KR20130124507A - 응고 인자 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 함유한 용액으로부터 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법 - Google Patents

응고 인자 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 함유한 용액으로부터 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법 Download PDF

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Abstract

하기 단계를 포함하는, 응고 인자 FXI와 FXIa, 및 주요 성분으로 면역글로불린을 함유한 원천 용액(source solution)으로부터 FXI 및 FXIa를 감소 및/또는 제거하는 방법:
a) FXI 및/또는 FXIa 함유 용액을 헤파린 또는 헤파란이 매트릭스 물질에 결합된 것인 친화도 크로마토그래피 겔과 접촉시키는 단계,
b) FXI 및/또는 FXIa가 흡착되게 하는 단계, 및
c) 흡착 매질(adsorption media)로부터 FXI 및/또는 FXIa가 제거된 용액을 분리하는 단계.

Description

응고 인자 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 함유한 용액으로부터 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법{A process for reduction and/or removal of FXI and FXIa from solutions containing said coagulation factors}
본 발명은 FXI 및 FXIa를 함유한 용액으로부터 FXI 및 FXIa를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 FXI 및 FXIa를 함유한 농축물(concentrate) 및 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 FXI 및 FXIa를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
응고 인자 XI (FXI)는 혈액의 응고에 관여하는 단백질로 잘 알려져 있고, 응고 캐스캐이드(coagulation cascade)의 고유한 경로의 일부를 나타낸다. FXI는 응고 동안 활성 화합물인, 활성화된 FXI (FXIa)의 전구체이다. 따라서, FXIa는 의도치않게 응고를 개시하여 생명을 위협하는 혈전 형성(thrombotic event)을 초래할 수 있기 때문에, 환자에게 정맥 내로 투여되는 약제학적 제제로부터 FXIa를 제거하는 것이 필수적이다. 반면에, FXI 및/또는 FXIa의 농축물은 FXI의 결핍 또는 불충분한 활성과 연관된 질환을 앓는 환자, 또는 신속하고 효과적인 응고가 매우 중요한, 과다 출혈을 경험한 환자를 위해 유용할 수 있다. 이와 같은 농축물은 또한 예를 들면, 혈우병 A 및 B에서와 같이, 응고 인자에 대한 저해성 항체로 인한 질환을 앓는 환자에게 유용할 수 있다. 그러한 저해제는 출혈 발생(bleeding event)을 유발할 수 있고, 따라서, 환자는 응고 및 상처 봉합(wound closure)을 지지할 작용제를 필요로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 FXI 및/또는 FXIa를 함유한 용액으로부터 FXI 및/또는 FXIa를 제거하거나 또는 적어도 감소시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 제시된 방법에 의해, FXI, FXIa의 치료적으로 적용가능한 농축물, 또는 FXI와 FXIa의 혼합물을 포함하는, 치료적으로 적용가능한 농축물을 제공하는 것이다.
FXI 농축물을 제조하는 방법이 여러 가지 알려져 있다. Bouma 및 Griffin은 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1977, vol. 252, no. 18, pp. 6432-6437에서 5개의 크로마토그래피 단계에 의해 인간 혈장으로부터 FXI를 정제하는 방법을 공개했다. 시간적 순서로 사용된 크로마토그래피 물질은 DEAE-Sephadex®, QAE-Sephadex®, SP-Sephadex®(2회), 및 최종적으로, Sepharose®에 결합된 콘카나발린(Concanavalin) A이다. 사용된 모든 완충액은 폴리브렌® (polybrene)및 벤즈아미딘을 포함한다.
M. BURNOUF-RADOSEVICH 및 T. BURNOUF는 TRANSFUSION, 1992, 32, pp. 861-867에서 FXI를 흡착하는, 음으로 하전된 필터(Zeta plus 50S) 상에서 동결-결핍(cryo-poor) 혈장의 여과, 흡착된 FXI의 용리 및 양이온 교환 수지 (Sulfate-Sepharose® Fast Flow) 상에서의 용리액의 크로마토그래피에 의한 FXI 동결건조물(lyophilisate)의 제조를 개시한다. 용리된 FXI는 동결건조 전에 항트롬빈 및 헤파린과 함께 제제화시켰다.
Hiroshl Mashiko 및 Hidenobu Takahashi는 BIOL . CHEM . HOPPE - SEYLER, 1994, vol. 375, pp. 481-484에서 고 분자 질량 키니노겐(high molecular mass kininogen)-친화도 크로마토그래피 및 Q-Sepharose® 상에서의 크로마토그래피에 기반한 돼지 FXI 및 FXIa의 제조 방법을 개시했다. 접촉 활성화(contact activation)를 방지하고 단백질 가수분해에 의한 소화(proteolytical digestion)를 극복하기 위해, 이들은 사용된 완충액에 폴리브렌® 및 벤즈아미딘을 첨가했다. 이들은 또한 헤파린-세파로오스(Heparin-Sepharose)® 친화도 크로마토그래피에 의해 FXI를 정제하지 못했다고 보고했다.
Hiroshl Mashiko 및 Hidenobu Takahashi에 의한 또 다른 논문은 AGENTS AND ACTIONS SUPPLEMENTS,(BIRKHAEUSER VERLAG, BASEL, CH), 1992, vol. 38, part 2, pp. 249-256에서 고 분자 질량 키니노겐, Q-Sepharose® 및 Protein A-Superose®에서 Polybrene® 및 벤즈아미딘을 포함한 완충액에 의한 크로마토그래피에 기반한 돼지 FXI 및 FXIa의 제조 방법을 논의했다.
Tait 및 Fujikawa는 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1981, vol. 262, no. 24, pp. 11651-11656에서 3개의 크로마토그래피 단계 및 완충액 중 Polybrene® 및 벤즈아미딘의 이용에 의해 인간 혈장으로부터 FXI 및 프리칼리크레인(prekallikrein)을 정제하는 방법을 논의했다. 고 분자량 키니노겐의 경쇄의 일부를 나타내는 합성 펩티드를 담체에 고정화시키고, 혈장으로부터 일부 IgG 캐리오버(carryover), FKI, 및 프리칼리크레인을 단리하기 위해 이용했다. 뒤이어, 헤파린-아가로오스 크로마토그래피에 의해 프리칼리크레인 및 FKI를 분리하고, 최종적으로 CM-Sephadex®에 의해 정제(polish)하여 FXI 및 프리칼리크레인의 외관상 순수한(apparently pure) 분획을 수득했다.
Saito 등은 THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, vol. 52, pp. 850-861, 1973에서 Ca3(PO4)2,상의 혈장 흡착, 복수의 암모늄 술페이트 분획화(fractionation) 및 FXI의 활성화를 방지하기 위해 존재하는, 폴리브렌®을 이용한, QAE-Sephadex®(2회), Sephadex®G150, 및 SP-Sephadex®에서의 연속적인 크로마토그래피로 구성된 FKI의 정제 방법을 제시했다.
발명의 요약
본 발명은 FXI, FXIa, 또는 이들의 혼합물의 함량을 이들 단백질 및 주요 성분으로 면역글로불린을 함유한 용액으로부터 감소시키는 방법을 제공한다. 이는 상기 단백질을 실리케이트(특히, 실리카, 퍼라이트(perlite), 제올라이트 또는 규조토), 알루미늄 히드록시드(Al2(OH)3), 알루미늄 옥시드 히드록시드(AlO(OH)), 알루미늄 옥시드(Al2O3) 또는 친화도 크로마토그래피에 적합한 물질로부터 선택된 흡착 물질 상에 흡착시키는 것에 의해 달성된다. 상기 친화도 크로마토그래피에 적합한 물질은 매트릭스 물질 (예를 들면, 제올라이트, 또는 아크릴레이트 및 사카라이드와 같은 폴리머), 특히, 헤파린 크로마토그래피를 위해 사용되는 겔, 예를 들면, 헤파린 세파로오스™ FF 또는 Toyopearl AF Heparin 650 M™에 결합된, 폴리사카라이드, 예를 들면, 덱스트란, 헤파린, 또는 헤파란으로 구성된다.
원천(source)을 함유한 용액은 혈액, 또는 혈장으로부터 유래된 FXI 및/또는 FXIa를 함유한 액체, 또는 생물공학적 방법으로부터 유래된 액체일 수 있다. 그와 같은 용액의 공지된, 그러나, 비-한정적인 예는 동결-결핍 혈장, 콘(Cohn) 방법의 중간체(예를 들면, 재구성된 페이스트 I+II+III) 및 그의 유도체, 키스틀러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 방법의 중간체(예를 들면, 재구성된 침전물 A) 및 그의 유도체, 또는 재조합 단백질 발현으로부터 수득된 용액, 또한, 면역글로불린-감마(IgG-γ)의 용액의 경우일 수 있는, 주로 다른 단백질로 구성되고, FXI 또는 FXIa는 불순물인 것인 용액이다.
응고 인자 FXI와 FXIa, 및 주요 성분으로 면역글로불린을 함유한 용액으로부터 FXI 및 FXIa를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) FXI 및/또는 FXIa 함유 용액을 헤파린 또는 헤파란이 매트릭스 물질에 결합된 것인 친화도 크로마토그래피 겔과 접촉시키는 단계,
b) FXI 및/또는 FXIa가 흡착되게 하는 단계, 및
c) 흡착 매질(adsorption media)로부터 FXI 및/또는 FXIa가 제거된 액체(the liquid deprived of FXI and/or FXIa)를 분리하는 단계.
또한, 매트릭스 또는 겔의 활성 부위가 이미 항트롬빈에 의해 포화되거나, 또는 매트릭스 또는 겔에 FXI 및/또는 FXIa를 로딩(loading) 하는 동안 항트롬빈에 의해 포화될 수 있게 한다면, 단계 a)를 변형할 수 있다.
흡착은 원천 용액을 흡착제와 혼합하고, 교반시키고, 흡착제에 로딩된 FXI 및/또는 FXIa를 침전, 여과 또는 원심분리와 같은 공지된 방법에 의해 상층액으로부터 제거하는 것인 배치 흡착(batch adsorption)으로 수행될 수 있다. 대안적인 절차는 흡착 물질을 크로마토그래피 컬럼에 충진하고, 흡착제에 FXI 및/또는 FXIa를 로딩하기 위해 원천 용액을 적용하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 실리카, 퍼라이트, 제올라이트 또는 규조토로부터 선택된 실리케이트가 추가적으로 FXI 및/또는 FXIa의 흡착제로 이용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 옥시드 히드록시드 또는 알루미늄 옥시드로부터 선택된 추가적인 흡착 매질(adsorption medium)이 이용될 수 있다.
또한, 배치 방식으로 수행된 흡착, 예를 들면, 규조토 또는 알루미늄 히드록시드를 흡착 물질로 이용한 흡착과 Heparin Sepharose™를 흡착제로 이용한 크로마토그래피 컬럼에서 수행된 흡착을 조합하는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 매트릭스 물질에 결합된 헤파린 또는 헤파란 상의 흡착은 크로마토그래피 물질을 항트롬빈-III에 의해 사전 조건화(precondition)시킨 후 수행된다.
FXI 및/또는 FXIa의 탈착을 방지하기 위해 로딩된 흡착제를 세척 완충액으로 조심스럽게 세척하고, 결과적으로 수득된 세척 용액을 더 가공하고, 이 FXI/FXIa-제거 용액(FXI-FXIa-depleted solution)에서 다른 목적 화합물, 예를 들면, 면역글로불린, 특히, IgG의 회수를 최적화시키기 위해, 통과액(flow-through) 및/또는 상층액에 첨가할 수 있다. Heparin Sepharose™상에서 처리된 FXI/FXIa-제거 용액은 통상적으로 0.15 IU FXI/ml 미만, 구체적으로, 0.1 IU FXI/ml 미만, 훨씬 더 구체적으로, 0.00 내지 0.05 IU FXI/ml를 포함한다. 그와 같은 제거 용액의 국제 단위(international unit, IU)로 표현된 FXIa의 함량은 통상적으로 10 mU FXIa/ml 미만, 구체적으로 5 mU FXIa/ml 미만, 훨씬 더 구체적으로, 0.0 내지 1.0 mU FXIa/ml이다.
FXI/FXIa-제거 용액의 추가적인 처리는 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계를 내포할 수 있고, 주어진 예는 용매/디터전트 처리(S/D 처리), UV-조사, 저온살균(pasteurization), 낮은 pH 인큐베이션, 카프릴레이트 침전 또는 나노여과이다. 다른 단계는 크로마토그래피 단계, 약제학적 활성 화합물의 농축물을 수득하기 위한 농축, 제제화, 및 충진(filling)을 포함하고, 이들은 예를 들면, 면역 글로불린, 특히, IgG, 알부민, 피브리노겐, 항트롬빈 또는 알파-1-항트립신과 같은 다양한 단백질의 제조로부터 알려져 있으며, 약제학적 조성물을 수득하기 위해 의무적이고, 제조될 제품에 의존적이다.
FXI 및/또는 FXIa는 로딩된 흡착제로부터 용리시킬 수 있고, 특히, 흡착제가 매트릭스에 결합된 헤파린 또는 헤파란을 갖는 친화도 크로마토그래피 겔인 경우, 용리시킬 수 있다. 친화도 크로마토그래피로부터 FXI 및/또는 FXIa의 용리는 0.2-1.4 M NaCl, 구체적으로, 0.25-1.0 M NaCl, 훨씬 더 구체적으로, 0.25-0.5 M NaCl 및 0.003-0.03 M 포스페이트 또는 이와 균등한 이온 강도로 구성된 용리 완충액을 이용하여 수행된다. 그에 의해 수득된 FXI 및/또는 FXIa를 함유한 용액은 또한 전술된 방법에 의해 바이러스-불활성화시키고, 한외/정용여과에 의해 농축시켜 FXI, FXIa, 또는 이들 모두를 함유한 농축물을 수득할 수 있다. 상기 농축물을 FXI 또는 FXIa의 결핍이나 불활성과 관련된 질환을 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 수득하기 위해 아쥬반트를 이용하여 제제화시킬 수 있다.
항트롬빈을 파과(break through)될 수 있게 하긴 하나, 헤파린 크로마토그래피 겔의 유출액(effluent)의 FXI 및 FXIa의 수준이 상기 단백질의 검출 한계 미만이라는 것을 발견한 것은 놀라웠다. 항트롬빈이 헤파린 및 헤파란 친화도 겔에 강하게 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, FXI 및 FXIa가 항트롬빈, 특히, 항트롬빈-β 이소형으로 대체될 것으로 예상되었다. 항트롬빈 포화 헤파린 친화도 겔(antithrombin saturated heparin affinity gel)로부터 FXI 및 FXIa를 낮은 이온 강도 내지 중간 이온 강도이고, 0.2 내지 1.4 NaCl을 필수적으로 함유한 용리 완충액, 또는 그와 균등한 이온 강도의 완충액에 의해 선택적으로 FXI 및 FXIa를 용리시킬 수 있고, 항트롬빈-III(AT-III)를 보다 높은 이온 강도, 필수적으로, 1.5M 보다 높은 농도의 NaCl, 특히, 약 2.0M NaCl을 포함하는 완충액에 의해 용리시키는 것이 필요하다는 것은 훨씬 더 놀라웠다. 이 특징은 FXI/FXIa의 별개의 용리, 뒤이은 AT-III의 용리, 또는 AT-III도 용리시킬 수 있도록 충분히 높은 이온 강도의 완충액으로 용리시키는 경우, FXI, FXIa 및 AT-III를 함유한 혼합물의 동시-용리(co-elution)를 가능하게 한다.
일반적으로 선행 기술 문헌에서 접촉 활성화를 방지하고 단백질 가수분해에 의한 소화를 극복하기 위해 교시되었던, Polybrene®및 벤즈아미딘의 완충액으로의 첨가가 불필요하다는 것을 발견하는 것이 훨씬 더 놀라웠다.
본 발명의 일 목적은 매트릭스 겔에 결합된 덱스트란, 헤파린 또는 헤파란을 갖는 친화도 크로마토그래피 겔을 항트롬빈-III (AT-III)로 사전 조건화시키는 것에 의해 최대 강점까지 수행된다. 사전 조건화는 크로마토그래피 물질의 활성 부위가 AT-III로 포화되는 정도까지 수행될 수 있다. 이 절차는 FXI 및 FXIa에 대한 친화도 겔의 결합능을 개선시키고, 다른 응고 인자의 결합을 방지하거나 또는 적어도 높은 정도까지 방해하므로 특히 유용하다. 따라서, 친화도 겔로부터의 용리 후 수반된 단백질로부터 FXI 및 FXIa를 선택적으로 제거하고 다른 응고 인자를 포함하지 않는, FXI 및 FXIa의 용액을 수득할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득가능한 약제학적 활성 성분의 농축물 및 그의 수득된 약제학적 조성물도 본 발명의 대상이다.
본 발명에 따른 약제학적 활성 성분의 농축물 또는 본 발명의 약제학적 조성물에서, 약제학적 활성 성분은 IgG이다.
본 발명은 FXI, FXIa, 또는 이들의 혼합물의 함량을 이들 단백질 및 주요 성분으로 면역글로불린을 함유한 용액으로부터 감소시키는 방법을 제공한다. 이는 실리케이트 (특히, 규조토)로부터 선택된 흡착 물질, 또는 친화도 크로마토그래피에 적합한 물질, 특히, 헤파린- 또는 헤파란-친화도 크로마토그래피를 위해 사용된 겔, 예를 들면, Heparin Sepharose™ FF 또는 Toyopearl AF Heparin 650 M™에 상기 단백질을 흡착시키는 것에 의해 달성된다.
원천을 함유한 용액은 혈액, 또는 혈장으로부터 유래된 FXI 및/또는 FXIa를 함유한 액체, 또는 생물공학적 방법으로부터 유래된 액체일 수 있다. 그와 같은 용액의 공지되었으나, 비-한정적인 예는 동결-결핍 혈장, 콘(Cohn) 방법의 중간체(예를 들면, 재구성된 페이스트 I+II+III) 및 그의 유도체, 키스틀러-니츠만(Kistler-Nitschmann) 방법의 중간체(예를 들면, 재구성된 침전물 A) 및 그의 유도체, 또는 재조합 단백질 발현으로부터 수득된 용액, 또한, 면역글로불린-감마(IgG)의 용액의 경우일 수 있는, 주로 다른 단백질로 구성되고, FXI 또는 FXIa는 불순물인 것인 용액이다.
응고 인자 FXI와 FXIa, 및 주요 성분으로 면역글로불린을 함유한 용액으로부터 FXI 및 FXIa를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) FXI 및/또는 FXIa 함유 용액을 헤파린 또는 헤파란이 매트릭스 물질에 결합된 것인 친화도 크로마토그래피 겔과 접촉시키는 단계,
b) FXI 및/또는 FXIa가 흡착되게 하는 단계, 및
c) 흡착 매질로부터 FXI 및/또는 FXIa가 제거된 액체를 분리하는 단계.
또한, 매트릭스 또는 겔의 활성 부위가 이미 항트롬빈에 의해 포화되었거나, 또는 매트릭스 또는 겔에 FXI 및/또는 FXIa를 로딩하는 동안 항트롬빈에 의해 포화될 수 있게 한다면, 단계 a)를 변형할 수 있다
대안적인 절차는 흡착 물질을 크로마토그래피 컬럼에 충진하고 흡착제에 FXI 및/또는 FXIa를 로딩하기 위해 원천 용액을 적용하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 규조토가 FXI 및/또는 FXIa의 흡착제로 추가적으로 사용될 수 있다.
단계 a) 및 b)는 10-18 mS의 전도도(conductivity), 구체적으로, 14 내지 17 mS의 전도도의 완충액 중 단백질을 크로마토그래피 수지(Heparin-Sepharose ™ FF)에 로딩하는 것에 의해 수행한다. 로딩된 흡착제를 FXI 및/또는 FXIa의 탈착을 방지하기 위해 동일한 전도도의 세척 완충액으로 조심스럽게 세척하고, 결과적으로 수득된 세척 용액을 더 가공하고 FXI/FXIa-제거 용액인 통과액에 존재하는 IgG의 회수를 최적화하기 위해 통과액(flow-through) 및/또는 상층액에 첨가할 수 있다. Heparin Sepharose™상에서 처리된 FXI/FXIa-제거 용액은 통상적으로 0.1 IU FXI/ml 미만, 훨씬 더 구체적으로, 0.00 내지 0.05 IU FXI/ml를 포함한다. 그와 같은 제거 용액의 국제 단위(international unit, IU)로 표현된 FXIa의 함량은 통상적으로 5 mU FXIa/ml 미만, 훨씬 더 구체적으로, 0.0 내지 1.0 mU FXIa/ml이다.
FXI/FXIa-제거 용액의 추가적인 가공은 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계를 내포할 수 있고, 주어진 예는 참조에 의해 포함된, EP-A-131 740에 개시된, 용매/디터전트 처리(S/D 처리), UV-조사, 저온살균(pasteurization), 낮은 pH 인큐베이션, 카프릴레이트 침전 또는 나노여과이다. 다른 단계는 크로마토그래피 단계, 약제학적 활성 화합물의 농축물을 수득하기 위한 농축, 제제화, 및 충진을 포함하고, 이들은 예를 들면, 면역 글로불린, 특히, IgG, 알부민, 피브리노겐, 항트롬빈 또는 알파-1-항트립신과 같은 다양한 단백질의 제조로부터 알려져 있으며, 약제학적 조성물을 수득하기 위해 의무적이고, 제조될 제품에 의존적이다.
FXI 및/또는 FXIa는 로딩된 흡착제로부터 0.36 M NaCl 및 0.01 M 포스페이트 또는 이와 균등한 이온 강도로 구성된 용리 완충액을 이용하여 용리시킬 수 있다. 그에 의해 수득된 FXI 및/또는 FXIa를 함유한 용액은 또한 전술된 방법에 의해 바이러스-불활성화시키고, 한외/정용여과에 의해 농축시켜 FXI, FXIa, 또는 이들 모두를 함유한 농축물을 수득할 수 있다. 상기 농축물을 FXI 또는 FXIa의 결핍이나 불활성과 관련된 질환을 치료할 수 있는 약제학적 조성물을 수득하기 위해 아쥬반트를 이용하여 제제화시킬 수 있다.
인자 XIa 활성 분석
시료에 존재하는 FXIa에 의해 재조합 응고 인자 IX (FIXa 불포함)는 FIXa로 활성화된다. 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에, FXIa는 분석 용액 중에 과량으로 존재하는 트롬빈-활성화 FVIII:C(thrombin-activated FVIII:C)와 효소 복합체를 형성한다. 이 효소 복합체는 뒤이어 분석 용액 중에 존재하는 FX를 인자 Xa(FXa)로 활성화시킨다. FXa의 생성된 양은 상용 기질에 의해 측정 가능하고, 시료 중 FXIa 농도에 정비례한다. 정량화는 보정 곡선(calibration curve)을 이용한 비교에 의해 수행한다.
이 분석은 또한 혈장 분획화 과정의 초기 단계로부터의 시료, 예를 들면, 동결-결핍 혈장이 측정되는 경우, FIXa 및 FXa의 활성을 나타낸다는 것이 언급되어야 한다. 따라서, FIXa 및 FXa가 시료 중에 존재해야 한다는 선결 요건 하에, 그와 같은 시료에 대한 FXIa, FIXa, 및 FXa의 요약된 활성이 표시되는 것으로 이해될 수 있다.
실시예 1:
FXI 및 FXIa가 크로마토그래피 물질에 흡착될 수 있도록 컬럼에 충진된 Heparin Sepharose FF 상에서 출발 물질을 처리했다. IgG 함유 통과액을 Hyflo, 즉, 규조토와 접촉시키고, 원심분리하여 로딩된 Hyflo를 제거하고, IgG 함유 상층액을 뒤이어 중간 페이스트(intermediate paste) I+II+III까지 더 가공하였다. 이에 의해 생성된 중간체의 재구성(reconstitution)은 0.02 IU FXI/ml 및 1mU FXIa/ml 미만을 밝혔다.
실시예 2:
규조토 상에서의 FXI/FXIa-포획(capture)를 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 페이스트 I+II+III를 제조했다. FXI 및 FXIa의 결정은 0.05 IU FXI/ml 및 3.5 mU FXIa/ml의 함량을 밝혔다.
표 1 내지 3은 크로마토그래피의 전과 후 시료의 분석 결과를 나타내며, 런(run) 2 내지 5는 런 1 대비 헤파린 겔에 대한 출발물질의 감소된 로드로 수행했다.
표 1: 출발 물질의 분석.
시료 A- 출발 물질 　 감소된 컬럼 로드
런 1 런 2 런 3 런 4 런 5
IgG [g/L] 7.12 6.94 6.65 5.47 7.02
인자 XI [IU/mL] 1.03 1.00 1.00 0.94 0.92
인자 XIa [mU/mL] 2.5 1.6 1.6 1.9 1.6
표 2: 실시예 1 (런 1, 런 4 및 런 5) 및 실시예 2(런 2 및 런 3)에 따른 여러 실험의 시료 분석.
시료 B - 헤파린 세파로 오스 크로마토그래피 후 　 감소된 컬럼 로드
런 1 런 2 런 3 런 4 런 5
IgG [g/L] 6.42 6.5 6.38 5.66 6.95
Factor XI [IU/mL] 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
Factor XIa [mU/mL] 3.5 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0
표 3: 실시예 1에 따른 여러 실험의 시료 분석
시료 C - 헤파린 세파로오스 및 Hyflo 처리 후 　 감소된 컬럼 로드
런 1 런 2 런 3 런 4 런 5
IgG [g/L] 4.79 - - 4.98 4.43
Factor XI [IU/mL] 0.02 - - < 0.01 < 0.01
Factor XIa [mU/mL] <1.0 - - <1.0 <1.0

Claims (11)

  1. 하기 단계를 포함하는, 응고 인자 FXI와 FXIa, 및 주요 성분으로 면역글로불린을 함유한 원천 용액(source solution)으로부터 FXI 및 FXIa를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법:
    a) FXI 및/또는 FXIa 함유 용액을 헤파린 또는 헤파란이 매트릭스 물질에 결합된 것인 친화도 크로마토그래피 겔과 접촉시키는 단계,
    b) FXI 및/또는 FXIa가 흡착되게 하는 단계, 및
    c) 흡착 매질(adsorption media)로부터 FXI 및/또는 FXIa가 제거된 액체를 분리하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 친화도 크로마토그래피 겔의 활성 부위는 항트롬빈으로 이미 포화되었거나 또는 포화될 수 있게 하는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 실리카, 퍼라이트(perlite), 제올라이트(zeolite), 또는 규조토의 군으로부터 선택된 실리케이트가 추가로 FXI 및/또는 FXIa의 흡착제로 사용되는 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3에 있어서, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 옥시드 히드록시드 또는 알루미늄 옥시드의 군으로부터 선택된 추가적인 흡착 매질이 사용되는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4에 있어서, 상기 크로마토그래피 물질을 항트롬빈-III로 사전 조건화(precondition)한 후, 매트릭스 물질에 결합된 헤파린 또는 헤파란으로의 흡착이 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원천 용액은 주로 면역글로불린-γ를 함유하는 것인 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXI 및/또는 FXIa가 제거된 액체에 용매/디터전트(solvent/detergent) 처리, UV-조사, 저온살균, 낮은 pH 인큐베이션, 카프릴레이트 침전 또는 나노여과로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계를 적용하여, 바이러스 불활성화(virus-inactivated)된, FXI 및/또는 FXIa가 제거된 액체를 수득하는 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로, 상기 바이러스 불활성화된, FXI 및/또는 FXIa가 제거된 액체를 농축하여 약제학적 활성 성분의 농축물을 수득하고, 상기 농축물은 선택적으로 약제학적 조성물을 수득하기 위해 제제화되는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 면역글로불린-γ 함유 조성물을 10-18 mS 전도도의 로딩 완충액 중 헤파린-친화도 크로마토그래피 수지에 적용하는 단계,
    (ii) 뒤이어, 상기 수지를 10-18 mS 전도도의 완충액으로 세척하고, 단계 (i)의 통과액(flow-through)과 세척 과정의 유출액(effluent)을 합치는 단계,
    (iii) 트리-N-부틸 포스페이트 및 디터전트를 이용하여 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계를 수행하는 단계,
    (iv) 뒤이어 농축 단계를 수행하는 단계;
    (v) 선택적으로, 수득된 면역글로불린-γ 함유 용액을 제제화하는 단계가 수행되는 것인 방법.
  10. 청구항 9의 방법에 의해 수득가능한 약제학적 활성 성분의 농축물.
  11. 청구항 10의 농축물로부터 수득가능한 약제학적 조성물.
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