NO179997B

NO179997B - Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk anvendbart faktor IX-konsentrat med stor renhet

Info

Publication number: NO179997B
Application number: NO884688A
Authority: NO
Inventors: Thierry Burnouf; Catherine Michalski
Original assignee: Centre Regional De Transfusion
Priority date: 1987-10-23
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1996-10-21
Also published as: EP0317376B1; US5457181A; GR3006910T3; DK173859B1; NO179997C; DK587788A; NO884688D0; NO884688L; DK587788D0; ES2045167T3; JP2768957B2; GR3019900T3; DE3877529D1; ES2045167T5; JPH01207239A; EP0317376A1; DE3877529T2; EP0317376B2

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et Faktor IX-konsentrat med høy renhet ved å underkaste en kryosupernatantfraksjon av humant plasma inneholdende Faktor IX for en kromatogråfisk prosess.

Disse og andre trekk fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Oppfinnelsen vedrører fremstilling av faktor IX-konsentrat med høy renhet ved hjelp av metoder med ionebytte-kromatografering og affinitetskromatografering under anvendelse av en fraksjon av et hvilket som helst humant plasma inneholdende faktor IX som et utgangsmaterial. Oppfinnelsen gjør det mulig å oppnå fraksjoner anriket med alfa-antitrypsin, protein C og protein S, prokonvertin eller faktor VII, protrombin eller faktor II og Stuart faktor eller faktor X. Oppfinnelsen gjør det også mulig å utvinne albumin, antitrombin III og immunoglobuliner.

Tilgjengeliggjøring av for det første faktor Vll-konsentrater og for det andre faktor IX-konsentrater som er fri for andre proteiner med levringsvirkninger ville være ytterst gunstig for pasienter som mangler både faktor VII og faktor IX (B-hemofile). Disse to kategorier av sykdom er hittil behandlet ved å anvende konsentrater av plasmaproteiner av et protrombin-kompleks (også kjent som PPSB) inneholdende 4 levrende proteiner, nemlig faktor II, VII, IX og X. Pasienter som under sine blødningsepisoder behandles med PPSB, nemlig pasienter som mangler faktor VII og pasienter som mangler faktor IX, mottar begge store doser av andre levringsfaktorer (faktor II og X), mens de før behandlingen har normale nivåer. Dette overskudd av levringsproteiner kan medføre en fare for trombose. Denne fare er mer sannsynlig med de pasienter som mangler faktor VII ettersom dette protein in vivo har en forholdsvis kort halveringstid (7 - 9 timer) som for å reetablere normale fysiologiske nivåer innbefatter injeksjon av massive doser av PPSB og således av faktorer II, IX og X. Dette fenomen forsterkes ved det forhold at PPSB vanligvis har lavt innhold av faktor VII (10-18 IU/ml sammenlignet med 30 - 45 IU/ml av faktor X f. eks). Behandlinger med totalt plasma har vært foreslått, men disse induserer velkjente farer for viral forurensning ettersom det terapeutiske plasma vanligvis ikke inaktiveres med hensyn til patogene virus og krever de samme massive og gjentatte injeksjoner med PPSB og resulterer i overbelastninger med ekstra tilførte plasma-avledede proteiner.

Selv om det er visse publikasjoner som viser brukbarheten av ionebytte-kromatografering (DEAE) og affinitetskromatografering (heparin-Sepharose) (Andersson et al., Thrombosis

Research; 7, 451-459, 1975), er det få tilgjengelige spesifikke terapeutiske faktor VII- og faktor IX-konsentrater. Det finnes for tiden et faktor Vll-konsentrat, men dette derivat inneholder antigener av faktor IX, II og X, protein C og store doser heparin. En metode for fremstilling av faktor IX-konsentrat med høy renhet er blitt publisert (Menaché et al., Blood, 64, 1220 - 1227, 1984). Denne metode anvender to kromatografiske adsorpsjonstrinn, hvorav det første er en porsjonsbehandling i nærvær av DEAE-Sephadex, det andre er en passering gjennom en kolonne av dekstransulfatgel. Denne metode består i først å rense PPSB (DEAE-Sephadex) og deretter isolere faktor IX ved å utnytte dens affinitet for dekstransulfat. Denne metode frembyr imidlertid ikke alle fordelene med industriell kolonnekromatografering pga porsjons-adsorpsjonstrinnet (en metode som bare kan automatiseres i liten grad og som er dårlig reproduserbar) og nedsetter den optimaliserte utvinning av andre potensielt nyttige plasmafraksjoner. Metoden begunstiger heller ikke den samtidige utvinning av prokonvertin.

I oppfinnelsens sammenheng er det nå funnet en metode hvorved det anvendes konvensjonelle kromatografiske metoder, som kan anvendes på hvilken som helst fraksjon av humant plasma inneholdende faktor IX slik at det etter at fraksjonen er blitt passende behandlet tilveiebringes en faktor IX med høy renhet, nemlig med spesifikk aktivitet på mer enn 120 I U/mg og hovedsakelig fritt for faktor II, VII og X.

Oppfinnelsen muliggjør således fremstilling av faktor IX med høy renhet, hvor en fraksjon av humant plasma underkastes et forrensingstrinn for å eliminere lipidholdige og proteinholdige forurensninger og deretter underkaste denne forrensede fraksjon for kromatografisk behandling, under kombinasjon av bl. a. anionebytte-kromatografering og affinitetskromatografering.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en fremgangsmåte for fremstilling av et Faktor IX-konsentrat med høy renhet ved å underkaste en kryosupernatantfraksjon av humant plasma inneholdende Faktor IX for en kromatografisk prosess, som er kjennetegnet ved at den omfatter de følgende tre kromatografiske trinn:

a) en forrensing ved kromatografering på DEAE-Sephadex,

b) en separasjon ved anionbytte-kromatografering på DEAE-Sepharose og selektiv eluering med en fosfat-natriumcitratbuffer, supplert med heparin, hvis ionestyrke

økes trinnvis med natriumklorid slik at man separerer tre fraksjoner, idet den første er anriket med prokonvertin, den andre med proteiner C og S, den tredje med Faktor IX, og

c) en separasjon ved affinitetskromatografering på heparin-Sepharose og selektiv eluering med en citratbuffer supplert med lysin og arginin, hvis ionestyrke økes

trinnvis med natriumklorid slik at man separerer to fraksjoner, idet den første er anriket med Faktor X, den andre er anriket med Faktor IX, idet Faktor II allerede er separert inn i det gjennomgående filtrat.

Som angitt i det foregående kan fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendes for hvilken som helst plasmafraksjon inneholdende faktor IX og som også inneholder faktor II, X og VII, såvel som proteiner S og C, som da også kan separeres ved hjelp av den nevnte metode.

Blant de mulige behandlinger som plasmafraksjonen kan underkastes kan nevnes:

adsorpsjon på myke eller harde ionebytte-harpikser

behandling med trikalsiumfosfat

behandling med bariumsulfat eller bariumklorid

utfelling med ammoniumsulfat

adsorpsjon på aluminiumgel.

Disse forskjellige behandlinger adsorberer faktor IX, såvel som faktor II, VII og X som eventuelt er til stede og som desorberes før de etterfølgende kromatografiske trinn foretas.

Forrensingsbehandlingen er ment å gi en fraksjon hvori den spesifikke aktivitet av faktor IX er større enn eller lik 0,5 IU/mg. Generelt muliggjør en spesifikk aktivitet på 1 IU/mg at metoden kan anvendes tilfredsstillende og muliggjør oppnåelse av en faktor IX med den ønskede renhet.

Eluatet fra denne forrensningskolonne inneholder albumin, immunoglobuliner, anti-trombiner III og alfa-antitrypsin idet disse forskjellige substanser deretter kan renses og konsentreres.

De etterfølgende kromatografiske trinn gjennomføres ved å anvende ionebytte-kromatografering på DEAE-Sepharose, idet denne kromatografering gjennomføres i nærvær av heparin, etterfulgt av affinitetskromatografering, på immobilisert heparin. Det er mulig å erstatte forrensingen med et trinn med fortynningsfiltrering av kryopresipitat-supernatanten med osmosebehandlet vann slik at dens ionestyrke reduseres og tillater adsorpsjon av selekterte proteiner på kromatograferingsgelen. Fordelaktig tilsettes heparin til en endelig dose på 1 IU/ml.

Ved dette spesielle aspekt bør alfa-antitrypsinet tilbakeholdes i den første anionbytte-kromatograferingskolonne. Det kan desorberes ved hjelp av buffer inneholdende mellom 0,13 og 0,17 M NaCI, mer spesielt innstilt til 0,16 M NaCI og med en svakt sur pH. Det er selvfølgelig mulig ved et hvilket som helst trinn av fremgangsmåten å gjennomføre en viral inaktiveringsbehandling ved hjelp av en metode som er velkjent for den fagkyndige på området.

Spesielt tilfredsstillende resultater er imidlertid oppnådd ved å underkaste den forrensede plasmafraksjon for en løsningsmiddel-detergentbehandling, f. eks den behandling som er beskrevet i europeisk patentsøknad 0.131.740.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen inkluderer kromatografering på en ionebytter-harpiks og mer spesielt på en DEAE-Sepharosegel. Ved hjelp av eluering med en buffer med økende ionestyrke blir 3 fraksjoner utvunnet som er anriket med henholdsvis prokonvertin (faktor VII), proteiner C og S og alfa-inter-trypsin-inhibitor og endelig med faktor IX, II og X.

Fraksjonen som er rik på prokonvertin desorberes ved hjelp av en buffer inneholdende en NaCI-konsentrasjon på 0,18 - 0,20 M og foretrukket 0,19 M og en svakt sur pH. Så snart denne er eluert er det tilrådelig å tilsette den en dose på 1 IU/ml (sluttkonsen-trasjon) av humant antitrombin III. Fraksjonen blir så konsentrert og ved dette trinn innstilles heparin-konsentrasjonen mellom 5 og 10 IU/ml og foretrukket til 5 IU/rnl.

Metoden muliggjør at det med et utbytte på 45 % kan oppnås et prokonvertin med en spesifikk aktivitet på minst 0,7 IU/mg protein.

Utvinningen av de andre plasmafraksjoner adsorbert på ionebytter-harpiksen foregår ved gradvis å øke ionestyrken. Således blir en fraksjon inneholdende protein C og S, men fri for de andre levringsfaktorer (II, VII, IX, X) foretrukket eluert ved å øke saltkonsentrasjonen i kromatograferingsbufferen. Saltkonsentrasjonen, foretrukket natriumklorid, skal være mellom 0,26 og 0,30 M og innstilles fordelaktig til 0,28 M og ved en svakl: sur pH. Den fraksjon som er rik på faktor IX, II og X elueres ved en ny økning av saltkonsentrasjonen i kromatograferingsbufferen, idet den sistnevnte bringes til mellom 0,34 og 0,38 M natriumklorid og foretrukket 0,36 M, idet pH innstilles til 8,0.

Etter denne kromatografering på anionbytter-harpiksen inkluderer fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen et nytt rensetrinn ved affinitetskromatografering som særlig tillater separering av faktorer II og X. Denne affinitetskromatografering gjennomføres på immobilisert heparin, nærmere bestemt på heparin-Sepharose i citratbuffer.

Denne kromatografering gjør det mulig å separere et filtrat inneholdende faktor II som deretter kan samles for å fremstille trombin.

Ved å øke saltkonsentrasjonen i citratbufferen og mer nøyaktig ved å innstille mengden av natriumklorid i området 0,23 - 0,27 M og mer foretrukket 0,25 M, elueres en fraksjon som er rik på faktor X og som eventuelt inneholder protein C- og F-inhibitorer og alfa-inter-trypsin-inhibitor.

Endelig, ved å heve NaCI-konsentrasjonen til en dose på omtrent 0,43 - 0,47 M eller mer og foretrukket 0,45 M, elueres en fraksjon som er rik på faktor 'X. Denne fraksjon kan så konsentreres ved ultrafiltrering og frysetørking.

Ved f. eks å begynne med en kryopresipitat-supernatant inneholdende faktor IX i en mengde tilsvarende en spesifikk aktivitet på 0,014 IU/mg gjør bruk av denne metode det mulig å oppnå en faktor IX med høy renhet på omtrent 120 IU/mg protein.

For å begunstige stabiliteten av faktor IX er det mulig å tilveiebringe ett eller flere stabiliseringsmidler som beskytter den mot nedbrytning og unngår tap av koagulerende aktivitet. Foretrukket tilsettes disse stabiliseringsmidler til elueringsbufferen.

Blant de forskjellige substanser som er undersøkt syntes arginin å være særlig effektiv for stabilisering av faktor IX. Foretrukket anvendes mellom 1 og 5 g/l, foretrukket 1 g/l, som en miniumumsdose.

Videre kan det også være tilrådelig å beskytte faktor IX, særlig i forbindelse med dens frysetørking, ved å tilsette et ytterligere stabiliseringsmiddel som fort som den elueres fra kromatograferingskolonnen. I dette tilfelle anvendes lysin foretrukket ved en konsentrasjon på minst 0,5 g/l, f. eks mellom 0,5 og 2 g/l.

Produktet oppnådd på denne måte kan fordelaktig anvendes i terapeutiske midler, særlig for behandling av hemofili B. Når sammenlignet med ekvivalente substanser som tidligere har vært anvendt har dette produkt fordelen med at det er fritt for andre koagulerende faktorer, plasmaproteiner og lipidholdige forurensninger.

Det etterfølgende eksempel illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL

Som utgangsmaterial anvendes en kryopresipitat-supernatant som oppnås ved å tine og sentrifugere ved 0 - 3°C et frosset friskt plasma. Dette material inneholder faktor IX (spesifikk aktivitet 0,014 IU/mg).

1. Forrensing

En supernatantporsjon behandles med DEAE-Sephadex A 50-harpiks i nærvær av fysiologisk serum. Etter vasking med 0,20 M natriumklorid i en 0,01 M citratbuffer ved pH 7,0 gjennomføres elueringen med 2 M natriumklorid i en 0,01 M citratbuffer ved pH 7,0. Saltet fjernes så ved ultrafiltrering.

Den spesifikke aktivitet av faktor IX i denne forrensede fraksjon er i området 1 IU/mg.

Eluatet fra denne forrensingskolonne inneholder blant annet proteiner, albumin, immunoglobuliner, antitrombin III, alfa-antitrypsin og transferrin, som deretter kan samles, renses og konsentreres.

Alternativt er det mulig å erstatte denne forrensing på Sephadex ved hjelp av el: trinn med fortynning og filtrering av kryopresipitat-supernatanten med osmosebehancllet vann (1/3 tynning). Heparinet tilsettes til en endelig konsentrasjon på 1 IU/ml etter filtrering. I dette tilfellet skal albumin, immunoglobuliner og antitrombin III utvinnes fra filtratet fra den neste kolonne og alfa-antitrypsinet skal adsorberes på kolonnen. Det kan også elueres ved hjelp av en buffer med lav ionestyrke inneholdende f. eks 0,16 M NaCI ved pH 6,0. Den kan så ytterligere renses ved kromatografering på Sephacryl S-200

(Pharmacia) i henhold til en metode som er beskrevet i europeisk patentsøknad 88.400235.3.

Det bemerkes videre at dette fortynnings/filtreringstrinn ikke vil muliggjøre oppnåelse ved slutten av prosessen av en faktor IX så renset som den vil være når det anvendes et forrensningstrinn på Sephadex. Med bare 30 % utbytte vil det bli oppnådd en faktor IX med spesifikk aktivitet på 5 -10 IU/mg protein.

2. lonebytter- kromatoqrafering

Den forrensede fraksjon, desorbert fra harpiksen beskrevet i det foregående og inneholdende faktor IX og faktorer II, VII og X, med 1 IU/ml heparin (endelig konsentrasjon) eventuelt tilsatt, injiseres på en DEAE-Sepharose CL 6B kolonne (Pharmacia) fylt til likevekt med en fosfatbuffer ved pH 6,0.

For å sikre viral inaktivering, før innføring på kolonnen, er det mulig å gjennomføre en løsningsmiddel-detergent-type behandling ved å anvende 0,3 % av tri-n-butylfosfat og 1 % "Tween" 80 (Merck) idet behandlingen gjennomføres ved 24°C i 6 timer.

De forskjellige molekyler desorberes fra kolonnen ved hjelp av eluering med en buffer med økende ionestyrke.

Utvinning av fraksjonen rik på faktor VII ( prokonvertin)

Ved eluering med en 6 mM fosfatbuffer i nærvær av natriumcitrat 5 mM blandet med natriumklorid 0,19 M, samles en fraksjon rik på faktor VII. Til denne tilsettes antitrombin III til en endelig konsentrasjon på 1 IU/ml. Etter ultrafiltrering for å innstille protein-konsentrasjonen til omtrent 30 g/l innstilles heparinkonsentrasjonen til 5 IU/ml og konsentratet fordeles i en mengde på 20-ml pr flaske og frysetørkes.

Analyse av det således oppnådde konsentrat viser at prokonvertinet er til stede her med en aktivitet på omtrent 25 IU/ml for en spesifikk aktivitet vanligvis i området 1,0 - 2,0 IU/mg protein. Man bekrefter også fraværet av levringsfaktorer II, IX og X, som ville bidra til en økning av trombogenisiteten av produktet, og fravær av protein C. Den svake trombogene evne for produktet påvises videre ved "in vitro" tester (NAPTT, TGT 50) og "in vivo" (effektiv dose 50) (ED50) på kaniner på mer enn 500 IU/kg i sammen-ligning med omtrent 30 - 60 IU/kg med PPSB.

Egenskapene av produktet viser at det tilveiebringer vesentlige forbedringer ved anti-blødningsbehandling for pasienter med en prokonvertinmangel.

Utvinning av protein C- og protein S- fraksion

Angjeldende fraksjon desorberes fra DEAE-Sepharosekolonnen ved gjennomføring av fosfatbufferen i nærvær av 5 mM natriumcitrat ved pH 6,0 inneholdende 0,28 M natriumklorid.

Eluatet karakteriseres ved følgende innhold:

Protein C : 5 IU/ml

Protein S 5 IU/ml

Det er fritt for koagulasjonsfaktor II, VII, IX og X.

Eluering av fraksjonen inneholdende faktorer II, IX og X

Denne fraksjon elueres ved gjennomføring av 5 mM citrat-fosfatbufferen innstilt til pH 8,0 og inneholder 0,36 M natriumklorid.

Faktor IX er til stede i eluatet i en mengde tilsvarende en spesifikk aktivitet på omtrent 3 IU/mg. Det er sikret at denne fraksjon ikke inneholder noen faktor VII:C. 3. Affinitetskromatografering på immobilisert heparin og fremstilling av faktor IX-konsentratet

Den siste fraksjon eluert fra den foregående kolonne inneholder en blanding av faktor II, IX og X. Den dialyseres for å innstille ionestyrken og stabiliseringsmiddel tilsettes til en konsentrasjon på 3 g/l. Fraksjonen blir så injisert på en kolonne inneholdende en heparin-Sepharose kromatografisk gel i likevekt med 20 mM citratbufferen, pH 7,4.

Et filtrat inneholdende faktor II samles.

Gelen blir så underkastet en eluering med citratbufferen anriket med 0,25 M NaCI og en faktor X-anriket fraksjon samles.

Ved videre eluering med buffer inneholdende 0,45 M natriumklorid, hvortil det er tilsatt 3,5 g/l arginin som et stabiliseringsmiddel, samles faktor IX-konsentratet.

Så snart dette eluerer tilsettes 1 g/l lysin som stabiliseringsmiddel, og eventuelt heparin til en endelig konsentrasjon på 5 IU/ml. Produktet blir så konsentrert ved ultrafiltrering, sterilisert ved filtrering og frysetørket.

De gjennomsnittlige biokjemiske egenskaper av produktet er angitt i det følgende:

Dette faktor IX-konsentrat inneholder ikke noen påvisbare levringsfaktorer (faktorer XI, XII, prekallikrein, HMW kininogen) eller noen aktiverte faktorer (trombin, Xa, pka ...). Det er også i det vesentlig fritt for andre proteiner som inter-alfa-trypsin-inhibitorer eller faktor C4 som er vesentligere forurensninger av protrombin-komplekset.

Dets trombogene aktivitet, som bestemt ved hjelp av den statiske kaninmodell (Wessler-testen) er ytterst lav: DE50 > 450 IU/kg.

Ved hjelp av stabiliseringsmidlene, etter fornyet oppløseliggjøring, er mengden av faktor IX stabil i det minste i 8 timer ved romtemperatur uten noen tap av aktivitet.

De første forsøk med mennesker indikerer ikke ved injeksjonstidspunktet noen intoleransereaksjon. Doseringen av faktor V, fibrinogen og blodplater viser ikke noen variasjon som indikerer noen mulig trombogenisitet av produktet.

Injeksjonene i mennesker indikerer en 40 - 50 % opptagning av faktor IX og en halveringstid på 20 - 25 timer og dette er verdier som er sammenlignbare med dem som oppnås med PPSB-injeksjoner.

Dette konsentrat viser seg å være et produkt med høy kvalitet og frembyr økt sikkerhet ved behandling av blødninger hos B-hemofile.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et Faktor IX-konsentrat med høy renhet ved å underkaste en kryosupernatantfraksjon av humant plasma inneholdende Faktor IX for en kromatografisk prosess, karakterisert ved at den omfatter de følgende tre kromatografiske trinn: a) en forrensing ved kromatografering på DEAE-Sephadex, b) en separasjon ved anionbytte-kromatografering på DEAE-Sepharose og selektiv eluering med en fosfat-natriumcitratbuffer, supplert med heparin, hvis ionestyrke økes trinnvis med natriumklorid slik at man separerer tre fraksjoner, idec den første er anriket med prokonvertin, den andre med proteiner C og S, den tredje med Faktor IX, og c) en separasjon ved affinitetskromatografering på. heparin-Sepharose og selektiv eluering med en citratbuffer supplert med lysin og arginin, hvis ionestyrke økes trinnvis med natriumklorid slik at man separerer to fraksjoner, idet den første er anriket med Faktor X, den andre er anriket med Faktor IX, idet Faktor II allerede er separert inn i det gjennomgående filtrat.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at etter forrensingstrinnet har den oppsamlede fraksjon en F IX spesifikk aktivitet på 0,5 til 1 IU/mg protein.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at natriumkloridkonsentrasjonen i trinn b) økes til 0,18 - 0,20 M, ved en svakt sur pH, for å eluere fraksjonen anriket med prokonvertin.

4. Fremgangsmåte som er angitt i krav 3, karakterisert ved at den eluerte prokonvertinfraksjonen suppleres med heparin og antitrombin III.

5. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1 og 3 , karakterisert ved at natriumkloridkonsentrasjonen i trinn b) ytterligere økes til 0,26 - 0,30 M, ved en svakt sur pH, for å eluere fraksjonen anriket med protein C og protein S.

6. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1, 3 og 5, karakterisert ved at natriumkloridkonsentrasjonen i trinn b) ytterligere økes til 0,34 - 0,38 M, ved en svakt basisk pH, for å eluere fraksjonen anriket med Faktor IX.

7. Fremgangsmåte som angitf i krav 1, karakterisert ved at filtratet i trinn c) som inneholder Faktor II oppsamles.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at natriumkloridkonsentrasjonen i trinn c) økes til 0,23-0,27 M for å eluere fraksjonen som er anriket med Faktor X.

9. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1 og 8, karakterisert ved at natriumkloridkonsentrasjonen i trinn c) ytterligere økes til 0,43 - 0,47 M for å eluere fraksjonen som er anriket med Faktor IX.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at den eluerte fraksjon, anriket med Faktor IX, suppleres med 0,5 - 2 g lysin pr liter, som et Faktor IX-stabiliseringsmiddel under et etterfølgende frysetørkingstrinn.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at en viral inaktivering ved løsningsmiddel-detergentbehandling utføres etter forrensingstrinnet.