CN107206103A - 用于治疗目的的抗体‑脲酶缀合物 - Google Patents

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Abstract

公开了包含抗体‑脲酶缀合物并基本上不含非缀合脲酶的药物组合物。通过不需要色谱纯化的方法制备这些组合物。通过抗体导向酶前药治疗，这些药物组合物可用于治疗癌症，其中脲酶将内源性尿素原位转化为氨以诱导细胞毒性。

Description

用于治疗目的的抗体-脲酶缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年1月23日提交的美国临时申请第62/107,210号的权益。该申请通过引用并入本文。
序列表
即时申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本于2016年1月14日创建，命名为105013-1610_SL.txt，大小为11,000字节。
技术领域
本公开提供具有治疗效用的抗体-脲酶缀合物。更具体地，本公开涉及具有缀合至脲酶的一种或多种抗体的治疗性缀合物、组合物、其用途及其制备。
背景技术
脲酶是催化尿素水解成二氧化碳和氨的酶。具体地，脲酶催化尿素水解产生氨和氨基甲酸酯，随后通过自发水解使产生的氨基甲酸酯降解以产生另外的氨和碳酸。在这方面，脲酶活性倾向于增加其产生氨(其是具有一般毒性的碱性分子)的局部环境的pH值。
在癌症治疗中使用抗体靶向肿瘤相关抗原的观念已经有一段时间了(Herlyn等人，(1980)Cancer Research 40,717)。然而，关于脲酶，有毒成分是通过尿素的酶降解产生的碱性环境，并且使用高亲和力抗体片段。
发明概述
本技术涉及抗体-脲酶缀合物。本技术提供包含适于静脉内注射的药学上可接受的水溶液和基本上不含脲酶、不含非缀合抗体和/或不含非水性HPLC溶剂的抗体-脲酶缀合物的药物组合物。
在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约6个或更多个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约6个或更多个抗体部分的平均缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约8-11个抗体部分的平均缀合比。在一些方面，脲酶是洋刀豆(Jack bean)脲酶。
在一些方面，抗体是人源化抗体或非人抗体。在一些方面，抗体的分子量为从约5kDa至约200kDa。在一些方面，抗体的分子量为从约5kDa至约50kDa。在一些方面，抗体是单结构域抗体。在一些方面，单结构域抗体具有不超过110个氨基酸残基、或约90个至130个氨基酸残基的大小。在一些方面，单结构域抗体的分子量为从约10kDa至约50kDa。在一些方面，单结构域抗体的分子量为从约12kDa至约15kDa。在一些方面，抗体对肿瘤细胞的抗原具有特异性。在一些方面，抗体对由非小细胞肺癌表达的肿瘤抗原具有特异性。在某一些方面，抗体对CEACAM6具有特异性。
在一些方面，抗体对CEACAM6具有高于约1×10-6M的Kd值的的结合亲和力。在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约1×10-8M的Kd值的结合亲和力。在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约1×10-10M的Kd值的结合亲和力。在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约5nM的IC50值的合亲和力。在一些方面，IC50值为约3nM至约5nM。在一些方面，IC50值为约3.22nM。在一些方面，缀合物以约10μg/mL至约30μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。在一些方面，缀合物以约20μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。
在一些方面，抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。在一些方面，抗体包含含有对SEQ ID NO：1的氨基酸序列的至少一个修改的多肽。
本技术提供了治疗有需要对象中癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文提供的组合物，从而治疗对象中的癌症。
在一些方面，癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或其组合中的一种或多种。在一些方面，癌症是非小细胞肺癌。在一些方面，对象是人。
本技术提供了制备包含基本上不含脲酶的抗体-脲酶缀合物的组合物的方法，该方法包括在具有约6.0-7.0(如约6.5)的pH值的水性缓冲液中组合活化的抗体和脲酶，将pH值调节至8.0-9.0(如约8.3)以形成抗体-脲酶缀合物，并纯化抗体-脲酶缀合物，其中该方法不包括色谱纯化步骤，诸如常用的蛋白纯化色谱法，包括尺寸排阻色谱法(SEC)、离子交换色谱法、亲和色谱法、固定化金属亲和色谱法、免疫亲和色谱法、液固吸附色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)、反相色谱法(RPC)和高效液相色谱法等。在一些方面，通过超透析过滤法纯化抗体-脲酶缀合物。
在一些方面，抗体-脲酶缀合物具有每个脲酶部分8-11个抗体部分的缀合比。在一些方面，具有约6.5的pH值的缓冲液是乙酸钠缓冲液。在一些方面，通过包括添加硼酸钠溶液的方法将pH值调节至约8.3。
本技术提供增加对肿瘤抗原的抗体结合亲和力的方法，其包括将多个抗体分子与脲酶分子缀合以形成抗体-脲酶缀合物，其中所述缀合物对肿瘤抗原具有比非缀合抗体高至少约100倍的结合亲和力。
在一些方面，抗体是人源化抗体或非人抗体。在一些方面，抗体是单结构域抗体。在一些方面，肿瘤抗原由非小细胞肺癌表达。在一些方面，抗体对CEACAM6具有特异性。
本技术还提供了试剂盒，其包含本文提供的组合物和使用该组合物的说明书。
下面进一步描述本公开的这些方面和其它方面。
附图说明
图1A-B描述了在癌细胞系中L-DOS47的示例性结合和细胞毒性研究。(A)L-DOS47与以下五种癌细胞系的直接结合：BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T和MDA-MB231。结合信号由与20mM尿素一起孵育时产生的氨的量表示。在BxPC-3细胞(●)、Capan-1细胞和ZR-75-30细胞(◆)中观察到良好的L-DOS47结合，而在LS174T细胞(▲)中观察到中等结合，并且在MDA-MB231细胞(■)中没有发现结合。此外，在相应的细胞系上没有观察到与非缀合DOS47对照的结合(数据未显示)，表明L-DOS47结合是特异性的并且归因于抗体部分。(B)在加入20mM尿素时，L-DOS47对癌细胞系诱导了细胞毒性。在MDA-MB231细胞(■)中没有观察到作用，其与结合研究一致。BxPC-3(●)和ZR-75-30(◆)对L-DOS47高度敏感，而在Capan-1细胞和LS174T细胞(▲)中仅发现中等作用。
图2A-B描述了L-DOS47抗体、DOS47抗体和AFAIKL2抗体与BxPC-3细胞的示例性直接和竞争性结合。(A)钌标记的L-DOS47抗体、AFAIKL2抗体和非缀合的DOS47与BxPC-3细胞的结合。电化学发光分析提供了L-DOS47抗体和AFAIKL2抗体与BxPC-3细胞结合的直接测量。用AFAIKL2抗体(▲)观察到弱结合信号，而由于抗体缀合物上存在多个AFAIKL2抗体的亲合力，L-DOS47显示出更强的结合信号(●)。用阴性对照DOS47(◇)没有观察到结合。(B)L-DOS47-标签与BxPC-3细胞的结合，与L-DOS47抗体、AFAIKL2抗体或DOS47竞争。可以通过测试制品的IC50(导致结合降低50％所需竞争者的量)，来比较L-DOS47抗体和AFAIKL2抗体两者的表观结合亲和力。L-DOS47抗体(●)和AFAIKL2抗体(▲)的IC50分别估计为2μg/mL和20μg/mL(或3.22nM和1.55μM)，表明L-DOS47的结合亲和力约为AFAIKL2抗体的500倍。用阴性对照DOS47(◇)没有观察到抑制作用。结果表示代表性实验的平均值(n＝3)。
图3A-C描述了示例性的CEACAM6基因的过表达和敲低。(A)L-DOS47与CEACAM6转染的H23细胞的结合。通过FACS细胞分选与增加量的选择抗生素一起富集转染的细胞系群(▲)。与天然H23细胞(○)和A549细胞(△)相比，结合分布图表明CEACAM6在转染细胞中的表达水平低于在A549细胞中的水平。(B)在CEACAM6转染的H23细胞上L-DOS47的细胞毒性试验。与BxPC-3细胞(●)、A549细胞(△)和天然H23细胞(○)相比，在H23细胞(▲)中的CEACAM6过表达大大提高了其对L-DOS47细胞毒性的敏感性。有趣地是，尽管在(A)中观察到较弱的L-DOS47结合，但转染的H23细胞比A549细胞和BxPC-3细胞两者对L-DOS47细胞毒性都更敏感。(C)L-DOS47与具有敲低的CEACAM6基因的BxPC-3细胞的结合。在天然(●)BxPC-3细胞和对照(HUSH-TR3▲)BxPC-3细胞中观察到良好的结合信号。然而，由于CEACAM6基因被shRNA(HUSH#6和HUSH#7△)沉默，L-DOS47结合丧失，表明CEACAM6是被抗体缀合物识别的表面抗原。结果表示代表性实验的平均值(n＝3)。所有值的标准偏差(SD)小于10％。
图4描述了具有L-DOS47的人结肠癌和肺腺癌的免疫组织化学染色。阳性染色显示为深色。
图5描述了AFAIKL2抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图6示例了通过两步反应合成L-DOS47缀合产物。步骤1是使用SIAB活化抗体，步骤2涉及活化的抗体与脲酶的缀合以形成生物缀合物L-DOS47。
图7描绘了空白制剂、AFAIKL2、高纯度脲酶(HPU)和缀合物L-DOS47的示例性尺寸排阻色谱图。每个成分的二聚体的非常小的峰，出现在各自单体峰的前面。空白制剂含有10mM组氨酸、1％蔗糖、0.2mM EDTA，pH值6.8。
图8描绘了空白制剂(A)、L-DOS47(B)、掺有2.4％HP脲酶(HPU)的L-DOS47(C)、掺有4.8％HP脲酶(HPU)的L-DOS47(D)和掺有7.2％HP脲酶(HPU)的L-DOS47(E)的示例性离子交换色谱图。空白制剂含有10mM组氨酸、1％(w/v)蔗糖、0.2mM EDTA，pH6.8。
图9描绘了Experion SDS窗口的示例性快照。图块1：泳道2和泳道4的电泳图叠加。图块2：泳道L，分子量(MW)梯；泳道1、2、7和8：使用经过额外IEC净化的活化AFAIKL2产生的L-DOS47；泳道3-6：使用未经过额外IEC净化的AFAIKL2产生的L-DOS47；泳道9和泳道10：HPU。在图块1中，x轴上图块1中的数字2-14是泳道1的电泳图的峰数；3*表示内部MW标准的最低分子量标记峰，14*表示内部MW标准的最高MW标记峰。
图10描绘了L-DOS47(图9的泳道2)的示例性电泳图，显示了与0-4个抗体分子连接的脲酶亚基的离散峰。x轴上的数字1-11是峰数；3*表示内部MW标准的最低分子量标记峰，11*表示内部MW标准的最高MW标记峰。
图11描述了缀合比对L-DOS47结合活性的示例性影响。以不同抗体缀合比(从1.8至12)制备L-DOS47。测定L-DOS47样品与固定的CEACAM6-A分子的直接结合。
图12描述了AFAIKL2、脲酶和L-DOS47的示例性免疫印迹。左图：L-DOS47、脲酶和AFAIKL2的凝胶电泳(考马斯蓝染色)。中间图：用抗AFAIKL2抗体探测的AFAIKL2、脲酶和L-DOS47(标准负载和5x过载)的蛋白质印迹。右图：用抗脲酶抗体探测的AFAIKL2、脲酶和L-DOS47(标准负载和5x过载)的蛋白质印迹。插入框：L-DOS47的放大。
图13描绘了AFAIKL2-Cys-FL的胰蛋白酶消化物在420nm处的示例性RP-HPLC色谱图。在相应的HPLC峰标出鉴定的缀合肽及其肽质量。
图14描述了L-DOS47与癌细胞系BxPC-3、A549和MCF7的示例性直接结合。结合信号用与20mM尿素一起孵育时产生的氨的量表示。在BxPC-3(·)中观察到升高的L-DOS47结合，而在A549细胞(▲)中观察到中等结合，并且在MCF7细胞中没有发现结合。此外，在相应的细胞系(○,△,▽)中没有发现与非缀合DOS47对照的结合，表明L-DOS47结合对BxPC-3细胞和A549细胞是特异性的。
图15描绘了在加入20mM尿素时L-DOS47诱导的对BxPC-3细胞和A549细胞的细胞毒性的实例。在MCF7细胞中没有观察到作用。BxPC-3(·)对L-DOS47高度敏感，而在A549细胞(▲)中仅观察到中等作用。另外，在相应细胞系(○,△,▽)中没有观察到与非缀合的DOS47对照的结合。图的结果表示代表性实验的平均值(n＝3)。所有值的标准偏差(SD)小于10％。
发明详述
应当理解，本公开不限于所描述的具体方面或具体实施方案，因此当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体方面或具体实施方案的目的，并不旨在限定，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
仅为了读者的方便，将本公开的详细描述被分成各个节，并且可以将在任何节中发现的公开与另一节中的公开相结合。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
定义
必须指出，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“化合物”包括多种化合物。
如本文所用，术语“约”用在数字指定(例如温度、时间、数量、浓度以及包括范围在内的其它值)之前时表示近似值，其可以变化规定值的(+)或(-)10％、5％或1％。
如本文所用，术语“给药/施用(admnistration)”可以按一次剂量、连续或间歇地或通过几个亚剂量在总体上提供单次剂量来起作用。可以在整个治疗过程中进行给药。确定最有效的给药手段和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的、被治疗的靶细胞和被治疗的对象而变化。可以通过治疗医师所选择的剂量水平和模式，进行单次给药或多次给药。合适的剂量制剂和施用药剂的方法是本领域已知的。还可以确定给药途径，并且确定最有效的给药途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的、治疗对象的健康状况或疾病阶段以及靶细胞或靶组织而变化。给药途径的非限制性实例包括：口服给药、阴道给药、鼻腔给药、注射、局部施用、舌下给药、肺部给药和通过栓剂给药。
如本文所用，术语“亲和力”是指受体及其配体之间(例如抗体与其抗原之间)的结合强度。术语“Kd”或“解离常数”是指抗体与抗原之间的亲和力，即抗体与特定抗原结合的程度如何。术语“IC50”或“半数最大抑制浓度”表示导致测试制品结合降低50％所需竞争者的量。
如本文所用，术语“氨基酸”是指L-氨基酸或D-氨基酸或其混合物，包括天然氨基酸和合成氨基酸等，只要由多肽保留了期望的功能性质即可。当用在肽序列开始时，NH2是指存在于多肽的氨基末端(或N末端)的游离氨基。当用在肽序列的末端时，COOH是指存在于多肽的羧基末端(或C末端)的游离羧基。氨基酸残基的标准多肽缩写如下：A(Ala或丙氨酸)；C(Cys或半胱氨酸)；D(Asp或天冬氨酸)；E(Glu或谷氨酸)；F(Phe或苯丙氨酸)；G(Gly或Glycine)；H(His或组氨酸)；I(IIe或异亮氨酸)；K(Lys或赖氨酸)；L(Leu或亮氨酸)；M(Met或甲硫氨酸)；N(Asn或天冬氨酰)；P(Pro或脯氨酸)；Q(Gln或谷氨酰胺)；R(Arg或精氨酸)；S(Ser或丝氨酸)；T(Thr或苏氨酸)；V(Val或缬氨酸)；W(Trp或色氨酸)；X(Xaa或未知或其他)；Y(Tyr或酪氨酸)；Z(Glx/Gln/Glu或谷氨酸/谷氨酰胺)；和Dpr(2,3-二氨基丙酸)。在本文中由化学式表示的所有氨基酸残基序列，具有在氨基末端至羧基末端的常规方向上从左至右的取向。在氨基酸残基序列的开始或末端的破折号，表示与一个或多个氨基酸残基的另一序列的肽键，或与氨基末端基团(如NH2)或乙酰基或羧基末端基团(如COOH)的共价键。
如本文所用，术语“包含(comprising/comprises)”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。用于定义组合物和方法时，“基本上由…组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何本质意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的要素组成的组合物或过程，将不排除不会实质上影响本公开的基本特征和新颖特征的其它材料或步骤。“由…组成”的意思是排除超过微量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些转换术语中的每一个定义的实施方案在本公开的范围内。
如本文所用，术语“活性剂”、“药物”和“药理学活性剂”在本文中可互换使用，是指当施用于对象时诱导期望的药理作用的化学材料或化合物，并且旨在包括治疗剂，其包括放射性核素、药物、抗癌剂、毒素等。示例性活性剂是抗体脲酶缀合物。
如本文所用，术语“抗体”是指对抗原具有结合亲和力的肽、多肽或蛋白。典型的抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每条链的N末端限定了主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。抗体以完整的免疫球蛋白或以其片段如F(ab)’2或Fab'单体存在，F(ab)’2是Fab的二聚体其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链，Fab'单体其可以由铰链区二硫键的断裂产生。Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)，关于其他抗体片段的更详细的描述)。可以通过用例如化学方法或通过利用重组DNA方法从头合成的各种肽酶，消化完整的抗体来产生抗体片段。因此，本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰抗体产生的或通过使用重组DNA方法从头合成产生的抗体片段。抗体包括单链抗体，其包括单链Fv(sFv)抗体，其中VH和VL连接在一起(直接或通过肽连接子)以形成连续多肽。
如本文所用，术语“单结构域抗体”(sdAb或“VHH”)是指单重链可变结构域的抗体类型，并且在一些方面可以在天然缺乏轻链的骆驼科(Camelid)哺乳动物中发现。在一些方面，单结构域抗体可以衍生自VH区、VHH区或VL区。在一些方面，单结构域抗体是人源的。在一些方面，人单结构域抗体包含WO2006/099747和WO2009/079793以及WO2012/100343中公开的重链序列或轻链序列，它们的全部内容通过引用并入本文。在一方面，人单结构域抗体包含在WO2012/100343中讨论的框架区内具有二硫键的重链序列或轻链序列。
如本文所用，术语“抗体片段”还包括通过结合特异性抗原以形成复合物而像抗体一样起作用的任何合成或基因工程改造的蛋白。
如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接以形成较大构建体的两个或更多个分子。在一方面，通过直接键合连接两个分子，其中脲酶上的反应性官能团与抗体上的互补反应性官能团结合，例如赖氨酸的氨基官能团与天冬氨酸或谷氨酸的羧基官能团结合。应当理解，这种反应可能需要常规的羧基修饰以使其更具反应性。另一方面，通过连接子部分连接两个分子。
如本文所用，本文所用的术语“蛋白”、“多肽”或“肽”可互换使用。蛋白具有由其亚基序列表示的一级结构，并且可以具有二级螺旋结构或褶状结构，以及整体三维结构。虽然“蛋白”通常是指相对较大的多肽(例如含有100个或更多个氨基酸)，而“肽”指较小的多肽相同，但所述术语在本文中可互换使用。也就是说，术语“蛋白”可以指较大的多肽以及较小的肽，反之亦然。
如本文所用，术语“靶向部分”是指结合所定义的细胞群或选择的细胞类型的分子。靶向部分可以结合存在于靶细胞或细胞群体上或内的受体、寡核苷酸、酶底物、抗原决定簇或其它结合位点。示例性靶向部分是抗体。能够识别表达的抗原的抗体片段和小肽序列，也是考虑的靶向部分。
如本文所用，本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括缓解、减轻或改善疾病或病况或其一种或多种症状，预防其他症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或病况(例如阻止或抑制疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，导致疾病或病况消退，减轻由疾病或病况引起的状况，或抑制疾病或病况的症状)，并且旨在包括预防。这些术语还包括减轻疾病或病况，例如导致临床症状的消退。术语还包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善正在治疗的潜在病症。此外，通过消除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理学症状来实现治疗益处，使得在个体中观察到改善，尽管个体仍然受潜在病症的折磨。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，以指代治疗的任何目标。本技术还提供了在原位或其正常位置或部位治疗肿瘤细胞(例如乳腺肿瘤或前列腺肿瘤的肿瘤细胞)的方法。这些原位肿瘤可以位于各种宿主内或上，例如，人宿主、犬宿主、猫宿主、马宿主、牛宿主、猪宿主等。任何其中发现肿瘤或肿瘤细胞的宿主都可以被治疗并且符合本技术。因此，对象包括脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。
如本文所用，术语“基本上不含”颗粒将完全缺乏颗粒，或者几乎完全缺乏颗粒而使得其效果将与完全缺乏颗粒相同。换句话说，“基本上不含”某成分或要素的组合物可能仍然实际上含有这样的物品，只要其没有可测量的效果即可。除非另有说明，术语“基本上”是指大于约90％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％。在一些实施方案中，包含抗体-脲酶缀合物的组合物基本上不含非缀合脲酶，意味着组合物含有大于约90％的抗体-脲酶缀合物、大于约95％的抗体-脲酶缀合物、大于约96％的抗体-脲酶缀合物、大于约97％的抗体-脲酶缀合物、大于约98％的抗体-脲酶缀合物或大于约99％的抗体-脲酶缀合物。换句话说，组合物含有小于约0.1％的非缀合脲酶、小于约0.5％的非缀合脲酶、小于约1％的非缀合脲酶、小于约2％的非缀合脲酶、小于约3％的非缀合脲酶、小于约4％非缀合脲酶、小于约5％的非缀合脲酶，或小于约10％的非缀合脲酶。术语“非缀合脲酶”是指不与抗体缀合的脲酶。
如本文所用，术语“脲酶”是指具有天然存在或通过例如重组核酸技术和/或化学合成获得的尿素酰胺水解酶(E.C.3.5.1.5)的酶活性的酶。脲酶还包括融合蛋白，其包含整个脲酶、其亚基或其片段，和/或具有保留了该多肽的尿素酰胺水解酶活性的氨基酸取代、缺失或添加的脲酶。
如本文所用，术语“DOS47”是指纯化的脲酶。
抗体-脲酶缀合物
本技术涉及抗体-脲酶缀合物。本技术提供包含适于静脉内注射的药学上可接受的水溶液和基本上不含脲酶、不含非缀合抗体和不含非水性HPLC溶剂的抗体-脲酶缀合物的药物组合物。非水性HPLC溶剂包括通常用于制备型HPLC或HPLC纯化的有机溶剂，诸如甲醇、乙腈、三氟乙酸等。在一些方面，抗体-脲酶缀合物基本上不含来自磷酸盐缓冲液的磷酸盐。在一些方面，将含有10mM磷酸盐、50mM NaCl，pH值7.0的磷酸盐缓冲液用于SEC纯化。在一些方面，在制造产生抗体-脲酶缀合物中不进行HPLC纯化。
在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约6个或更多个抗体部分的平均缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约8个、9个、10个或11个抗体部分的平均缀合比。
在一些方面，连接是共价键或直接键合，其中脲酶上的反应性官能团与抗体上的互补反应性官能团结合，诸如例如赖氨酸的氨基(NH2)官能团与例如天冬氨酸或谷氨酸的羧基(COOH)官能团或半胱氨酸的巯基(SH)结合。应当理解，这种反应可能需要常规的羧基修饰以使其更具反应性。
反应性官能团可以是相同的，诸如草酸、琥珀酸等，或者可以是正交官能团，诸如氨基(其在缀合后变成NH)和羧基(其在缀合后变成CO或COO)。可选地，抗体和/或脲酶可以被衍生化以暴露或附加另外的反应性官能团。衍生化可以涉及连接许多连接子分子中的任何一种，如可从Pierce Chemical Company，Rockford Ill获得的那些连接子分子。
如本文所用的“连接子”是用于将靶向部分连接到活性剂(诸如将抗体连接到脲酶)的分子。连接子能够与靶向部分和活性剂都形成共价键。合适的连接子是本领域技术人员公知的，包括但不限于：直链碳连接子或支链碳连接子、杂环碳连接子、或肽连接子。当靶向部分和活性剂分子是多肽时，连接子可以通过其侧基与组成氨基酸连接(例如通过二硫键连接到半胱氨酸)。在一优选的方面，连接子将连接到末端氨基酸的α碳氨基和羧基。在一些方面，连接是通过具有两个或更多个官能团的连接子(如羧基或氨基)进行的，以允许其与脲酶和抗体反应。连接子是本领域公知的，并且通常包含1-20个原子，其包括碳、氮、氢、氧、硫等。
可以使用具有与脲酶上基团反应的一个官能团和与抗体反应的另一基团的双功能连接子，以形成期望的免疫缀合物。可选地，衍生化可以涉及靶向部分的化学处理，例如用高碘酸盐处理的糖蛋白抗体的糖部分的二醇断裂，以产生游离醛基。抗体上的游离醛基可以与试剂上的游离胺基团或肼基团反应，以将试剂与其结合。(参见第4,671,958号的美国专利号)。在多肽(如抗体或抗体片段)上产生游离巯基的步骤也是已知的(参见第4,659,839号的美国专利)。
其它连接子分子及其用途包括描述于以下文献中的那些：例如欧洲专利申请第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号，以及Borlinghaus等人(1987)(CancerRes.47：4071-4075)。
在一些方面，当缀合分子已经达到其靶位点时，在靶位点处或其附近的连接是可切割的，并且脲酶从靶向部分释放。可以通过酶活性或在靶细胞内或靶标位点附近缀合物经受的条件来促进对连接的切割，以从靶向部分释放脲酶。在一些方面，可以使用在肿瘤部位存在的条件(例如当暴露于肿瘤相关酶或酸性pH时)下可切割的连接子。
可切割的连接子包括描述于以下文献中的那些：例如美国专利第4,618,492号、第4,542,225号和第4,625,014号。从这些连接子释放活性剂的机理，包括例如光不稳定键的照射和酸催化的水解。例如美国专利第4,671,958号包括对包含通过患者补体系统的蛋白水解酶在体内的靶位点处切割的连接子的免疫缀合物的描述。在一些方面，合适的连接子是氨基酸残基或由两个或更多个氨基酸组成的肽间隔子。
在一些方面，合适的连接子是R1-L-R2，其中R1和R2是相同的官能团或不同的官能团，其中一个与抗体连接，另一个与脲酶连接。R1和R2可以独立地选自但不限于：-NH-、-CO-、-COO-、-O-、-S-、NHNH-、-N＝N-、＝N-NH-等。L可以是直链烃链或支链烃链(如烷基链)，其中一个或多个碳任选地被氧、氮、酰胺、硫、亚砜、砜、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基等替代。在一些方面，连接子可以是氨基酸残基或肽。在一些情况下，连接子可以在靶位点处或接近靶位点处由于酶或改变pH值而被切割。适于制备缀合物的某些连接子和步骤描述于以下文献：美国专利第4,414,148号、第4,545,985号、第4,569,789号、第4,671,958号、第4,659,839号、第4,680,338号、第4699,784号、第4,894,443号和第6,521,431号。在某些方面，连接子是
其中和代表连接到抗体或脲酶的点。在一些方面，代表连接到抗体的氨基的点，而代表连接到脲酶的硫代基的S原子的点。这个连接子是使用交联剂SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯)来缀合抗体和尿素酶的残基。在一些方面，超纯化是适合于使用SIAB作为交联剂的缀合方法的分离方法。
在一些方面中，连接子是使用具有下式的连接剂的残基：
其中X是溴或碘，L是如本文所述的连接子。
在一些方面，交联剂是SBAP(琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯)或SIA(N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)，在与SIAB类似的条件下(例如，不需要HPLC色谱法纯化和可以仅需要超透析过滤)，其可以用于缀合。在一些方面，在SIAB的连接臂长度比SBAP的连接臂长度和SIA的连接臂长度更适合/更具灵活性(reflexable)。在一些方面中，交联剂是SPDP(琥珀酰亚胺基3-(吡啶基二硫基)丙酸酯)、SMPT(琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-(2-吡啶基二硫基)甲苯)或SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-羧酸酯)，其可以用于缀合，但是可能需要超过一种分离方法(如IEC和乙醇分级分离)，以从较低产量的缀合反应溶液中分离未反应的脲酶。
另外，其他成分(如但不限于诸如抗癌剂的治疗剂)也可用于与抗体结合以进一步增强治疗效果。
脲酶
大量的研究已经提供了关于来自多种进化上不同的细菌、植物、真菌和病毒的脲酶的遗传学的详细信息(Mobley,H.L.T.等人(1995)Microbiol.Rev.59:451-480；EurJ.Biochem.,175,151-165(1988)；Labigne,A.(1990)International publication No.WO90/04030；Clayton,C.L.等人(1990)Nucleic Acid Res.18,362以及美国专利第6,248,330号和第5,298,399号，其各自通过引用并入本文)。特别令人感兴趣的是在植物中发现的脲酶(Sirko，A和Brodzik，R.(2000)Acta Biochim Pol 47(4):1189-95)。一个示例性的植物脲酶是洋刀豆脲酶。可以在公共数据库(例如，Entrez(ncbi.nlm.nih.gov/Entrez))中鉴定其他有用的脲酶序列。
在一些方面，脲酶是洋刀豆脲酶。洋刀豆脲酶氨基酸序列具有如下所示的SEQ IDNO.2的氨基酸序列：
MKLSPREVEKLGLHNAGYLAQKRLARGVRLNYTEAVALIASQIMEYARDGEKTVAQLMCLGQHLLGRRQVLPAVPHLLNAVQVEATFPDGTKLVTVHDPISRENGELQEALFGSLLPVPSLDKFAETKEDNRIPGEILCEDECLTLNIGRKAVILKVTSKGDRPIQVGSHYHFIEVNPYLTFDRRKAYGMRLNIAAGTAVRFEPGDCKSVTLVSIEGNKVIRGGNAIADGPVNETNLEAAMHAVRSKGFGHEEEKDASEGFTKEDPNCPFNTFIHRKEYANKYGPTTGDKIRLGDTNLLAEIEKDYALYGDECVFGGGKVIRDGMGQSCGHPPAISLDTVITNAVIIDYTGIIKADIGIKDGLIASIGKAGNPDIMNGVFSNMIIGANTEVIAGEGLIVTAGAIDCHVHYICPQLVYEAISSGITTLVGGGTGPAAGTRATTCTPSPTQMRLMLQSTDDLPLNFGFTGKGSSSKPDELHEIIKAGAMGLKLHEDWGSTPAAIDNCLTIAEHHDIQINIHTDTLNEAGFVEHSIAAFKGRTIHTYHSEGAGGGHAPDIIKVCGIKNVLPSSTNPTRPLTSNTIDEHLDMLMVCHHLDREIPEDLAFAHSRIRKKTIAAEDVLNDIGAISIISSDSQAMGRVGEVISRTWQTADKMKAQTGPLKCDSSDNDNFRIRRYIAKYTINPAIANGFSQYVGSVEVGKLADLVMWKPSFFGTKPEMVIKGGMVAWADIGDPNASIPTPEPVKMRPMYGTLGKAGGALSIAFVSKAALDQRVNVLYGLNKRVEAVSNVRKLTKLDMKLNDALPEITVDPESYTVKADGKLLCVSEATTVPLSRNYFLF(SEQ IDNo.2)
可以在公共数据库(例如，Entrez(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/))中鉴定有用脲酶序列。此外，可以利用用于扩增来自各种生物体的脲酶的引物，其描述于Baker，K.M.和Collier，J.L.(http：//WWW.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_web page/abstracts.html)，或使用CODEHOP(共识-简并杂合寡核苷酸引物)，其描述于Rose等人(1998)Nucl.Acids Res.26：1628。脲酶可以将底物尿素转化成氨和氨基甲酸酯。这种酶活性可以提高pH值，使环境更碱性。癌细胞周围的环境是典型酸性的(Webb，S.D.等人(2001)Novartis Found Symp 240：169-81)。因此，通过以这种方式提高细胞外环境的pH值，抑制癌细胞的生长。因此，在本技术的某些方面，添加抗体-脲酶缀合物导致间质液的pH值提高约0.1个pH单位，例如，0.1-0.5个pH单位以上。
本技术的脲酶包括脲酶的天然存在形式及其功能活性变体。预期了两种一般类型的氨基酸序列变体。氨基酸序列变体是那些在特定氨基酸具有不破坏脲酶活性的一个或多个取代的氨基酸序列变体。这些变体包括沉默变体和与天然蛋白基本上同源且功能上等同的保守修饰的变体。当其氨基酸序列的至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，甚至更优选98％和最优选至少约99％与天然蛋白的氨基酸序列相同时，天然蛋白的变体是与天然蛋白“基本上同源的”。变体可以是仅仅1个或高达10个或更多个氨基酸的不同。
第二类变体包括是分离的脲酶活性片段的脲酶的大小变体。可以通过例如片段化脲酶，通过化学改性，通过蛋白水解酶消化，或通过它们的组合形成大小变体。此外，可以使用基因工程技术以及从氨基酸残基直接合成多肽的方法来产生大小变体。
所谓“功能等同”是指变体序列限定了产生具有与天然脲酶基本上相同的生物活性的蛋白的链。本技术也包括包含大量序列变化的这种功能上等同的变体。因此，天然脲酶蛋白的功能等同变体将具有足够的生物学活性以用于治疗。在本领域中有可用于确定功能等同的方法。可以使用专门设计用于测量天然脲酶蛋白的活性试验来测量生物活性。此外，可以测试针对生物活性的天然蛋白产生的抗体结合到功能等同变体的能力，其中有效结合指示具有类似于天然蛋白构象的蛋白。
本技术的脲酶蛋白序列(包括保守取代序列)，可以作为更大的多肽序列的部分存在，诸如发生在加入用于纯化蛋白的一个或多个结构域(例如，聚His片段、FLAG标签片段等)，其中附加的功能性结构域对蛋白的脲酶蛋白部分的活性有很少的影响或没有影响，或其中可通过后合成处理步骤(如通过用蛋白酶处理)除去附加的结构域。
添加不改变本技术的核酸分子的编码活性的一个或多个核酸或序列(如添加非功能性序列)是基本核酸分子的保守变化，而添加不改变本技术的多肽活性的一个或多个氨基酸残基是基本多肽的保守变化。这两种类型的添加都是本技术的特点。本领域的普通技术人员将认识到，公开的核酸构建体的许多保守变化产生功能相同构建体。
可以使用各种测定序列关系的方法，包括手工比对和计算机辅助序列比对和分析。这后一种方法是本技术的优选方法，由于通过计算机辅助方法提供了增加的吞吐量。各种用于进行序列比对的计算机程序是可用的，或可以通过技术人员来制备。
如上所述，本技术中使用的核酸序列和多肽序列(及其片段)不需要与本技术的脲酶多肽或脲酶核酸分子(或其片段)或相关分子的相应序列是相同的，但可以是基本上相同的(或基本上类似)。例如，所述多肽可以经历各种变化，诸如一个或多个氨基酸或核酸的插入、缺失和取代，无论保守或非保守的，包括其中例如，这样的变化可能在其用途(例如，在其治疗应用或给药应用)中提供一定的优势。
靶向部分
预期了将靶向部分作为本技术的化学实体，并且与确定的、选择的细胞类型或靶细胞群(如癌细胞)结合。在这方面有用的靶向部分包括抗体和抗体片段、肽和激素。对应于已知细胞表面受体的蛋白(包括低密度脂蛋白、转铁蛋白和胰岛素)、纤维蛋白溶解酶、血小板结合蛋白(如膜联蛋白)和生物反应调节剂(包括白细胞介素、干扰素、促红细胞生成素和集落刺激因子)也是预期的靶向部分。可以将与靶细胞核酸的一部分互补的寡核苷酸(例如，反义寡核苷酸)用作本技术的靶向部分。靶向部分也可以是与靶细胞表面结合的寡核苷酸。保留与确定的靶细胞群结合的能力的上面列出的靶向部分的类似物，也可以用作靶向部分。
前述的靶向部分的功能等同物也可以用作本技术的靶向部分。示例性靶向部分功能等同物是设计以模仿用于靶向部分靶细胞结合的适当构象和/或取向的有机化学构建体。另一靶向部分功能等同物是展现靶向部分的结合亲和力的短多肽。
在一些方面，本公开的靶向部分是抗体、肽、寡核苷酸等，其与靶细胞表面上的抗原反应。可以使用商购或在文献中描述的多克隆抗体和单克隆抗体。抗体可以是完整抗体或其片段。可以根据常规技术(如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白合成)制备单克隆抗体和片段。有用的单克隆抗体和片段可以来自任何物种(包括人)或可以形成为采用来自多于一种物种的序列的嵌合蛋白。
在一些方面中，靶向部分是人源化抗体或非人抗体。在一些方面中，靶向部分是单结构域抗体。在一些方面，单结构域抗体(sdAb)或“VHH”是指能够在骆驼科哺乳动物中发现的抗体类型的单重链可变区结构域，所述抗体类型天然没有轻链。在一些方面，单结构域抗体可以来源于VH区、VHH区或VL区。在一些方面，单结构域抗体是源自人类的。在一些方面中，人单结构域抗体包含重链序列或轻链序列，其公开在WO2006/099747和WO2009/079793以及WO2012/100343中，通过引用将其全部并入本文。在一方面，人单结构域抗体包含具有如在WO2012/100343中所讨论的框架区内的二硫键的重链序列或轻链序列。
在一些方面，靶向部分(例如抗体)对由癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤表达的肿瘤抗原具有特异性。癌可能是肛门癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、尿道癌、卵巢癌、结肠癌、非小细胞肺癌、生殖道癌、内分泌腺癌、甲状腺癌和皮肤癌。在一些方面，靶向部分(例如抗体)对由如下肿瘤表达的肿瘤抗原具有特异性：类癌瘤、胃肠道间质瘤、头颈部肿瘤、原发性肿瘤、血管瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤和脑肿瘤、神经肿瘤、眼肿瘤和脑膜肿瘤。在一些方面，靶向部分(例如抗体)对由癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌表达的肿瘤抗原具有特异性。在一些方面，靶向部分(例如抗体)对由非小细胞肺癌表达的肿瘤抗原具有特异性。
在一些方面，抗体对由非小细胞肺癌表达的肿瘤抗原具有特异性。在一些方面，由非小细胞肺癌表达的肿瘤抗原是CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘附分子6)，并且抗体对CEACAM6具有特异性。CEACAM6，也被称为非特异性交叉反应抗原(NCA)或CD66c，是被充分表征的癌症抗原(11，12)。它与其他人癌胚抗原(如CEACAM1、CEACAM7和CEACAM8)具有高的序列同源性。它是糖基磷酸肌醇(GPI)-连接的细胞表面蛋白，但是没有已知的细胞质结构域。在乳腺癌组织、胰腺癌组织、卵巢癌组织、肺癌组织和结肠癌组织中，CEACAM6的表达是显著升高的。其增加的表达涉及肿瘤细胞的侵袭性行为和转移行为(13)。在一些方面，抗体对CEACAM6具有高于约1×10-6M的Kd值的结合亲和力。在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M或1×10-20M的Kd值的结合亲和力。在一些方面，抗体是识别肺腺癌细胞上的CEACAM6的单结构域骆驼科抗体片段(AFAIKL2，SEQ ID NO.1)。在一些方面，抗体包含含有如图5所示的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。在一些方面，抗体包含含有对SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少一个修改的多肽。在一些方面，抗体包含含有与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％和99％的序列同源性的多肽。
在一些方面，CEACAM6抗体是抗-CEACAM6抗体(9A6)：购自Santa Cruz Biotech的sc-59899。CEACAM6抗体(9A6)是以200μg/ml提供的小鼠单克隆IgG1，其是针对人源的CEACAM6表达肿瘤细胞系产生的。推荐用于检测人源的CEACAM6。
在一些方面，CEACAM6抗体是购自abcam的抗-CEACAM6抗体(ab56234)。抗-CEACAM6抗体(ab56234)是CEACAM6的兔多克隆抗体。它是针对对应于人CEACAM6的内部序列217-266位氨基酸的合成肽(IQNPASANRS DPVTLNVLYG PDGPTISPSK ANYRPGENLN LSCHAASNPP(SEQID NO：3))中的区域产生的。
在一些方面，CEACAM6抗体是购自Novus Biologicals的抗-CEACAM-6/CD66c的抗体，其是针对CEACAM6的兔多克隆抗体，并且经过蛋白质印迹和免疫组织化学-P来验证。它是针对指向人CEACAM6(NP_002474)的中间区域的合成肽(EIQNPASANRSD(SEQ ID NO：4))产生的。
在一些方面，CEACAM6抗体是购自Origene的抗-CEACAM6抗体EPR4403，其是针对CEACAM6(克隆EPR4403)的兔单克隆抗体。它是针对对应于人CEACAM6中的残基的合成肽产生的。它对小鼠CEACAM6、大鼠CEACAM6和人CEACAM6具有反应性。
在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约10nM的IC50值的结合亲和力。在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约5nM的IC50值的结合亲和力。在一些方面，缀合物对CEACAM6具有不大于约4nM的IC50值的结合亲和力。在一些方面，IC50值约为3.22nM。在一些方面，缀合物以约10-30μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。在一些方面，缀合物以约20μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。可以根据本文所述的方法或本领域已知的方法，测定抗体或缀合物与靶抗原的结合亲和力。在一些方面，本技术描述了该抗-CEACAM6-脲酶缀合物(L-DOS47)。在一些方面，本技术描述了抗体-脲酶缀合物，例如，AFAIKL2-脲酶。通过针对非小细胞肺腺癌A549进行淘选，将来源于美洲驼重链抗体所有组成成分的噬菌体库，用于确定单结构域抗体(sdAb)。将sdAb指定为AFAI。为了缀合的目的优化了AFAI的基因序列，并重命名为AFAIKL2。在一些方面，在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pT7-7系统中克隆和表达AFAIKL2抗体。
人源化靶向部分能够降低宿主受体中抗体或多肽的免疫反应性，以允许增加半衰期和减少不良免疫反应。可以通过例如将编码小鼠Fv区的核苷酸序列或其互补决定区与编码人恒定结构域区和Fc区的核苷酸序列进行遗传重组，将小鼠单克隆抗体人源化。也可以将小鼠残基保留在人可变区框架结构域内以确保适当的靶位点结合特性。用于将各种活性剂递送至癌细胞的基因工程抗体综述于Bodey，B.(2001)Expert Opin Biol.Ther.1(4):603-17。
在一些方面，靶向部分是与靶细胞表面上的受体反应的配体。因此，靶向部分可以包括但不限于：对细胞结合成分具有亲和力的激素，包含被细胞结合成分识别的碳水化合物部分的任何分子，以及与细胞结合成分结合的药物或小分子。短语“结合成分”包括受体和受体分子。优选地，结合成分是细胞表面结合成分。在一方面，靶向部分是与靶位点结合的天然存在的蛋白(如胰岛素)。包括白细胞介素和诸如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)的因子的细胞因子，也是已知的与表达其高水平受体的特异性细胞结合的特异性靶向部分(Terlikowski，SJ(2002)Toxicology 174(3)：143-152)。
为了降低暴露于非靶细胞或非靶组织的脲酶或其它活性剂，可以筛选靶向部分以鉴定显示最小非靶反应性的那些靶向部分，同时保持靶特异性和反应性。通过减少非靶暴露(和不利的非靶定位和/或毒性)，可以施用增加剂量的脲酶或其它活性剂。这允许施用最高可能浓度的脲酶或其它治疗剂以最大限度地暴露靶细胞，同时保持低于不可接受的非靶细胞毒性的阈值。
在一些方面，使用两种或更多种活性剂-靶向部分缀合物，其中每种缀合物包括不同的靶向部分，例如不同的抗体种类。每种所用的靶向部分结合到可以与相同或不同靶位点相关联的不同靶位点区域。每种施用的缀合物的活性剂成分可以相同或不同。参见例如美国专利第4,867,962号和第5,976,535号，其各自通过引用并入本文。在一些方面，由于每种靶向部分(例如抗体种类)识别不同的靶位点区域(即表位)，因此改善了活性剂缀合到靶位点的靶位点的增加。这种可选的靶位点区域方法为活性剂提供了更多潜在的靶位点结合点。因此，例如通过表位饱和和/或空间位阻可以避免实际或有效的靶位点饱和。因此，可以实现活性剂(例如脲酶)的递增积累。可选地，或联合地，可以使用另外的脲酶特异性基因产物作为活性剂，例如用于在靶位点生产催化活性全酶。示例性的脲酶脱辅酶包括由细菌ureABC基因编码的γ亚基、β亚基和α亚基(Burne，R.A.和Chen，Y.M.(2000)Microbes andInfection 2：533-542)。
可以分析针对特定靶位点的单克隆抗体的交叉反应性模式，以鉴定用于治疗应用的具有非重叠交叉反应性的一组两种或更多种靶特异性单克隆抗体。短语“交叉反应性的非重叠模式”，表示由一种抗体种类结合的非靶组织与由另一抗体种类结合的非靶组织显著不同。交叉反应性的模式对于成比例地减少用于治疗应用的活性剂的暴露所需的程度是不同的。优选较少的抗体对(或更大的一组抗体)重叠。
可以通过多种方法筛选抗体。可以使用免疫组织化学分析来确定与靶组织的反应性和与非靶组织的交叉反应性。可以通过将组织暴露于抗体来鉴定抗体种类要结合的组织；洗涤组织以除去任何未结合的抗体；并检测结合的抗体的存在。体外组织化学方法是本领域已知的。参见例如Sanchez-Islas，E.和Leon-Olea，M.(2001)Nitric Oxide 5(4)：302-16。
当靶向部分相对较短时，可以使用标准化学肽合成技术合成。对于多肽化学合成方法的一方面，预期了其中将序列的C末端氨基酸连接到不溶性支持体上并随后顺序添加序列中的剩余氨基酸的固相合成。固相合成技术描述于Barany和Merrifield，Solid-PhasePeptide Synthesis；pp.3-284in The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.Vol.2：Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield等人，J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)和Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版。PierceChem.Co.,Rockford,III.(1984)。
可以通过任何合适的方法制备编码抗体或脲酶的DNA，包括例如克隆和限制合适的序列或通过如下方法的直接化学合成：诸如Narang等人(1979)Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；Brown等人Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人(1981)Tetra.Lett.,22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法(1981)和美国专利第4,458,066号的固体支持法。
化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交或通过使用单链作为模板与DNA聚合酶聚合而转化成双链DNA。本领域技术人员将认识到，虽然DNA的化学合成限于约100个碱基的序列，但是通过连接较短的序列可以获得更长的序列。
可选地，可以克隆子序列，并使用合适的限制酶切割适当的子序列。然后可以将片段连接以产生期望的DNA序列。
制备抗体-脲酶缀合物的方法
本技术提供了制备包含抗体-脲酶缀合物且基本上不含非缀合脲酶(如基于抗体-脲酶缀合物重量不超过约5％、4％、3％、2％或1％的脲酶)的组合物的方法，该方法包括：(1)在溶剂中组合活化的抗体和脲酶，且在所述溶剂中活化抗体和脲酶基本上不反应(如不超过每小时10％、5％或1％的反应)形成反应混合物，其中活性抗体和脲酶在溶剂中的分布是均匀的，和(2)改变(1)的混合物的性质，使得活化的抗体容易与脲酶反应形成抗体-脲酶缀合物。在一些方面，(1)的混合物的性质是pH值。在一些方面，改变(1)混合物的性质包括将pH值增加到活化抗体容易与脲酶反应以形成抗体-脲酶缀合物的值。在一些方面，在(2)中活化的抗体容易(例如至少90％或至少95％的活化抗体)与脲酶以如下速度反应：在改变混合物的性质约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1小时后，混合物基本上不含非缀合脲酶。
在一些方面，所述方法包括在具有约6.0-7.0(如约6.5)的pH值的酸性水性缓冲液中组合活化的抗体和脲酶，将pH值调节至约8.0-9.0(如约8.3)的碱性pH值以形成抗体-脲酶缀合物，并通过超透析过滤法纯化抗体-脲酶缀合物，其中该方法不包括色谱纯化步骤。在一些方面，所述水性缓冲液具有约5-8的pH值。在一些方面，将活化的抗体和脲酶在酸性水性缓冲液中组合。在一些方面，活化的抗体和脲酶的比率为从约3至约12。在一些方面，抗体-脲酶缀合物具有每个脲酶部分6-15个抗体部分的缀合比。在一些方面，抗体-脲酶缀合物具有每个脲酶部分8-11个抗体部分的缀合比。在一些方面，pH调节剂是缓冲剂或缓冲溶液。在一些方面，pH调节剂包含以下的一种或多种：盐酸、硫酸、硝酸、硼酸、碳酸、重碳酸、葡糖酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、柠檬酸、单乙醇胺、乳酸、乙酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、磷酸、甲磺酸、苹果酸、丙酸、三氟乙酸、其盐或其组合。在一些方面，缓冲剂包含以下的一种或多种：甘氨酸、乙酸、柠檬酸、硼酸、邻苯二甲酸、磷酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、碳酸、盐酸、氢氧化钠、其盐或其组合。在一些方面，缓冲溶液包括以下的一种或多种：甘氨酸盐酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、磷酸盐-乙酸盐-硼酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液或其组合。在一些方面，缓冲液不是磷酸盐缓冲液。在一些方面，酸性缓冲液是乙酸钠缓冲液。在一些方面，通过包括加入水性碱溶液如硼酸钠溶液(例如0.1-5M，或1M)的方法，将pH值调节至碱性pH值。不希望受理论的束缚，乙酸钠缓冲液具有低的缓冲能力，适用于通过pH 8.5，1M硼酸盐缓冲液，将pH值调节至8.3。在一些方面，使用Tris-HCl缓冲液(例如1M Tris-HCl)将混合物调节至pH值8-9(例如8.3)。
在一些方面，将反应时间和抗体/脲酶比保持为常数。在一些方面，反应混合物中抗体/脲酶的摩尔比为：约25、或约21、或约1.8-12的抗体/脲酶。在一些方面，将抗体/脲酶摩尔比从4调整到25。在一些方面，抗体/脲酶摩尔比至少为6。
在一些方面，在纯化(如超透析过滤)之后，混合物中存在不超过1％或2％的未反应的抗体。在一些方面，可以使用其它非HPLC纯化方法。例如，可以将乙醇结晶/分级分离用于具有较低产率的纯化。在一些方面，抗体的分子量不超过50kDa，诸如约10-20kDa或约13kDa，并且所述纯化为超透析过滤。在一些方面，所述方法提供抗体-脲酶缀合物，其产率为总蛋白重量的至少约60％，总蛋白重量的约70％，总蛋白重量的约80％，或总蛋白重量的至少90％。总蛋白是指脲酶和AFAIKL2抗体的组合量(重量)。在一些方面，在纯化前，不超过10％-20％(占总蛋白重量)的非缀合抗体残留在反应混合物中。
本技术提供了包含在酸性水性溶剂(如上所述)中的活化的抗体和脲酶且基本上不含(如基于脲酶重量不超过约5％、4％、3％、2％或1％的抗体-脲酶缀合物)抗体-脲酶缀合物的稳定组合物。本技术还提供了包含在水性溶剂中的抗体-脲酶缀合物且基本上不含(如基于抗体-脲酶缀合物重量不超过约5％、4％、3％、2％或1％的脲酶)非缀合脲酶的组合物，其中所述水性溶剂具有约8-9如8.3(如上所述)的pH值。在一些方面，包含抗体-脲酶缀合物的组合物还包含占总抗体(活化的抗体和未反应的抗体)的不超过约40％至60％的非缀合抗体。在一些方面，包含抗体-脲酶缀合物的组合物还包含占总蛋白的不超过约10％至20％的非缀合抗体。
由于脲酶导致体内氨的释放，氨具有一般毒性并且本身不能靶向肿瘤，所以非缀合脲酶的存在增加了脲酶在正常组织中的存在并对正常组织产生毒性的风险。然而，由于脲酶的大小和其他性质，抗体与脲酶的缀合不会导致足够的大小或其他差异，从而允许通过色谱纯化方法将抗体-脲酶缀合物从非缀合的脲酶中容易地分离出来，特别是以大规模方式。
本技术令人惊奇地提供脲酶与抗体的基本完全缀合，使得不进行任何色谱纯化所得产物基本上不含非缀合的脲酶。通过基本上不含脲酶，通过全身给药，本文所述的组合物将组合物中基本上所有脲酶部分递送至靶位点。将脲酶靶向递送至靶位点减少或消除了由脲酶产生的氨的一般毒性，并减少需要施用的脲酶的量以产生治疗效果。本技术特别适用于大规模制备(如至少约1g、10g、100g或1kg)用于临床用途，特别是用于治疗转移性肿瘤(其通过局部施用脲酶难于或无法实施治疗)的基本上不含用脲酶的抗体-脲酶缀合物。
本技术还提供了增加对肿瘤抗原的抗体结合亲和力的方法，其包括将多个抗体分子与脲酶分子缀合以形成抗体-脲酶缀合物，其中所述缀合物具有比非缀合的抗体高至少约100倍(如约200倍、约300倍、约400倍和约500倍)的与肿瘤抗原的结合亲和力。在一些方面，竞争性结合试验显示，由于增加的亲合力，抗体-脲酶缀合物的结合亲和力比天然单结构域抗体的结和亲和力强约100倍、约200倍、约300倍、约400倍和约500倍。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约6个或更多个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分8个、9个、10个或11个抗体部分的缀合比。在一些方面，缀合物具有每个脲酶部分约8个、9个、10个或11个抗体部分的平均缀合比。在一些方面，脲酶是洋刀豆脲酶。在一些方面，抗体是人源化抗体或非人抗体。在一些方面，抗体是单结构域抗体。在一些方面，肿瘤抗原由非小细胞肺癌表达。在一些方面，抗体对CEACAM6具有特异性。在一些方面，抗体对CEACAM6具有高于约1×10-6M的Kd值的结合亲和力。在一些方面，缀合物以不大于约1×10-8M的Kd值与CEACAM6结合。在一些方面，缀合物以不大于约1×10-10M的Kd值与CEACAM6结合。在一些方面，缀合物以不大于约5nM的IC50值与CEACAM6结合。在一些方面，IC50值为约3.22nM。在一些方面，缀合物以约20μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。也称为非特异性交叉反应抗原(NCA)或CD66c的CEACAM6，是被充分表征的癌症抗原。它与其他人癌胚抗原(如CEACAM1、CEACAM7和CEACAM8)具有高的序列同源性。它是糖基磷酸肌醇(GPI)连接的细胞表面蛋白，但没有已知的细胞质结构域。在乳腺癌组织、胰腺癌组织、卵巢癌组织、肺癌组织和结肠癌组织中，CEACAM6的表达是显著升高的。
组合物制剂
本技术的组合物包含基本上不含脲酶且任选地不含非水性HPLC溶剂的抗体-脲酶缀合物。在一些方面，组合物是药学上可接受的组合物。组合物还可以包含生物相容的药物载体、佐剂或媒介物。在一些方面，组合物为固体形式。在一些方面，组合物是包含约0.1-10mg/mL、约0.5-5mg/mL、约1-5mg/mL、或约1.5-2.0mg/mL缀合物的水溶液。在一些方面，水溶液还包含赋形剂，诸如组氨酸、蔗糖和EDTA中的一种或多种。在一些方面，水溶液包含约1-20mM(如10mM)组氨酸，约0.1-5w/v％(如1w/v％)蔗糖、约0.1-0.5mM(如0.2mM EDTA)。在一些方面，水溶液具有约6.5-7(如约6.8)的pH值。在一些方面，水溶液不含有磷酸盐。在一些方面，组合物是通过水溶液的冻干获得的固体形式。在一些方面，固体形式不含磷酸盐。
组合物还可以包括与赋形剂或其它药学上可接受的载体混合的其它核苷酸序列、多肽、药物或激素。除药物组合物以外的组合物，任选地包含液体，即水或基于水的液体。
要添加到药物组合物中的药学上可接受的赋形剂，也是本领域技术人员熟知且易于获得的那些。赋形剂的选择将部分地由用于施用产品的具体方法来确定。因此，存在用于本技术背景下的各种合适的制剂。
用于药物组合物的制剂和给药的技术，可参见Remington's PharmaceuticalSciences，第19版，Williams&Wilkins，1995，并且是本领域技术人员所熟知的。赋形剂的选择将部分地由根据本技术用于施用产品的具体方法来确定。因此，存在用于本技术背景下的各种合适的制剂。以下方法和赋形剂仅仅是示例性的，绝不是限制性的。
可以使用任何常规方法(例如混合、溶解、成粒、研磨、乳化、包封、包埋、熔融纺丝、喷雾干燥或冻干过程)制造本技术的药物组合物。然而，根据给药途径和所需剂量，本领域技术人员将确定最佳药物制剂。这种制剂可影响施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
将药物组合物配制成含有合适的药学上可接受的载体，并且可以任选地包含促进将活性化合物加工成药学上可使用的制剂的赋形剂和助剂。给药形式通常将决定载体的性质。例如，用于肠胃外给药的制剂可以包含水溶性形式的活性化合物水溶液。适合肠胃外给药的载体可以选自盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水和其他生理上相容的溶液。用于胃肠外给药的优选载体是生理上相容的缓冲液，诸如Hank溶液、Ringer溶液或生理缓冲盐水。对于组织给药或细胞给药，在制剂中使用适合于要透过的特定屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。对于包含蛋白的制剂，制剂可以包括稳定材料，诸如多元醇(例如蔗糖)和/或表面活性剂(例如非离子表面活性剂)等。
可选地，用于肠胃外使用的制剂可以包含作为合适的油性注射悬浮液制备的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)和合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。含水注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。还可以使用乳化剂(例如水包油分散体和油包水分散体)，任选地通过乳化剂或分散剂(表面活性材料；表面活性剂)来稳定。如上所述的含有活性剂的脂质体也可以用于肠胃外给药。
可选地，可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体配制包含适于口服给药剂量的试剂的药物组合物。配制用于口服给药的制剂可以是片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、锭剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液或粉剂的形式。为了说明，可以通过将活性化合物与固体赋形剂组合获得口服用的药物制剂，任选地研磨所得混合物，并且如果需要加入合适的助剂之后，加工颗粒混合物以获得片剂。口服制剂可以使用类似于肠胃外使用的所述的那些类型的液体载体，例如缓冲水溶液、悬浮液等。
这些制剂可以含有一种或多种赋形剂，其包括但不限于：a)稀释剂，如糖，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；b)粘合剂，如硅酸铝镁和来自玉米、小麦、水稻、马铃薯的淀粉等；c)纤维素材料(如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、树胶(如阿拉伯树胶和黄蓍胶)和蛋白(如明胶和胶原蛋白)；d)崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、琼脂、海藻酸或其盐(如海藻酸钠)；或泡腾组合物；e)润滑剂，如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其镁盐或钙盐，以及聚乙二醇；f)香味剂和甜味剂；g)着色剂或色素，例如用于鉴定产品或表征活性剂的量(剂量)；和h)其他成分，如防腐剂、稳定剂、溶胀剂、乳化剂、溶液促进剂，用于调节渗透压的盐和缓冲剂。
所述药物组合物可以作为活性剂的盐来提供，该盐可以由许多酸形成，包括但不限于：盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于更易溶于水性溶剂或其它质子溶剂，它们是相应的游离碱形式。
缀合物本身的特性和缀合物制剂，可以影响所施用的缀合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。通过临床前的体外和体内研究，可以收集这些药代动力学信息和药效学信息，稍后可以在临床试验过程中在人体中证实这些信息。可以从许多来源获得基于体内动物数据来进行人类临床试验的指导，包括例如http://www.clinicaltrials.gov。因此，对于本技术方法中使用的任何化合物，可以首先从生物化学测定和/或基于细胞的测定来估计哺乳动物(特别是人)中的治疗有效剂量。然后，可以在动物模型中配制剂量，以实现能调节缀合物活性的期望的循环浓度范围。随着人类研究的进行，有关各种疾病和病况的合适剂量水平和治疗时间的进一步信息将会出现。
可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序，来确定所述缀合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50(50％群体的致死剂量)和ED50(50％群体的治疗有效的剂量)。
其他活性剂
在本技术的组合物中也可以包括其他活性剂。可以在细胞与第一活性剂接触之前、同时或之后，在组合物中利用其他活性剂如抗肿瘤剂(针对增殖细胞的活性剂)。例如，在脲酶已经靶向肿瘤细胞之后，其可以具有调节或调控肿瘤外部环境的能力，例如通过pH值变化。有利于碱性环境的活性剂(如抗肿瘤剂)则更为有效。
在某些方面，预期了将能够通过脲酶酶促处理的底物用作活性剂。在一些方面，活性剂是脲酶可以用来形成铵离子的底物(例如尿素)。
示例性的抗肿瘤剂包括细胞因子和其它部分，如白细胞介素(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-12等)、转化生长因子-β、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、干扰素(例如γ-干扰素)、集落刺激因子(例如GM-CSF、M-CSF等)、血管通透性因子、凝集素炎症反应启动子(选择素)(如L-选择素、E-选择素、P-选择素)和蛋白质部分(如C1q受体蛋白和NK受体蛋白)。其他合适的抗肿瘤剂包括，抑制血管生成并因此抑制转移的化合物。这些试剂的实例包括：鱼精蛋白甲羟孕酮、戊聚糖多硫酸盐(pentosan polysulphate)、苏拉明、紫杉酚、沙利度胺、血管抑素、干扰素-α、金属蛋白酶抑制剂、血小板因子4、生长激素抑制素、凝血酶敏感蛋白(thromobospondin)。可用于本技术的活性剂的其它代表性实例和非限制性实例包括：长春新碱、长春花碱、长春地辛、白消安、苯丁酸氮芥(chiorambucil)、螺铂、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、阿霉素、丝裂霉素、博来霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、巯嘌呤、米托坦、甲基苄肼、更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、盐酸阿霉素、紫杉酚、普卡霉素、氨鲁米特、雌氮芥、氟他胺、亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、他莫昔芬、睾内酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(左旋天冬酰胺酶)、依托泊苷、血液制品(如血卟啉)或上述的衍生物。活性剂的其它实例包括遗传物质，如天然或合成来源的核酸、RNA和DNA，包括重组RNA和DNA。编码某些蛋白的DNA可用于治疗许多不同类型的疾病。例如，可以提供肿瘤坏死因子基因或白细胞介素-2基因来治疗晚期癌症；可以提供胸苷激酶基因来治疗卵巢癌或脑肿瘤；并且可以提供白细胞介素-2基因来治疗神经母细胞瘤；恶性黑素瘤或肾癌。预期了用于本技术的其他活性剂，其描述于第6,261,537号美国专利，其全部内容通过引用并入本文。抗肿瘤剂和用于检测这些药剂的筛选，综述于Monga,M.和Sausville,E.A.(2002)Leukemia 16(4):520-6。
在一些方面，活性剂是弱碱性抗肿瘤化合物，其疗效被实质瘤中较高的细胞内/较低的细胞外pH梯度降低。示例性弱碱性抗肿瘤化合物包括：阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、表柔比星、丝裂霉素、博来霉素、长春花生物碱(如长春花碱和长春新碱)、烷化剂(如环磷酰胺和盐酸氮芥)以及抗肿瘤嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。
在一些方面，组合物包括脲酶，并且基本上缺少任何细胞因子(例如，肿瘤坏死因子和/或干扰素)。在这方面，脲酶单独或与除细胞因子以外的活性剂组合小分子抗肿瘤剂，对抑制癌细胞生长是有效的。因此，在这方面，组合物可以或可以不与所治疗的对象中存在的内源性细胞因子或天然细胞因子一致地起作用，但所施用的组合物不含有另外的外源性细胞因子。
在一些方面，所述其他活性剂不是培美曲塞和/或卡铂。在一些方面，所述其他活性剂不是叶酸抗代谢物和/或铂剂。
递送和给药方法
可以通过本领域已知的多种方法，将抗体-脲酶缀合物组合物递送至癌细胞。在治疗应用中，将组合物以足以抑制癌细胞生长的量施用于具有癌细胞的患者。可以通过多种途径给药，包括但不限于肠胃外、肠内、经上皮、经粘膜、透皮和/或手术，将药物组合物暴露于癌细胞。
肠胃外给药方式包括通过如下方式施用组合物的那些：例如静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、髓内施用、肌肉内施用、关节内施用、鞘内施用和心室内注射施用、皮下施用、性腺内施用(intragonadal)或瘤内针刺弹丸注射施用，或使用适当的泵技术的延长的连续施用、脉动施用或计划灌注施用或微灌注施用。肠内给药方式包括口服给药(包括口腔和舌下)和直肠给药。经上皮给药方式包括例如经粘膜给药和透皮给药。经粘膜给药包括例如肠内给药以及经鼻、吸入和深肺给药、阴道给药和直肠给药。透皮给药包括被动或主动的透皮或经皮方式，包括例如贴剂方式和离子电渗装置方式，以及局部敷用糊剂、药膏或软膏方式。外科手术技术包括植入药性持久(储库)组合物、渗透泵等。
可以根据对象所需要和耐受的剂量和频率，施用单次给药或多次给药的活性剂。无论如何，组合物应提供足够量的活性剂，以有效治疗对象。
在一些方面，本技术预期了使用诸如脂质体和/或纳米胶囊的囊泡作为化学实体，用于将包含抗体-脲酶缀合物的药物组合物递送至癌细胞。这种制剂对于引入本文公开的多肽、药物和/或抗体的药学上可接受的制剂可能是优选的。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。(参见例如Backer，M.V.等人，(2002)Bioconjug Chem 13(3)：462-7)。在优选的方面，所公开的组合物可以包埋在脂质体中。
纳米胶囊通常可以以稳定和可再生的方式捕获化合物(Whelan，J.(2001)DrugDiscov Today 6(23)：1183-84)。为了避免由于细胞内聚合物超载引起的副作用，可以使用能够在体内降解的聚合物来设计这样的超微颗粒(大小约为0.1μm)。预期将满足这些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸异丁酯纳米颗粒用于本技术中，并且这样的颗粒可以容易地制备，如描述于例如Lambert，G.等人(2001)Int J Pharm 214(1-2)：13-6。制备含有生物活性物质的聚烷基-氰基-丙烯酸酯纳米颗粒的方法及其用途，描述于第4,329,332号、第4,489,055号和第4,913,908号美国专利。纳米胶囊可以从诸如Capsulution，Inc.(www.capsulution.com)等来源商购。
包含用于递送组合物的纳米胶囊的药物组合物，描述于第5,500,224号、第5,620,708号和第6,514,481号美国专利。第5,500,224号美国专利描述了纳米胶囊的胶态悬浮液形式的药物组合物，其包含基本上由含有溶解有表面活性剂的油组成的油相和悬浮在其中的具有小于500纳米直径的多个纳米胶囊。第5,620,708号美国专利描述了组合物和用于施用药物和其它活性剂的方法。组合物包含附着于特异性结合存在于哺乳动物肠上皮细胞表面上的靶分子的结合部分的活性剂载体颗粒。所述结合部分以足以引发颗粒活性剂载体的内吞作用或吞噬作用的结合亲和力或亲合力结合靶分子，使得载体被肠上皮细胞吸收。然后，活性剂将从载体释放到宿主的体循环。以这种方式，可以避免肠道中降解敏感性药物(如多肽)的降解，同时增加从肠道吸收蛋白和多肽。可选地，本技术预期了在靶细胞周围的环境中释放活性剂。例如，在一方面，抗体-脲酶缀合物在靶向部分结合到靶细胞后从纳米胶囊中释放，使得脲酶被释放到靶细胞(例如肿瘤细胞)周围的微环境中。第6,379,683号和第6,303,150号美国专利描述了制备纳米胶囊的方法及其用途，并且通过引用并入本文。
将使用的药物组合物以有效量施用于对象。通常，有效量是有效(1)减少寻求治疗的疾病的症状的量；或(2)诱导与治疗寻求治疗的疾病相关的药理学变化的量。对于癌症，有效量可以包括如下有效的量：减少肿瘤的大小；减缓肿瘤的生长；预防或抑制转移；或者增加受影响对象的预期寿命。接触包括向细胞中加入包含靶向部分和以所选择电荷和与第二、相反电荷的卷曲形成肽相互作用以形成稳定的α-螺旋卷曲螺旋异源二聚体的能力为特征的第一卷曲形成肽的缀合物。随后，向细胞中加入脂质体。脂质体包含外表面和内部隔室；位于脂质体内部隔室的活性剂(例如脲酶)；和多个第二肽，其中每个第二肽被连接到脂质体的外表面。
在一些方面，接触包括将脂质体添加到细胞中，其中脂质体具有包埋形式的活性剂(例如抗体-脲酶缀合物)，并且脂质体的外表面包括有效且特异性结合靶表面的细胞靶向部分，以及有效地屏蔽靶向部分以免于与靶表面相互作用的亲水性聚合物覆盖层。亲水聚合物覆盖层可以由通过可释放的键与脂质体中的表面脂质成分共价连接的聚合物链组成。在一些方面，将释放剂以能有效引起所添加的脂质体中大部分键的释放的量加入到肿瘤细胞中，从而将靶向部分暴露于靶表面。可释放的键可以是可还原的化学键如二硫键、酯键和肽键。
在一些方面，本文预期了针对哺乳动物对象的基于脂质体的疗法。该方法包括对对象全身施用(例如静脉内施用)具有表面结合的靶向部分和亲水性聚合物覆盖层的脂质体。由可释放地连接的聚合物链组成的亲水性聚合物覆盖层，有效地屏蔽靶向部分以免于与其靶标的相互作用。使所施用的脂质体全身循环，直到实现期望的脂质体生物分布。向对象施用有效地引起大部分(例如，大于所施用脂质体中可释放键的约50％，优选大于约70％，更优选大于约90％)裂解的量的释放剂。当释放亲水性聚合物链以与其靶标相互作用时，所述靶向部分被暴露。
在一些方面，脂质体用于治疗实体瘤。脂质体包括抗体-脲酶缀合物，以及任选地，包埋形式的其他活性剂(例如抗肿瘤药物)，并且通过有效且特异性结合肿瘤特异性抗原的靶向部分而靶向肿瘤区域。在一示例性方法中，通过在脂质体中包括VEGF配体，使脂质体靶向肿瘤的血管内皮细胞，用于选择性附着到在增殖性肿瘤内皮细胞上表达的Flk-1,2受体(Niederman，TM等人(2002)Proc Natl Aced Sci 99(10)：7009-14)。
在一些方面，脂质体具有在约30-400nm的尺寸。已经显示在该大小范围内的脂质体能够通过存在于肿瘤脉管系统的内皮细胞衬里层中的“间隙”进入肿瘤(Maruyama，K等人(1999)Adv Drug Deliv Rev40(1-2)：89-102)。
在施用(例如静脉内施用)脂质体之后，并且在经过足够的时间以使脂质体分布在对象中并结合肿瘤之后，向对象施用释放剂以从脂质体中释放亲水性表面覆盖层。释放表面覆盖层对于暴露靶向部分以允许脂质体与靶细胞结合是有效的。在一方面，亲水性表面覆盖层通过pH敏感性键附着到脂质体上。脂质体与肿瘤结合后释放该键。
上述任何方面中的脂质体，可以任选地包括一种或多种包埋的抗肿瘤药物或显像剂或二者。可以加入脂质体并使其分散，然后可以施用释放剂以释放亲水性表面覆盖层，以暴露附着的靶向部分并开始结合。可以如第6,043,094号美国专利号中所述制备和施用脂质体，其通过引用并入本文。
在本技术中可以使用其他递送剂，诸如第6,180,114号美国专利中所述的小单层囊泡(SUV)，其全部内容通过引用并入本文。
本领域技术人员应当理解，存在不是严重血管化的或者被紧密连接所连接的细胞和/或主动转运机制保护的一些区域，其减少或阻止了存在于血流中的大分子的进入。因此，例如，全身施用治疗剂以治疗神经胶质瘤或其他脑癌，可能受到抵抗大脑分子进入蛛网膜下腔空间的血脑屏障的制约。在这些类型的肿瘤中，治疗组合物可优选直接施用于肿瘤部位。因此，例如，可以通过将治疗组合物直接施用(例如通过弹丸注射、微注射或手术植入导管)于肿瘤部位来治疗脑肿瘤。
剂量
对于本技术的方法，可以使用调节剂量时间和顺序的任何有效的给药方案。人对象的示例性剂量水平，将取决于给药方式、肿瘤的程度(大小和分布)、患者个体大小以及癌症对脲酶治疗的应答性。
当将抗体-脲酶缀合物组合物施用于(例如直接注射)肿瘤中时，示例性剂量为约0.1至1,00010μg/kg体重(如约0.2至5μg/kg，或约0.5至2μg/kg)。可以通过常规的图像引导技术(例如荧光透视)来引导注射针的安放，使得医生可以相对于靶组织观察针的位置。这种引导工具可以包括超声、荧光透视、CT或MRI。
在一些方面，可以在施用抗体-脲酶缀合物进入肿瘤期间或之后，通过用能够检测对象癌组织区域中pH值变化的工具监测肿瘤组织，来监测施用剂量的抗体-脲酶缀合物的有效性或分布。这样的工具可以包括可以直接插入肿瘤的pH探针或可视化工具(如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)或荧光透视)。可以在没有额外的成像剂情况下进行MRI问诊，这仅仅是基于作为pH值函数的组织的磁性能差异。CT或荧光透视成像可能需要额外的pH敏感成像剂，其不透明度受组织培养基的pH值影响。这些试剂是本领域技术人员公知的。
在施用任何抗体-脲酶缀合物之前，可以通过相对于周围正常组织的其较低pH值来显现肿瘤组织。因此，正常组织可以具有约7.2的正常pH值，而肿瘤组织可以为低0.1个至0.4个或更高的pH值单位。也就是说，在注射任何抗体-脲酶缀合物之前，可以通过其较低的pH值来明确肿瘤组织的程度。在施用脲酶后，具有脲酶的肿瘤区域的pH值将开始上升，并且可以通过将所得图像与较早的给药前图像进行比较来鉴定。
通过以这种方式问诊组织，可以监测pH值的变化程度和组织受影响的程度。基于这种问诊，医生可以向该部位施用其他组合物，和/或可以在肿瘤部位内的另外区域施用组合物。可以重复该过程直到在实体肿瘤的整个区域达到期望的pH变化程度，例如0.2至0.4个pH值单位。
可以以合适的间隔重复(例如每周一次或每周两次)给药如通过直接注射，直到观察到期望的，优选肿瘤块基本上消退或完全消退。如上所述，可以通过在处理过程中显现处理组织的pH值的变化来监测治疗效果。因此，在每次额外的注射之前，可以显现组织的pH值以确定目前存在的肿瘤程度，此后可以使用组织的pH值变化来监测对组织施用新剂量的抗体-脲酶组合物。
当通过非直接注射的方法肠胃外施用抗体-脲酶组合物时，抗体-脲酶组合物的示例性剂量为100-100,000个国际单位/kg脲酶活性/kg对象体重。如本文所述，该方法中的抗体-脲酶组合物包括用于将脲酶靶向癌症细胞(例如实体瘤位点)的抗体，或用于在肿瘤部位选择性地螯合尿素酶的抗体(例如以脂质体形式)。
对组织pH值变化敏感的成像技术，可用于监测给药剂量的有效性。由于这种靶向可能需要几个小时或更长时间，所以该方法可以包括如上所述在注射抗体-脲酶组合物之前和给药后数小时(例如12-24小时)，监测肿瘤pH值以确认肿瘤部位已被充分地给药，如通过肿瘤区域pH值的升高所证实。根据这种问诊结果，该方法可以确定额外的剂量，直到观察到期望的pH值升高，例如0.2-0.4个pH值单位。一旦确立了该剂量，可以定期(例如每周一次或两次)对患者进行类似剂量的脲酶组合物的治疗，直到达到肿瘤大小或状况的改变。
考虑到改变药物作用的各种因素(如药剂的比活性，疾病状态的严重性，患者的应答性，患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，任何感染的严重程度等)，由主治医师鉴于良好的医学实践来确定最终剂量方案。可以考虑的其他因素包括：给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受/应答。由本领域从业人员，尤其是根据所公开的剂量信息和测定方法，以及在临床试验中观察到的药代动力学数据，常规地进行适用于治疗的涉及本文提及的任何制剂的剂量的进一步改进。可以通过使用已建立的用于确定体液中的试剂或其它样品的浓度的测定方法以及剂量应答数据来确定合适的剂量。
给药的频率将取决于药剂的药代动力学参数和给药途径。调整剂量和给药以提供足够水平的活性剂或维持期望的效果。因此，可以根据需要以单剂量、多个离散剂量、持续输注、缓释储库或其组合来施用药物组合物，以维持期望的药剂最低水平。
可以每天一次或每天超过一次(例如每天两次、三次或四次)施用短效药物组合物(即，短半衰期)。可以每3-4天、每周或每两周一次施用长效药物组合物。将泵(例如皮下泵、腹膜内泵或硬膜下泵)用于连续输注。
可以制备在药学上可接受的载体中包含缀合物的组合物，置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病况。标签上指示的病况可以包括但不限于治疗各种癌症类型。也涵盖如下所述的试剂盒，其中试剂盒包含药物组合物的剂型和包含使用该组合物治疗医学病况的说明的包装说明书。
通常，将缀合物组合物以有效量施用于对象。通常，有效量是有效(1)减少寻求治疗的疾病的症状的量；或(2)诱导与治疗寻求治疗的疾病相关的药理学变化的量。对于癌症，有效量可以包括如下有效的量：减少肿瘤的大小；减缓肿瘤的生长；预防或抑制转移；或增加受影响对象的预期寿命。
治疗方法
本技术提供了治疗对象的癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文提供的组合物，从而治疗对象的癌症。适合通过本文的方法治疗的癌症通常包括：癌、白血病、淋巴瘤和肉瘤。癌可以是肛门癌、胆道癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、尿道癌、卵巢癌、结肠癌、非小细胞肺癌、生殖道癌、内分泌腺癌、甲状腺癌和皮肤癌。其他适合的癌症包括：类癌瘤、胃肠道间质瘤、头颈部肿瘤、原发性肿瘤、血管瘤、黑素瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤和脑肿瘤、神经肿瘤、眼肿瘤和脑膜肿瘤。
在一些方面，待治疗的癌症形成实体肿瘤，诸如癌、肉瘤、黑素瘤和淋巴瘤。在一些方面，癌症是以下中的一种或多种：非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或其组合。在一些方面，癌症是非小细胞肺癌。在一些方面，对象是人。
可以通过本领域熟知的方法来估计治疗有效剂量。癌症动物模型，如具有小鼠肿瘤的免疫能力小鼠，或具有人肿瘤异种移植物的免疫受损小鼠(例如，裸鼠)，在本领域中是众所周知的，并且被广泛地描述于以引用并入本文的许多参考文献中。这些信息与在大鼠、狗和/或非人灵长类动物中的安全性研究结合使用，以确定在人类中安全和潜在有用的初始剂量。用于估计生物体内剂量的其他信息，可来自临床试验报告的实际人癌症研究。
在一些方面，癌症治疗方法旨在包括治愈以及改善癌症的至少一种癌症症状。如果患者被治愈了癌症，癌症进入缓解期，生存期以统计学显著的方式延长，肿瘤进展时间以统计学显著的方式增长，基于为每种类型的淋巴细胞恶性肿瘤或造血恶性肿瘤建立的规范标准，淋巴细胞肿瘤负荷或造血肿瘤负荷减少，或者实体瘤负荷已经按照如实体瘤应答评估标准定义的减少，则治疗了癌症患者(RECIST 1.0或RECIST1.1，Therasse等人，JNatl.Cancer Inst.92(3)：205-216,2000和Eisenhauer等人，Eur.J.Cancer 45：228-247,2009)。如本文所用，“缓解期”是指先前证明患有癌症的患者中不存在生长中的癌细胞。因此，缓解期的癌症患者，或者治愈了其癌症，或者其癌症是存在的但不容易检测的。因此，当肿瘤不能增大或转移时，癌症可能是在缓解期。如本文所用的完全缓解期，是通过诊断方法(如成像，诸如x射线、MRI、CT和PET，或血液活检或骨髓活检)所示的疾病不存在。当癌症患者进入缓解期时，其后可能会复发，其中癌症再次出现。
在一些方面，所述治疗不与培美曲塞和/或卡铂联合。在一些方面，所述治疗不与叶酸抗代谢物化合物和/或铂剂联合。
试剂盒
在一些方面，本技术提供使用本文所述方法抑制肿瘤细胞生长的试剂盒。试剂盒包括含有一种或多种活性剂的容器。试剂盒可以另外包括用于实施本技术方法的本文所述的任何其它成分。
试剂盒可以任选地包括含有公开用于抑制肿瘤细胞生长的活性剂的用法说明的(即，方案)的说明材料。因此，一方面，试剂盒包括含有活性剂，优选脲酶的药物组合物，以及教导向对象施用该组合物以治疗对象中癌症的说明材料。在一方面，说明材料教导向对象施用如下量的脲酶组合物，其量取决于肿瘤的大小，并且当通过直接注射施用组合物进入肿瘤时，每mm3肿瘤0.1至100个国际单位的脲酶活性，当经肠胃外施用组合物于对象而不是通过直接注射进入肿瘤中时，其量为100-100,000个国际单位/kg国际单位脲酶活性/kg对象体重。
在另一方面，说明材料教导了以有效减少或逆转实体瘤中较高的细胞内/较低的细胞外pH值梯度的脲酶量，向还在接受其有效性被实体瘤中较高的细胞内/较低的细胞外pH值梯度降低的弱碱性抗肿瘤化合物的对象施用脲酶组合物。
可选地，说明材料教导了在可有效定位对象的实体瘤中的脲酶的条件下，向含有或怀疑含有实体瘤的对象施用脲酶组合物，用能够检测对象组织中细胞外pH值的变化的诊断工具问诊对象，以及鉴定在所述给药后显示细胞外pH值升高的对象内的组织区域。
虽然说明材料通常包括书面材料或印刷材料，但是它们不限于此。本技术涵盖了任何能够存储这些说明并将其传递给最终用户的介质。这样的介质包括但不限于：电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒带、芯片)，光学介质(例如，CD ROM)等。这样的介质可以包括提供这种说明材料的因特网站点的地址。
实施例
给出以下实施例是为了说明本公开的各个方面。它们并不意图以任何方式限制本公开。本领域技术人员将理解，本公开很好地适用于实现目标并获得所提及的目的和优点，以及本文中固有的任何目标、目的和优点。本发明的实施例(以及本文所述的方法)目前代表优选方面。它们是示例性的，并不意图限制本公开的范围。本领域技术人员将想到包含在由权利要求的范围限定的本公开的精神内的变化和其它用途。
实施例1.L-DOS47：靶向表达CEACAM6的肿瘤的抗体-脲酶缀合物
相对于正常组织，肿瘤的微环境通常是酸性的。响应于由异常脉管系统的局部缺氧导致无氧糖酵解而引起的乳酸积累，似乎是直接原因(1,2)。然而，即使在氧的存在下，癌细胞继续无氧代谢葡萄糖(3)。这表明转变的代谢表型和所产生的酸性环境可能赋予癌细胞生长优势(4)。
已经表明，将尿素转变成氨并提高溶液pH值的洋刀豆脲酶，对癌细胞是细胞毒性的(8)。在负载人乳腺癌和肺癌的异种移植物的小鼠中，向肿瘤内注射酶也显著延迟了肿瘤生长(8)。然而，在临床环境中，肿瘤内递送癌症治疗剂是一个困难的实践。在患有晚期和显著转移性疾病的患者中，瘤内注射不是可行的选择。更实际的方法是通过静脉内注射来递送酶。然而，脲酶缺乏靶向结构域，并且酶的全身递送可能导致脱靶毒性。使用特异性靶向肿瘤的抗体-酶缀合物将脲酶递送至癌症部位。所述缀合物中使用的该抗体能特异性识别在非小细胞肺癌患者中的CEACAM6。
选择识别肺腺癌细胞(17)上的CEACAM6的单结构域骆驼科抗体片段(AFAIKL2，SEQID NO.1)，用于与洋刀豆脲酶(DOS47)缀合以产生癌症治疗剂。本技术描述了对这种抗CEACAM6-脲酶缀合物(L-DOS47)进行的一些相关临床前研究(目前处在人类I期临床研究中)。
将洋刀豆脲酶的抗肿瘤活性与抗-CEACAM6单结构域抗体的特异性，以抗体-脲酶偶联物(L-DOS47)的形式组合。L-DOS47特异性结合表达CEACAM6的癌细胞系，并发挥有效的细胞毒作用。竞争性结合试验显示，由于增加的亲合力，L-DOS47的结合亲和力比天然单结构域抗体强约500倍。L-DOS47的细胞毒性取决于原位尿素的可用性和靶细胞对氨毒性的敏感性。通过沉默CEACAM6基因来保护BxPC-3细胞免受L-DOS47的影响，而CEACAM6过表达致使转染的H23细胞对L-DOS47细胞毒性敏感。人正常组织和癌组织的免疫化学染色显示，L-DOS47优先结合肺腺癌，以及结合结肠腺癌和胰腺腺癌，具有阳性但较弱的染色。小鼠肺腺癌A549细胞的转移研究也表明，L-DOS47在10μg/mL浓度下可有效减少肺中癌细胞计数。
材料。洋刀豆(Canavalia ensiformis)脲酶得自BioVectra Inc.(PEI，加拿大)，并通过酸沉淀、醇分级分离和离子交换色谱法进一步纯化。通过SDS-PAGE、HPLC和质谱法测定，酶的纯度>97％。脲酶的一个单位定义为在25℃和pH值7.6下产生1μmol/分钟的氨。
来自美洲驼的重链抗体库的噬菌体文库，用于通过对非小细胞肺腺癌A549进行淘选来鉴定单结构域抗体(sdAb)。sdAb被指定为AFAI(17)。优化AFAI的基因序列用于缀合目的，并重命名为AFAIKL2。然后将AFAIKL2抗体在大肠杆菌BL21(DE3)pT7-7系统中克隆并表达。使用离子交换色谱法从包涵体中纯化该抗体。使用异双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基-苯甲酸酯(SIAB)，进行抗体与脲酶的缀合。首先通过伯胺基团用SIAB连接子的NHS酯部分活化AFAIKL2抗体。活化的抗体通过交联剂的碘乙酰基结合脲酶，以释放存在于酶上的巯基。通过以2:1的质量比将高纯度脲酶和活化的抗体混合，来控制靶向缀合比(1:6至1:10，脲酶与抗体比)。通过超透析过滤纯化抗体-脲酶缀合物。
尿素、胰蛋白酶(组织培养级)、吩嗪硫酸乙酯(PES)、硝普化钠、次氯酸钠溶液、苯酚、NaCl、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3和戊二醛，购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)和胰蛋白酶(用于肽片段化和质谱分析)，购自Promega Corp.(Madison，WI)。过氧化氢(30％)、SIAB、KCl、D-葡萄糖、HCl、Na2HPO4和NaH2PO4，购自Fisher Scientific(Ottawa，ON)。牛血清白蛋白V部分(BSA)购自Roche(Indianapolis，IN)。氯化铵(0.100M)购自Ricca Chemical(Arlington，TX)。抗-AFAIKL2-过氧化物酶缀合物，由Rockland Immunochemicals(Gilbertsville，PA)生产。细胞培养基(RPMI)、胎牛血清和抗生素，获自LifeTechnologies(Burlington，ON)。雌性CrTac：NCr-Foxn1nu裸鼠，由Taconic(Hudson，NY)提供。实验中使用的改性Krebs Ringer缓冲液(KRB)含有NaCl(98.3mM)、KCl(4.73mM)、KH2PO4(1.19mM)、MgSO4(1.19mM)、D-葡萄糖(11.7mM)、Na2HPO4(11.1mM)和NaH2PO4(2.77mM)，pH值7.2。
靛酚测定
使用改良的靛酚测定法(18)，测定脲酶酶反应产生的氨的量。简言之，通过将165mg苯酚和132mg NaOH颗粒溶解在10mL水中，然后加入66μL硝普化钠溶液(10mg/mL)，新鲜制备溶液A。通过向5mL水中加入40μL次氯酸钠制备溶液B。将来自全细胞结合试验(见下文)的样品溶液(每次30μL)转移到含有50μL/孔的5N NaOH:H2O(3.3:46.7)和20μL/孔水的新的96孔板中。加入溶液A(50μL/孔)和溶液B(50μL/孔)，然后将平板转移到酶标仪上，在37℃显色30分钟。在630nm处测量OD值。使用氯化氨作为标准品(0至150μM)，从校准曲线计算在孔中产生的氨的量。
L-DOS47的全细胞结合测定
通过在96孔培养板中接种100μL/孔的肿瘤细胞(4×104个细胞/孔)，并在37℃孵育过夜，来制备细胞单层。从平板上去除培养基，并在室温(RT)下用100μL/孔的0.05％戊二醛(在磷酸盐缓冲盐水，PBS中)将细胞单层固定10分钟。然后用PBS洗涤平板，加入120μL/孔的甘氨酸溶液(50mM)，并在37℃下孵育20分钟。孵育后，将平板用120μL/孔的1％BSA/PBS在37℃封闭30分钟。然后，将平板用缓冲液A(PBS中0.05％BSA)洗涤3次，加入80μL/孔的稀释的L-DOS47溶液或DOS47溶液，并在37℃下孵育1.5小时。通过尿素方法或抗体方法产生结合信号：(1)用尿素方法，将平板用缓冲液A洗涤4次，加入80μL/孔的20mM尿素(在pH值7.6的0.1M磷酸盐缓冲液中制备)，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，加入40μL/孔的1N HCl以停止反应。使用靛酚测定法测定每个孔中产生的氨的量。(2)对于抗体方法，在封闭步骤前，首先用100μL/孔的0.3％过氧化氢猝灭内源性过氧化物酶30分钟。在用试验物质孵育后，用PBS洗涤平板，并在含有0.05％Tween-20和0.1％奶粉的缓冲液A中，制备稀释的抗-AFAIKL2-过氧化物酶抗体缀合物(1:8,000)。将平板用缓冲液A洗涤3次，向平板中加入100μL/孔的抗体-过氧化物酶缀合物。在37℃下孵育1小时后，将平板用缓冲液A洗涤3次。在含有0.03％H2O2的柠檬酸钠缓冲液中，制备1mM的过氧化物酶底物，加入100μL/孔的底物溶液，并在室温下孵育30分钟。将平板转移至酶标仪，在405nm下测量OD值。
L-DOS47的细胞毒性测定
通过在96孔培养板中接种100μL/孔的肿瘤细胞(4×104个细胞/孔)，并在37℃孵育过夜，来制备细胞单层。从每个孔中去除培养基，加入80μL/孔的L-DOS47或DOS47，并在37℃下进一步孵育2小时。孵育后，将平板用缓冲液A洗涤3次。然后将100μL/孔的KRB中的尿素(20mM)加入到平板中，将其在37℃下孵育过夜。去除培养基，用100μL/孔普通培养基代替。使用MTS细胞活力测定法测定细胞活力，其中制备MTS/PES溶液混合物(20:1体积/体积；MTS，2mg/mL；PES，1mg/mL)，并将20μL/孔的混合物加入到平板中。然后将平板在37℃下孵育1-2小时，并在630nm处测量OD值，参考490nm处的OD值。
基于细胞的电化学发光(ECL)结合测定
根据制造商的说明书，用钌-NHS-酯(Sulfo-Tag，Meso Scale Discovery MSD；Rockville，MD)标记L-DOS47、AFAIKL2抗体和DOS47。这些钌标记的蛋白允许直接测量L-DOS47和AFAIKL2与靶抗原的结合。对于直接结合测定，在96孔SECTOR PR高结合板(MSD)上，制备BxPC-3细胞单层。固定和封闭后，加入各种量的L-DOS47标签或AFAIKL2标签。将平板在37℃下孵育1.5小时。孵育后，将板洗涤两次，并用读取缓冲液(Read Buffer)(MSD)填充。然后立即使用SECTOR PR-100读取器(MSD)读取ECL信号。对于竞争性结合测定，使用L-DOS47或AFAIKL2抗体来抑制L-DOS47标签与BxPC-3细胞的结合。使用1μg/mL的L-DOS47标签结合BxPC-3细胞。使用各种浓度的竞争者(L-DOS47或AFAIKL2)来竞争标记的L-DOS47的结合。孵育后，将平板洗涤两次，并用读取缓冲液填充。然后立即使用SECTOR PR-100读取器读取平板。
BxPC-3细胞中的CEACAM6基因敲低
为了证实CEACAM6是由L-DOS47识别的特异性抗原，使用来自OriGene(Rockville，MD)的HuSH-29发夹表达克隆，使阳性细胞系BxPC-3的CEACAM6基因沉默。这些质粒转录短发夹RNA(shRNA)序列，其通过RNA干扰阻断靶基因转录。用HuSH质粒转染BxPC-3细胞，并且使用嘌呤霉素来选择出稳定转染的细胞。从转染HuSH6(AAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTA(SEQ ID NO：5))、HuSH7(AAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATAC(SEQ ID NO：6))和对照质粒HuSH-TRS，获得不同的克隆。通过抗生素选择来获得两种阳性稳定细胞系(HUSH#6和HUSH#7)和对照(HUSH-TRS)。然后使用全细胞结合测定法，将这些克隆用于检查与L-DOS47的结合。用L-DOS47孵育后，将平板用缓冲液A洗涤3次，加入80μL/孔的20mM尿素(在pH值7.6的0.1M磷酸盐缓冲液中制备)。将平板在37℃下孵育30分钟。通过加入40μL/孔的1N HCl终止酶促反应。使用靛酚测定法测定产生的氨的量。
将CEACAM6基因转染到H23细胞
将含有G418选择标记的哺乳动物表达载体克隆，其具有PMP-GFP基因(质膜蛋白-绿色荧光蛋白)和CEACAM6基因。使用Cellfectin试剂(Life Technologies)，将表达载体转染到H23细胞中。简言之，将在2mL完全RPMI培养基(含有10％胎牛血清和50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素)中的2×106个细胞/孔的H23细胞，接种在6孔培养板中并在37℃下孵育过夜。将Cellfectin试剂(10μL)和DNA(1-2μL)分别稀释于100μL无血清RPMI培养基中。然后将两种稀释溶液合并，轻轻混合，并在室温下孵育30分钟。将平板用1.5mL无血清RPMI培养基洗涤两次。将合并的溶液稀释于0.8mL无血清RPMI培养基中，轻轻混合，并加入到细胞中。将细胞于37℃在CO2培养箱中孵育过夜。第二天，用2mL完全RPMI培养基代替该培养基。转染的细胞共表达了来自与CEACAM6相同的mRNA的GFP。通过在含有400μg/mL G418抗生素的培养基中孵育来选择转染的细胞。将细胞直接分选或用Cy5.5标记的L-DOS47孵育后分选，其表明CEACAM6的表面表达。
L-DOS47对人肿瘤组织的免疫化学染色
筛选代表42个癌组织和正常组织的总共400个组织样品(Axel Wellmann，University Hospital Aachen，RWTH Aachen Germany)。首先将载玻片在62℃的烘箱中以垂直取向孵育1小时以除去石蜡。然后，将载玻片在二甲苯代替物中脱蜡5×4分钟。将载玻片在100％、95％和75％乙醇中水合2x3分钟每次，然后浸入自来水中5分钟。用0.3％H2O2淬灭内源性过氧化物酶30分钟。使用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Labs，Burlington，ON)，检测载玻片上的L-DOS47结合。简言之，在PBS中洗涤3×5分钟后，将载玻片在封闭血清中于4℃孵育过夜。然后将载玻片在L-DOS47溶液(在缓冲液A中为20μg/mL)中于37℃中孵育1.5小时。用PBS洗涤后，将载玻片用小鼠抗-脲酶抗体(Sigma，1:1500)在37℃孵育1小时。用PBS洗涤后，将载玻片用生物素化的二抗溶液(Vector Labs)孵育30分钟。用PBS洗涤后，将载玻片与Vectastain Elite ABC试剂一起孵育30分钟。用PBS洗涤后，将载玻片在新鲜的DAB(3,3-二氨基联苯胺)过氧化物酶底物溶液混合物(Vector Labs)中，在室温下孵育2分钟。通过在自来水中洗涤5分钟来停止反应。然后将载玻片在Meyer苏木精中复染10sec。将载玻片在75％、80％、95％和100％乙醇中脱水。在二甲苯中清洗后，用Clarion安装介质安装载玻片。
A549转移研究
接种A549肿瘤细胞(5×106)，并在低结合培养板中生长。一旦获得足够的数量，收获细胞并以5×106个细胞/mL的浓度重悬于培养基中。然后将细胞以1mL/孔置于6-孔的低结合组织培养板中。然后将终浓度为10μg/mL或15μg/mL的L-DOS47(1mL)加入每个孔中。用10μg/mL的V21-DOS47缀合物(靶向血管内皮生长因子(VEGF)受体的抗体-脲酶缀合物)处理同种型对照。将细胞在37℃下孵育4小时。孵育后，将细胞离心并用无菌PBS洗涤3次，并在无菌PBS中重悬至1×107个细胞/mL。然后每只小鼠接受1×106个处理的细胞的单次接种。本研究由4组雌性CrTac：NCr-Foxn1nu小鼠(未处理、同种型和L-DOS47(10μg/mL和15μg/mL))组成。通过尾静脉进行静脉内接种A549肿瘤细胞，总共40只小鼠(每组10只)。
每组5只动物在第22天(3周)安乐死，而剩余动物保持到第71天(10周)。处死后，用墨汁(Calvert Labs；Olyphant，PA)气管内注射动物；然后切除肺，随后在Fekete溶液(Calvert Labs)中固定。通过在解剖显微镜下计数每个肺中的转移性肿瘤(病灶)的数目，来确定测试物品对肿瘤转移的影响。拍摄来自各组的代表性肺。
L-DOS47结合各种癌细胞系
在5种肿瘤细胞系-BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T和MDA-MB231之间，观察到L-DOS47的不同结合分布图(图1A)。结果显示，L-DOS47与两种胰腺细胞系(BxPC-3和Capan-1)和乳腺细胞系(ZR-75-30)结合良好，表明CEACAM6抗原在细胞表面表达。在结肠细胞系LS174T中也观察到中等结合，但在乳腺细胞系MDA-MB231(阴性对照)中没有发现结合。当与脲酶缀合时，AFAIKL2抗体提供了针对表达CEACAM6细胞的特异性靶向。这通过在DOS47处理的细胞中没有结合信号得以证实(数据未显示)。
L-DOS47的细胞毒性
图1B显示，BxPC-3和ZR-75-30都对L-DOS47细胞毒性敏感。在用小于1μg/mL的L-DOS47处理的这两种细胞系中，观察到细胞存活的快速下降。在Capan-1细胞和LS174T细胞中，观察到中等作用。L-DOS47对阴性对照细胞系MDA-MB231没有任何作用。来自更多细胞系的结合和细胞毒性的结果列表显示在表1中。L-DOS47细胞毒性直接取决于L-DOS47对相应细胞系的结合活性。A549和Capan-1的较弱的细胞毒性应答，是由于这两种细胞系对氨毒性的较高耐受性(数据未显示)。另一方面，H23细胞对氨高度敏感(数据未显示)。尽管在细胞表面没有CEACAM6抗原，H23细胞仍然显示出对L-DOS47的一些弱的细胞毒性应答，这可能是由于在孔中存在非特异性结合的L-DOS47。
表1.从L-DOS47对9种人肿瘤细胞系的各种结合和细胞毒性研究获得的结果总结
其中：+，阳性(+的数表示活性强度)；-，阴性
来自四种人组织的五种细胞系(BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T和A549)，显示出如表1中所示的强L-DOS47结合和对L-DOS47细胞毒性的良好敏感性(A549除外)。L-DOS47的细胞毒性作用或多或少依赖于与癌细胞的相对结合强度。图中的结果表示代表性实验的平均值(n＝3)。所有值的标准偏差(SD)小于10％。
L-DOS47与BxPC-3细胞的直接和竞争性结合
基于细胞的电化学发光结合测定，允许直接检测结合到肿瘤细胞的钌标记的抗体缀合物。在图2A中，发现钌标记的L-DOS47和AFAIKL2抗体都结合BxPC-3细胞，而钌标记的DOS47作为阴性对照。因为L-DOS47中呈现较高的抗体亲合力(6-10个抗体)，L-DOS47显示出比AFAIKL2抗体高得多的结合亲和力。使用L-DOS47和AFAIKL2抗体作为竞争者来抑制钌标记的L-DOS47与BxPC-3细胞的结合，进一步证实了结果(图2B)。L-DOS47和AFAIKL2抗体均抑制钌标记的L-DOS47与BxPC-3的结合，并且如预期的那样，L-DOS47表现出更好的结合亲和力，并因此比AFAIKL2抗体更强地抑制钌标记的L-DOS47与BxPC-3的结合。可以通过测试物品的IC50(导致结合降低50％所需竞争者的量)来比较L-DOS47和AFAIKL2抗体的表观结合亲和力。估计L-DOS47和AFAIKL2抗体的IC50分别为2μg/mL和20μg/mL；或对于L-DOS47为3.22nM(对于1个脲酶比6个抗体的缀合比，MW＝622k)和对于AFAIKL2为1.55μM(MW＝12.9k)。结果表明，L-DOS47的结合亲和力为AFAIKL2抗体的结合亲和力的约500倍。
在H23细胞中过表达转染的CEACAM6基因
用CEACAM6基因转染后，鉴定出阳性克隆H23-CC6#7。通过用L-DOS47-cy5.5重新分选H23-CC6#7克隆，获得具有更接近于A549细胞的CEACAM6水平的克隆。用更高量的G418抗生素(800μg/mL)进一步孵育克隆，有助于选择具有较高水平的CEACAM6表达的克隆。尽管H23-CC6#7比A549细胞和BxPC-3细胞在细胞表面上表达较少的CEACAM6，但由于其对氨的毒性的高度易感性(数据未显示)，该CEACAM6转染的克隆比BxPC-3细胞对L-DOS47细胞毒性更敏感(图3B)。
BxPC-3细胞中的CEACAM6基因敲低
与天然BxPC-3细胞和对照克隆(HUSH-TR3)相比，L-DOS47与两个CEACAM6敲低克隆(HUSH#6和HUSH#7)的结合显著降低(图3C)。实验清楚地表明，CEACAM6在细胞表面的存在对于L-DOS47结合是重要的。沉默该基因确实显著降低了L-DOS47的结合。
L-DOS47对人肿瘤组织的免疫化学染色
正常组织和癌组织筛选表明，L-DOS47几乎唯一地识别腺癌亚型(表2)。在筛选的400多个组织样品中，其代表由各种癌组织和匹配的正常组织组成的42组，肺腺癌组织显示相当大的染色，有超过80％的细胞被识别。相应的年龄匹配的正常肺组织是阴性，其少数活化肺细胞中有病灶暗示。显示一些阳性但弱染色的其他组织是结肠腺癌和胰腺腺癌。图4显示用L-DOS47进行结肠腺癌和肺腺癌免疫化学染色。
表2.筛选L-DOS47结合的人正常组织和癌组织
用L-DOS47进行的人结肠腺癌和肺腺癌免疫组织化学染色如图4所示。
A549转移研究
在3周时，接受用10μg/ml和15μg/ml L-DOS47处理的A549细胞的小鼠显示出降低的肺肿瘤计数，与未处理的对照组相比展示显著的降低(p<0.05)(表3)。然而，在10周时，没有观察到肿瘤细胞计数的平均数量的显著降低。尽管不具有统计学意义，但用10μg/ml L-DOS47治疗，与未治疗的对照组相比，治疗后3周和10周显示平均肿瘤细胞数量一致下降(表3)。有趣地是，同种型对照(V21-DOS47)也影响并减少了肺中的肿瘤计数的数量。总之，在治疗后3周，用10μg/mL的L-DOS47处理的A549细胞减少了肺肿瘤的平均数，但是这种作用是短暂的，因为在治疗后10周没有观察到平均肿瘤数目的显著降低。
表3.在A549转移研究中计数的肺肿瘤的平均数
#平均值±sem；当与未处理的对照组相比时，*p<0.05。
如表3所示，在体外用L-DOS47或同种型对照(V21-DOS47)处理A549人肺腺癌细胞。在37℃下孵育4小时后，将细胞用PBS洗涤3次，并以1×107个细胞/mL重悬于PBS中。然后每只小鼠接受1×106个处理的细胞的单次接种。每组5只动物在注射后3周和10周安乐死。通过在解剖显微镜下计数每个肺中的转移性肿瘤的数量，来确定测试物品对肿瘤转移的影响。将L-DOS47治疗组的转移性肿瘤生长，与未经治疗的对照组进行非配对t检验比较。用L-DOS47共注射治疗后3周，显著减少肿瘤计数的数量。
证明了，基于由脲酶介导的氨产生和局部pH值升高，使用脲酶作为潜在癌症治疗剂(8)。然而，相对于正常细胞所述酶对肿瘤细胞的选择性缺乏，已经限制了其作为癌症治疗剂的应用。抗体-药物缀合物(ADC)的应用，或更具体地，该技术的抗体导向酶前药治疗(ADEPT)的应用，可以规避这种限制。在该实施例中，通过将CEACAM6特异性美洲鸵单结构域抗体(AFAIKL2)与脲酶(DOS47)缀合，来制备抗体-脲酶缀合物(L-DOS47)的特殊形式。缀合的AFAIKL2抗体提供了特异性，因此提高了脲酶对表达CEACAM6的肿瘤的疗效。通过体外结合研究来评估L-DOS47对在细胞表面表达CEACAM6的癌细胞的特异性(图1和图2)。这些研究结果表明，L-DOS47结合表达CEACAM6的细胞系(BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30和LS174T)，但不结合不表达的细胞系(MDA-MB231)。此外，通过CEACAM6在癌细胞中的敲低和过表达实验，证实了CEACAM6的功能作用(图3)。通过将CEACAM6编码的质粒转染到H23细胞中，CEACAM6被过表达，而在BxPC-3细胞中通过小发夹RNA介导的CEACAM6缺失来进行基因敲低。结合研究显示，L-DOS47以高亲和力结合天然BxPC-3细胞，但不结合具有CEACAM6基因敲低的BxPC-3细胞(图3C)。相比之下，CEACAM6在H23细胞中的过表达使得该细胞对L-DOS47结合和细胞毒性敏感(图3A和图3B)。这些结果表明，L-DOS47与CEACAM6抗原的特异性结合对于抗体缀合物诱导肿瘤细胞毒性是重要的。相对于单独抗体，将抗体与脲酶缀合的另一个好处是亲合力的总体增加。ECL结合分析显示，具有6-10个抗体比1个脲酶的摩尔缀合比的L-DOS47与BxPC-3细胞的结合，超过单一抗体与BxPC-3细胞的结合500倍(图2B)。进一步的结合研究表明，对于L-DOS47结合CEACAM6，大于6:1的抗体比酶的缀合比是最佳的(数据未显示)。
通过体外研究和体内研究调查了作用机制。脲酶是L-DOS47的活性成分，以前的研究已经证明在体外脲酶对人类肿瘤细胞具有细胞毒性(8)。对裸鼠的A549(肺)肿瘤和MCF-7(乳腺)肿瘤进行脲酶瘤内给药，显著抑制了肿瘤生长(8)。然而，脲酶或L-DOS47的细胞毒性也依赖于肿瘤细胞系对氨的敏感性。例如，在图1A中，L-DOS47与BxPC-3、ZR-75-30和Capan-1的结合大致相同，但与其他两种细胞系相比，Capan-1显示出中等的细胞毒性应答(图1B)。与BxPC-3和ZR-75-30相比，Capan-1对氨细胞毒性作用较不敏感(数据未显示)。类似地，人肺腺癌H23细胞对氨的存在敏感；与BxPC-3细胞(数据未显示)和A549细胞(图3A)相比，尽管在细胞表面上呈现较少的CEACAM6抗原，但一旦用CEACAM6基因转染，该细胞系变得对L-DOS47细胞毒性敏感(图3B)。总之，对于L-DOS47对肿瘤发挥细胞毒作用，在细胞表面表达CEACAM6和对氨的敏感性是两个重要的要求。
人癌症组织的免疫组织化学筛选显示，L-DOS47对肺腺癌、结肠腺癌和胰腺癌是特异性的(表2)，但不针对相应的正常组织。脲酶表面的多重抗体的缀合，大大增强了对CEACAM6抗原的特异性(图1A和图2)，并且降低了该酶的非特异性结合性质(数据未显示)。体内研究进一步证实了L-DOS47对肿瘤异种移植物的疗效。在对裸小鼠肿瘤异种移植物的L-DOS47的静脉内注射给药中(数据未显示)和A549肺腺癌转移研究中，观察到肿瘤生长抑制(表3)。在用10μg/mL或15μg/mL L-DOS47注射后3周的处理的A549细胞中，观察到肺部病灶的显著减少(表3)。然而，10周后没有发现显著性差异，这可能是由于来自动物对L-DOS47的清除。同种型对照(V21-DOS47，抗VEGFR2-DOS47缀合物)也引起一定程度的肺部病灶的减少，尽管事实是A549细胞在正常条件下不表达VEGFR2。Ohwada等人(19)报道，在暴露于50mMHCl后的A549细胞中诱导了VEGFR功能。可以通过外源VEGF给药来恢复受损的A549细胞的抑制增殖，而加入中和性的抗-VEGFR1抗体和抗-VEGFR2抗体则重新抑制细胞增殖。然而，VEGF抗体和抗-VEGFR抗体都对对照细胞没有影响。不希望被理论束缚，在这种转移研究中，可能在细胞制备过程中诱导A549细胞中的VEGFR2功能。这解释了为什么在同种型对照组中观察到细胞计数减少。来自体外研究和体内研究的结果表明，抗体缀合至脲酶使得该抗体缀合物能够以良好的选择性和疗效特异性靶向表达CEACAM6的肿瘤，这为L-DOS47的临床开发提供了概念证明。
实例2.在复发性或转移性非鳞状NSCLC(非小细胞肺癌)中的L-DOS47剂量升高研究
这项研究的主要目的是，评估在具有第IV阶段(TNM M1a和M1b)复发性或转移性非鳞状非小细胞肺癌的患者中，与培美曲塞/卡铂的标准双效治疗联合的L-DOS47剂量范围的安全性、耐受性以及有效性。
主要疗效判定指标如下。不良事件患者的数量，作为与培美曲塞/卡铂联合治疗的L-DOS47安全性和耐受性的度量，是随访12周的参与者。这被指定为安全性问题。AE报告期从第1周期的第1天开始，直至最后的研究访问。次要疗效判定指标如下。根据RECIST 1.1接受联合治疗的患者的客观反应率最长为12周，并且未被指定为安全性问题。在已经完成了至少2个周期的研究治疗并且具有至少1次治疗后疾病评估的患者中，将根据1.1版本的RECIST评估客观肿瘤反应。接受持续临床受益的患者数量随访达12周，并未被指定为安全性问题。定义为与L-DOS47+培美曲塞/卡铂联合治疗后，达到完全应答、部分应答和稳定疾病的患者百分比。与培美曲塞/卡铂联合治疗给药后，L-DOS47的最大观察血浆浓度(Cmax)长达12周，并未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。与培美曲塞/卡铂联合治疗给药后，出现L-DOS47的最大观察血浆浓度(Tmax)的时间长达12周，并未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中，确定L-DOS47的药代动力学参数。与培美曲塞/卡铂联合治疗给药后，L-DOS47的浓度-时间曲线下面积(AUC)长达12周，未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。与培美曲塞/卡铂联合治疗给药后，L-DOS47的终末消除半衰期长达12周，并未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。与培美曲塞/卡铂联合治疗，用L-DOS47给药的患者的抗L-DOS47抗体的存在长达12周，并被指定为安全性问题。从用L-DOS47给药的所有患者中收集和分析血清样品。
将进行涉及培美曲塞和卡铂+L-DOS47的实验。患者将被招募到L-DOS47升高剂量的群组中，每个群组最少3名患者，最多6名患者。L-DOS47的起始剂量为0.59μg/kg；可评估的进一步可能的剂量水平为0.78μg/kg、1.04μg/kg、1.38μg/kg和1.84μg/kg。分别与L-DOS47联合施用的培美曲塞[500mg/m2]和卡铂[AUC6]的护理剂量标准，将在群组间保持不变。治疗周期为21天，患者在周期的第1天、第8天和15天接受L-DOS47治疗，并且在每个治疗周期的第1天接受培美曲塞/卡铂。计划患者将接受4个周期L-DOS47+培美曲塞/卡铂的联合治疗。根据研究者的意见，只要有临床益处并且耐受性良好，在4个周期联合治疗后疾病没有发展的和没有经历不可接受的毒性的患者，将有机会继续接受L-DOS47治疗直到疾病进展。根据研究者的意见，由于培美曲塞/卡铂毒性而无法完成4个周期L-DOS47+培美曲塞/卡铂联合治疗的患者，只要有临床益处并且耐受性良好，将有机会在停用培美曲塞/卡铂后继续接受L-DOS47治疗直到疾病进展。
实施例3.用于治疗非小细胞肺癌的免疫缀合物L-DOS47的I期/II期非盲、非随机剂量升高研究
本研究的主要目的是，评价当作为单一疗法给予时，非鳞状非小细胞肺癌患者的L-DOS47剂量范围的安全性、耐受性和有效性。
主要疗效判定指标如下。药物相关不良事件的发生率和严重程度，作为L-DOS47的安全性和耐受性的度量长达12周，并被指定为安全性问题。在从第1周期第1天开始，直到最后研究访问的AE报告期间评估这些结果。
主次疗效判定指标如下。在输注后的第一个2小时期间的L-DOS47相关毒性，是在输注后的第一个2小时期间，并被指定为安全性问题。通过AE和SAE的发生率和严重程度以及生命体征的变化来评估这些结果。所有报告的不良事件和严重不良事件的发生率和严重程度均在时间框架之下，即参与者将被随访12周和30天的随访期。这些结果被指定为安全性问题，并从第1周期第1天开始，直到最后研究访问的AE报告期间被评估。其他安全参数(临床实验室评估、生命体征、体重、氧气需求和12导联心电图)从基线的变化在直到12周的时间框架内，并被指定为安全性问题。安全参数包括临床实验室评估、生命体征、重量、氧需求量和12导联心电图。抗L-DOS47抗体随时间推移评估长达12周，并被指定为安全性问题。从用L-DOS47给药的所有患者中收集和分析血清样品。
其他疗效判定指标如下。在每个剂量水平下，L-DOS47的最大观察血浆浓度(Cmax)在直到12周的时间框架内，并未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。在每个剂量水平下，出现L-DOS47的最大观察血浆浓度(Tmax)的时间长达12周，并未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。在每个剂量水平下，测量L-DOS47的浓度-时间曲线下面积(AUC)长达12周，并未指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。在每个剂量水平下，L-DOS47的终点消除半衰期在直到12周的时间框架内，并未被指定为安全性问题。将从收集自用L-DOS47给药的所有患者的血浆样品中确定L-DOS47的药代动力学参数。患者将被招募到L-DOS47升级剂量的群组中，每个群组最少3名患者，最多6名患者。L-DOS47的起始剂量为0.12μg/kg；进一步可能的剂量水平包括0.21μg/kg、0.33μg/kg、0.46μg/kg、0.59μg/kg、0.78μg/kg、1.04μg/kg、1.38μg/kg、1.84μg/kg、2.45μg/kg、3.26μg/kg和4.33μg/kg。治疗周期为21天，患者在第1周期的第1天和第8天接受L-DOS47治疗。
患者将被招募到群组中，每群组最少三名患者，最多六名患者。在随后的患者可以进行递增之前，给定剂量水平的所有患者必须完成第1周期(3周的周期)。在安全性和可用的药代动力学(PK)数据已由试验指导委员会(TSC)审查后，将进行剂量递增至下一剂量水平的决定。递增L-DOS47将持续，直到达到最大耐受剂量(MTD)。在第一阶段确定L-DOS47的MTD后，最多可以招募20名患者(从I期开始)来评估L-DOS47的初步疗效(即使用1.1标准版本(疾病进展和生存)的实体肿瘤反应评估标准的应答率[RECIST])；监测将包括每两个周期的放射学评估。也将进一步评估L-DOS47的安全性和耐受性。将收集L-DOS47的药代动力学信息以及关于其活性的相关观察结果。
对于所有患者，使用L-DOS47的治疗将持续，直到患者经历疾病进展、不可接受的毒性，患者撤回同意或已经完成了四个治疗周期，并且不希望继续进行额外的周期，以先发生者为准。四个周期后，根据研究者的意见，只要有持续的临床益处并且耐受性好，患者可能会持续接受L-DOS47。
实施例4：制备和表征用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的骆驼科单结构域抗体-脲酶缀合物
最常用的癌症化疗药物的有效性，受到其狭窄的治疗指标和对肿瘤细胞缺乏选择性作用的限制。抗体定向酶前药治疗(ADEPT)通过将抗体-酶缀合物递送到肿瘤位点来改善选择性，其中抗体-酶缀合物在肿瘤位点与肿瘤相关抗原结合，而剩余的未结合的缀合物从血流中消除[20]。一旦抗体-酶缀合物积累，前药被施用并且在肿瘤部位通过抗体-酶缀合物的酶部分转化为其活性细胞毒性形式，从而实现选择性肿瘤细胞死亡。由于ADEPT概念是由Bagshawe于1987年引入的[20-22]，研究人员已经应用了这一概念的变化来开发更有效和更具有特效的抗癌药物[22-24]。开发了不同代的半乳糖苷前药和抗体-半乳糖苷酶缀合物，以减少全身毒性，同时增加活化药物的细胞毒性[25]。改造人嘌呤核苷磷酸化酶的突变形式，以增强基于腺苷的前药作为底物的特异性[26]。此外，已经开发了不同类型的免疫酶输注蛋白，以改善酶活性和抗体亲合力[27-29]。
描述了L-DOS47的制备和表征，其是具有每个天然脲酶分子约10个抗体的缀合比的单结构域重组抗体与洋刀豆脲酶的化学缀合物。L-DOS47免疫缀合物使用在肿瘤组织中天然丰富的尿素作为产生氨的前药。AFAIKL2抗体与靶肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原CEACAM6[33]的选择性结合导致尿素酶的积累，从而导致细胞外尿素的水解以产生细胞毒性的氨，并产生不利于癌细胞的碱性环境[34]。由于缀合物的复杂性和大小，其可以具有高达680kDa的分子量，因此开发了缀合物化学、反应和分离程序以应对大规模生产中的挑战。由于脲酶具有选择抗体的多个潜在的缀合位点，所以使用Experion SDS微通道凝胶电泳系统来表征L-DOS47对药物效力至关重要的缀合比[31,32]。通过尺寸排阻色谱法测定L-DOS47缀合物纯度。通过质谱肽图谱和蛋白质印迹来表征L-DOS47的化学特性。由于在单结构域抗体的CDR3区域上携带伯胺(K32)，所以通过RP-HPLC和MALDI质谱法测定抗体侧的缀合位点的分布。还通过ESI质谱法表征抗体侧和脲酶侧的缀合位点。通过ELISA评估缀合比对L-DOS47结合CEACAM6的亲和力的影响。进行体外研究，以确认L-DOS47结合及其在表达CEACAM6的癌细胞系中引起细胞毒性的能力。
开发和表征作为用于表达CEACAM6的肿瘤的治疗剂的免疫缀合物(L-DOS47)。在大肠杆菌BL21(DE3)pT7-7系统中表达靶向CEACAM6的单结构域抗体AFAIKL2。从洋刀豆磨粉中提取和纯化高纯度脲酶(HPU)。使用N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(SIAB)作为交联剂来活化AFAIKL2，然后将其与脲酶缀合。通过改变pH值来控制活化反应和缀合反应。在这些条件下，材料比率实现每个脲酶分子8-11个抗体的缀合比，残留的游离脲酶含量几乎可以忽略不计(<2％)，可以仅使用超滤去除未反应的抗体和水解的交联剂制备高纯度(>95％)的L-DOS47缀合物。通过包括SEC、IEC、蛋白质印迹、ELISA和LC-MSE肽图谱的一组分析技术来表征L-DOS47。随着抗体-脲酶缀合比的增加，观察到更高的结合信号。然而，在高于每脲酶6个抗体的缀合比下，效果较不明显。通过在三种细胞系(BxPC-3、A549和MCF7)中筛选，证实L-DOS47的特异性和细胞毒性。发现BxPC-3(表达CEACAM6的细胞系)对L-DOS47最为敏感。正在研究L-DOS47作为在人I期临床研究中用于非小细胞肺癌(NSCLC)的潜在治疗剂。
制备高纯度尿素酶的中间体尿素酶(以下称为粗制尿素酶或DOS47)，采购自BioVectra Inc.(Charlottetown，PE Canada)。在用于缀合前，纯化粗制脲酶以去除洋刀豆基质蛋白污染物(如刀豆球蛋白和伴刀豆球蛋白A)。将粗制脲酶溶解在高纯度水中，并用10mM乙酸、0.2mM EDTA(乙酸盐-EDTA缓冲液)将pH值调至5.15，然后使用硅藻土503的浆液在真空下过滤。将滤饼用10mM乙酸钠、1mM EDTA、pH值5.15的缓冲液洗涤，并在真空下干燥。将含脲酶的滤液冷却至0-4℃，并通过加入冷冻乙醇分级分离至终浓度为25％(v/v)。将混合物搅拌15分钟，然后使用洗涤的硅藻土503在真空下过滤。将滤饼用含有25％(v/v)乙醇的乙酸盐-EDTA缓冲液洗涤，然后在真空下干燥。
将滤饼重新悬浮于乙酸盐-EDTA缓冲液中，并将该浆液在真空下通过硅藻土过滤以收集滤液。所得滤饼用乙酸盐-EDTA缓冲液洗涤，并在真空下干燥。将洗涤滤液和初始滤液通过0.65μm小皿过滤。使用两个Sartorius Sartocon 100000Da MWCO聚醚砜膜，将该乙醇分级分离的脲酶滤液浓缩至～2X，随后缓冲液更换为乙酸盐-EDTA缓冲液。
将咪唑和TCEP(三羟甲基氨基甲烷(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐)，分别以20mM和1mM的终浓度加入到该培养基纯度脲酶中，并将pH值调节至6.5。将蛋白溶液加载到用20mM咪唑、1mM TCEP、pH值6.5的缓冲液(咪唑-TCEP缓冲液)预平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱上。所有步骤以500mL/min的流速进行。该柱用咪唑-TCEP缓冲液洗涤，然后用含有80mMNaCl的咪唑-TCEP缓冲液洗涤，以去除未结合的杂质。用含有180mM NaCl的咪唑-TCEP缓冲液洗脱脲酶。合并A280>0.1和SEC的纯度≥90-97％的级分。
使用两个Sartorious Sartocon 100 000Da MWCO PESU膜，将合并的级分浓缩至浓度为6-8mg/mL的目标蛋白，然后对含有10mM乙酸钠、1mM EDTA、pH值6.5的乙酸盐-EDTA缓冲液进行渗滤。该步骤的产率通常>起始活性的55％。表达和纯化AFAIKL2药物中间体，AFAIKL2抗体的氨基酸序列如图5(SEQ ID NO.1)所示。
在大肠杆菌BL21(DE3)pT7-7系统中表达抗体基因。将一个小瓶的主细胞库，通过三个接种步骤无菌地接种到补充有50mg/L卡那霉素、1g/L葡萄糖、0.02g/L MgSO4和0.01％Biospumex消泡剂的350L Luria HiVeg(20g/L)试剂的500L发酵罐中。控制该过程以将溶解氧维持在>20％，温度在37℃±2℃，背压在5-20psi之间，pH值在7.0±0.2，OD600在0.5-40之间和葡萄糖浓度在1-3g/L之间。一旦培养物达到7-10的OD600，通过加入IPTG至终浓度为1mM来诱导抗体表达，并允许持续6-8小时。通过离心收集细胞，洗涤并裂解以释放包涵体，然后重悬于10倍体积的pH值6.8的50mM咪唑中。将细胞悬浮液分批均质，并将匀浆首先通过75微米不锈钢卫生筛，然后通过最小压力为10,000psi的微射流机总共三次，同时保持温度低于10℃。将细胞裂解物离心，将不溶物质合并，并且在均化作用下将沉淀重新悬浮于10倍体积的含有5mM DTT的1％Triton X-100中。通过离心收集洗涤的沉淀。重复该洗涤，然后用含有5mM DTT的pH值4.0的25mM乙酸钠洗涤二次，以除去残留的Triton X-100，并将沉淀缓冲至pH值4。
将含有洗涤的包涵体的沉淀，重新悬浮于8M尿素、25mM DTT、125mM乙酸钠，pH值4.0的缓冲液中，然后用Ross均质器和架空混合器交替溶解，直至视觉外观无进一步变化，然后单独用架空混合器总共混合3小时。将溶解的包涵体离心，将澄清的上清液以550mL/min加载到SP-Sepharose XL柱上，该柱用在pH值4.0的125mM乙酸钠中的8M尿素(SP平衡缓冲液)预平衡。加载澄清的上清液后，用平衡缓冲液洗涤柱，直到洗脱液A280降低到0.05以下，然后用在有50mM NaCl的pH值4.0的乙酸钠中的8M尿素缓冲液洗涤，直到洗脱液A280降低到0.05以下。将泵速降低到275mL/min，并将3cv的含有25mM乙酸钠、180mM NaCl、pH值4.0的8M尿素缓冲液施加到柱上，以洗脱AFAIKL2。合并A280>0.4和A280/A260比例>1.5的级分，并分析其纯度和蛋白含量。该步骤的百分产率通常为35％-45％。用SP平衡缓冲液将合并的物料稀释至≤2.5g/L，用pH值8.0的2M Tris-Cl将pH值调节至8.0，加入DTT至2.5mM，并将调节池混合60分钟以完全还原变性蛋白。然后将变性蛋白溶液在pH值8.5的含有25mM Tris-Cl的重折叠缓冲液中稀释至小于0.1mg/mL的最终蛋白浓度。重新折叠在2-8℃进行，并通过Ellman测定和C18反相HPLC进行跟踪，直到游离巯基的水平<0.75μM，并且仅检测到完全氧化的蛋白。
将重折叠的蛋白溶液加载到用pH值6.8的25mM咪唑预平衡的Q-Sepharose XL柱上，并用平衡缓冲液洗涤柱直到A280<0.05，然后用含有50mM NaCl的pH值6.8的25mM咪唑洗涤，直至A280<0.01。然后用含有150mM NaCl的pH值6.8的25mM咪唑洗脱蛋白，收集级分直到A280≤0.3。合并级分以产生不低于97％纯度和产率不低于45％的目标池。然后使用具有Hydrosart再生纤维素5000MWCO柱的UF/DF系统，将池浓缩至3-5g/L，随后与pH值7.0的10mM磷酸盐缓冲液进行缓冲液交换并冻干。
缀合化学
分两步进行缀合(图6)。在第一步中，通过与SIAB的NHS酯部分反应来活化AFAIKL2上的伯胺基团。在第二步中，通过SIAB的碘乙酰胺末端将活化的AFAIK2与尿素酶上的巯基偶联。如图6所示，L-DOS47缀合产物的合成是两步反应。步骤1是使用SIAB活化抗体，步骤2涉及活化的抗体与脲酶的缀合，以形成生物缀合物L-DOS47。
AFAIKL2抗体的活化。将冻干的AFAIKL2(25g)溶于注射用水(WFI)中。将SIAB(2.00g)溶于无水DMF中，并且以三等份加入到AFAIKL2溶液中，每次加入后搅拌60分钟。在最终加入SIAB 1小时后，通过加入超过原始添加量的SIAB的10×摩尔过量的甘氨酸，来终止任何剩余的未反应的NHS基团。为了除去水解的和甘氨酸猝灭的SIAB，使用SartoriousSartocon 5000Da MWCO将反应溶液浓缩至10mg/mL的AFAIKL2，随后缓冲液更换为pH值6.5的10mM乙酸钠、1mM EDTA的缓冲液。
活化的抗体与脲酶的缀合。将高纯度脲酶(50g)与活化的AFAIKL2在pH值6.5的10mM乙酸钠、1mM EDTA缓冲液中混合。然后通过加入pH值8.5的1M硼酸钠使pH值达到8.3，其允许活化的抗体上的碘乙酰基与脲酶上可用的半胱氨酸残基反应。使反应在搅拌下进行90分钟。然后通过加入超过原始添加量的SIAB的10×摩尔过量的半胱氨酸来终止未反应的碘乙酰基，并将该溶液混合60分钟。为了除去未缀合的AFAIKL2，使用100000Da MWCOSartorious Sartocon，将L-DOS47浓缩至6mg/mL的目标，然后缓冲液交换为pH值6.8的10mML-组氨酸、2.2mM EDTA的缓冲液。加入蔗糖至1％w/v的终浓度，并用pH值6.8的10mM L-组氨酸、2.2mM EDTA缓冲液将L-DOS47稀释至为1.8g/L的目标浓度。
用于纯度评估的尺寸排阻色谱法(SEC)。使用有Empower 2软件的具有996PAD的Waters 2695HPLC系统进行数据采集和处理。在210-400±4nm处记录色谱图，提取280nm的信号进行处理。在Superose6 100/300GL柱(GE)上进行分离。在10mM磷酸盐、50mM NaCl、0.2mM EDTA，pH值7.2的缓冲液中洗脱蛋白。在注射100μl纯样品后，以0.5mL/min的恒流进行分离。柱在室温下运行，而样品温度控制在5±2℃。
用于残留脲酶的离子交换色谱法(IEC)。使用具有996PAD和Empower软件的Waters2695HPLC系统。在210-400nm±4nm处采集色谱图，提取280nm处的信号进行处理。将柱(Mono-Q 5/50GL，GE)在室温下运行，同时将样品温度控制在5±2℃。洗脱缓冲液含有50mM乙酸盐、0.025％聚山梨酯80(超纯HX2，NOF Corporation，Tokyo)，有(缓冲液B)或无(缓冲液A)0.70M NaCl，pH值5.5。在注射样品之前，将柱用15％缓冲液B和85％缓冲液A以1mL/min流速(6CV)平衡6分钟。洗涤周期(15％缓冲液B，以1.0mL/min进行6分钟)后，用15-60％缓冲液B的梯度在20分钟内以0.5mL/min流速洗脱蛋白。用100％缓冲液B以1.0mL/min清洗6分钟后，在下一次样品注入之前，将该柱用15％缓冲液B重新平衡。将800μl纯的L-DOS47样品掺有HP脲酶参照标准品达到最终百分比为0-8％w/w，并且注入50μl/样品。使用标准加法作为校准方法，将峰高用于计算残留脲酶含量。
将Experion SDS微通道凝胶电泳用于测定缀合比。使用BioRad Experion自动电泳系统和BioRad SDS凝胶电泳试剂盒(Pro260试剂盒)，分析L-DOS47缀合比。将样品用Tris-HCl缓冲液(10mM，0.2mM EDTA，pH值7.0)稀释至0.5mg/ml的目标蛋白浓度，然后将4μl稀释的样品或分子量梯子与2μl样品缓冲液混合并短暂离心。将样品在70℃加热10分钟，然后在用凝胶染色溶液引发该系统和通道之后，将样品加载到微通道芯片上。Experion软件自动记录电泳图。
通过SDS-PAGE凝胶电泳来分离用于鉴定表征L-DOS47测试样品和AFAIKL2/HPU对照的蛋白质印迹，然后使用Invitrogen iBlot系统转移到硝酸纤维素膜上。由平行运行的凝胶制成重复的印迹。需要使用兔抗-AFAIKL2IgG一抗(Rockland)的检测和使用与碱性磷酸酶(AP)(Sigma)缀合的山羊抗兔IgG的二次检测一起确认AFAIKL2的身份。需要使用兔抗脲酶IgG一抗(Rockland)的检测和使用与AP(Sigma)缀合的山羊抗兔IgG的二次检测一起确认脲酶的身份。对于使用抗AFAIKL2IgG的检测，将L-DOS47样品在含有0.1mg/mL BSA的1×TBS中稀释至0.002mg/mL，然后与蛋白凝胶上样缓冲液1:1混合，加热至70℃持续10分钟，每泳道加载0.01μg的L-DOS47。对于使用抗-脲酶IgG的检测，将L-DOS47样品在含有0.1mg/mLBSA的1×TBS中稀释至0.02mg/mL，然后与蛋白凝胶上样缓冲液1:1混合，加热至70℃持续10分钟，每泳道加载0.1μg的L-DOS47。用含有NBT/BCIP的AP缓冲液进行蛋白质印迹的最终显影。
具有不同缀合比的L-DOS47的ELISA
为了研究缀合比对L-DOS47与其靶向抗原CEACAM6结合的亲和力的影响，通过调节缀合过程中的AFAIKL2/HPU摩尔比，在实验室规模下产生具有不同缀合比的L-DOS47缀合物。通过SDS-Experion测定所得缀合物的缀合比，并使用总蛋白试剂盒(Sigma，TP0200)通过Micro Lowry测定蛋白浓度。用100μL/孔的CEACAM6-A(CEACAM6全抗原的结构域A)(PBS中为2.5μg/ml)包被微量滴定板，并在室温下孵育6小时。将平板用缓冲液A(PBS中的0.05％BSA)洗涤两次，用150μL/孔的3％BSA/PBS于4℃封闭过夜，然后用缓冲液A洗涤两次。所有后续步骤在室温下进行，伴有轻轻摇动。加入L-DOS47(100μL/孔)并孵育2小时，将平板用缓冲液A洗涤3次，然后加入100μL/孔的抗-脲酶IgG(1：12000，Rockland)并孵育1小时。用缓冲液A洗涤三次后，加入100μL/孔的山羊抗-兔IgG-AP(1：6000，Sigma)并孵育1小时。用缓冲液A洗涤三次后，加入100μL/孔的AP底物溶液，并孵育25分钟。在405nm处测定吸光度。
确定AFAIKL2抗体上的活化位点
为了制备荧光素标记的半胱氨酸(Cys-FL)，将半胱氨酸过量与NHS-酯荧光素(Pierce)在1M硼酸盐(pH值8.0)中于室温下反应60分钟。通过RP-HPLC用C8柱分离反应溶液。通过MALDI质谱法鉴定Cys-FL峰级分，并根据其在493nm和pH值7下的消光系数通过光谱法确定其浓度。将峰级分等分试样冻干，并在-20℃的黑暗中储存。首先用SIAB交联剂在实验室规模活化AFAIKL2抗体，并通过内部制备的G25脱盐柱除去水解的SIAB。使活化的抗体与荧光素标记的半胱氨酸(Cys-FL)在pH值8.3的100mM硼酸缓冲液中于室温下反应90分钟。通过G25脱盐柱将反应溶液与30mM碳酸氢铵缓冲液交换，将得到的AFAIKL2-Cys-FL在含有20％乙腈的30mM碳酸氢铵中稀释至0.5-0.8mg/mL。加入胰蛋白酶(Promega)达到20:1的最终蛋白与胰蛋白酶的比例，并在37℃进行消化36小时。通过加入0.1M TCEP将胰蛋白酶消化物还原至2mM的终浓度，然后通过反相HPLC分离(具有Zobax 300SB-C18柱(5μm，4.6x150mm)的Agilent 1100系统，在55分钟内从0至45％的乙腈的梯度、0.025％TFA)，并在420nm处记录吸收。因为AFAIKL2上的SIAB活化的赖氨酸与荧光素标记的半胱氨酸连接，所以不可能被胰蛋白酶接近，并且应该产生肽(XnKXm)-Cys-FL。收集含有荧光素修饰肽的峰级分，并应用反射模式(Micromass Tof 2e)的MALDI-质谱。使用相应肽的HPLC峰面积来计算每个活化位点的分布百分比。
通过ESI质谱法进行缀合肽的肽作图和鉴定。使用Waters Xevo G2QTOF质谱仪和具有BEH300 C18柱(1.7μm，2.1x150mm)的Acquine UPLC系统H级。将每个L-DOS47样品(1.5-2.0mg/mL，50.0μl)与0.063±0.003g胍-HCl混合。该盐完全溶解后，加入1.50μL的0.7M DTT并将溶液在60℃下孵育30分钟。加入10.0μL的0.20M碘乙酰胺(IAA)，并用饱和的Tris-Base溶液将pH值调至8.0-8.5。将样品在37℃下孵育60分钟。将50.0μL每个烷基化样品与15.0μL的0.1M CaCl2和80.0μL的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，pH值8.0)混合，然后加入3.00μL的0.5mg/ml胰蛋白酶溶液。在37℃进行胰蛋白酶消化20-24小时。经胰蛋白酶消化后，将50.0μL消化物与0.50μL纯甲酸混合，以用于LC-MS分析。将柱温度设定为60℃，并将溶剂A(在水中的0.075％v/v甲酸)和溶剂B(在乙腈中的0.075％甲酸)用于UPLC分离。以0.15mL/min的流速，在80分钟内从0至55％溶剂B的梯度进行UPLC。
由Masslynx V4.1软件控制LC-MS分析。在50-2000Da的M/Z范围内以分辨率模式进行LC-MSE TIC(总离子计数)数据采集，扫描速率为0.3/s，毛细管电压为3.0kV，样品锥电压为25V，提取锥电压为4.0kV。随着碰撞能量从20V增加至40V，进行高能碰撞诱导的碎片TIC数据采集。离子源温度设定在100℃，去溶剂化温度设定在300℃。去溶剂气流量为600L/小时。用100fmole/μLGlu-Fib B以3.0μl/分钟的流速获得实时锁定质量TIC原始数据集(扫描/20s)。
在分辨率为20000的肽图模式下，用BioPharmalynx(v1.2)处理质谱原始数据。应用785.8426Da的锁定质量，进行实时点对点质量校准。低能MS离子强度阈值设定在3000个计数，而MSE高能离子强度阈值设定为300个计数。将MS数据集和MSE数据集的质量匹配公差设置为15ppm。将AFAIKL2氨基酸序列和脲酶氨基酸序列输入到肽匹配/鉴定的序列文库中。将可变修饰剂(包括脱酰胺N、脱酰胺琥珀酰亚胺N、氧化M、氧化2xM、+K、+Na和氨基甲酰甲基C(用于烷基化半胱氨酸)的固定修饰剂)用于肽图分析。为了鉴定AFAIKL2侧的缀合肽，将脲酶的含半胱氨酸肽加上交联剂SIAB(C9H7O2N，161.0477Da)的连接部分作为可变修饰剂产生，并被包含在可变修饰剂库中。在这种情况下，包括氨基甲酰甲基C作为可变修饰剂。为了鉴定脲酶侧的缀合肽，将AFAIKL2的赖氨酸中间肽XnKXm加上SIAB的连接部分作为可变修饰剂产生，并被包含在可变修饰剂库中。
L-DOS47的全细胞结合测定
通过在96孔培养板中接种100μL/孔的MCF-7细胞、BxPC-3细胞和A549细胞(4×104细胞/孔)并在37℃孵育过夜来制备细胞单层。然后从平板中去除培养基，并在室温(RT)下用100μL/孔的在PBS中的0.05％戊二醛将细胞单层固定10分钟。然后用PBS洗涤平板，并加入120μL/孔的50mM甘氨酸。在37℃下孵育20分钟后，将平板用120μL/孔的1％BSA/PBS在37℃封闭30分钟。然后将平板用缓冲液A(PBS中0.05％BSA)洗涤3次，加入80μL/孔的稀释的L-DOS47或DOS47，并在37℃下孵育1.5小时。将平板用缓冲液A洗涤4次，加入在pH值7.6、0.1MPBS中的80μL/孔的20mM尿素，并在37℃下孵育30分钟。孵育后，加入40μL/孔的1N HCl以停止反应。使用改进的靛酚测定法测定每个孔中产生的氨的量。简言之，通过将165mg苯酚和132mg NaOH溶解在10mL水中，然后加入66μL硝普钠溶液(10mg/mL)制备新鲜的溶液A。通过向5mL水中加入40μL次氯酸钠制备溶液B。将来自全细胞结合测定的样品溶液(每个30μL)，转移到含有50μL/孔的5N NaOH:H2O(3.3:46.7)和20μL/孔水的新的96孔板中。加入溶液A(50μL/孔)和溶液B(50μL/孔)，然后将平板转移到酶标仪上，在37℃显色30分钟。在630nm处测量OD值。使用0至150mM氯化铵作为标准品，从校准曲线计算在所述孔中产生的氨的量。
L-DOS47的细胞毒性测定。通过在96孔培养板中接种100μL/孔的MCF-7细胞、BxPC-3细胞和A549细胞(4×104个细胞/孔)并在37℃下孵育过夜来制备细胞单层。然后从平板中去除培养基，加入80μL/孔的稀释的L-DOS47或DOS47，并在37℃下进一步孵育2小时。孵育后，将平板用KR-II缓冲液/0.05％BSA洗涤3次，并加入100μl/孔的20mM尿素溶液。将平板在37℃下孵育过夜，然后去除培养基并用100μL/孔普通培养基替换。使用MTS细胞活力测定法测定细胞活力，其中制备21:1v/v的MTS/PES(MTS：2mg/mL；PES：1mg/mL)的溶液，并将20μL/孔的混合物加入平板中。然后将平板在37℃下孵育1小时，并在6300nm处测量OD值，参考490nm处的OD值。
洋刀豆脲酶是由六个相同的约91kDa的亚基组成的六聚酶，每个亚基具有15个游离的半胱氨酸残基。AFAIKL2抗体含有7个伯胺和一个二硫键。抗体上的伯胺和脲酶上的半胱氨酸残基是通过异双功能交联剂进行化学缀合的基础。然而，缀合物的分子大小和两种蛋白的性质在缀合产物的大规模制备、纯化和表征方面造成了挑战。用作肠胃外药物时，该免疫缀合物在生理pH附近的水性介质中必须是可溶的和稳定的；因此，重组抗体的等电点(pI)需要仔细的序列设计，因为脲酶是从植物来源提取的并且其pI(观察到的pI为4.8-5.1)不能被改变。优化以确保反应均匀性并去除残留反应物和副产物对缀合化学至关重要。虽然几种交联剂[24,30]被广泛用于蛋白缀合并且在开发过程中进行筛选，但是由于两个交联反应最适pH值的差异，选择N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(SIAB)用于L-DOS47缀合物制备。在制备过程中，在pH值7.0时用交联剂活化抗体，然后缓冲交换至pH值6.5并与脲酶混合。然后通过将反应介质的pH值升高至8.3，将抗体与脲酶连接。因为连接活化的AFAIKL2与脲酶的反应速率在pH值6.5时非常低，通过在pH值6.5下预混合来确保大反应容器中的材料均匀性。因此，残留游离脲酶的分布和脲酶-(Ab)x的亚种类仅由概率和物质摩尔比决定。在8-11抗体/脲酶的缀合比下，残留脲酶含量理论上可以忽略，并且可以使用超滤法纯化L-DOS47缀合物以除去未反应的抗体和水解的交联剂。L-DOS47缀合物、游离AFAIKL2和游离脲酶的大小排阻色谱图，如图7所示。
L-DOS47缀合物在～24.6分钟时洗脱，二聚体(可能通过二硫键连接或被以两个SIAB活化的AFAIKL2分子连接)在20.5分钟时作为小的未分离峰洗脱，并且聚合物在空白时间(～15分钟)作为痕量峰值洗脱。在～40分钟的痕量峰代表缓冲液成分。L-DOS47缀合峰宽度稍大于但是与游离尿素酶的峰宽相当，表现出均匀分布的缀合反应。游离抗体在37分钟时洗脱。抗体峰前面的小的未分离峰代表非共价二聚体。通常在制备批次中观察到高纯度的抗体(>95％)，其高分子量物质种类包括不超过5％的二聚体。HPU通常在～26.9分钟时洗脱主峰，在24分钟时洗脱小二聚体峰和在15分钟时洗脱痕量聚合物峰。将粗制脲酶纯化为HPU产生～97％的单体，而二聚体和聚合物的总和不超过3％。通常仅使用超滤进行简单纯化即可达到95％以上的L-DOS47纯度。因为SEC在天然条件下运行，它可以确定由于蛋白四级结构的降解和解离而导致的有效分子量的变化；因此，该方法也用作L-DOS47的稳定性指示试验。使用离子交换色谱法评估L-DOS47中残留游离脲酶的存在(图8)。
残留游离脲酶在15.33分钟时洗脱，这非常接近掺入的脲酶峰(15.42分钟)。HPU峰从大型L-DOS47峰(1.48的Rs)得到很好的分离。如图8的插图所示，测定残留脲酶含量的标准添加方法(掺有2.4％、4.8％和7.2％w/w HPU的L-DOS47)，显示出良好的线性(0.9995的R2)。该样品计算的残留脲酶含量为0.72％，并且残留脲酶在迄今为止的所有制备批次中都没有超过2％，证明在这些条件下残留脲酶实际上可以忽略不计，并且制备过程不需要额外的步骤以从非缀合的脲酶中分离L-DOS47缀合物。
在L-DOS47制备期间，六个单体脲酶亚单位中的每一个可以与0个、1个、2个、3个或4个AFAIKL2分子缀合；因此，在变性条件下，L-DOS47的SDS-Experion产生从～90-155kDa的多个离散峰/带的图案。另外，在抗体活化反应期间，可以用每个抗体分子(AFAIKL2-(SIAB)2)的两个SIAB随机活化一小部分抗体，这导致这些抗体分子中的每一个与脲酶的两个亚单位缀合。因此，单抗体双亚基会产生范围从200-260kDa较小的第二组未良好分离的峰/条带。
在图9中，图块2描绘了虚拟凝胶图像，图块1包含了泳道1和4的电泳图的叠加。泳道1-2和7-8中的L-DOS47实验室规模样品是用在第二缀合反应之前通过离子交换色谱法纯化的活化的AFAIKL2制备的。因为去除了AFAIKL2-(SIAB)2种类，所得到的缀合物缺少相互交联的亚基，并且仅观察到一组峰/带。在第3-6泳道的L-DOS47样品中，AFAIKL2在活化步骤后无需另外纯化而直接用于缀合，因此存在小的第二组峰/带。泳道9和10用HPU样品过载。
峰面积(图9，图块1)和带强度(图9，图块2)取决于与相应数量的抗体分子连接的脲酶亚基的相对丰度。峰面积在基线校正后通过软件积分，并且L-DOS47缀合比(CR)计算如下(参见图10，来自图9的凝胶的泳道2的示意图)：
CR＝6*(PK1*0+PK2*1+PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PK1+PK2+PK3+PK4+PK5)
其中PKi(i＝1-5)是与i-1抗体分子连接的脲酶亚单位的峰面积。
因为在大规模制备L-DOS47期间，活化的抗体不进行离子交换色谱纯化，所以在这些样品的电泳图中出现第二组未良好分离的峰。然而，因为活化位点分布由概率和抗体与SIAB的摩尔比确定，两组峰预期具有相似的强度模式。因为条带未良好分离并与260kDa分子量标记物重叠，因此第二组峰不用于计算缀合比。虽然AFAIKL2-(SIAB)2种类理论上可以通过连接到来自不同天然脲酶分子的两个亚基来产生二聚体缀合物或多聚体缀合物，但在L-DOS47样品尺寸排阻色谱图中观察到的组合的二聚体和多聚体峰面积的最小水平(小于3％)(图7)表明，大多数AFAIKL2-(SIAB)2种类有助于单个天然脲酶分子的亚基间连接以产生单体L-DOS47，而不是分子间连接以产生二聚体缀合物和多聚体缀合物。此外，SEC色谱图中这些二聚体峰和多聚体峰的存在可以在逻辑上归因于二硫键，因为类似的峰也出现在HP脲酶的尺寸排阻色谱图中。因此，电泳图中的第二组峰不用作质量控制的参数。
L-DOS47的缀合比对于其对CEACAM6(抗体所靶向的肿瘤抗原)的亲和力至关重要。通过调节AFAIKL2/HP脲酶摩尔比来产生具有不同缀合比(每个脲酶1.8至12个AFAIK)的L-DOS47，以评估缀合比对结合亲和力的影响。发现L-DOS47对固定化CEACAM6-A的结合亲和力，与缀合到脲酶的抗体数量直接成正比(图11)。缀合的抗体越多，观察到结合信号越高。然而，缀合比为6以上时效果较差。
通过双重蛋白质印迹分析L-DOS47(图12)，证实了通过SDS-Experion看到的条带图案。插图框显示了主要印迹的加框区域的放大，其中脲酶和缀合物(N1-N4分别对应于具有1至4个缀合的AFAIKL2的脲酶)被标记。当用抗脲酶抗体探测时，91kDa脲酶带是最强烈可见的，并且较高分子量带(对应于更高度缀合的种类)的强度降低。相比之下，当用抗AFAIKL2抗体探测时，91kDa条带几乎不可见，接下来的两个较高分子量条带是最强烈的(N1和N2)。这是由于它们是缀合物中的优势带的事实。通过抗-AFAIKL2和抗-脲酶抗体两者可以显现L-DOS47的能力，证明了缀合物中两个种类都存在，抗体的特异性通过以下事实证实：抗-AFAIKL2抗体不与脲酶结合，抗-脲酶抗体不与AFAIKL2结合。
因为L-DOS47是AFAIKL2和脲酶的化学缀合物，所以应该从缀合物的胰蛋白酶消化物中检测来自抗体和脲酶的胰蛋白酶肽以及两种蛋白的共价交联的肽。进行ESI LC-MSE肽作图以表征该缀合物。如相关内容所示，来自AFAIKL2的肽出现在L-DOS47谱中，但不在HP脲酶谱中。从L-DOS47的胰蛋白酶消化物中，AFAIKL2的氨基酸序列和脲酶氨基酸序列的肽覆盖率为100％，典型质量误差小于6ppm，并且通过具有小于±15ppm质量误差的其高能MS/MSb/y碎片离子确认每种肽。
为了鉴定AFAIKL2的活化位点并确定每个缀合位点的分布，使用SIAB活化AFAIKL2，然后缀合到荧光素标记的半胱氨酸(Cys-FL)上。在胰蛋白酶消化所得AFAIKL2-Cys-FL后，通过RP-HPLC色谱进行分离，收集峰级分用于MALDI-MS，以鉴定Cys-FL连接的抗体胰蛋白酶肽。因为只有SIAB活化的位点可以连接到Cys-荧光素，其中0.025％TFA中的最大吸收波长为420nm，所以在420nm处应该仅检测到活化的肽峰。例如，如果AFAIKL2的赖氨酸#32被SIAB活化，则应该连接到Cys-FL，并且在胰蛋白酶消化期间将会漏掉该胰蛋白酶消化位点；因此，应该观察到分子量为2768.113Da的峰，其代表Cys-FL连接的赖氨酸中间肽(LSCAAHDPIFDK32NLMGWG)-Cys-FL(SEQ ID NO：7)，表示为L2K32-Cys-FL。AFAIKL2-Cys-FL的胰蛋白酶消化物的RP-HPLC色谱图，如图13所示。
具有检测到的质量值的鉴定的缀合肽，也在图13中的相应HPLC峰处标记。根据抗体的氨基酸序列，来自六个赖氨酸残基的伯胺和N-末端胺在理论上可用用于活化反应。然而，实际上只有四个被活化了。这最有可能是由于抗体的三级结构暴露了表面上的那些四个伯胺，同时将其他伯胺埋在天然结构内部。根据其峰面积和图13中所有确定的HPLC峰面积的总和，计算每个活化位点的分布(表4)。
表4.AFAIKL2上每个活化位点的HPLC峰面积和分布百分比
如表4所示，对于交联剂，抗体的最活跃位点是L2K76，其次是L2M1，然后是L2K44。L2K32对于抗体结合是必不可少的，也是最不活跃的位点，但仍占总反应性的～18％。对于L-DOS47，交联剂活化的AFAIKL2与暴露于脲酶四级结构表面的半胱氨酸残基共价连接。因此，应该从L-DOS47的胰蛋白酶消化物的肽谱中检测共价交联的肽。
为了鉴定那些共价交联的肽，通过BiopharmaLynx处理来自L-DOS47样品的胰蛋白酶消化物的ESI LC-MSE原始数据，但用含有用于脲酶侧的所有15个半胱氨酸残基的一组用户创建的修饰剂的可变修饰剂库进行搜索。根据表4中的活化分布，这些用户创建的修饰剂是三种赖氨酸中间肽加上SIAB的连接部分(C9H5O2N，159.0320Da)(表示为L2K76、L2K44和L2K32)，以及N-末端甲硫氨酸加上连接(表示为L2M1)。结果(相关内容的细节)证明，在每个脲酶亚基的15个半胱氨酸残基中，仅6个是基本上缀合的。最容易获得的半胱氨酸是UC824，其次是UC663、UC59、UC207、UC329和UC268。脲酶活性必不可少的半胱氨酸残基Cys592是基本上不缀合的。四个交联剂活化的AFAIKL2位点对脲酶侧的六个半胱氨酸残基中每一个的相对可用性也是不同的。例如，UC329只能接近L2M1。这些基本的缀合位点也通过其MS/MS片段谱确认。作为实例，通过将缀合肽L2K32UC663作为用来自AFAIKL2侧的(LSCAAHDPIFDKNLMGWGR(SEQID NO：8))-连接-(2346.0674Da)作为修饰剂来修饰的脲酶肽(SEQ ID NO：9)CDSSDNDNFR进行搜索，以2.1ppm的质量匹配误差鉴定缀合肽L2K32UC663，其序列为(LSCAAHDPIFDKNLMGWGR(SEQ ID NO：8)-连接-(CDSSDNDNFR(SEQ ID NO：9)，并且具有3517.4873的肽质量。通过将肽作为用来自脲酶侧的连接-(CDSSDNDNFR(SEQ ID NO：9))(1330.4520Da)作为修饰剂来修饰的AFAIKL2肽LSCAAHDPIFDKNLMGWGR(SEQ ID NO：8)进行搜索，以2.1ppm的质量匹配误差还鉴定了同样的肽。通过将缀合肽作为用来自AFAIKL2侧的修饰剂来修饰的脲酶肽进行搜索，绘制了具有来自脲酶侧的9个b/y片段离子的该缀合肽的高能量碰撞诱导的MS/MS光谱。通过将肽作为具有用来自脲酶侧的修饰剂的AFAIKL2肽进行搜索，还绘制了从AFAIKL2侧具有14个b/y离子的同样的光谱。
在BxPC-3细胞系、A549细胞系和MCF7细胞系中，观察到不同的L-DOS47结合分布图(图14)。结果显示，L-DOS47与胰腺细胞系BxPC-3结合良好，表明在细胞表面表达了CEACAM6抗原。在肺细胞系A549中观察到中等结合，但在乳腺细胞系MCF7中没有发现结合。当与脲酶(DOS47)缀合时，AFAIKL2抗体提供了针对表达CEACAM6的细胞的特异性靶向。这是通过用非缀合的DOS47对照处理的三种细胞系中没有结合信号证实的。
BxPC-3细胞对L-DOS47细胞毒性非常敏感(图15)，如用小于1μg/mL的L-DOS47处理细胞时，观察到的细胞存活的快速下降所示。在A549细胞中观察到中度细胞毒性，而在MCF7中没有观察到作用，与结合研究的结果一致。此外，阴性对照DOS47对任何细胞系都没有细胞毒性作用。
在其大规模制备中成功应用了开发用于L-DOS47免疫缀合物的缀合和纯化的方法。使用已建立的缀合化学和反应条件，通过将交联剂活化的抗体与HP脲酶中间体预混合，然后调节pH值以活化缀合反应，实现了良好的均匀性。在每个脲酶分子8-11个抗体的缀合比下，残留的脲酶含量几乎可以忽略不计，并且可以仅使用超滤法纯化L-DOS47缀合物以除去未反应的抗体和水解的交联剂，并且避免了从最终免疫缀合物分离残留脲酶的挑战步骤。该方法产生高纯度的L-DOS47产物(>95％)，游离脲酶低于2％。通过ELISA评估L-DOS47对固定化CEACAM6-A的结合亲和力，与缀合脲酶的抗体数目直接成正比，并且当缀合比大于6时结合亲和力达到平衡。对所有大规模批量，缀合比具有每个脲酶分子9至11个抗体的范围，证明在这些条件下已经实现最佳缀合。双抗体蛋白质印迹分析证实了该缀合物的化学特性。ESI LC-MSE肽图谱分析获得了来自L-DOS47免疫缀合物的抗体和脲酶的100％序列回收率。通过相应肽的MS/MS b/y片段图谱证实了包括AFAIKL2和脲酶的C末端序列和N末端序列的具有多于3个氨基酸残基的肽序列。通过L-DOS47样品的ESI LC-MSE肽图谱分析，鉴定了有效缀合位点(AFAIKL2侧4个，脲酶侧6个)。通过来自抗体侧和脲酶侧的相关肽的MS/MSb/y片段图谱，证实了这些交联肽。
通过与抗体缀合的L-DOS47的对应物相对的DOS47不存在结合活性和细胞毒活性，阐明了L-DOS47对表达CEACAM6的两种细胞系BxPC-3和A549的特异性。在测试的三种细胞系中，BxPC-3显示出最强的结合信号，而A549仅显示中度结合。BxPC-3的结合信号约为A549的结合信号的5倍。该结果与细胞毒性测定中观察到的结果一致。L-DOS47诱导了对BxPC-3明显高于对A549的细胞杀伤作用。由于缺乏L-DOS47结合，在MCF-7中没有观察到细胞毒性应答。正在研究L-DOS47作为用于非小细胞肺癌人类I期临床研究中的潜在治疗剂。
应当理解，虽然已经结合上述方面描述了本公开，但是前述描述和实施例旨在说明而不是限制本公开的范围。在本公开的范围内的其他方面、优点和修改对于本公开所属领域的技术人员将是显而易见的。
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在本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。
参考文献
1.Stubbs M,McSheehy PMJ,Griffiths JR,et al.Causes and consequences oftumor acidity and implications for treatment.Mol Med Today 2000；6:15-9.
2.Raghunand N,Gillies RJ.pH and Chemotherapy.In:Goode JA,Chadwick DJ,eds.The tumor microenvironment:causes and consequences of hypoxia andacidity.Chichester:John Wiley&Sons Ltd.2001；199-211.
3.Schornack PA,Gillies RJ.Contributions of cell metabolism and H+diffusion to the acidic pH of tumors.Neoplasia 2003；5:135-45.
4.Helmlinger G,Sckell A,Dellian M,et al.Acid production inglycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.ClinCancer Res 2002；8:1284-91.
5.Izumi H,Torigoe T,Ishiguchi H,et al.Cellular pH regulators:potentially promising molecular targets for cancer chemotherapy 2003；29:541-9.
6.Robey IF,Baggett BK,Kirkpatrick ND,et al.Bicarbonate increasestumor pH and inhibits spontaneous metastases.Cancer Res 2009；69:2260-8.
7.Mahoney BP,Raghunand N,Baggett B,et al.Tumor acidity,ion trappingand chemotherapeutics I.Acid pH affects the distribution of chemotherapeuticagents in vitro.Biochem Pharmacol 2003；66:1207-18.
8.Wong WY,DeLuca CI,Tian B,et al.Urease-induced alkalinization ofextracellular pH and its antitumor activity in human breast and lungcancers.J Exp Ther Oncol 2005；5:93-9.
9.Teicher BA,Chari RVJ.Antibody conjugate therapeutics:Challenges andpotential.Clin Cancer Res 2011；17:6389-97.
10.Xu G,McLeod HL.Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy.ClinCancer Res 2001；7:3314-24.
11.Kuespert K1,Pils S,Hauck CR.CEACAMs:their role in physiology andpathophysiology.Curr Opin Cell Biol 2006；18:565-71.
12.Pavlopoulou A,Scorilas A.A comprehensive phylogenetic andstructural analysis of the carcinoembryonic antigen(CEA)gene family.GenomeBiol Evol 2014；6:1314–26.
13.Blumenthal RD,Hansen HJ,Goldenberg DM.Inhibition of adhesion,invasion,and metastasis by antibodies targeting CEACAM6(NCA-90)and CEACAM5(carcinoembryonic antigen).Cancer Res 2005；65:8809-17.
14.Baral TN,Murad Y,Nguyen TD,et al.Isolation of functional singledomain antibody by whole cell immunization:implications for cancertreatment.J Immunol Methods 2011；371:70-80.
15.Strickland LA,Ross J,Williams S,et al.Preclinical evaluation ofcarcinoembryonic cell adhesion molecule(CEACAM)6as potential therapy targetfor pancreatic adenocarcinoma.J Pathol 2009；218:380-390.
16.Duxbury MS,Matros E,Ito H,et al.Systemic siRNA-mediated genesilencing:A new approach to targeted therapy of cancer.Annals of Surgery2004；240:667-76.
17.Zhang J,Li Q,Nguyen TD,et al.A pentavalent single-domain antibodyapproach to tumor antigen discovery and the development of novel proteomicsreagents.J Mol Biol 2004；341:161-9.
18.Weatherburn MW.Phenol-hypochlorite reaction for determination ofammonia.Anal Chem 1967；39:971-4.
19.Ohwada A,Yoshioka Y,Iwabuchi K,et al.VEGF regulates theproliferation of acid-exposed alveolar lining epithelial cells.Thorax 2003；58:328-32.
20.Napier,M.P.et al.,(2000)Antibody-directed Enzyme Prodrug Therapy:Efficacy and Mechanism of Action in Colorectal Carcinoma1.Clinical CancerResearch 6,765-772.
21.Bagshawe,K.D.(1987)Antibody directed enzymes revive anti-cancerprodrugs concept.Br.J.Cancer 56,531–532.
22.Bagshawe K.D.(2006)Antibody-directed enzyme prodrug therapy(ADEPT)of cancer.Expert Rev Anticancer Ther 6,1421–1431.
23.Tietze,L.F.and Feuerstein,T.(2003)Enzyme and Proton-ActivatedProdrugs for a Selective Cancer Therapy.Curr.Pharm.Des.9,2155–2175.
24.Denny,W.A.(2004)Tumor-activated Prodrugs-A New Approach to CancerTherapy.Cancer Invest.22,604–619.
25.Pasquetto M.V.,Vecchia,L.,Covini,D.,Digilio,R.,and Scotti,C.,(2011)Targeted Drug Delivery Using Immunoconjugates:Principles andApplications Journal of Immunother 34,611–628.
26.Tietze,L.F.,and Krewer,B.(2009)Antibody-directed enzyme prodrugtherapy:a promising approach for a selective treatment of cancer based onprodrugs and monoclonal antibodies.Chem Biol Drug Des 74,205–211.
27.Afshar,S.,Asai.T.,and Morrison,S.L.(2009)Humanized ADEPT Comprisedof an Engineered Human Purine Nucleoside Phosphorylase and a Tumor TargetingPeptide for Treatment of Cancer.Mol Cancer Ther 2009,8 1-9.
28.Afshar,S.,Olafsen,T.,Wu A.M.,and Morrison,S.L.,(2009)Characterization of an engineered human purine nucleoside phosphorylase fusedto an anti-her2/neu single chain Fv for use in ADEPT.J Exp Clin Cancer Res28:147.
29.Alderson R.A.,Toki,B.e.,Roberge,M.,Geng,W.,Basler,J.,Chin,R.,Liu,A.,Ueda,R.,Hodges,D.,Escandon,E.,Chen,T.,Kanavarioti,T.,Babé,L.,Senter,P.D.,Fox,J.A.,Schellenberger,V.,(2006)Characterization of a CC49-Based Single-Chain Fragment--Lactamase Fusion Protein for Antibody-Directed EnzymeProdrug Therapy(ADEPT).Bioconjugate Chem,17,410-418.
30.http://www.piercenet.com/method/crosslinking-applications
31.Kim,J.H.,Kim,Y-W.,Kim,I-W.,Park,D.C.,Kim,Y.W.,Lee,K-H.,Jang,C.K.,Ahn,W.S.,(2013)Identification of candidate biomarkers using the ExperionTMautomated electrophoresis system in serum samples from ovarian cancerpatients.International Journal of Oncology 42940,1257-1262.
32.Chan,O.T.M.,and Herold,D.A.,(2009)Chip Electrophoresis as a Methodfor Quantifying Total Albumin in Cerebrospinal Fluid.Journal of theAssociation for Laboratory Automation 14,6-11.
33.Zhang,J.,Li,Q.,Nguyen,T.D.,Tremblay,T-L.,Stone,E.,To,R.,Kelly,J.,and MacKenzie,C.R.,(2004)A pentavalent single-domain antibody approach totumor antigen discovery and the development of novel proteomics reagents.JMol Biol 41 161-1699.
34.Wong,W.Y.,DeLuca,C.I.,Tian,B.,Wilson,I.,Molund,S.,Warriar,N.,Govindan,M.V.,Sega,l D.,and Chao,H.,(2005)Urease-induced alkalinization ofextracellular pH and its antitumor activity in human breast and lungcancers.J Exp Ther Oncol 5,93-9.
序列表
<110> 赫利克斯生物药品公司
<120> 用于治疗目的的抗体-脲酶缀合物
<130> 105013-1610
<140>
<141>
<150> 62/107,210
<151> 2015-01-23
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成多肽
<400> 1
Met Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala His Asp Pro Ile Phe Asp Lys
20 25 30
Asn Leu Met Gly Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Tyr
35 40 45
Val Ala Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Ser Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ser Ala Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Glu Glu Asp Asp Gly Lys
115 120
<210> 2
<211> 840
<212> PRT
<213> 洋刀豆(Canavalia ensiformis)
<400> 2
Met Lys Leu Ser Pro Arg Glu Val Glu Lys Leu Gly Leu His Asn Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Leu Ala Gln Lys Arg Leu Ala Arg Gly Val Arg Leu Asn Tyr
20 25 30
Thr Glu Ala Val Ala Leu Ile Ala Ser Gln Ile Met Glu Tyr Ala Arg
35 40 45
Asp Gly Glu Lys Thr Val Ala Gln Leu Met Cys Leu Gly Gln His Leu
50 55 60
Leu Gly Arg Arg Gln Val Leu Pro Ala Val Pro His Leu Leu Asn Ala
65 70 75 80
Val Gln Val Glu Ala Thr Phe Pro Asp Gly Thr Lys Leu Val Thr Val
85 90 95
His Asp Pro Ile Ser Arg Glu Asn Gly Glu Leu Gln Glu Ala Leu Phe
100 105 110
Gly Ser Leu Leu Pro Val Pro Ser Leu Asp Lys Phe Ala Glu Thr Lys
115 120 125
Glu Asp Asn Arg Ile Pro Gly Glu Ile Leu Cys Glu Asp Glu Cys Leu
130 135 140
Thr Leu Asn Ile Gly Arg Lys Ala Val Ile Leu Lys Val Thr Ser Lys
145 150 155 160
Gly Asp Arg Pro Ile Gln Val Gly Ser His Tyr His Phe Ile Glu Val
165 170 175
Asn Pro Tyr Leu Thr Phe Asp Arg Arg Lys Ala Tyr Gly Met Arg Leu
180 185 190
Asn Ile Ala Ala Gly Thr Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Asp Cys Lys
195 200 205
Ser Val Thr Leu Val Ser Ile Glu Gly Asn Lys Val Ile Arg Gly Gly
210 215 220
Asn Ala Ile Ala Asp Gly Pro Val Asn Glu Thr Asn Leu Glu Ala Ala
225 230 235 240
Met His Ala Val Arg Ser Lys Gly Phe Gly His Glu Glu Glu Lys Asp
245 250 255
Ala Ser Glu Gly Phe Thr Lys Glu Asp Pro Asn Cys Pro Phe Asn Thr
260 265 270
Phe Ile His Arg Lys Glu Tyr Ala Asn Lys Tyr Gly Pro Thr Thr Gly
275 280 285
Asp Lys Ile Arg Leu Gly Asp Thr Asn Leu Leu Ala Glu Ile Glu Lys
290 295 300
Asp Tyr Ala Leu Tyr Gly Asp Glu Cys Val Phe Gly Gly Gly Lys Val
305 310 315 320
Ile Arg Asp Gly Met Gly Gln Ser Cys Gly His Pro Pro Ala Ile Ser
325 330 335
Leu Asp Thr Val Ile Thr Asn Ala Val Ile Ile Asp Tyr Thr Gly Ile
340 345 350
Ile Lys Ala Asp Ile Gly Ile Lys Asp Gly Leu Ile Ala Ser Ile Gly
355 360 365
Lys Ala Gly Asn Pro Asp Ile Met Asn Gly Val Phe Ser Asn Met Ile
370 375 380
Ile Gly Ala Asn Thr Glu Val Ile Ala Gly Glu Gly Leu Ile Val Thr
385 390 395 400
Ala Gly Ala Ile Asp Cys His Val His Tyr Ile Cys Pro Gln Leu Val
405 410 415
Tyr Glu Ala Ile Ser Ser Gly Ile Thr Thr Leu Val Gly Gly Gly Thr
420 425 430
Gly Pro Ala Ala Gly Thr Arg Ala Thr Thr Cys Thr Pro Ser Pro Thr
435 440 445
Gln Met Arg Leu Met Leu Gln Ser Thr Asp Asp Leu Pro Leu Asn Phe
450 455 460
Gly Phe Thr Gly Lys Gly Ser Ser Ser Lys Pro Asp Glu Leu His Glu
465 470 475 480
Ile Ile Lys Ala Gly Ala Met Gly Leu Lys Leu His Glu Asp Trp Gly
485 490 495
Ser Thr Pro Ala Ala Ile Asp Asn Cys Leu Thr Ile Ala Glu His His
500 505 510
Asp Ile Gln Ile Asn Ile His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala Gly Phe
515 520 525
Val Glu His Ser Ile Ala Ala Phe Lys Gly Arg Thr Ile His Thr Tyr
530 535 540
His Ser Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp Ile Ile Lys Val
545 550 555 560
Cys Gly Ile Lys Asn Val Leu Pro Ser Ser Thr Asn Pro Thr Arg Pro
565 570 575
Leu Thr Ser Asn Thr Ile Asp Glu His Leu Asp Met Leu Met Val Cys
580 585 590
His His Leu Asp Arg Glu Ile Pro Glu Asp Leu Ala Phe Ala His Ser
595 600 605
Arg Ile Arg Lys Lys Thr Ile Ala Ala Glu Asp Val Leu Asn Asp Ile
610 615 620
Gly Ala Ile Ser Ile Ile Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val
625 630 635 640
Gly Glu Val Ile Ser Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Met Lys Ala
645 650 655
Gln Thr Gly Pro Leu Lys Cys Asp Ser Ser Asp Asn Asp Asn Phe Arg
660 665 670
Ile Arg Arg Tyr Ile Ala Lys Tyr Thr Ile Asn Pro Ala Ile Ala Asn
675 680 685
Gly Phe Ser Gln Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Leu Ala Asp
690 695 700
Leu Val Met Trp Lys Pro Ser Phe Phe Gly Thr Lys Pro Glu Met Val
705 710 715 720
Ile Lys Gly Gly Met Val Ala Trp Ala Asp Ile Gly Asp Pro Asn Ala
725 730 735
Ser Ile Pro Thr Pro Glu Pro Val Lys Met Arg Pro Met Tyr Gly Thr
740 745 750
Leu Gly Lys Ala Gly Gly Ala Leu Ser Ile Ala Phe Val Ser Lys Ala
755 760 765
Ala Leu Asp Gln Arg Val Asn Val Leu Tyr Gly Leu Asn Lys Arg Val
770 775 780
Glu Ala Val Ser Asn Val Arg Lys Leu Thr Lys Leu Asp Met Lys Leu
785 790 795 800
Asn Asp Ala Leu Pro Glu Ile Thr Val Asp Pro Glu Ser Tyr Thr Val
805 810 815
Lys Ala Asp Gly Lys Leu Leu Cys Val Ser Glu Ala Thr Thr Val Pro
820 825 830
Leu Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Phe
835 840
<210> 3
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成多肽
<400> 3
Ile Gln Asn Pro Ala Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn
1 5 10 15
Val Leu Tyr Gly Pro Asp Gly Pro Thr Ile Ser Pro Ser Lys Ala Asn
20 25 30
Tyr Arg Pro Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn
35 40 45
Pro Pro
50
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成多肽
<400> 4
Glu Ile Gln Asn Pro Ala Ser Ala Asn Arg Ser Asp
1 5 10
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成寡核苷酸
<400> 5
aaggcgaaag agtggatggc aacagtcta 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成寡核苷酸
<400> 6
aagaagcaac cggacagttc catgtatac 29
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成多肽
<400> 7
Leu Ser Cys Ala Ala His Asp Pro Ile Phe Asp Lys Asn Leu Met Gly
1 5 10 15
Trp Gly Cys
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成多肽
<400> 8
Leu Ser Cys Ala Ala His Asp Pro Ile Phe Asp Lys Asn Leu Met Gly
1 5 10 15
Trp Gly Arg
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成多肽
<400> 9
Cys Asp Ser Ser Asp Asn Asp Asn Phe Arg
1 5 10

Claims (51)

1.药物组合物，其包含适合于静脉内注射的药学上可接受的水溶液和基本上不含非缀合脲酶的抗体-脲酶缀合物。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述非缀合脲酶少于5％。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其不含非水性HPLC溶剂。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中pH值是约6.8。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缀合物具有每个脲酶部分3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述缀合物具有每个脲酶部分6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述缀合物具有每个脲酶部分8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缀合物具有每个脲酶部分约6个或更多个抗体部分的平均缀合比。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缀合物具有每个脲酶部分约8-11个抗体部分的平均缀合比。
10.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述脲酶是洋刀豆脲酶。
11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体是人源化抗体或非人抗体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体是单结构域抗体。
13.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体对由非小细胞肺癌表达的肿瘤抗原具有特异性。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体对CEACAM6具有特异性。
15.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体对CEACAM6具有高于约1×10-6M的Kd值的结合亲和力。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述缀合物对CEACAM6具有不大于约1×10- 8M的Kd值的结合亲和力。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述缀合物对CEACAM6具有不大于约1×10-10M的Kd值的结合亲和力。
18.如利要求1所述的组合物，其中所述缀合物对CEACAM6具有不大于约5nM的IC50值的结合亲和力。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述IC50值为约3.22nM。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述缀合物以约20μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。
21.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包含含有对SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少一个修改的多肽。
23.治疗对象中癌症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的权利要求1-22中任一项所述的组合物，从而治疗对象中的癌症。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌或其组合中的一种或多种。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述对象是人。
27.制备包含抗体-脲酶缀合物和基于抗体-脲酶缀合物的重量不超过约5％的脲酶的组合物的方法，该方法包括：(1)在溶剂中组合活化的抗体和脲酶，且在所述溶剂中活化的抗体和脲酶基本上不反应形成反应混合物，其中活化的抗体和脲酶在溶剂中的分布是均匀的，和(2)提高(1)的混合物的pH值使得活化的抗体容易与脲酶反应形成抗体-脲酶缀合物，和(3)任选地通过纯化步骤纯化抗体-脲酶缀合物，其中该方法不包括色谱纯化步骤。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述纯化步骤是超透析过滤。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述抗体-脲酶缀合物具有每个脲酶部分8-11个抗体部分的缀合比。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述步骤(1)中的溶剂是具有约6.0-7.0的pH值的酸性水性缓冲液，如乙酸钠缓冲液。
31.如权利要求27所述的方法，其中增加所述步骤(2)中的pH值包括加入碱性缓冲液，如硼酸钠溶液，以将pH值调节至约8-9。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中在所述纯化步骤之前，所述组合物包含占总蛋白重量约10％-20％的非缀合抗体。
33.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中在所述纯化步骤之后，所述组合物包含占总蛋白重量约少于1％的非缀合抗体。
34.增加对肿瘤抗原的抗体结合亲和力的方法，其包括将多个抗体分子缀合到脲酶分子以形成抗体-脲酶缀合物，其中所述缀合物对所述肿瘤抗原具有比非缀合抗体高至少约100倍的结合亲和力。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述缀合物具有每个脲酶部分3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述缀合物具有每个脲酶部分约6个或更多个抗体部分的缀合比。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述缀合物具有每个脲酶部分6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个抗体部分的缀合比。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述缀合物具有每个脲酶部分8个、9个、10个或11个抗体部分的缀合比。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述缀合物具有每个脲酶部分约8-11个抗体部分的平均缀合比。
40.如权利要求34所述的方法，其中所述脲酶是洋刀豆脲酶。
41.如权利要求34-40中任一项所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体或非人抗体。
42.如权利要求34-41中任一项所述的方法，其中所述抗体是单结构域抗体。
43.如权利要求34所述的方法，其中所述肿瘤抗原由非小细胞肺癌表达。
44.如权利要求34-43中任一项所述的方法，其中所述抗体对CEACAM6具有特异性。
45.如权利要求34-44中任一项所述的方法，其中所述抗体对CEACAM6具有高于约1×10-6M的Kd值的结合亲和力。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述缀合物以不大于约1×10-8M的Kd值与CEACAM6结合。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述缀合物以不大于约1×10-10M的Kd值与CEACAM6结合。
48.如权利要求34-47中任一项所述的方法，其中所述缀合物以不大于约5nM的IC50值与CEACAM6结合。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述IC50值为约3.22nM。
50.如权利要求34-47中任一项所述的方法，其中所述缀合物以约20μg/mL的IC50值与CEACAM6结合。
51.试剂盒，其包含权利要求1-22中任一项所述的组合物和使用所述组合物的说明书。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2017009537A (es) 2015-01-23 2018-04-10 Helix Biopharma Corp Conjugados ureasa-anticuerpo con fines terapeuticos.
CA3045327A1 (en) * 2016-09-24 2018-03-29 Helix Biopharma Corp. Restoring function of tumour acidified t cells
CN110382540A (zh) * 2017-01-05 2019-10-25 赫利克斯生物药品公司 Vegfr-2抗体
WO2018126315A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-12 Helix Biopharma Corporation Anti-vegfr-2 urease conjugates
JP6899560B2 (ja) * 2017-05-23 2021-07-07 株式会社島津製作所 質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラム
AU2019281358A1 (en) 2018-06-03 2021-01-07 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD47
US20230136228A1 (en) 2019-09-18 2023-05-04 Lamkap Bio Alpha AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2908475A1 (en) * 2013-04-08 2014-10-16 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
EP0007895B1 (fr) 1978-07-19 1983-06-22 Patrick Couvreur Nanoparticules biodégradables, compositions pharmaceutiques les contenant et procédé pour leur préparation
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2523445A1 (fr) 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
ZA912490B (en) * 1990-04-19 1992-12-30 Res Dev Foundation Antibody conjugates for treatment of neoplastic disease
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
WO1994018955A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
WO1995014093A1 (en) 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
CA2130072C (en) * 1994-08-12 2003-02-18 John W. Cherwonogrodzky Method of detecting a pathogen using a virus
WO1997015316A1 (en) * 1995-10-27 1997-05-01 Merck & Co., Inc. Conjugates of gonadotropin releasing hormone
EP0824019B1 (en) 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
AU4305101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Research Foundation Of The State University Of New York, The Magnetic nanoparticles for selective therapy
NZ538284A (en) * 2002-07-18 2008-04-30 Helix Biopharma Corp Use of urease and targeting molecule for inhibiting cancer cell growth
ES2642565T3 (es) * 2003-11-28 2017-11-16 National Research Council Of Canada Anticuerpos anticarcinoma y sus usos
ATE493152T1 (de) 2004-09-23 2011-01-15 Guerbet Sa Liposomale kontrastmittel für die cest-bildgebung
EP2322622A3 (en) 2005-03-25 2012-03-07 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
EP2254909A4 (en) 2007-12-21 2012-05-02 Ca Nat Research Council HUMAN NON-AGGREGATING DOMAINS
SI2408807T1 (sl) 2009-03-18 2021-11-30 Ac Immune Sa Postopek za terapevtsko uporabo
CA2817096A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Octapharma Ag A process for reduction and/or removal of fxi and fxia from solutions containing said coagulation factors
ES2746559T3 (es) 2011-01-28 2020-03-06 Nat Res Council Canada Modificación genética de dominios de inmunoglobulina
JP6430373B2 (ja) * 2012-06-12 2018-11-28 プロミス、ニューロサイエンシズ、インコーポレイテッドＰｒｏｍｉｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ミスフォールドプリオンタンパク質を標的とする抗体および複合体
MX2017009537A (es) 2015-01-23 2018-04-10 Helix Biopharma Corp Conjugados ureasa-anticuerpo con fines terapeuticos.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2908475A1 (en) * 2013-04-08 2014-10-16 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NA: "Supplement 2, Proceedings of the 14th World Conference on Lung Cancer, Book 2", 《JOURNAL OF THORACIC ONCOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3261678B8 (en) 2021-03-17
JP2020143084A (ja) 2020-09-10
EP3261678A1 (en) 2018-01-03
ES2852001T3 (es) 2021-09-10
US11931422B2 (en) 2024-03-19
RU2017129729A (ru) 2019-02-25
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