JP2014501721A - FXIおよびFXIaを、これら凝固因子を含む溶液から減少させるおよび/または除去するための方法 - Google Patents
FXIおよびFXIaを、これら凝固因子を含む溶液から減少させるおよび/または除去するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
下記工程、a)FXIおよび/またはFXIa含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程;b)FXIおよび/またはFXIaを吸着させる工程;およびc)FXIおよび/またはFXIaを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程、を含む、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む原溶液(source solution)からFXIおよびFXIaを減少させるおよび/または除去する方法。
Description
本発明は、FXIおよびFXIaを、これら凝固因子を含む溶液から減少させるおよび/または除去する方法、本発明の方法によって得ることが可能なFXIおよびFXIaを含む濃縮物、ならびに本発明の方法によって得ることが可能なFXIおよびFXIaを含む医薬組成物に関する。
凝固因子XI(FXI)は、血液凝固に関与するタンパク質であることが周知であり、凝固カスケードの内因系凝固経路の一部である。FXIは、凝固中の活性化合物である活性化FXI(FXIa)の前駆体である。そのため、前記FXIaによって、生命を血栓症事象の危険にさらすことにつながる凝固が、意図せず開始される場合があるため、患者の静脈内に投与する医薬品からFXIaを除去することが必須である。他方では、FXIの欠如または不十分な活性に関する疾患を患っている患者にとって、または急速で有効な凝固が極めて重要となる大量出血を経験している患者にとっては、FXIおよび/またはFXIaの濃縮物が有益であろう。このような濃縮物は、血友病AおよびBなどの凝固因子に対する阻害抗体に苦しんでいる患者にとっても有益となり得る。これらの阻害物質は、出血事象を引き起こし得、したがって、患者は、凝固および創傷閉鎖(wound closure)を助ける薬剤を必要とする。
したがって、FXIおよび/またはFXIaを、FXIおよび/またはFXIaを含む溶液から除去する、または少なくとも減少させることが本発明の目的である。本発明の別の目的は、FXI、FXIaの治療上適用可能な濃縮物、または示した方法によるFXIおよびFXIaの混合物を含む治療上適用可能な濃縮物を提供することである。
FXI濃縮物を調製するいくつかの方法が公知である。BoumaおよびGriffinは、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,1977,vol.252,no.18,pp.6432−6437に、5回のクロマトグラフィー工程によるヒト血漿からのFXI精製方法を公表した。使用されたクロマトグラフィーの材料は、時系列でDEAE−セファデックス(登録商標)、QAE−セファデックス(登録商標)、SP−セファデックス(登録商標)(2倍)および最終的にセファロース(登録商標)に結合したコンカナバリンAである。使用された緩衝液はすべてポリブレン(登録商標)およびベンズアミジンを含む。
M.BURNOUF−RADOSEVICHおよび、T.BURNOUFは、TRANSFUSION,1992,32,pp.861−867に、FXIを吸着する、負に帯電されたフィルター(Zeta plus 50S)でのクリオ−プアー血漿(cryo−poor plasma)の濾過、吸着したFXIの溶出、および溶出液のカチオン交換樹脂(硫酸−セファロース(登録商標)ファストフロー)によるクロマトグラフィーによる、FXI凍結乾燥物の生成を報告した。溶出されたFXIは、凍結乾燥前にアンチトロンビンおよびヘパリンを製剤された。
HiroshI MashikoおよびHidenobu Takahashiは、BIOL.CHEM.HOPPE−SEYLER,1994,vol.375,pp.481−484に、高分子量キニノーゲン−アフィニティークロマトグラフィーおよびQ−セファロース(登録商標)クロマトグラフィーに基づいたブタのFXIおよびFXIaの生成方法を開示した。彼らは、接触活性化を防止し、タンパク分解性消化を克服するために、ポリブレン(登録商標)およびベンズアミジンを使用緩衝液に添加した。彼らは、ヘパリンセファロース(登録商標)アフィニティークロマトグラフィーによるFXI精製に失敗したことも報告した。
HiroshI MashikoおよびHidenobu Takahashiの別の論文は、AGENTS AND ACTIONS SUPPLEMENTS,(BIRKHAEUSER VERLAG,BASEL,CH),1992,vol.38,part2,pp.249−256に、高分子量キニノーゲン、Q−セファロース(登録商標)およびProtein A−Superose(登録商標)と共に、ポリブレン(登録商標)およびベンズアミジンの存在する緩衝液を用いたクロマトグラフィーに基づいたブタのFXIおよびFXIaの生成方法を論じた。
TaitおよびFujikawaは、JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,1981,vol.262,no.24,pp.11651−11656に、3回のクロマトグラフィー工程ならびに緩衝液中のポリブレン(登録商標)およびベンズアミジンの使用により、ヒト血漿からFXIおよびプレカリクレイン(prekallikrein)を精製する方法を開示した。高分子量キニノーゲンの軽鎖の一部である合成ペプチドが担体上で固定され、血漿からプレカリクレイン、FXIおよびいくらかのIgGのキャリーオーバーを単離するために使用された。続いて、プレカリクレインおよびFXIは、ヘパリン−アガロースクロマトグラフィーによって分離され、最終的にCM−セファデックス(登録商標)によって精製されて(polished)、FXIおよびプレカリクレインのあきらかに(apparently)純粋な画分を得た。
Saitoらは、THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION,vol.52,pp.850−861,1973に、Ca3(PO4)2による血漿の吸着、複数回の硫安分画法、ならびにFXIの活性化を妨げるポリプレン(登録商標)の存在と共に、QAE−セファデックス(登録商標)(2倍)、セファデックス(登録商標)−G150、およびSP−セファデックス(登録商標)による連続クロマトグラフィーからなるFXIの精製方法を提示した。
本発明は、FXI、FXIaまたは両方の混合物の含有量を、これらタンパク質、および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させる方法を提供する。これは、ケイ酸塩(特にシリカ、真珠岩、ゼオライト(zeolithes)または珪藻土)、水酸化アルミニウム(Al2(OH)3)、酸化アルミニウム水酸化物(AlO(OH))、酸化アルミニウム(Al2O3)、またはアフィニティークロマトグラフィーに適切な材料から選択される吸着材料への前記タンパク質の吸着によって達成される。アフィニティークロマトグラフィーに適切な前記材料は、マトリックス材料(例えば、ゼオライト(zeolithes)またはアクリレート(acrlyates)および糖類のようなポリマー)に連結している多糖(例えば、デキストラン(dextrane)、ヘパリン、またはヘパラン)、特にヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに使用されるゲル(例えば、ヘパリンセファロース(商標)FFまたはToyopearl AF Heparin 650 M(商標)など)から構成される。
ソース(source)を含む溶液は、血液もしくは血漿に由来するFXIおよび/またはFXIaを含むどのような液体、あるいは生物工学的方法に由来する液体であってもよい。このような溶液の公知であるが限定されない例としては、クリオ−プアー血漿、Cohn processの中間体(例えば再構成ペーストI+II+III)およびその誘導体、Kistler−Nitschmann processの中間体(例えば再構成沈殿物A)およびその誘導体、または組換えタンパク質発現の結果生じる溶液であるが、ガンマ免疫グロブリン(IgG)溶液の場合であってもよいFXIまたはFXIaが不純物となる他のタンパク質から主として構成される溶液である。
FXIおよびFXIaを、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させるおよび/または除去する方法は、下記工程、
a)FXIおよび/またはFXIa含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程;
b)FXIおよび/またはFXIaを吸着させる工程;および
c)FXIおよび/またはFXIaを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程と、を含む。
a)FXIおよび/またはFXIa含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程;
b)FXIおよび/またはFXIaを吸着させる工程;および
c)FXIおよび/またはFXIaを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程と、を含む。
マトリックスまたはゲルにFXIおよび/またはFXIaを充填している間、マトリックスまたはゲルの活性部位がアンチトロンビンですでに飽和しているか、または飽和させられるかのどちらかである限り、ステップa)を改変することもできる。
原溶液を吸着剤と混合し、撹拌し、吸着剤上に充填されたFXIおよび/またはFXIaを沈降、濾過または遠心分離のような公知の方法によって上清から除去するバッチ吸着として吸着を実施してもよい。代替手法としては、クロマトグラフカラム中への吸着材料の装填し、および原溶液を適用して、FXIおよび/またはFXIaを吸着剤に充填する。
本発明の一実施形態において、シリカ、真珠岩、ゼオライト(zeolithes)または珪藻土の群から選択されるケイ酸塩を、FXIおよび/またはFXIaの吸着剤(adsprbems)としてさらに使用してもよい。
さらなる一実施形態において、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム水酸化物、または酸化アルミニウムの群から選択されるさらなる吸着媒体を使用してもよい。
例えば、吸着材料として珪藻土または水酸化アルミニウムを用いてバッチ方式で実施する吸着と、吸着剤にヘパリンセファロース(商標)を用いてクロマトグラフカラムにおいて実施する吸着とを組み合わせることもできる。
さらに本発明の別の実施形態において、クロマトグラフィー材料をアンチトロンビンIIIで前処理した後、マトリックス材料に連結しているヘパリンまたはヘパランへの1回の吸着を実施する。
FXIおよび/またはFXIaの脱離を防止するために、充填された吸着剤を洗浄緩衝液で丁寧に洗浄し、結果として生じる洗浄溶液を、さらに処理されるフロースルーおよび/または上清に添加して、このFXI/FXIaが取り除かれた溶液中の、特にIgGなどの、免疫グロブリンのような他の関心対象化合物の回収を最適化してもよい。ヘパリンセファロース(商標)で処理したFXI/FXIaが取り除かれた溶液は、典型的には0.15IU FXI/ml未満、具体的には0.1IU FXI/ml未満、更に具体的には0.00から0.05IU FXI/mlを含む。このように取り除かれた溶液の国際単位(IU)で表現したFXIaの含有量は、典型的には10mU FXIa/ml未満、具体的には5mU FXIa/ml未満、さらに具体的には0.0から1.0mU FXIa/mlである。
FXI/FXIaが取り除かれた溶液をさらに処理する工程は、1回以上のウイルス不活性化工程を組み込んでもよく、例として挙げられるのは、溶媒/界面活性剤処理(S/D処理)、紫外線照射、殺菌(pasteurization)、低pHインキュベーション、カプリル酸沈殿またはナノフィルトレーションである。他の工程は、クロマトグラフィー工程、医薬的に有効な化合物の濃縮物を得る濃縮(concentration)、製剤および充填を含み、また、免疫グロブリン(特にIgG)、アルブミン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンまたはアルファ−1−アンチトリプシンなどの様々なタンパク質の生成から公知であり、医薬組成物を得るために必須であり、生成される生成物に依存する。
FXIおよび/またはFXIaを、充填された吸着剤から(特に、吸着剤が、マトリックスに付着したヘパリンまたはヘパランを用いたアフィニティークロマトグラフィーゲルである場合)溶出してもよい。アフィニティークロマトグラフィーゲルからのFXIおよび/またはFXIaの溶出は、0.2〜1.4MのNaCl、特に0.25〜1.0MのNaCl、なおさらに特に0.25〜0.5MのNaClおよび0.003〜0.03Mのリン酸または同等のイオン強度からなる溶出緩衝液を用いて実施される。したがって、得られたFXIおよび/またはFXIaを含む溶液を、上記に述べた方法によってウイルス不活性化し、ウルトラダイアフィルトレーション(ultra/diafiltration)によって濃縮して、FXI、FXIaまたは両方を含む濃縮物を得ることもできる。前記濃縮物はアジュバントと共にさらに製剤されて、FXIまたはFXIaの欠如または不活性に関連する疾患を治療することができる医薬組成物を得てもよい。
アンチトロンビンを突破させたにもかかわらず、ヘパリンクロマトグラフィーゲルの流出液のFXIおよびFXIaのレベルを前記タンパク質の検出限界より下で見出したことは、驚くべきことであった。FXIおよびFXIaは、ヘパリンおよびヘパランアフィニティーゲルに強く結合することが公知であるので、アンチトロンビン、特にアンチトロンビン−βアイソフォームによって、置換されていたであろうと予測された。さらに驚くべきことには、1.5Mを超えるNaCl、特に約2.0MのNaClを基本的に含む、より高いイオン強度の緩衝液で、アンチトロンビンIII(AT−III)を溶出する必要がある一方、0.2〜1.4MのNaClを基本的に含む、低〜中イオン強度の溶出緩衝液または同等のイオン強度の緩衝液で、アンチトロンビンで飽和しているヘパリンアフィニティーゲルからFXIおよびFXIaを選択的に溶出することができた。十分に高いイオン強度の緩衝液で溶出してAT−IIIも溶出する場合、この機構(feature)により、FXI/FXIaの溶出に続くAT−IIIの溶出の分離溶出、またはFXI、FXIaおよびAT−IIIを含む混合物の同時溶出のどちらかが可能となる。
さらに驚くべきことに、接触活性化を防止し、タンパク分解性消化を克服するために先行技術文献によって一般に教示されるような緩衝液へのポリブレン(登録商標)およびベンズアミジンの添加が不必要であることを見出した。
本発明の1つの目的は、マトリックス材料に連結しているデキストラン(dextrane)、ヘパリン、またはヘパランを用いるアフィニティークロマトグラフィーゲルを、アンチトロンビンIII(AT−III)で前処理することによって、最も有利に実施される。前処理は、クロマトグラフィー材料の活性部位がAT−IIIで飽和されるような範囲で実施されてもよい。FXIおよびFXIaのためのアフィニティーゲルの結合能は改善され、他の凝固因子の結合は禁止または少なくとも高い度合まで妨害されるため、この手法は特に有益である。よって、アフィニティーゲルからの溶出の後、FXIおよびFXIaを付随タンパク質から選択的に除去し、他の凝固因子を欠くXIおよびFXIaの溶液を得ることが可能である。
本発明の方法によって得ることが可能な医薬的に有効な成分の濃縮物と同様に、それから得ることが可能な医薬組成物も、本発明の対象である。
本発明による医薬的に有効な成分の濃縮物または本発明の医薬組成物において、医薬的に有効な成分はIgGである。
本発明は、FXI、FXIaまたは両方の混合物の含有量を、これらタンパク質および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させる方法を提供する。これは、ケイ酸塩(特に珪藻土)、またはアフィニティークロマトグラフィーに適切な材料(例えばヘパリンセファロース(商標)FF、Toyo−pearl AFヘパリン650M(商標)のような、特にヘパリンアフィニティークマトグラフィーまたはヘパランアフィニティークロマトグラフィーに使用されるゲル)から選択される吸着材料への前記タンパク質の吸着により達成される。
ソースを含む溶液は、血液または血漿に由来するFXIおよび/もしくはFXIaを含むどのような液体であっても、または、生物工学的方法に由来する液体であってもよい。このような溶液の限定されない公知の例は、クリオ−プアー血漿、Cohn processの中間体(例えば再構成ペーストI+II+III)およびその誘導体、Kistler−Nitschmann processの中間体(例えば再構成沈殿物A)およびその誘導体、または組換えタンパク質発現の結果生じる溶液の他、ガンマ免疫グロブリン(IgG)溶液の場合であってもよいFXIもしくはFXIaが不純物となる他のタンパク質から主として構成される溶液である。
FXIおよびFXIaを、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む溶液から減少させるおよび/または除去する方法は、下記工程:
a)FXIおよび/またはFXIa含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程;
b)FXIおよび/またはFXIaを吸着させる工程;及び
c)FXIおよび/またはFXIaを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程を含む。
a)FXIおよび/またはFXIa含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程;
b)FXIおよび/またはFXIaを吸着させる工程;及び
c)FXIおよび/またはFXIaを取り除いた液体を吸着媒体から分離する工程を含む。
マトリックスまたはゲルにFXIおよび/またはFXIaを充填している間、マトリックスまたはゲルの活性部位がアンチトロンビンですでに飽和しているか、または飽和させられるかのどちらかである限り、ステップa)を改変することもできる。
代替手法は、クロマトグラフカラム中への吸着材料の装填および原溶液を適用し、FXIおよび/またはFXIaを吸着剤に充填する。
本発明の一実施形態において、珪藻土を、FXIおよび/またはFXIaの吸着剤としてさらに使用してもよい。
10−18mSの導電率、特に14−17mSの導電率を有する緩衝液中のタンパク質をクロマトグラフィー樹脂(ヘパリンセファロース(商標)FF)に充填することにより、ステップa)およびb)は実施される。FXIおよび/またはFXIaの脱離を防止するために、充填された吸着剤は同じ導電率の洗浄緩衝液で丁寧に洗浄され、結果として生じる洗浄溶液は、さらに処理されるフロースルーおよび/または上清に添加して、FXI/FXIaが取り除かれた溶液としてフロースルー中に存在するIgGの回収を最適化してもよい。ヘパリンセファロース(商標)で処理したFXI/FXIaが取り除かれた溶液は、典型的には0.1IU FXI/ml未満、さらに具体的には0.00から0.05IU FXI/mlを含む。このような取り除かれた溶液の国際単位(IU)で表したFXIaの含有量は、典型的には5mU FXIa/ml未満、さらに具体的には0.0から1.0mU FXIa/mlである。
FXI/FXIaが取り除かれた溶液をさらに処理する工程は、1回以上のウイルス不活性化工程を組み込んでもよく、例として挙げられるのは、参照により組み込まれる欧州特許出願公開第131740に開示されているような溶媒/界面活性剤処理(S/D処理)、紫外線照射、殺菌(pasteurization)、低pHインキュベーション、カプリル酸沈殿またはナノフィルトレーションである。他の工程は、クロマトグラフィー工程、医薬的に有効な化合物の濃縮物を得る濃縮、製剤および充填を含み、また、免疫グロブリン(特にIgG)、アルブミン、フィブリノーゲン、アンチトロンビンまたはアルファ−1−アンチトリプシンなどの様々なタンパク質の生成から公知であり、医薬組成物を得るために必須であり、生成される生成物に依存する。
FXIおよび/またはFXIaは、充填された吸着剤から、0.36MのNaClおよび0.01Mのリン酸、または同等のイオン強度からなる溶出緩衝液で溶出されてもよい。したがって、FXIおよび/またはFXIaを含む得られた溶液を、上記に述べた方法によってウイルス不活性化し、ウルトラダイアフィルトレーションによって濃縮して、FXI、FXIaまたは両方を含む濃縮物を得ることもできる。前記濃縮物はアジュバントと共にさらに製剤されて、FXIまたはFXIaの欠如または不活性に関連する疾患を治療することができる医薬組成物を得てもよい。
XIa因子活性アッセイ
試料中に存在するFXIaによって、組換え凝固因子IX(FIXaを欠く)をFIXaに活性化する。リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、FIXaは、アッセイ溶液中に過剰に存在するトロンビン活性化FVIII:Cと酵素複合体を形成する。この酵素複合体は続いて、アッセイ溶液中に存在するFXをXa因子(FXa)に活性化する。FXaの生成量は、市販の基質によって測定可能であり、試料中のFXIa濃度に正比例する。検量線と比較して定量を行う。
試料中に存在するFXIaによって、組換え凝固因子IX(FIXaを欠く)をFIXaに活性化する。リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、FIXaは、アッセイ溶液中に過剰に存在するトロンビン活性化FVIII:Cと酵素複合体を形成する。この酵素複合体は続いて、アッセイ溶液中に存在するFXをXa因子(FXa)に活性化する。FXaの生成量は、市販の基質によって測定可能であり、試料中のFXIa濃度に正比例する。検量線と比較して定量を行う。
クリオ−プアー血漿のような、血漿分画方法の初期段階由来の試料を測定するとき、このアッセイはFIXaおよびFXaの活性も示すということについて述べなければならない。したがって、FIXaおよびFXaが試料中に存在しているという必要条件と共に、要約されたFXIa、FIXaおよびFXaの活性はこのような試料に適用されるということが理解可能である。
実施例1:
出発材料を、カラムに装填したヘパリンセファロースFFで処理してクロマトグラフィー材料にFXIおよびFXIaを吸着させた。IgG含有フロースルーをHyflo、つまり珪藻土に接触させ、遠心分離を行って充填されたHyfloを除去した。続いてIgG含有上清は、中間のペーストI+II+IIIに処理された。これにより、生成された中間体の再構成は0.02IU FXI/mlおよび1mU FXIa/ml未満であることが明らかになった。
出発材料を、カラムに装填したヘパリンセファロースFFで処理してクロマトグラフィー材料にFXIおよびFXIaを吸着させた。IgG含有フロースルーをHyflo、つまり珪藻土に接触させ、遠心分離を行って充填されたHyfloを除去した。続いてIgG含有上清は、中間のペーストI+II+IIIに処理された。これにより、生成された中間体の再構成は0.02IU FXI/mlおよび1mU FXIa/ml未満であることが明らかになった。
実施例2:
珪藻土へのFXI/FXIa捕獲を含めないこと以外は実施例1と同様の方法で、ペーストI+II+IIIを生成した。FXIおよびFXIaの測定は、0.05IU FXI/mlおよび3.5mU FXIa/mlの含有量であることを明らかにした。
珪藻土へのFXI/FXIa捕獲を含めないこと以外は実施例1と同様の方法で、ペーストI+II+IIIを生成した。FXIおよびFXIaの測定は、0.05IU FXI/mlおよび3.5mU FXIa/mlの含有量であることを明らかにした。
表1−表3は、操作1と比較して、ヘパリンゲルに対する出発材料の充填を減少させて操作2−操作5を実施したクロマトグラフィー前後の試料の分析結果を示す。
Claims (11)
- 下記工程、
a)FXIおよび/またはFXIa含有溶液と、ヘパリンまたはヘパランがマトリックス材料に連結しているアフィニティークロマトグラフィーゲルとを接触させる工程;
b)FXIおよび/またはFXIaを吸着させる工程;及び
c)FXIおよび/またはFXIaが取り除かれた液体を吸着媒体から分離する工程
を含む、これら凝固因子および主成分としての免疫グロブリンを含む原溶液からFXIおよびFXIaを減少させるおよび/または除去する方法。 - 前記アフィニティークロマトグラフィーゲルの活性部位がアンチトロンビンですでに飽和しているか、または飽和させられる、請求項1に記載の方法。
- シリカ、真珠岩、ゼオライト(zeolithes)または珪藻土の群から選択されるケイ酸塩を、FXIおよび/またはFXIaの吸着剤としてさらに使用する、請求項1または2に記載の方法。
- 水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム水酸化物、または酸化アルミニウムの群から選択されるさらなる吸着媒体を使用する、請求項1から3に記載の方法。
- クロマトグラフィー材料をアンチトロンビンIIIで前処理した後、マトリックス材料に連結しているヘパリンまたはヘパランへの吸着を1回実施する、請求項1から4に記載の方法。
- 前記原溶液が主としてγ免疫グロブリンを含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- FXIおよび/またはFXIaを取り除いた前記液体に、溶媒/界面活性剤処理、紫外線照射、殺菌(pasteurization)、低pHインキュベーション、カプリル酸沈殿またはナノフィルトレーションから選択される少なくとも1つのウイルス不活性化工程をさらに実施し、FXIおよび/またはFXIaを取り除いたウイルス不活性化溶液を得る、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 所望によりウイルスを不活性化した、FXIおよび/またはFXIaを取り除いた前記液体を濃縮して、所望により医薬組成物を得るために製剤される、医薬的に有効な成分の濃縮物を得る、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- (i)γ免疫グロブリン含有組成物を、導電率10−18mSの充填緩衝液(loading buffer)中のヘパリンアフィニティークロマトグラフィー樹脂にかける工程と、
(ii)その後、導電率10−18mSの緩衝液で前記樹脂を洗浄し、工程(i)のフロースルー(flow−through)と洗浄作業の流出液とを組み合わせる工程;
(iii)リン酸トリN−ブチル(tri−N−butyl phospate)および界面活性剤を用いる少なくとも1回のウイルス不活性化ステップを実施する工程;
(iv)その後、濃縮する工程;
(v)所望により、得られた前記γ免疫グロブリン含有溶液を製剤する工程、
を特徴とする請求項1から8のいずれかに記載の方法。 - 請求項9に記載の方法によって得ることが可能な医薬的に有効な成分の濃縮物。
- 請求項10に記載の濃縮物から得ることが可能な医薬組成物。
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