 deligheden af ionbytter (DEAE) chromatografi og affini-tetschromatografi (heparin-sepharose) (Anderson et al., Thrombosis Research; 7, 451-459, 1975), findes der få specifikke terapeutiske faktor VII og faktor IX koncentrater. Der findes for øjeblikket et faktor VII koncen-15 trat, men dette derivat indeholder antigener af faktor IX, II og X, protein C og store doser af heparin. En fremgangsmåde til fremstilling af faktor IX koncentrat med stor renhed er blevet beskrevet af (Menaché et al.,

Blood, 64, 1220-1227, 1984); denne metode anvender 2 20 chromatografiske adsorptionstrin, idet det første er en batch vis oparbejdning i nærværelse af DEAE-sephadex, det andet trin er en gennemledning gennem en søjle af dex-transulfatgel. Denne metode består af først at rense PPSB (DEAE-sephadex) og derefter isolere faktor IX ved hjælp 25 af dens affinitet overfor dextransulfat. Imidlertid frembyder denne metode ikke alle fordelene ved industriel søjlechromatografi på grund af batch adsorptionstrinnet (en metode, der kun i ringe grad kan automatiseres, og som er dårligt reproducerbar) og svækker den optimerede 30 udvindelse af andre potentielt værdifulde plasmafraktioner. Endelig fremmer metoden ikke den samtidige udvindelse af proconvertin.

3 DK 173859 B1

Bajaj et al (Preparative Biochemistry 11,4; 1981; 397-412) beskriver ligeledes en fremgangsmåde til rensning, hvis første trin udføres på bariumcitrat og ammoniumsulfat, men hvis specifikke trin, på heparin-agarose, 5 udføres i nærvær af benzamidin. Tilsætningen af benzami-din, der letter rensningen, alt imedens aktiviteten af faktor IX bevares (og proteaserne hæmmes), er uforenelig med en terapeutisk brug af det fremkomne produkt.

10 GB patent 1 460 607 beskriver flere fremgangsmåder til rensning af blodfaktorer, bl.a. faktor IX, ved chromato-grafiske metoder, ud fra Cohn I eller III-fraktionen, d.v.s. en pasta, der fremkommer ved en udfældning med ethanol. Efter rensning på DEAE-sephadex og heparin-15 sepharose opnår man en fraktion, der især indeholder aktiveret faktor IX, undtagen når man beskytter faktor IX-molekylet ved tilsætning af benzamidin.

Han har nu opdaget en fremgangsmåde, der anvender almin-20 delige chromatografiske metoder, der kan anvendes på en hvilken som helst fraktion af humant plasma indeholdende faktor IX, således at der opnås, efter at fraktionen er blevet passende behandlet, faktor IX med høj renhed, nemlig med en specifik aktivitet på mere end 120 IU/mg og i 25 det væsentlige uden faktor II, VII og X.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af faktor IX med høj renhed, hvor en fraktion af humant plasma behandles i et forrensningstrin, således at 30 der fjernes fedtholdige og proteinholdige forurenede bestanddele, og at man herefter underkaster denne forrensede fraktion for chromatografisk behandling, idet man kombinerer bl.a. anionbytterchromatografi og affinitets-chromatografi.

4 DK 173859 B1

Som angivet ovenfor kan den omhandlede fremgangsmåde anvendes på en hvilken som helst plasmafraktion, der indeholder faktor IX, og specielt på fraktioner, der også 5 indeholder faktor II, X og VII, såvel som proteinerne S og C, der herefter også kan fraskilles ved hjælp af fremgangsmåden.

Forrensningsbehandlingen er designet således, at der op-10 nås en fraktion, i hvilken dens specifikke aktivitet af faktor IX er større end eller lig med 0,5 IU/mg. Sædvanligvis muliggør en specifik aktivitet på ca. 1 IU/mg, at fremgangsmåden kan anvendes tilfredsstillende og muliggør, at man kan opnå en faktor IX med den ønskede renhed.

15

Eluatet af denne forrensningssøjle indeholder albumin, immunoglobuliner, antithrombin III og α-antitrypsin; disse forskellige forbindelser kan herefter renses og koncentreres , 20

De efterfølgende chromatografiske trin udføres fortrinsvis under anvendelse af ionbytterchromatografi f.eks. på DEAE sepharose, idet denne chromatografi muligvis udføres i tilstedeværelse af heparin, efterfulgt af affinitets-25 chromatografi, specielt på immobiliseret heparin.

Naturligvis er det muligt på et hvilket som helst trin af fremgangsmåden at udføre en viral inaktiveringsbehandling ved hjælp af metoder, der er velkendte af fagmanden.

30

Imidlertid har man opnået særligt tilfredsstillende resultater ved at underkaste den forrensede plasmafraktion for en opløsningsmiddel-detergent behandling, f.eks. som den der er beskrevet i EP patentansøgning nr.O 131 740.

5 DK 173859 B1

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter chromatografi på en anionbytterharpiks og mere specielt på en DEAE-sepharose gel; ved hjælp af eluering med en puffer med 5 stigende ionstyrke, udvindes 3 fraktioner beriget henholdsvis på prokonvertin (faktor VII), proteinerne C og S og en α-inter-trypsin inhibitor og til slut med faktor IX, II og X.

10 Fraktionen, rig på prokonvertin, desorberes af en puffer indeholdende en NaCl koncentration på 0,18 til 0,20 M og fortrinsvis 0,19 M og ved et svagt surt pH. Så snart som forbindelsen eluerede, er det tilrådeligt at tilsætte til denne en dosis på 1 IU/ml (slutkoncentration) humant an-15 titrombin III. Fraktionen koncentreres herefter, og på dette trin indstilles heparinkoncentrationen til mellem 5 og 10 IU/ml og fortrinsvis til 5 IU/ml.

Denne metode gør det muligt at opnå, med et udbytte på 20 ca. 45%, en prokonvertin med en specifik aktivitet på mindst 0,7 IU/mg protein.

Udvindeisen af andre plasmafraktioner, adsorberede på anionbytterharpiksen, sker ved gradvis at forøge ionstyr-25 ken.

Således elueres en fraktion indeholdende proteinerne C og S, men uden de andre koagulerende faktorer (II, VII, IX og X}, fortrinsvis ved at forøge saltkoncentrationen af 30 chromatografipufferen. Saltkoncentrationen, fortrinsvis natriumchlorid, skal være mellem 0,26 og 0,30 M og indstilles fordelagtigt til 0,28 M og et svagt surt pH.

6 DK 173859 B1

Fraktionen, rig på faktor IX, II og X, elueres ved hjælp af en ny stigning af saltkoncentrationen i chromatografi-pufferen, idet sidstnævnte bringes til mellem 0,34 og 0,38 M natriumchlorid og fortrinsvis 0,36 M, idet pH ind-5 stilles til 8,0.

Efter denne chromatografi på anionbytterharpikser, omfatter den omhandlede fremgangsmåde et nyt rensningstrin ved hjælp af affinitetschromatografi, der muliggør specielt 10 af fraskille faktorerne II og X. Denne affinitetschromatograf i udføres på heparin-sepharose i en citratpuffer.

Denne chromatografi gør det muligt at fraskille et filtrat indeholdende faktor II, der herefter opsamles for at 15 fremstille trombin.

Ved at forøge saltkoncentrationen i citratpufferen og mere præcist ved at justere mængden af natriumchlorid til området 0,23-0,27 M og fortrinsvis til 0,25 M, kan man 20 eluere en fraktion, rig på faktor X, og som muligvis indeholder protein C og protein S og a-inter-trypsininhibi-tor.

Til slut elueres ved at hæve NaCl koncentrationen til en 25 størrelse på ca. 0,43-0,47 M og fortrinsvis til 0,45 M en fraktion, der er rig på faktor IX. Denne fraktion koncentreres herefter ved ultraf iltrering__og_ frysetørres.

Ved at gå ud fra f.eks. en cryoprecipitatsupernatant in-30 deholdende faktor IX i en mængde svarende til en specifik , aktivitet på 0,014 IU/mg, muliggør denne fremgangsmåde, at man kan opnå faktor IX af høj renhed med ca. 120 IU/mg protein.

7 DK 173859 B1

For at forøge stabiliteten af faktor IX er det muligt at tilsætte en eller flere stabilisatorer, der beskytter forbindelsen mod nedbrydning og undgår tab af koagulerende virkning. Fortrinsvis sættes disse stabilisatorer til 5 elueringspufferen.

Valgt i forskellige undersøgte forbindelser til stabilisering synes arginin at være særlig effektiv til stabilisering af faktor IX. Fortrinsvis anvendes 1 g/1 f.eks.

10 mellem 1 og 5 g/1 som minimum dosis.

Herudover kan det være tilrådeligt at beskytte faktor IX, specielt med hensyn til frysetørring af forbindelsen, ved at tilsætte en anden stabilisator så snart som forbindel-15 sen eluerer fra den chromatografiske søjle. I dette tilfælde anvendes fortrinsvis lysin i en koncentration på mindst 0,5 g/1, f.eks. mellem 0,5 og 2 g/1.

Det fremstillede produkt kan med fordel anvendes som te-20 rapeutikum, specielt til behandling af hcemophili B. I forhold til lignende, allerede anvendte forbindelser har dette produkt den fordel, at det er uden andre koagulerende faktorer, plasmaproteiner og fedtholdige forurenende bestanddele.

25 Følgende eksempler illustrerer opfindelsen nærmere.

EKSEMPEL

30 Som et udgangsmateriale anvendes en cryoprecipitatsuper-natant, der er opnået ved at optø og centrifugere en frossen frisk plasma ved 0-3 °c. Dette materiale indeholder faktor IX (specifik aktivitet 0,014 IU/mg).

8 DK 173859 B1 1. Forrensning

En supernatant del behandles med DEAE-sephadex A 50 harpiks i nærværelse af fysiologisk serum. Efter vask med 5 0,20 M natriumchlorid i en 0,01 M citratpuffer ved pH

7,0, elueres med 2 M natriumchlorid i en 0,01 M citratpuffer ved pH 7,0. Herefter fjernes saltet ved ultrafiltrering .

10 Den specifikke aktivitet af faktor IX denne forrensede fraktion er omkring 1 IU/mg.

Eluatat af denne forrensningssøjle indeholder blandt andre proteiner, albumin, immunoglobuliner, antithrombin 15 III, α-antitrypsin og transferrin, der herefter kan indsamles, renses og koncentreres.

2. Anionbytterchromatografi 20 Den forrensede fraktion, desorberet fra harpiksen beskrevet ovenfor og indeholdende faktor IX og faktorerne II, VII og X, eventuelt tilsat 1 iU/ml heparin (slutkon-centration) indsprøjtes på en DEAE-sepharose CL 6B søjle (Pharmacia) fyldt til ligevægt med en phosphatpuffer ved 25 pH 6, 0.

For at sikre viral inaktivering inden injektion i søjlen er det muligt at udføre en opløsningsmiddel-detergenttype behandling under anvendelse af 0,31 tri-n-butylphosphat 30 og II tween 80 (Merck), idet behandlingen udføres 6 timer ved 24 °c.

De forskellige molekyler desorberes fra søjlen ved hjælp af eluering med en puffer med stigende ionstyrke.

9 DK 173859 B1

Udvinding af fraktionen rig på faktor VII (prokonvertin)

Ved eluering med en 6 mM phosphatpuffer i nærværelse af 5 natriumcitrat 5 mM blandet med natriumchlorid 0,19 M opsamles en fraktion rig på faktor VII. Til denne sættes antithrombin m til en slutkoncentration på 1 IU/ml.

Efter ultrafiltrering, for at justere proteinkoncentrationen til ca. 30 g/1, indstilles heparinkoncentrationen 10 til 5 IU/ml, og koncentratet fordeles i en mængde på 20 ml per flaske og frysetørres.

Analyse af det således opnåede koncentrat viser, at pro-konvertiv forefindes heri med en aktivitet på ca. 25 15 IU/ml med en specifik aktivitet, der sædvanligvis ligger på 1,0 til 2,0 lU/mg protein. Man kan også bekræfte at koaguleringsfaktorerne II, IX og X ikke forefindes, hvilket medvirker til at forøge produktets thrombogenicitet og manglende tilstedeværelse af protein C. Produktets 20 svage thrombogene evne bekræftes yderligere ved "in vitro" forsøg (NAPTT, TGT 50 ) og "in vivo" effektiv dosis 50 (ED50) på kaniner på mere end 500 IU/kg i forhold til ca. 30 til 60 IU/kg med PPSB.

25 Produktets egenskaber viser, at det udviser signifikante forbedringer ved anti-blødnings behandlinger af patienter med prokonvertinmangel.

Udvinding af protein C og protein S fraktionen.

30

Den pågældende fraktion desorberes fra DEAE-sepharosesøj-len ved at lede phosphatpuffer i nærværelse af 5 mM natriumcitrat ved en pH 6,0 indeholdende 0,28 M natriumchlorid gennem søjlen.

10 DK 173859 B1

Eluatet er karakteriseret ved følgende indhold:

Protein C: 5 IU/ml 5 Protein S: 5 IU/ml

Det er uden koaguleringsfaktorerne II, VII, IX og X.

Eluering af fraktionen indeholdende faktorerne 10 II, IX og X

Denne fraktion elueres ved gennemledning af 5 mM citrat-phosphatpuffer indstillet til en pH på 8,0 og indeholdende 0,36 M natriumchlorid.

15

Faktor IX forefindes i eluatet i en mængde svarende til en specifik aktivitet på ca. 5 lU/mg. Det er blevet påvist, at denne fraktion ikke indeholder noget som helst faktor VII:C.

20 3. Affinitetschromatoqrafi på immobiliseret heparin og fremstilling af faktor IX koncentratet.

Den sidste fraktion elueret fra foregående søjle inde-25 holder en blanding af faktorerne II, IX og X; den dialyseres for at indstille ionstyrken, og stabilisator tilsættes til en koncentration på 3 g/1; herefter indsprøjtes den i en søjle indeholdende en heparin-sepharose-chromatografisk gel bragt i ligevægt med 20 mM citratpuf-30 fer, pH 7,4.

Et filtrat indeholdende faktor II opsamles.

11 DK 173859 B1

Gelen underkastes herefter eluering med citratpuffer beriget med 0,25 M NaCl, og en faktor X-beriget fraktion opsamles.

5 Ved yderligere eluering med puffer indeholdende 0,45 M natriumchlorid, hvortil der er sat 3,5 g/1 arginin som stabilisator, opsamles faktor IX koncentratet.

Så snart som dette eluerer, tilsætter man 1 g/1 lysin som 10 stabilisator og eventuelt heparin til slutkoncentration på 5 IU/ml. Herefter koncentreres slutproduktet ved ultrafiltrering, sterilfiltreres og frysetørres.

De gennemsnitlige biokemiske egenskaber af produktet er 15 angivet nedenfor:

Proteiner (g/1) 0,19 ±0,03

Faktor IX:C (IU/ml) 25 ± 3

Faktor IX specifik aktivitet (IU/ml) 130 + 10 20 Faktor II:C (IU/ml) 0,1

Faktor X:C (IU/ml) 0,1

Faktor VII:C (IU/ml) 0,1

Faktor IXa (%) 0 AT III (IU/ml) 0 25

Dette faktor IX koncentrat indeholder ingen påviselige koaguleringsfaktorer (faktorerne XI, XII, prekallikrein, HMW kininogen) eller nogen som helst aktiverede faktorer (thrombin, Xa, pka...). Det er også i det væsentlige uden 30 andre proteiner som f.eks. inter-a-trypsininhibitor eller faktor Cj, der er hovedforurenende bestanddele af pro-thrombinkomplekset.

12 DK 173859 B1

Koncentratets thrombogene aktivitet bestemt ved hjælp af den kaninstatistiske model (Wessler forsøg) er umådelig lav: DEs,j > 4 50 IU/kg.

5 Ved hjælp af stabilisatorerne er efter genopløsning mængden af faktor IX stabil i mindst 8 timer ved stuetemperatur uden noget tab af aktivitet.

De første undersøgelser på mennesker indicerer ikke på 10 injektionstidspunktet/ at præparatet ikke kan tåles. Dosis af faktor V, fibrinogen og blodplader viser ikke nogen som helst variation/ der kunne indicere eventuelt mulig thrombogenicitet ved produktet.

15 Injektioner på patienter viser en 40 til 45% genfindelse af faktor IX og en halveringstid på 20 til 25 timer, hvilke værdier svarer til de, der opnås med PPSB injektioner .

20 Dette koncentrat er således et produkt af høj kvalitet og frembyder forøget sikkerhed, når man behandler blødninger hos B hæmophile.

Claims

1. Fremgangsmåde til fraskillelse af en fraktion af humant plasma indeholdende faktor IX ved at underkaste 5 den cryoudfaeldede supernatante fraktion til en chromato-grafisk proces, kendetegnet ved, at fremgangsmåden indeholder de 3 følgende chromatografiske trin: a) forrensning ved chromatografi; 10 b) fraskillelse ved anionbytterchromatografien på DEAE- sepharose og selektiv eluering med en puffer, hvis ionstyrke er forhøjet trinvis; c) affinitetschromatografi på heparin/sepharose og selektiv eluering med en puffer, hvis ionstyrke er 15 forhøjet trinvis.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at forrensningstrinet er udført ved chromatografi på DEAE/sephadex. 20

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at efter forrensningstrinet er den specifikke aktivitet af faktor IX i den rensede fraktion fra 0,5 til 1 IU/mg protein. 25

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at efter fraskillelse af filtratet, er chromatografien udført ved anvendelse af eluant natrium phosphat-citrat, til hvilket natriumchlorid er tilsat til gradvis forhø- 30 jelse af dens ionstyrke, med hensyn til at fraskille tre fraktioner beriget, henholdsvis, i prokonvertin (Faktor ( Vil), protein C og protein S og endelig faktor IX. DK 173859 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at heparin er tilsat til pufferen.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller krav 5, kende-5 tegnet ved, at natriumchloridkoncentrationen af pufferen er forhøjet til 0,18-0,20 M, ved en lettere sur pH-værdi, med hensyn til at eluere fraktionen beriget i proconvertin .

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at heparin og anti-thrombin III er tilsat til den eluerede fraktion, som er beriget i proconvertin.

8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 4 15 til 6, kendetegnet ved, at natriumchloridkoncentrationen af pufferen er forhøjet til 0,26-0,30 M, ved en lettere sur pH-værdi, med hensyn til at eluere fraktionen beriget i protein C og protein S.

9. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 4 til β og 8, kendetegnet ved, at natriumchloridkoncentra-tionen af pufferen er forhøjet til 0,34-0,38 M, ved en lettere alkalisk pH-værdi, med hensyn til at eluere fraktionen beriget i faktor IX. 25

10. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 9, kendetegnet ved, at fraktionen beriget i faktor IX er udsat for en affinitetschromatografi på heparin-sepharose CL6B. 30

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at efter fraskillelse af filtratet indeholdende faktor 11, er chromatografien udført ved anvendelse af eluat af DK 173859 B1 ' en citratpuffer, til hvilken natriumchlorid er tilført med hensyn til lettere forhøjelse af dens ionstyrke.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10 eller 11, kendeteg- 5 net ved, at 0.5 til 2.0 g/1 af lysin tilsættes til elue- ringspufferen med hensyn til at stabilisere faktor IX.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved, at natriumchloridkoncentrationen af pufferen er 10 forhøjet til 0.23-0.21 m ved eluering af fraktionen beriget i faktor X.

14. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af krav 10 til 13, kendetegnet ved, at natriumchloridkoncentrationen 15 af pufferen er forhøjet til 0.43-0.47 M ved eluering af fraktionen beriget i faktor IX.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at der tilsættes 1 til 5 g/1 af arginin til elueringspuf- 20 feren med hensyn til at stabilisere faktor IX.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14 eller krav 15, kendetegnet ved, at .der tilsættes 0.5 til 2 g/1 af lysin til den eluerede fraktion, som er beriget i faktor IX med 25 hensyn til at stabilisere faktor IX, specielt med hensyn til frysetørring.

17. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 16, kendetegnet ved, at det indeholder en viral inak- 30 tivering ved hjælp af opløsningsmiddel-detergentbehand-ling efter forrensningstrinet.