PL238187B1 - Koniugaty przeciwciało-ureaza dla celów terapeutycznych - Google Patents

Koniugaty przeciwciało-ureaza dla celów terapeutycznych Download PDF

Info

Publication number
PL238187B1
PL238187B1 PL423259A PL42325916A PL238187B1 PL 238187 B1 PL238187 B1 PL 238187B1 PL 423259 A PL423259 A PL 423259A PL 42325916 A PL42325916 A PL 42325916A PL 238187 B1 PL238187 B1 PL 238187B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
urease
antibody
conjugate
dos47
ceacam6
Prior art date
Application number
PL423259A
Other languages
English (en)
Other versions
PL423259A1 (pl
Inventor
Heman Chao
Wah Yau Wong
Baomin Tian
Kimberly Jayne GASPAR
Kimberly Jayne Gaspar
Praveen Kumar
Original Assignee
Helix Biopharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helix Biopharma Corp filed Critical Helix Biopharma Corp
Publication of PL423259A1 publication Critical patent/PL423259A1/pl
Publication of PL238187B1 publication Critical patent/PL238187B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Ujawnienie to zapewnia koniugaty przeciwciało-ureaza mające zastosowanie terapeutyczne. Bardziej szczegółowo ujawnienie dotyczy terapeutycznych koniugatów obejmujących jedno lub większą liczbę przeciwciał sprzężonych z ureazą, ich kompozycji, zastosowań i otrzymywania.
STAN TECHNIKI
Ureaza jest enzymem, który katalizuje hydrolizę mocznika do dwutlenku węgla i amoniaku. Bardziej szczegółowo ureaza katalizuje hydrolizę mocznika, z wytworzeniem amoniaku i karbaminianu, przy czym wytworzony karbaminian następnie degraduje w spontanicznej hydrolizie, w wyniku czego wytwarza się kolejny amoniak i kwas węglowy. Pod tym względem aktywność ureazy ma tendencję do zwiększania pH lokalnego środowiska, w którym wytwarza się amoniak, który jest zasadową cząsteczką mającą ogólną toksyczność.
Koncepcję stosowania przeciwciał do celowania w antygeny związane z guzem w leczeniu nowotworu doceniono już jakiś czas temu (Herlyn et. al., (1980) Cancer Research 40, 717). Jednak w przypadku ureazy toksycznym komponentem jest alkaliczne środowisko wytworzone przez enzymatyczną degradację mocznika i wykorzystywano fragmenty przeciwciał o wysokim powinowactwie.
ISTOTA WYNALAZKU
Niniejsze ujawnienie dotyczy koniugatu przeciwciało-ureaza . Niniejsza technologia opisuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny wodny roztwór odpowiedni dla dożylnej iniekcji i koniugat przeciwciało-ureaza , zasadniczo wolną od ureazy, wolną od niesprzężonego przeciwciała i/lub wolną od niewodnych rozpuszczalników HPLC.
Wynalazek dotyczy więc kompozycji farmaceutycznej zawierającej farmaceutycznie dopuszczalny wodny roztwór odpowiedni do dożylnej iniekcji i koniugat jednodomenowe przeciwciało-ureaza , przy czym koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań jednodomenowego przeciwciała na ugrupowanie ureazy, przy czym jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem antygenu CEACAM6, i przy czym kompozycja jest zasadniczo wolna od niesprzężonej ureazy.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której niesprzężona ureaza wynosi mniej niż 5% w/w.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, która jest wolna od niewodnych rozpuszczalników HPLC.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, której pH wynosi około 6,8.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań jednodomenowych przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący 6 lub więcej ugrupowań jednodomenowych przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący 8-11 ugrupowań jednodomenowych przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której jednodomenowym przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem antygenu CEACAM6 wyrażanego przez niedrobnokomórkowego raka płuc.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której jednodomenowe przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M, przy czym korzystnej koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-8 M, przy czym korzystniej koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-10 M.
PL 238 187 B1
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości IC50 nie większej niż około 5 nM, korzystniej wartość IC50 wynosi około 3,22 nM
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50 wynoszącą około 20 ug/ml.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której jednodomenowe przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 1.
Korzystna jest kompozycja farmaceutyczna, w której jednodomenowe przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający co najmniej jedną modyfikację w sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO. 1, przy czym wspomniana modyfikacja zachowuje właściwość funkcjonalną polipeptydu. Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej według wynalazku, do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu wyrażającego antygen CEACAM6 u osobnika.
Korzystnie kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu wyrażającego antygen CEACAM6 u osobnika, jest stosowana do leczenia w którym nowotworem jest jeden lub większa liczba spośród niedrobnokomórkowego raka płuc, nowotworu sutka, trzustki, jajnika, płuc, okrężnicy lub ich kombinacja, przy czym korzystniej stosowana jest do leczenia nowotworu, którym jest niedrobnokomórkowy rak płuc.
Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu wyrażającego antygen CEACAM6 przy czym osobnikiem jest człowiek.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza i nie więcej niż około 5% w/w ureazy względem masy koniugatu przeciwciało-ureaza , przy czym sposób obejmuje:
(1) łączenie aktywowanego przeciwciała i ureazy w rozpuszczalniku zawierającym kwasowy wodny bufor, w którym aktywowane przeciwciało i ureaza zasadniczo nie reagują, w wyniku czego tworzy się mieszanina reakcyjna, przy czym dystrybucja aktywowanego przeciwciała i ureazy w rozpuszczalniku jest równomierna, i (2) zwiększanie pH mieszaniny z (1) buforem zasadowym, tak że aktywowane przeciwciało łatwo reaguje z ureazą, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , o stosunku koniugacji 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań jednodomenowego przeciwciała na ugrupowanie ureazy, i (3) oczyszczanie koniugatu przeciwciało-ureaza w etapie oczyszczania, przy czym sposób nie obejmuje etapu oczyszczania chromatograficznego.
W sposobie wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza korzystnym etapem oczyszczania jest ultradiafiltracja.
W korzystnym sposobie wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 8-11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
W korzystnym sposobie wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza kwasowy wodny bufor ma pH około 6,0-7,0, taki jak bufor octanu sodu.
W korzystnym sposobie wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza zasadowym buforem jest roztwór boranu sodu, dla doprowadzenia pH do około 8-9.
W korzystnym sposobie wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza kompozycja zawiera około 10-20% niesprzężonego jednodomenowego przeciwciała względem masy całkowitego białka przed etapem oczyszczania, korzystniej kompozycja zawiera mniej niż około 1% niesprzężonego jednodomenowego przeciwciała względem masy całkowitego białka po etapie oczyszczania.
Wynalazek dotyczy również sposobu zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, który obejmuje:
sprzęganie wielu cząsteczek jednodomenowego przeciwciała do cząsteczki ureazy, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , mający stosunek koniugacji 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, lub 12 cząsteczek jednodomenowego przeciwciała na cząsteczkę ureazy, przy czym jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6, przy czym koniugat przeciwciało-ureaza ma powinowactwo wiązania do wspomnianego CEACAM6 co najmniej około 100-krotnie wyższe niż niesprzężone przeciwciało.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 3, 4, 5, 6, cząsteczek jednodomenowych przeciwciał na cząsteczkę ureazy.
PL 238 187 B1
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący około 6 lub więcej cząsteczek jednodomenowego przeciwciała na cząsteczkę ureazy, korzystniej koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 8, 9, 10 lub 11 cząsteczek jednodomenowych przeciwciał na cząsteczkę ureazy, korzystniej koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 8-11 cząsteczek jednodomenowych przeciwciał na cząsteczkę ureazy.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, antygen guza jest wyrażany przez niedrobnokomórkowego raka płuc.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, jednodomenowe przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M, korzystniej koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością Kd nie większą niż około 1 x 10-8 M, jeszcze korzystniej koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością Kd nie większą niż około 1 x 10-10 M.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością IC50 nie większą niż około 5 nM, przy czym korzystniej wartość IC50 wynosi około 3,22 nM.
W korzystnym sposobie zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza, koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością IC50 wynoszącą około 20 μg/ml.
Wynalazek dotyczy również zestawu zawierającego kompozycję farmaceutyczną według wynalazku i instrukcje stosowania kompozycji w terapii leczenia nowotworu u osobnika. W niektórych opisanych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący około 6 lub więcej ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 6 lub więcej ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 8-11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej (ang. Jack bean).
W niektórych aspektach przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie. W niektórych aspektach masa cząsteczkowa przeciwciała wynosi od około 5 kDa do około 200 kDa. W niektórych aspektach masa cząsteczkowa przeciwciała wynosi od około 5 kDa do około 50 kDa. W niektórych aspektach przeciwciałem jest przeciwciało jednodomenowe. W niektórych aspektach przeciwciało jednodomenowe ma wielkość nie większą niż 110 reszt aminokwasowych lub od około 90 do 130 reszt aminokwasowych. W niektórych aspektach masa cząsteczkowa jednodomenowego przeciwciała wynosi od około 10 kDa do około 50 kDa. W niektórych aspektach masa cząsteczkowa przeciwciała jednodomenowego wynosi od około 12 kDa do około 15 kDa. W niektórych aspektach przeciwciało ma swoistość względem antygenu komórki guza. W niektórych aspektach przeciwciało ma swoistość względem antygenu guza wyrażanego przez niedrobnokomórkowego raka płuc. W niektórych aspektach przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6.
W niektórych aspektach przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M. W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-8 M. W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-10 M. W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości IC50 nie większej niż około 5 nM. W niektórych aspektach wartość IC50 wynosi od około 3 nM do około 5 nM. W niektórych aspektach wartość IC50 wynosi około 3,22 nM. W niektórych aspektach koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50od około 10 μg/ml do około 30 μg/ml. W niektórych aspektach koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50 około 20 μg/ml
PL 238 187 B1
W niektórych aspektach przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 1. W niektórych aspektach przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający co najmniej jedną modyfikację w sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO. 1.
Niniejsza technologia opisuje sposób leczenia nowotworu u osobnika, który tego wymaga, obejmujący podawanie osobnikowi terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji tu zapewnionej, w wyniku czego leczy się nowotwór u osobnika.
W niektórych aspektach nowotworem jest jeden lub większa liczba spośród niedrobnokomórkowego raka płuc, nowotworu sutka, trzustki, jajnika, płuca, okrężnicy lub ich kombinacja. W niektórych aspektach nowotworem jest niedrobnokomórkowy rak płuc. W niektórych aspektach osobnikiem jest człowiek.
Niniejsza technologia opisuje sposób otrzymywania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza zasadniczo wolnej od ureazy, przy czym sposób obejmuje łączenie aktywowanego przeciwciała i ureazy w wodnym buforze mającym pH około 6,0-7,0, tak jak około 6,5, doprowadzanie pH do 8,0-9,0, tak jak około 8,3, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , i oczyszczanie koniugatu przeciwciało-ureaza , przy czym sposób nie obejmuje etapu chromatograficznego oczyszczania, tak jak powszechnie stosowanymi sposobami chromatograficznymi w oczyszczaniu białka, wliczając chromatografię wykluczenia sterycznego (SEC), chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metali, chromatografię immunopowinowactwa, chromatografię adsorpcyjną ciecz-ciało stałe, chromatografię oddziaływań hydrofobowych (HIC), chromatografię w odwróconym układzie faz (RPC) i wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) itd. W niektórych aspektach koniugat przeciwciało-ureaza oczyszcza się z pomocą ultradiafiltracji.
W niektórych aspektach koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 8-11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach buforem mającym pH około 6,5 jest bufor octanu sodu. W niektórych aspektach pH doprowadza się do około 8,3 sposobem obejmującym dodawanie roztworu boranu sodu.
Niniejsza technologia opisuje sposób zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza obejmujący sprzęganie wielu cząsteczek przeciwciała do cząsteczki ureazy, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , przy czym koniugat ma powinowactwo wiązania do antygenu guza co najmniej około 100-krotnie wyższe niż niesprzężone przeciwciało.
W niektórych aspektach przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie. W niektórych aspektach przeciwciałem jest przeciwciało jednodomenowe. W niektórych aspektach antygen guza jest wyrażany przez niedrobnokomórkowego raka płuc. W niektórych aspektach przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6.
Niniejsza technologia ponadto opisuje zestaw zawierający zapewnioną tu kompozycję i instrukcję stosowania kompozycji.
Te i inne aspekty ujawnienia są dodatkowo opisane poniżej.
KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU
Fig. 1A-B przedstawia przykładowe badania wiązania i cytotoksyczności L-DOS47 w liniach komórek nowotworowych. (A) Bezpośrednie wiązanie L-DOS47 do pięciu linii komórek nowotworowych: BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T i MDA-MB231. Sygnał wiązania był reprezentowany przez ilość amoniaku wytworzonego po inkubacji z 20 mM mocznikiem. Dobre wiązanie L-DOS47 zaobserwowano w komórkach BxPC-3 (·), Capan-1 (▼) i ZR-75-30 (♦), podczas gdy umiarkowane wiązanie zaobserwowano w komórkach LS174T (▲) i nie stwierdzono wiązania w komórkach MDA-MB231 () . Dodatkowo nie zaobserwowano wiązania z niesprzężoną kontrolą DOS47 w odpowiadających liniach komórkowych (dane nieprzedstawione), co sugeruje, że wiązanie L-DOS47 było swoiste i było zapewniane przez ugrupowanie przeciwciała. (B) Cytotoksyczność indukowana L-DOS47 w liniach komórek nowotworowych po dodaniu 20 mM mocznika. Nie zaobserwowano żadnych efektów w komórkach MDA-MB231 (), co było zgodne z badaniem wiązania. BxPC-3 (·) i ZR-75-30 (♦) były wysoce podatne na L-DOS47, podczas gdy tylko umiarkowane efekty stwierdzono w komórkach Capan-1 (▼) i LS174T (▲).
Fig. 2A-B przedstawia przykładowe bezpośrednie i kompetycyjne wiązanie przeciwciała L-DOS47, DOS47 i AFAIKL2 do komórek BxPC-3. (A) Wiązanie tagowanego rutenem L-DOS47, przeciwciała AFAIKL2 i niesprzężoną DOS47 do komórek BxPC-3. Test elektrochemiluminescencji zapewnia bezpośredni pomiar wiązania przeciwciała L-DOS47 i AFAIKL2 do komórek BxPC-3. Słaby sygnał
PL 238 187 B1 wiązania zaobserwowano z przeciwciałem AFAIKL2 (▲), podczas gdy L-DOS47 wykazywało znacznie silniejszy sygnał wiązania (·) ze względu na awidność wielu przeciwciał AFAIKL2 prezentowanych w koniugacie przeciwciała. Nie zaobserwowano żadnego wiązania z kontrolą negatywną DOS47 (◊). (B) Wiązanie L-DOS47-tag do komórek BxPC-3 konkurowało z L-DOS47, przeciwciałem AFAIKL2 lub DOS47. Pozorne powinowactwa wiązania przeciwciała L-DOS47 i AFATKL2 można porównać z pomocą IC50 (ilości kompetytora wymaganej do wywołania 50% spadku w wiązaniu) przedmiotów badania. IC50 przeciwciała L-DOS47 (·) i AFAIKL2 (▲) oszacowano odpowiednio na 2 i 20 μg/ml (lub 3,22 nM i 1,55 μM), wskazując, że powinowactwo wiązania L-DOS47 wynosi około 500-krotności tego dla przeciwciała AFAIKL2. Nie zaobserwowano żadnego hamowania z kontrolą negatywną DOS47 (◊). Wyniki reprezentują średnią (n=3) reprezentatywnych doświadczeń.
Fig. 3A-C przedstawia przykładową nadekspresję i wyciszenie genu CEACAM6. (A) Wiązanie L-DOS47 do komórek H23 transfekowanych CEACAM6. Populację linii komórek transfekowanych (▲) wzbogacono poprzez sortowanie komórek FACS razem ze zwiększoną ilością selekcyjnego antybiotyku. Profil wiązania w porównaniu z tym dla natywnych komórek H23 (O) i komórek A549 (Δ) pokazał, że CEACAM6 było wyrażane w transfekowanych komórkach na poziomie niższym niż w komórkach A549. (A) Test cytotoksyczności L-DOS47 w komórkach H23 transfekowanych CEACAM6. Nadekspresja CEACAM6 w komórkach H23 (▲) znacznie zwiększyła ich podatność na cytotoksyczność L-DOS47 w porównaniu z komórkami BxPC-3 (·), A549 (Δ) i natywnymi H23 (O). Co ciekawe, transfekowane komórki H23 były bardziej podatne na cytotoksyczność L-DOS47 niż zarówno komórki A549, jak i BxPC-3, mimo tego że w (A) obserwowano słabsze wiązanie L-DOS47. (C) Wiązanie L-DOS47 do komórek BxPC-3 z wyciszonym genem CEACAM6. Dobry sygnał wiązania obserwowano w natywnych (•) i kontrolnych (HUSH-TR3A) komórkach BxPC-3. Jednak wiązanie L-DOS47 utracono, gdy gen CEACAM6 wyciszono z pomocą shRNA (HUSH#6^ i HUSH#7A), co sugeruje, że CEACAM6 jest powierzchniowym antygenem rozpoznawanym przez koniugat przeciwciała. Wyniki reprezentują średnią (n=3) reprezentatywnych doświadczeń. Odchylenie standardowe (SD) wynosiło poniżej 10% dla wszystkich wartości.
Fig. 4 przedstawia immunohistochemiczne barwienie ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy i płuc z L-DOS47. Dodatnie wybarwienie przedstawiono jako ciemny kolor.
Fig. 5 przedstawia sekwencję aminokwasową przeciwciała AFAIKL2 (SEQ ID NO: 1).
Fig. 6 przykładowo pokazuje syntezę produktu koniugatu L-DOS47 na drodze dwuetapowej reakcji. Etap 1 stanowi aktywację przeciwciała z zastosowaniem SIAB, a Etap 2 obejmuje koniugację aktywowanego przeciwciała z enzymem ureazą, w wyniku czego tworzy się biokoniugat L-DOS47.
Fig. 7 przedstawia przykładowe chromatogramy wykluczenia sterycznego formulacji ślepej, AFAIKL2, wysokiej czystości ureazy (HPU) i koniugatu L-DOS47. Bardzo mały pik dla dimeru dla każdej składowej pojawia się przed odpowiadającymi pikami monomerów. Formulacja ślepa zawiera 10 mM histydynę, 1% sacharozę, 0,2 mM EDTA, pH 6,8.
Fig. 8 przedstawia przykładowe chromatogramy jonowymienne formulacji ślepej (A), L-DOS47 (B) i L-DOS47 domieszkowanego 2,4% (C), 4,8% (D) i 7,2% (E) ureazą HP (HPU). Formulacja ślepa zawiera 10 mM histydynę, 1% (m/v) sacharozę, 0,2 mM EDTA, pH 6,8.
Fig. 9 przedstawia przykładowy obraz okna SDS Experion. Panel 1: nałożenie elektroforegramów ścieżek 2 i 4. Panel 2: Ścieżka L, drabina masy cząsteczkowej (MW); Ścieżki 1, 2, 7 i 8: L-DOS47 wytworzony z aktywowanym AFAIKL2, które wcześniej poddano dodatkowemu oczyszczaniu IEC; Ścieżki 3-6: L-DOS47 wytworzony z AFAIKL2, którego wcześniej nie poddano dodatkowej IEC; Ścieżka 9 i 10, HPU. W panelu 1 liczby 2-14 w Panelu 1 na osi x są liczbami pików z elektroforegramu Ścieżka 1; 3* reprezentuje pik markerowy o najniższej masie cząsteczkowej, a 14* pik markerowy o najwyższej MW dla wzorca wewnętrznego MW.
Fig. 10 przedstawia przykładowy elektroforegram L-DOS47 (ścieżka 2 z Figury 9) przedstawiający odrębne piki dla podjednostek ureazy połączonych z 0-4 cząsteczkami przeciwciał. Liczby 1-11 na osi x są liczbami pików; 3* reprezentuje pik markera o najniższej masie cząsteczkowej, a 11* pik markera o najwyższej MW dla wzorca wewnętrznego MW.
Fig. 11 przedstawia przykładowy efekt stosunku koniugacji do aktywności wiązania L-DOS47. L-DOS47 otrzymano z różnymi stosunkami koniugacji przeciwciała (od 1,8 do 12). Oznaczano bezpośrednie wiązanie próbek L-DOS47 do unieruchomionych cząsteczek CEACAM6-A.
Fig. 12 pokazuje przykładowy Western blot AFAIKL2, ureazy i L-DOS47. Lewy panel: Elektroforeza w żelu L-DOS47, ureazy i AFAIKL2 (barwienie błękitem Coomassie). Środkowy panel: Western
PL 238 187 B1 blot AFAIKL2, ureazy i L-DOS47 (standardowe załadowanie i 5x przeładowanie) sondowane przeciwciałem anty-AFAIKL2. Prawy panel: Western blot AFAIKL2, ureazy i L-DOS47 (standardowe załadowanie i 5x przeładowanie) sondowane przeciwciałem anty-ureaza. Wstawka: powiększenie L-DOS47.
Fig. 13 przedstawia przykładowy chromatogram RP-HPLC przy 420 nm AFAIKL2-Cys-FL po trawieniu trypsyną. Zidentyfikowane sprzężone peptydy i ich masy peptydowe wskazano w odpowiadających pikach HPLC.
Fig. 14 przedstawia przykładowe bezpośrednie wiązanie L-DOS47 do linii komórek nowotworowych BxPC-3, A549 i MCF7. Sygnał wiązania był reprezentowany przez ilość amoniaku wytworzonego po inkubacji z 20 mM mocznikiem. Podniesione wiązanie L-DOS47 obserwowano w BxPC-3 (·), podczas gdy umiarkowane obserwowano w komórkach A549 (▲) i nie stwierdzono żadnego wiązania w komórkach MCF7 (▼). Dodatkowo nie stwierdzono żadnego wiązania z niesprzężoną kontrolą DOS47 w odpowiadających liniach komórkowych (O,Δ,V,), co sugeruje, że wiązanie L-DOS47 było swoiste względem komórek BxPC-3 i A549.
Fig. 15 przedstawia przykład cytotoksyczności indukowanej L-DOS47 w komórkach BxPC-3 i A549 po dodaniu 20 mM mocznika. Nie zaobserwowano żadnych efektów w komórkach MCF7 (▼). BxPC-3 (·) były wysoce podatne na L-DOS47, podczas gdy tylko umiarkowane efekty zaobserwowano w komórkach A549 (▲). Dodatkowo nie zaobserwowano żadnego wiązania z niesprzężoną kontrolą DOS47 w odpowiadających liniach komórkowych (O,Δ,V,). Wyniki na wykresach reprezentują średnią (n=3) reprezentatywnych doświadczeń. Odchylenie standardowe (SD) wynosiło poniżej 10% dla wszystkich wartości.
OPIS SZCZEGÓŁOWY
Należy zrozumieć, że niniejsze ujawnienie nie ogranicza się do określonych aspektów lub opisanych przykładów wykonania, ponieważ mogą one oczywiście być różne. Należy również zrozumieć, że stosowana tu terminologia ma na celu opisanie wyłącznie określonych aspektów lub przykładów wykonania i w zamierzeniu nie jest ograniczająca, ponieważ zakres niniejszego ujawnienia będzie ograniczony wyłącznie przez załączone zastrzeżenia.
Szczegółowy opis niniejszego ujawnienia jest podzielony na różne rozdziały wyłącznie dla wygody czytelnika i ujawnienie stwierdzone w dowolnym rozdziale można łączyć z tym w innym rozdziale. O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie stosowane tu terminy techniczne i naukowe mają to samo znaczenie, co w powszechnym rozumieniu przez znawcę dziedziny, do której niniejsze ujawnienie należy.
Definicje
Należy zaznaczyć, że liczba pojedyncza, jak stosuje się tu i w załączonych zastrzeżeniach, obejmuje liczbę mnogą, o ile z kontekstu wyraźnie nie wynika inaczej. Zatem, na przykład, odniesienie do związku obejmuje wiele związków.
Jak się tu stosuje, termin „około”, gdy stosowany przed oznaczeniem liczbowym, np. temperaturą, czasem, ilością, stężeniem i tym podobnych, wliczając zakres, wskazuje przybliżenia, które mogą różnić się o (+) lub (-) 10%, 5% lub 1% podanej wartości.
Jak się tu stosuje, termin „podawanie” można osiągać w jednej dawce, w sposób ciągły lub przerywany lub poprzez kilka mniejszych dawek, które wspólnie zapewniają pojedynczą dawkę. Dawkowanie można przeprowadzać w czasie przebiegu leczenia. Sposoby oznaczania najskuteczniejszych środków i dawkowania podawania są znane znawcom dziedziny i będą się różnić zależnie od kompozycji stosowanej w terapii, celu terapii, leczonej docelowej komórki i leczonego osobnika. Pojedyncze lub wielokrotne podawanie kompozycji można przeprowadzać z zastosowaniem poziomu dawki i schematu wybranych przez lekarza prowadzącego. Odpowiednie formulacje dawkowania i sposoby podawania środków są znane w dziedzinie. Drogę podawania również można oznaczać i sposób oznaczania najskuteczniejszej drogi podawania jest znany znawcom dziedziny i będzie się różnić zależnie od kompozycji stosowanej w leczeniu, celu leczenia, stanu zdrowia lub stadium choroby leczonego osobnika i docelowej komórki lub tkanki. Nieograniczające przykłady drogi podawania obejmują podawanie doustne, dopochwowe, podawanie donosowe, iniekcję, stosowanie miejscowe, podjęzykowe, dopłucne i przez czopek.
Jak się tu stosuje, termin „powinowactwo” odnosi się do siły wiązania między receptorami i ich ligandami, na przykład między przeciwciałem i jego antygenem. Termin „Kd” lub „stała dysocjacji” odnosi się do powinowactwa między przeciwciałem i antygenem, tj. jak mocno przeciwciało wiąże się do określonego antygenu. Termin „IC50” lub „połowa maksymalnego stężenia hamującego” reprezentuje ilość kompetytora wymaganą do wywołania 50% spadku w wiązaniu przedmiotów badania.
PL 238 187 B1
Jak się tu stosuje, termin „aminokwas” odnosi się do L-aminokwasu lub D-aminokwasu lub ich mieszaniny, wliczając zarówno naturalny aminokwas, jak i syntetyczny aminokwas lub tym podobne, dopóki polipeptyd zachowuje pożądaną właściwość funkcjonalną. NH2, gdy stosowane na początku sekwencji peptydowej, odnosi się do wolnej grupy aminowej występującej na końcu aminowym (N-końcu) polipeptydu. COOH, gdy stosowane na końcu sekwencji peptydowej, odnosi się do wolnej grupy karboksylowej występującej na końcu karboksylowym (C-końcu) polipeptydu. Standardowe skróty w polipeptydach dla reszt aminokwasowych są następujące: A (Ala lub alanina); C (Cys lub cysteina); D (Asp lub kwas asparaginowy); E (Glu lub kwas glutaminowy); F (Phe lub fenyloalanina); G (Gly lub glicyna); H (His lub histydyna); I (Ile lub izoleucyna); K (Lys lub lizyna); L (Leu lub leucyna); M (Met lub metionina); N (Asn lub asparaginian); P (Pro lub prolina); Q (Gln lub glutaminian); R (Arg lub arginina); S (Ser lub seryna); T (Thr lub treonina); V (Val lub walina); W (Trp lub tryptofan); X (Xaa lub nieznany lub inny); Y (Tyr lub tyrozyna); Z (Glx/Gln/Glu lub kwas glutaminowy/glutamina); i Dpr (kwas 2,3-diaminopropionowy). Wszystkie sekwencje reszt aminokwasowych reprezentowane tu przez wzór mają orientację od lewej do prawej w konwencjonalnym kierunku od końca aminowego do końca karboksylowego. Kreska na początku lub końcu sekwencji reszt aminokwasowych wskazuje wiązanie peptydowe z dalszą sekwencją jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych lub wiązanie kowalencyjne z grupą na końcu aminowym, taką jak NH2 lub acetylowa, lub z grupą na końcu karboksylowym, taką jak COOH.
Jak się tu stosuje, termin „zawierający”/”obejmujący” lub „zawiera”/”obejmuje” w zamierzeniu oznacza, że kompozycje i sposoby obejmują wymienione elementy, ale nie wyłączają innych. „Składający się zasadniczo z”, gdy stosowany do zdefiniowania kompozycji i sposobów, oznacza wyłączenie innych elementów o jakimkolwiek kluczowym znaczeniu dla kombinacji do podanego celu. Zatem kompozycja lub sposób składający się zasadniczo z elementów, jak tu zdefiniowano, nie wyłączałyby i innych materiałów lub etapów, które materialnie nie wpływają na podstawową i nowatorską charakterystykę ujawnienia. „Składający się z” oznacza wyłączenie więcej niż elementów śladowych innych składników i zasadniczych etapów sposobu. Przykłady wykonania zdefiniowane przez każdy z tych przejściowych terminów są w obrębie zakresu tego ujawnienia.
Jak się tu stosuje, terminy „środek aktywny”, „lek” i „farmakologicznie aktywny środek” stosuje się tu zamiennie dla odniesienia się do chemicznego materiału lub związku, który, gdy podawany osobnikowi, indukuje pożądany efekt farmakologiczny i w zamierzeniu obejmuje środek terapeutyczny, wliczając radionuklidy, leki, środki przeciwnowotworowe, toksyny i tym podobne. Przykładowym środkiem aktywnym jest koniugat przeciwciało-ureaza .
Jak się tu stosuje, termin „przeciwciało” odnosi się do peptydu, polipeptydu lub białka, które ma powinowactwo wiązania do antygenu. Typowa jednostka strukturalna przeciwciała zawiera tetramer. Każdy tetramer składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, przy czym każda para ma jeden łańcuch „lekki” i jeden łańcuch „ciężki”. N-koniec każdego łańcucha definiuje region zmienny od około 100 do 110 lub więcej aminokwasów odpowiedzialny głównie za rozpoznawanie antygenu. Terminy „zmienny łańcuch lekki” (VL) i „zmienny łańcuch ciężki” (VH) odnoszą się odpowiednio do tych łańcuchów lekkiego i ciężkiego. Przeciwciała występują jako nienaruszone immunoglobuliny lub jako fragmenty, takie jakF(ab)’2, dimerFab, który sam jest łańcuchem lekkim połączonym z VH-CH1 wiązaniem disiarczkowym, lub monomer Fab’, który może wynikać z rozerwania wiązania disiarczkowego w regionie zawiasowym. Monomer Fab’ zasadniczo stanowi Fab z częścią regionu zawiasowego (patrz Fundamental Immunology, W. E. Paul, red., Raven Press, N.Y. (1993), dla bardziej szczegółowego opisu innych fragmentów przeciwciał). Fragmenty przeciwciał można wytwarzać na drodze trawienia nienaruszonego przeciwciała na przykład przez różne peptydazy, syntetyzować de novo chemicznie lub wykorzystując metodologię rekombinowanego DNA. Zatem termin „przeciwciało”, jak się tu stosuje, również obejmuje fragmenty przeciwciał wytworzone poprzez modyfikację przeciwciał lub syntetyzowane de novo z zastosowaniem metodologii rekombinowanego DNA. Przeciwciała obejmują jednołańcuchowe przeciwciała, wliczając jednołańcuchowe przeciwciała Fv (sFv), w których VH i VL są połączone razem (bezpośrednio lub przez peptydowy łącznik), w wyniku czego tworzy się ciągły polipeptyd.
Jak się tu stosuje, termin „przeciwciało jednodomenowe” (sdAb lub „VHH”) odnosi się do pojedynczej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciał tego rodzaju i w niektórych aspektach można je stwierdzić u ssaków wielbłądowatych, które w naturze nie mają łańcuchów lekkich. W niektórych aspektach przeciwciało jednodomenowe może pochodzić z regionu VH, regionu VHH lub regionu VL. W niektórych aspektach przeciwciało jednodomenowe jest pochodzenia ludzkiego. W niektórych aspek
PL 238 187 B1 tach ludzkie przeciwciało jednodomenowe zawiera sekwencje łańcucha ciężkiego lub lekkiego ujawnione w WO2006/099747 i WO2009/079793 i WO2012/100343, włączonych tu jako odniesienie w całości. W jednym z aspektów ludzkie przeciwciało jednodomenowe zawiera sekwencje łańcucha ciężkiego lub lekkiego z wiązaniami disiarczkowymi w obrębie regionu zrębowego, jak omówiono w WO2012/100343.
Jak się tu stosuje, termin „fragment przeciwciała” również obejmuje dowolne syntetyczne lub modyfikowane sposobami inżynierii genetycznej białko, które funkcjonuje jak przeciwciało poprzez wiązanie do swoistego antygenu, w wyniku czego tworzy się kompleks.
Jak się tu stosuje, termin „koniugat” odnosi się do dwóch lub większej liczby cząsteczek, które kowalencyjnie łączą się, w wyniku czego tworzy się większy konstrukt. W jednym z aspektów dwie cząsteczki są połączone bezpośrednim połączeniem, przy czym reaktywna grupa funkcyjna w ureazie wiąże się do komplementarnej reaktywnej grupy funkcyjnej w przeciwciele, tak jak aminowa funkcyjność lizyny wiąże się do karboksylowej funkcyjności kwasu asparaginowego lub glutaminowego. Przy czym należy rozumieć, że takie reakcje mogą wymagać konwencjonalnej modyfikacji grupy karboksylowej, by zapewnić jej większą reaktywność. W kolejnym aspekcie dwie cząsteczki są połączone przez ugrupowanie łącznika.
Jak się tu stosuje, do terminów „białko”, „polipeptyd” lub „peptyd”, jak się tu stosuje, odnosi się zamiennie. Białko ma strukturę pierwszorzędową reprezentowaną przez sekwencje jego podjednostek i może mieć struktury drugorzędowe helisy lub fałdowania, jak również ogólną trójwymiarową strukturę. Chociaż „białko” powszechnie odnosi się do względnie dużego polipeptydu, np. zawierającego 100 lub więcej aminokwasów, a „peptyd” do mniejszych polipeptydów, terminy te stosuje się tu zamiennie. Czyli termin „białko” może odnosić się do większego polipeptydu, jak również do mniejszego peptydu i vice versa.
Jak się tu stosuje, termin „ugrupowanie kierujące” odnosi się do cząsteczki, która wiąże się do zdefiniowanej populacji komórek lub wybranego rodzaju komórek. Ugrupowanie kierujące może wiązać receptor, oligonukleotyd, enzymatyczny substrat, determinantę antygenową lub inne miejsce wiązania występujące na lub w docelowej komórce lub populacji komórek. Przykładowym ugrupowaniem kierującym jest przeciwciało. Fragmenty przeciwciał i sekwencje małych peptydów zdolne do rozpoznawania wyrażanych antygenów również rozważa się jako ugrupowania kierujące.
Jak się tu stosuje, terminy „leczyć” lub „leczenie”, jak się tu stosuje, obejmują zmniejszanie, osłabianie lub łagodzenie choroby lub stanu lub ich jednego lub większej liczby objawów, zapobieganie dodatkowym objawom, łagodzenie lub zapobieganie przyczynom metabolicznym leżącym u podstawy objawów, hamowanie choroby lub stanu, np. zatrzymywanie lub supresję rozwoju choroby lub stanu, uwalnianie od choroby lub stanu, powodowanie regresji choroby lub stanu, uwalnianie od stanu spowodowanego przez chorobę lub stan lub supresję objawów choroby lub stanu i w zamierzeniu obejmują profilaktykę. Terminy również obejmują uwalnianie od choroby lub objawu, np. przez powodowanie regresji objawów klinicznych. Terminy dalej obejmują osiąganie terapeutycznej korzyści i/lub profilaktycznej korzyści. Przez terapeutyczną korzyść rozumie się likwidowanie lub łagodzenie leczonego zaburzenia leżącego u podstawy. Ponadto terapeutyczną korzyść osiąga się poprzez likwidowanie lub łagodzenie jednego lub większej liczby fizjologicznych objawów związanych z zaburzeniem leżącym u podstawy tak, że obserwuje się poprawę u osobnika, mimo że osobnik ten nadal cierpi na zaburzenie leżące u podstawy.
Terminy „osobnik”, „osoba” i „pacjent” stosuje się tu zamiennie, by odnieść się do dowolnego celu leczenia. Niniejsza technologia zapewnia również sposób leczenia komórek guza in situ lub w typowym dla nich miejscu lub lokalizacji, na przykład komórek neoplastycznych guza sutka lub gruczołu krokowego. Te guzy in situ mogą być zlokalizowane u lub na gospodarzach wszelkiego rodzaju, na przykład ludzkich gospodarzach, psich gospodarzach, kocich gospodarzach, końskich gospodarzach, bydlęcych gospodarzach, świńskich gospodarzach i tym podobnych. Można leczyć dowolnego gospodarza, u którego stwierdzono guza lub komórki guza, i mieści się to w zakresie niniejszej technologii. Osobnik zatem obejmuje kręgowca, korzystnie ssaka, korzystniej człowieka.
Jak się tu stosuje, termin „zasadniczo wolny od” cząstek dotyczy całkowitego braku cząstek lub prawie całkowitego braku cząstek, tak że efekt byłby taki sam, jakby zupełnie nie było cząstek. Innymi słowy kompozycja, która jest „zasadniczo wolna od” składnika lub elementu właściwie może nadal zawierać taką część, dopóki nie ma ona mierzalnego efektu. Termin „zasadniczo”, o ile nie wskazano inaczej, oznacza więcej niż około 90%, więcej niż około 95%, więcej niż około 96%, więcej niż około 97%, więcej niż około 98% lub więcej niż około 99%. W niektórych przykładach wykonania kompozycja zawierająca koniugaty przeciwciało-ureaza jest zasadniczo wolna od niesprzężonej ureazy, co oznacza,
PL 238 187 B1 że kompozycja zawiera więcej niż około 90% koniugatów przeciwciało-ureaza , więcej niż około 95% koniugatów przeciwciało-ureaza , więcej niż około 96% koniugatów przeciwciało-ureaza , więcej niż około 97% koniugatów przeciwciało-ureaza , więcej niż około 98% koniugatów przeciwciało-ureaza lub więcej niż około 99% koniugatów przeciwciało-ureaza . Innymi słowy kompozycja zawiera mniej niż około 0,1% niesprzężonej ureazy, mniej niż około 0,5% niesprzężonej ureazy, mniej niż około 1% niesprzężonej ureazy, mniej niż około 2% niesprzężonej ureazy, mniej niż około 3% niesprzężonej ureazy, mniej niż około 4% niesprzężonej ureazy, mniej niż około 5% niesprzężonej ureazy lub mniej niż około 10% niesprzężonej ureazy. Termin „niesprzężona ureaza” odnosi się do ureazy, która nie jest sprzężona do przeciwciała.
Jak się tu stosuje, termin „ureaza” odnosi się do enzymu mającego enzymatyczną aktywność amidohydrolazy mocznika (E.C. 3.5.1.5), występującego naturalnie lub uzyskanego np. z pomocą technik rekombinacji kwasu nukleinowego i/lub syntezy chemicznej. Ureaza obejmuje również białka fuzyjne zawierające całą ureazę, jej podjednostki lub fragmenty i/lub ureazę z aminokwasowymi substytucjami, delecjami lub addycjami, która zachowuje aktywność polipeptydu amidohydrolazy mocznika.
Jak się tu stosuje, termin „DOS47” odnosi się do oczyszczonej ureazy.
Koniugacja przeciwciało-ureaza
Niniejsza technologia dotyczy koniugatu przeciwciało-ureaza . Niniejsza technologia zapewnia kompozycję farmaceutyczną zawierającą farmaceutycznie dopuszczalny wodny roztwór odpowiedni dla dożylnej iniekcji i koniugat przeciwciało-ureaza , zasadniczo wolną od ureazy, wolną od niesprzężonego przeciwciała i wolną od niewodnych rozpuszczalników HPLC. Niewodne rozpuszczalniki HPLC obejmują organiczne rozpuszczalniki powszechnie stosowane w preparatywnej HPLC lub oczyszczaniu HPLC, takie jak metanol, acetonitryl, kwas trifluorooctowy itd. W niektórych aspektach koniugat przeciwciało-ureaza jest zasadniczo wolny od fosforanu z buforu fosforanowego. W niektórych aspektach do oczyszczania SEC stosuje się bufor fosforanowy zawierający 10 mM fosforan, 50 mM NaCl pH 7,0. W niektórych aspektach w wytwarzaniu koniugatu przeciwciało-ureaza nie przeprowadza się żadnego oczyszczania HPLC.
W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący około 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący około 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący około 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 6 lub więcej ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 8, 9, 10 lub 11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
W niektórych aspektach połączeniem jest wiązanie kowalencyjne lub bezpośrednie połączenie, przy czym reaktywna grupa funkcyjna w ureazie wiąże się do komplementarnej reaktywnej grupy funkcyjnej w przeciwciele, tak jak aminowa (NH2) funkcyjność np. lizyny wiąże się do karboksylowej (COOH) funkcyjności np. kwasu asparaginowego lub glutaminowego lub sulfhydrylowej w cysteinie. Przy czym należy rozumieć, że takie reakcje mogą wymagać konwencjonalnej modyfikacji grupy karboksylowej, by zapewnić jej większą reaktywność.
Reaktywne funkcyjności mogą być takie same jak kwas szczawiowy, kwas bursztynowy i tym podobne lub mogą być ortogonalnymi funkcyjnościami, takimi jak grupy aminowe (które stają się NH po koniugacji) i karboksylowe (które stają się CO lub COO po koniugacji). Alternatywnie przeciwciało i/lub ureazę można derywatyzować dla eksponowania lub przyłączenia dodatkowych reaktywnych grup funkcyjnych. Derywatyzacja może obejmować przyłączanie dowolnej liczby cząsteczek łącznika, takich jak te dostępne od Pierce Chemical Company, Rockford, III.
„Łącznik”, jak się tu stosuje, jest cząsteczką, którą stosuje się do łączenia ugrupowania kierującego (celującego, ang. targeting) z środkiem aktywnym, tak jak przeciwciała z ureazą. Łącznik ma zdolność tworzenia wiązań kowalencyjnych zarówno z ugrupowaniem kierującym, jak i ze środkiem aktywnym. Odpowiednie łączniki są dobrze znane znawcom dziedziny i obejmują, ale w sposób nieograniczający, łączniki węglowe o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu, heterocykliczne łączniki węglowe lub łączniki peptydowe. Gdy ugrupowanie kierujące i cząsteczka środka aktywnego są polipeptydami, łączniki można łączyć do składowych aminokwasów przez ich grupy boczne (np. przez wiązanie disiarczkowe do cysteiny). W jednym z korzystnych aspektów łączniki będą łączone do węgla alfa grup aminowych i karboksylowych w końcowych aminokwasach. W niektórych aspektach wiązanie występuje przez łącznik mający dwie lub większą liczbę funkcyjności, takich jak karboksylowa lub aminowa, by umożliwić
PL238 187 Β1 mu reagowanie zarówno z ureazami, jak i przeciwciałem. Łączniki są dobrze znane w dziedzinie i zwykle zawierają od 1-20 atomów, wliczając węgiel, azot, wodór, tlen, siarkę i tym podobne.
Dwufunkcyjny łącznik mający jedną grupę funkcyjną reagującą z grupą na ureazie i drugą grupę funkcyjną reagującą z przeciwciałem można stosować dla uzyskania pożądanego immunokoniugatu. Alternatywnie derywatyzacja może obejmować traktowanie chemiczne ugrupowania kierującego, np. cięcie glikolu ugrupowania cukrowego w glikoproteinowym przeciwciele nadjodanem, w wyniku czego generują się wolne grupy aldehydowe. Wolne grupy aldehydowe na przeciwciele mogą reagować z wolnymi grupami aminy lub hydrazyny na środku, w wyniku czego wiążą się one ze środkiem, (patrz Pat. USA nr 4,671,958). Procedury generowania wolnych grup sulfhydrylowych na polipeptydzie, takim jak przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, również są znane (patrz Pat. USA nr 4, 659,839).
Inne cząsteczki łącznika i ich zastosowanie obejmują te opisane np. w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym nr 188,256; Pat. USA nr 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; i 4,589,071; i Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res. 47: 4071-4075).
W niektórych aspektach połączenie (wiązanie) może być przecinane (rozszczepiane) w miejscu docelowym lub w jego sąsiedztwie i ureaza zostaje uwolniona od ugrupowania kierującego, gdy cząsteczka koniugatu dotrze do swojego miejsca docelowego. Przecięcie połączenia dla uwolnienia ureazy od ugrupowania kierującego można wywołać poprzez aktywność enzymatyczną lub warunki, którym poddawany jest koniugat wewnątrz komórki docelowej lub w sąsiedztwie miejsca docelowego. W niektórych aspektach można stosować łącznik, który może być przecinany w warunkach występujących w miejscu guza (np. przy wystawieniu na działanie enzymów związanych z guzem lub kwasowe pH).
Łączniki, które mogą być przecinane obejmują te opisane np. w Pat. USA nr 4,618,492; 4,542,225 i 4,625,014. Mechanizmy uwalniania środka aktywnego od tych grup łącznika obejmują na przykład napromieniowanie wiązania fotolabilnego i hydrolizę katalizowaną kwasem. Pat. USA nr 4,671,958, na przykład, obejmuje opis immunokoniugatów zawierających łączniki, które są przecinane w miejscu docelowym in vivo przez enzymy proteolityczne układu dopełniacza pacjenta. W niektórych aspektach odpowiednim łącznikiem jest reszta aminokwasu lub przerywnik peptydowy składający się z dwóch lub większej liczby aminokwasów.
W niektórych aspektach odpowiednim łącznikiem jest R1-L-R2, gdzie R1 i R2 są takimi samymi lub różnymi grupami funkcyjnymi, z których jedna jest przyłączona do przeciwciała, a druga jest przyłączona do ureazy. R1 i R2 można niezależnie wybierać, ale w sposób nieograniczający, spośród -NH-, -CO-, COO-, -O-, -S-, -NHNH-, -N=N-, =N-NH- itd. L może być prostym lub rozgałęzionym łańcuchem węglowodorowym, takim jak łańcuch alkilowy, przy czym jeden lub większa liczba węgli opcjonalnie jest zastąpiona tlenem, azotem, amidem, siarką, sulfotlenkiem, sulfonem, cykloalkilem, heterocykloalkilem, arylem, heteroarylem itd.
W niektórych aspektach łącznikiem może być reszta aminokwasowa lub peptyd. W niektórych okolicznościach łącznik może być przecinany przez enzym lub zmianę pH w miejscu docelowym lub jego pobliżu. Określone łączniki i procedury odpowiednie do otrzymywania koniugatów opisano w Pat. USA nr 4,414,148, 4,545,985, 4,569,789, 4,671,958, 4,659,839, 4,680,338, 4,699,784, 4,894,443 i 6,521,431. W niektórych aspektach łącznikiem jest
gdzie i_____reprezentują punkty przyłączenia do przeciwciała lub ureazy. W niektórych aspektach ^/wreprezentuje punkt przyłączenia do grupy aminowej przeciwciała, a_____reprezentuje punkt przyłączenia do atomu S grupy tiolowej w ureazie. Łącznik ten stanowi pozostałość stosowania środka łączącego SIAB (N-sukcynoimidylo(4-jodoacetylo)aminobenzoesanu) do koniugacji przeciwciała i ureazy. W niektórych aspektach ultraoczyszczanie stanowi sposób rozdzielania odpowiedni dla sposobu koniugacji z zastosowaniem SIAB jako środka sieciującego.
PL238 187 Β1
W niektórych aspektach łącznik stanowi pozostałość stosowania środka łączącego o wzorze:
O gdzie X oznacza bromo lub jodo i L oznacza łącznik, jak tu opisano.
W niektórych aspektach środkiem łączącym jest SBAP (sukcynoimidylo-3-[bromoacetamino]propionian) lub SIA (N-sukcynoimidylojodooctan), który można stosować do koniugacji w podobnych warunkach jak te dla SIAB (np. nie jest wymagane żadne chromatograficzne oczyszczanie HPLC i konieczna może być tylko ultrafiltracja). W niektórych aspektach długość ramienia wiązania SIAB (10,6 angstrema) jest bardziej odpowiednia/giętka niż ta w SBAP (6,2 A) i SIA (1,5 A). W niektórych aspektach środkiem łączącym jest SPDP (sukcynoimidylo-3-(pirydyloditio)propionian), SMPT (sukcynoimidyloksykarbonylometylo-(2-pirydyloditio)toluen) lub SMCC (sukcynoimidylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksanokarboksylan), który można stosować do koniugacji, ale więcej niż jeden sposób rozdzielania, taki jak IEC i frakcjonowanie etanolem może być wymagane dla rozdzielenia nieprzereagowanej ureazy od roztworu reakcyjnego koniugacji z mniejszym uzyskiem.
Co więcej z przeciwciałami mogą być związane dodatkowe komponenty, takie jak, ale w sposób nieograniczający, środki terapeutyczne, takie jak środki przeciwnowotworowe, dla dalszego wzmocnienia terapeutycznego efektu.
Ureaza
Wiele badań zapewniło szczegółowe informacje o genetyce ureazy z różnych ewolucyjnie zróżnicowanych bakterii, roślin, grzybów i wirusów (Mobley, H. L. T. et al. (1995) Microbiol. Rev. 59: 451480; Eur J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990) Międzynarodowa Publikacja nr WO 90/04030; Clayton, C. L. et al. (1990) Nucleic Acid Res. 18, 362; i Pat. USA nr 6,248,330 i 5,298,399, z których każdy włącza się tu jako odniesienie). Szczególnym przedmiotem zainteresowania jest ureaza, którą stwierdzono u roślin (Sirko, A. i Brodzik, R. (2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95). Jedną z przykładowych ureaz roślinnych jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej. Inne sekwencje przydatnych ureaz można identyfikować w ogólnie dostępnych bazach danych, np. Entrez (ncbi.nlm.nih.gov/Entrez).
W niektórych aspektach ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej. Ureaza z kanawalii mieczokształtnej ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 2, jak przedstawiono poniżej:
MKLSPREVEKLGLHNAGYLAQKRLARGVRLNYTE
AVALIASQIMEYARDGEKTVAQLMCLGQHLLGRR QVLPAVPHLLNAVQVEATFPDGTKLVTVHDPISRE NGELQEALFGSLLPVPSLDKFAETKEDNRIPGEILCE
PL238 187 Β1
DECLTLNIGRKAVILKVTSKGDRPIQVGSHYHFIEV NPYLTFDRRKAYGMRLNIAAGTAYRFEPGDCK.SYT LVSIEGNKVIRGGNAIADGPVNETNLEAAMHAVRS KGFGHEEEKDASEGFTKEDPNCPFNTFIHRKEYANK YGPTTGDKIRLGDTNLLAEIEKDYALYGDECYFGG GKVIRDGMGQSCGHPPAISLDTVITNAVIIDYTGIIK ADIGIKDGLIASIGKAGNPDIMNGYFSNMIIGANTEY IAGEGLIVTAGAIDCHVHYICPQLVYEAISSGITTLV GGGTGPAAGTRATTCTPSPTQMRLMLQSTDDLPLN FGFTGKGSSSKPDELHEIIKAGAMGLKLHEDWGSTP AAIDNCLTIAEHHDIQINIHTDTLNEAGFVEHSIAAF KGRTIHTYHSEGAGGGHAPDIIKYCGIKNYLPSSTNP TRPLTSNTIDEHLDMLMYCHHLDREIPEDLAFAHSR IRKKTIA AED YLNDIG AIS I1S SDS Q AMGRYGE VISRT WQTADKMKAQTGPLKCDSSDNDNFRIRRYIAKYTI NPAIANGFSQYVGSVEVGKLADLVMWKPSFFGTKP EMVIKGGMVAWADIGDPNASIPTPEPVKMRPMYGT LGKAGGALSIAFVSKAALDQRVNVLYGLNKRVEA VSNVRKLTKLDMKLNDALPEITVDPESYTVKADGK LLCYSEATTYPLSRNYFLF (SEQ ID No. 2)
Sekwencje przydatnych ureaz można identyfikować w ogólnie dostępnych bazach danych, np. Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/). Dodatkowo startery, które są przydatne w amplifikacji ureaz z wielu różnych organizmów, można wykorzystywać, jak opisano w Baker, K. M. i Collier, J. L.
(http://www.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webpage/abstracts.html), lub stosując CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer), jak opisano w Rosę, et al. (1998) Nuci. Acids Res. 26:1628.
Ureaza może przekształcać substrat mocznik do amoniaku i karbaminianu. Ta aktywność enzymatyczna może zwiększać pH, skutkując bardziej zasadowym środowiskiem. Środowisko wokół komórki nowotworowej zwykle jest kwasowe (Webb, S.D., et al. (2001) Novartis Found Symp 240:169-81. Zatem poprzez zwiększanie w ten sposób pH środowiska zewnątrzkomórkowego hamuje się wzrost komórki nowotworowej. Odpowiednio dodanie koniugatów przeciwciało-ureaza w określonych aspektach niniejszej technologii powoduje, że pH płynu śródmiąższowego wzrasta o około 0,1 jednostki pH, np. 0,1-0,5 jednostki pH lub więcej.
Ureaza stosowana w niniejszej technologii obejmuje naturalnie występujące postacie ureazy, jak również jej funkcjonalnie aktywne odmiany. Rozważa się dwa ogólne rodzaje wariantów sekwencji aminokwasowych. Wariantami sekwencji aminokwasowych są te mające jedną lub większą liczbę substytucji w określonych aminokwasach, które nie niszczą aktywności ureazy. Warianty te obejmują warianty ciche i konserwatywnie modyfikowane warianty, które są zasadniczo homologiczne i funkcjonalnie równoważne z natywnym białkiem. Wariant natywnego białka jest „zasadniczo homologiczny” z natywnym białkiem, gdy co najmniej około 80%, korzystniej co najmniej około 90%, jeszcze korzystniej co najmniej około 95%, jeszcze bardziej korzystnie 98%, a najkorzystniej co najmniej około 99% jego sekwencji aminokwasowej jest identyczne z sekwencją aminokwasową natywnego białka. Wariant może różnić się nawet tylko o 1 lub do 10 lub więcej aminokwasów.
PL 238 187 B1
Drugi rodzaj wariantu obejmuje warianty ureazy względem wielkości, które stanowią izolowane aktywne fragmenty ureazy. Warianty względem wielkości można uzyskiwać np. poprzez fragmentację ureazy, chemiczną modyfikację, trawienie enzymem proteolitycznym lub poprzez ich kombinację. Dodatkowo do wytwarzania wariantów względem wielkości można wykorzystywać techniki inżynierii genetycznej, jak również sposoby syntetyzowania polipeptydów bezpośrednio z reszt aminokwasowych.
„Funkcjonalnie równoważny” w zamierzeniu oznacza, że sekwencja wariantu definiuje łańcuch, który wytwarza białko mające zasadniczo taką samą aktywność biologiczną co natywna ureaza. Takie funkcjonalnie równoważne warianty, które zawierają znaczne zmiany w sekwencji również są objęte niniejszą technologią. Zatem funkcjonalnie równoważny wariant białka natywnej ureazy będzie mieć wystarczającą aktywność biologiczną, by być terapeutycznie przydatnym. W dziedzinie dostępne są sposoby oznaczania funkcjonalnej równoważności. Aktywność biologiczną można mierzyć z zastosowaniem testów specjalnie opracowanych do pomiaru aktywności białka natywnej ureazy. Dodatkowo przeciwciała utworzone wobec biologicznie aktywnego natywnego białka można testować pod kątem ich zdolności wiązania do funkcjonalnie równoważnego wariantu, przy czym skuteczne wiązanie wskazuje, że białko ma konformację podobną do tej dla natywnego białka.
Sekwencje białka ureazy sosowana w niniejszej technologii, wliczając konserwatywnie podstawione sekwencje, mogą występować jako część sekwencji większego polipeptydu, tak jak ma to miejsce po dodaniu jednej lub większej liczby domen do oczyszczania białka (np. segmenty poliHis, segmenty taga FLAG itd.), przy czym dodatkowe funkcjonalne domeny mają niewielki lub żaden wpływ na aktywność porcji białka ureazy lub przy czym dodatkowe domeny można usuwać w etapach przetwarzania po syntezie, tak jak poprzez traktowanie proteazą.
Dodanie jednego lub większej liczby kwasów nukleinowych lub sekwencji, które nie zmieniają kodowanej aktywności cząsteczki kwasu nukleinowego dla niniejszej technologii, tak jak dodanie niefunkcjonalnej sekwencji, stanowi konserwatywną zmianę w podstawowej cząsteczce kwasu nukleinowego, a dodanie jednej lub większej liczby reszt aminokwasowych, które nie zmieniają aktywności polipeptydu dla niniejszej technologii stanowi konserwatywną zmianę podstawowego polipeptydu. Oba takie rodzaje dodawania stanowią cechę niniejszej technologii. Znawca dziedziny doceni, że wiele konserwatywnych zmian w konstruktach kwasu nukleinowego, które ujawniono, da funkcjonalnie identyczny konstrukt.
Można stosować różne sposoby oznaczania relacji między sekwencjami, wliczając ręczne dopasowanie i wspomagane komputerowo dopasowanie sekwencji i analizę. To ostatnie podejście jest korzystnym podejściem w niniejszej technologii ze względu na zwiększoną przepustowość zapewnianą przez sposoby wspomagane komputerowo. Różne programy komputerowe do przeprowadzania dopasowania sekwencji są dostępne lub mogą być wytworzone przez znawcę.
Jak podano powyżej, sekwencje kwasów nukleinowych i polipeptydów (i ich fragmentów) wykorzystane w niniejszej technologii nie muszą być identyczne, ale mogą być zasadniczo identyczne (lub zasadniczo podobne) z odpowiadającą sekwencją polipeptydu ureazy lub cząsteczki kwasu nukleinowego (lub jej fragmentu) dla niniejszej technologii lub powiązanej cząsteczki. Na przykład polipeptydy można poddawać różnym zmianom, takim jak jedna lub większa liczba insercji, delecji i substytucji, konserwatywnych lub niekonserwatywnych, aminokwasu lub w kwasie nukleinowym, wliczając te, gdzie np. takie zmiany mogą zapewniać określone zalety w ich zastosowaniu, np. w ich zastosowaniu terapeutycznym lub podawaniu.
Ugrupowania kierujące
Ugrupowania kierujące (celujące, ang. targeting) są uznawane jako jednostki chemiczne w niniejszej technologii i wiążą się do zdefiniowanego, wybranego rodzaju komórek lub docelowej populacji komórek, takiej jak komórki nowotworowe. Ugrupowania kierujące przydatne pod tym względem obejmują przeciwciała i fragmenty przeciwciał, peptydy i hormony. Białka odpowiadające znanym receptorom powierzchniowym komórek (w tym lipoproteiny o niskiej gęstości, transferyna i insulina), enzymy fibrynolityczne, białka wiążące płytki, takie jak aneksyny, i modyfikatory odpowiedzi biologicznej (w tym interleukina, interferon, erytropoetyna i czynnik stymulujący tworzenie kolonii) również rozważa się jako ugrupowania kierujące. Jako ugrupowania kierujące w niniejszej technologii można stosować oligonukleotydy np. antysensowne oligonukleotydy, które są komplementarne do porcji docelowego kwasu nukleinowego. Ugrupowaniami kierującymi mogą również być oligonukleotydy, które wiążą się do powierzchni docelowej komórki. Analogi wyżej podanych ugrupowań kierujących, które zachowują zdolność wiązania się do zdefiniowanej docelowej populacji komórek również można stosować jako ugrupowania kierujące.
PL 238 187 B1
Funkcjonalne równoważniki wyżej wymienionych ugrupowań kierujących również są przydatne jako ugrupowania kierujące według niniejszej technologii. Przykładowym funkcjonalnym równoważnikiem ugrupowania kierującego jest organiczny konstrukt chemiczny opracowany do naśladowania właściwej konfiguracji i/lub orientacji dla wiązania komórki docelowej przez ugrupowanie kierujące. Kolejnym funkcjonalnym równoważnikiem ugrupowania kierującego jest krótki polipeptyd, który wykazuje powinowactwo wiązania ugrupowania kierującego.
W niektórych aspektach ugrupowaniami kierującymi według niniejszego ujawnienia są przeciwciała, peptydy, oligonukleotydy lub tym podobne, które reagują z antygenem na powierzchni komórki docelowej. Można wykorzystywać zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne, które są handlowo dostępne lub opisane w literaturze. Przeciwciałami mogą być całe przeciwciała lub ich fragmenty. Przeciwciała monoklonalne i fragmenty można wytwarzać według konwencjonalnych technik, takich jak synteza hybrydomy, techniki rekombinowanego DNA i synteza białka. Przydatne monoklonalne przeciwciała i fragmenty mogą pochodzić z dowolnego gatunku (w tym ludzi) lub mogą być tworzone jako chimeryczne białka, które wykorzystują sekwencje z więcej niż jednego gatunku.
W niektórych aspektach ugrupowaniem kierującym jest przeciwciało humanizowane lub niehumanizowane. W niektórych aspektach ugrupowaniem kierującym jest przeciwciało jednodomenowe. W niektórych aspektach przeciwciało jednodomenowe (sdAb) lub „VHH” odnosi się do pojedynczej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciał tego rodzaju, które można stwierdzić u ssaków wielbłądowatych, które w naturze nie mają łańcuchów lekkich. W niektórych aspektach przeciwciało jednodomenowe może pochodzić z regionu VH, regionu VHH lub regionu VL. W niektórych aspektach przeciwciało jednodomenowe jest pochodzenia ludzkiego. W niektórych aspektach ludzkie przeciwciało jednodomenowe zawiera sekwencje łańcucha ciężkiego lub lekkiego ujawnione w WO2006/099747 i WO2009/079793 i WO2012/100343, włączonych tu jako odniesienie w całości. W jednym z aspektów ludzkie przeciwciało jednodomenowe zawiera sekwencje łańcucha ciężkiego lub lekkiego z wiązaniami disiarczkowymi w obrębie regionu zrębowego, jak omówiono w WO2012/100343.
W niektórych aspektach ugrupowanie kierujące (np. przeciwciało) ma swoistość względem antygenu guza wyrażanego przez raki, białaczki, chłoniaki i mięsaki. Raki mogą dotyczyć odbytu, dróg żółciowych, pęcherza moczowego, sutka, okrężnicy, odbytnicy, płuca, części ustnej gardła, części krtaniowej gardła, przełyku, żołądka, trzustki, wątroby, nerki, pęcherzyka żółciowego i przewodów żółciowych, jelita cienkiego, dróg moczowych, jajnika, okrężnicy, niedrobnokomórkowego raka płuc, dróg płciowych, gruczołów endokrynnych, tarczycy i skóry. W niektórych aspektach ugrupowanie kierujące (np. przeciwciało) ma swoistość względem antygenu guza wyrażanego przez rakowiaki, guzy podścieliska przewodu pokarmowego, guzy głowy i szyi, guzy pierwotne, naczyniaki, czerniaki, międzybłoniaka złośliwego, szpiczaka mnogiego i guzy mózgu, nerwów, oczu i opon mózgowych. W niektórych aspektach ugrupowanie kierujące (np. przeciwciało) ma swoistość względem antygenu guza wyrażanego przez raka, nowotwór sutka, trzustki, jajnika, płuca i okrężnicy. W niektórych aspektach ugrupowanie kierujące (np. przeciwciało) ma swoistość względem antygenu guza wyrażanego przez niedrobnokomórkowego raka płuc.
W niektórych aspektach przeciwciało ma swoistość względem antygenu guza wyrażanego przez niedrobnokomórkowego raka płuc. W niektórych aspektach antygenem guza wyrażanym przez niedrobnokomórkowego raka płuc jest CEACAM6 (cząsteczka adhezyjna komórek powiązanych z antygenem rakowo-płodowym 6) i przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6. CEACAM6, znana również jako nieswoisty antygen reagujący krzyżowo (NCA) lub CD66c, jest dobrze scharakteryzowanym antygenem nowotworowym (11, 12). Wykazuje wysoką homologię sekwencji z innymi ludzkimi antygenami rakowo-płodowymi, takimi jak CEACAM1, CEACAM7 i CEACAM8. Jest białkiem powierzchniowym komórki związanym z glikozylofosfoinozytolem (GPI), ale bez znanej domeny cytoplazmatycznej. Ekspresja CEACAM6 jest istotnie podwyższona w tkankach nowotworu sutka, trzustki, jajnika, płuca i okrężnicy. Jego podwyższoną ekspresję wskazuje się w inwazyjnym i przerzutowym zachowaniu komórek guza (13). W niektórych aspektach przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M. W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M lub 1 x 10-20 M. W niektórych aspektach przeciwciałem jest fragment przeciwciała jednodomenowego wielbłądowatych (AFAIKL2, SEQ ID NO. 1), który rozpoznaje CEACAM6 na komórkach gruczolakoraka płuc. W niektórych aspektach przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 1, jak przedstawiono na Figurze 5. W niektórych aspektach przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający co najmniej jedną modyfikację w sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO. 1. W niektórych aspektach
PL 238 187 B1 przeciwciało zawiera polipeptyd mający co najmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 98% i 99% homologii sekwencji z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO. 1.
W niektórych aspektach przeciwciałem CEACAM6 jest przeciwciało anty-CEACAM6 (9A6): sc59899 dostępne od Santa Cruz Biotech. Przeciwciałem dla CEACAM6 (9A6) jest mysie monoklonalne IgGl zapewniona w 200 μg/ml, która jest utworzona wobec linii komórek guza pochodzenia ludzkiego wyrażających CEACAM6. Jest ono zalecane do wykrywania CEACAM6 ludzkiego pochodzenia.
W niektórych aspektach przeciwciałem dla CEACAM6 jest przeciwciało anty-CEACAM6 (ab56234) dostępne od Abcam. Przeciwciałem anty-CEACAM6 (ab56234) jest królicze poliklonalne względem CEACAM6. Zostało utworzone wobec regionu w obrębie syntetycznego peptydu (IQNPASANRS DPVTLNVLYG PDGPTISPSK ANYRPGENLN LSCHAASNPP (SEQ ID NO: 3)), który odpowiada wewnętrznej sekwencji aminokwasów 217-266 ludzkiej CEACAM6.
W niektórych aspektach przeciwciałem dla CEACAM6 jest przeciwciało anty-CEACAM-6/CD66c dostępne od Novus Biologicals, które jest króliczym poliklonalnym przeciwciałem przeciw CEACAM6 i było walidowane z pomocą Western blot i immunohistochemii-P. Zostało utworzone wobec syntetycznego peptydu (EIQNPASANRSD (SEQ ID NO: 4)) skierowanego względem środkowego regionu ludzkiej CEACAM6 (NP_002474).
W niektórych aspektach przeciwciałem dla CEACAM6 jest przeciwciało anty-CEACAM6 EPR4403 dostępne od OriGene, które jest króliczym monoklonalnym przeciwciałem przeciw CEACAM6 (klon EPR4403). Zostało utworzone wobec syntetycznego peptydu odpowiadającego resztom w ludzkiej CEACAM6. Wykazuje reaktywność względem mysiej, szczurzej i ludzkiej CEACAM6.
W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości IC50 nie większej niż około 10 nM. W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości IC50 nie większej niż około 5 nM. W niektórych aspektach koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości IC50 nie większej niż około 4 nM. W niektórych aspektach wartość IC50 wynosi około 3,22 nM. W niektórych aspektach koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50 około 10-30 μg/ml. W niektórych aspektach koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50 około 20 μg/ml. Powinowactwo wiązania przeciwciała lub koniugatu do docelowego antygenu można oznaczać według sposobów tu opisanych lub znanych w dziedzinie. W niektórych aspektach niniejsza technologia opisuje ten koniugat anty-CEACAM6-ureaza (L-DOS47). W niektórych aspektach niniejsza technologia opisuje koniugat przeciwciało-ureaza , np. AFAIKL2-ureaza. Do identyfikacji przeciwciała jednodomenowego (sdAb) stosuje się bibliotekę fagową pochodzącą z repertuaru łańcuchów ciężkich przeciwciał lamy poprzez panning względem niedrobnokomórkowego gruczolakoraka płuc A549. AFAI oznacza sdAb. Sekwencję genu AFAI optymalizuje się pod kątem koniugacji i zmienia się nazwę na AFAIKL2. W niektórych aspektach przeciwciało AFAIKL2 jest klonowane i wyrażane w systemie E. coli BL21 (DE3) pT7-7.
Humanizowane ugrupowania kierujące mają zdolność obniżania immunoreaktywności przeciwciała lub polipeptydu u biorcy gospodarza, pozwalając na wzrost okresu półtrwania i redukcję niepożądanych reakcji immunologicznych. Mysie monoklonalne przeciwciała można humanizować np. poprzez genetyczną rekombinację sekwencji nukleotydowej kodującej mysi region Fv lub jego regiony determinujące komplementarność z sekwencją nukleotydową kodującą region ludzkiej domeny stałej lub region Fc. Mysie reszty mogą również być zachowane w obrębie domen zrębowych ludzkiego regionu zmiennego w celu zapewnienia właściwej charakterystyki wiązania miejsca docelowego. Przeglądu przeciwciał modyfikowanych sposobami inżynierii genetycznej do dostarczania różnych środków aktywnych do komórek nowotworowych dokonano w Bodey, B. (2001) Expert Opin Biol. Ther. 1(4):603-17.
W niektórych aspektach ugrupowaniem kierującym jest ligand, który reaguje z receptorem na powierzchni komórki docelowej. Zatem ugrupowanie kierujące może obejmować, w sposób nieograniczający, hormony z powinowactwem względem komponentu wiązania komórkowego, dowolną cząsteczkę zawierającą ugrupowanie węglowodanowe rozpoznawane przez komponent wiązania komórkowego i leki lub niewielkie cząsteczki, które wiążą się do komponentu wiązania komórkowego. Wyrażenie „komponent wiązania” obejmuje zarówno receptor, jak i cząsteczki akceptorowe. Korzystnie komponentem wiązania jest komponent wiązania na powierzchni komórki. W jednym z aspektów ugrupowaniem kierującym jest naturalnie występujące białko, takie jak insulina, które wiąże się do miejsca docelowego. Cytokiny, wliczając interleukiny i czynniki takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów/makrofagów (GM-CSF) i czynnik martwicy nowotworu (TNF), również stanowią swoiste ugrupowania kierujące, znane z wiązania się do określonych komórek wyrażających wysokie poziomy ich receptorów (Terlikowski, SJ (2002) Toxicology 174(3): 143-152).
PL 238 187 B1
W celu obniżenia ekspozycji komórek lub tkanek innych niż docelowe na ureazę lub inne środki aktywne ugrupowania kierujące można przesiewać pod kątem identyfikacji tych, które wykazują minimalną reaktywność nieukierunkowaną na cel, jednocześnie zachowując swoistość i reaktywność względem celu. Dzięki redukcji ekspozycji innej niż docelowa (i niepożądanej lokalizacji innej niż docelowa i/lub toksyczności) można podawać zwiększone dawki ureazy lub innego środka aktywnego. Pozwala to na podawanie możliwie najwyższego stężenia ureazy lub innego środka terapeutycznego w celu maksymalizacji ekspozycji komórek docelowych przy jednoczesnym pozostawaniu poniżej progu niedopuszczalnej toksyczności względem komórek inne niż docelowe.
W niektórych aspektach wykorzystuje się dwa lub większą liczbę koniugatów środek aktywnyugrupowanie kierujące, przy czym każdy koniugat obejmuje inne ugrupowanie kierujące, np. inny rodzaj przeciwciała. Każde z wykorzystywanych ugrupowań kierujących wiąże się do innego regionu miejsca docelowego, który może być powiązany z tym samym lub innym miejscem docelowym. Komponent środka aktywnego w każdym podawanym koniugacie może być taki sam lub inny. Patrz np. Patent USA nr 4,867,962 i 5,976,535, z których każdy włączono tu jako odniesienie. W niektórych aspektach przywarcie (akrecja, ang. accretion) miejsca docelowego koniugatu środka aktywnego do miejsca docelowego polepsza się, ponieważ każde ugrupowanie kierujące np. rodzaj przeciwciała, rozpoznaje inny region miejsca docelowego (tj. epitop). To podejście alternatywnego regionu miejsca docelowego zapewnia więcej potencjalnych punktów wiązania miejsca docelowego dla środka aktywnego. W konsekwencji można uniknąć rzeczywistego lub skutecznego wysycenia miejsca docelowego, np. poprzez wysycenie epitopu i/lub zawadę steryczną. Zatem można osiągać addytywną akumulację środka aktywnego, np. ureazy. Alternatywnie lub w połączeniu jako środki aktywne można wykorzystywać dodatkowe produktu genu swoiste względem ureazy, np. dla wytworzenia katalitycznie aktywnego holoenzymu w miejscu docelowym. Przykładowy apoenzym ureazy obejmuje podjednostki gamma, beta i alfa kodowane przez bakteryjne geny ureABC (Burne, R.A. i Chen, Y.M. (2000) Microbes and Infection 2:533542).
Wzory reaktywności krzyżowej dla monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw określonemu miejscu docelowemu można analizować w celu identyfikacji zestawu dwóch lub większej liczby monoklonalnych przeciwciał swoistych względem celu z nienakładającą się reaktywnością krzyżową do stosowania w zastosowaniach terapeutycznych. Wyrażenie „nienakładające się wzory reaktywności krzyżowej” wskazuje, że tkanki inne niż docelowe związane przez jeden rodzaj przeciwciał zasadniczo różnią się od tkanek innych niż docelowe związanych przez drugi rodzaj przeciwciał. Wzory reaktywności krzyżowej różnią się w zakresie niezbędnym do proporcjonalnej redukcji ekspozycji środka aktywnego dla zastosowań terapeutycznych. Korzystne jest mniejsze nakładanie się pary przeciwciał (lub większego zestawu przeciwciał).
Przeciwciała można wyszukiwać z pomocą różnych sposobów. Analizę immunohistochemiczną można wykorzystywać do oznaczania reaktywności z tkaną docelową i reaktywności krzyżowej z tkanką inną niż docelowa. Tkanki, do których wiąże się rodzaj przeciwciał, można identyfikować poprzez eksponowanie tkanki na przeciwciało; przemywanie tkanki w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała; i wykrywanie obecności związanego przeciwciała. Histochemiczne procedury in vitro są znane w dziedzinie. Patrz np. Sanchez-Islas, E. i Leon-Olea, M. (2001) Nitric Oxide 5(4):302-16.
Gdy ugrupowanie kierujące jest względnie krótkie, można je syntetyzować z zastosowaniem standardowych technik syntezy chemicznej peptydów. Dla jednego z aspektów sposobu syntezy chemicznej polipeptydów rozważa się syntezę w fazie stałej, w której C-końcowy aminokwas w sekwencji przyłącza się do nierozpuszczalnego podłoża, po czym następuje sekwencyjne dodawanie pozostałych aminokwasów w sekwencji. Techniki syntezy w fazie stałej opisano w Barany i Merrifield, Solid -Phase Peptide Synthesis; s. 3-284 w The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963) i Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, wyd. drugie, Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984).
DNA kodujący przeciwciało lub ureazę można otrzymywać z pomocą odpowiedniego sposobu, wliczając na przykład klonowanie i poddanie właściwych sekwencji działaniu enzymów restrykcyjnych lub bezpośrednią syntezę chemiczną z pomocą sposobów takich jak sposób fosfotriestrowy w Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99; sposób fosfodiestrowy w Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; sposób dietylofosforamidytowy w Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862; i sposób ze stałym podłożem w Pat. USA nr 4,458,066.
Synteza chemiczna daje jednoniciowy oligonukleotyd. Ten można przekształcać w dwuniciowy DNA poprzez hybrydyzację z komplementarną sekwencją lub poprzez polimeryzację z polimerazą DNA
PL 238 187 B1 z zastosowaniem pojedynczej nici jako matrycy. Znawca będzie wiedzieć, że podczas gdy synteza chemiczna DNA ogranicza się do sekwencji z około 100 zasad, dłuższe sekwencje można uzyskiwać poprzez ligację krótszych sekwencji.
Alternatywnie podsekwencje można klonować i właściwe podsekwencje ciąć z zastosowaniem właściwych enzymów restrykcyjnych. Fragmenty można ligować, w wyniku czego wytwarza się pożądaną sekwencję DNA.
Sposoby otrzymywania koniugatów przeciwciało-ureaza
Niniejsza technologia zapewnia sposób otrzymywania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza i zasadniczo wolnej od niesprzężonej ureazy, tak jak nie więcej niż około 5%, 4%, 3%, 2% lub 1% ureazy względem masy koniugatu przeciwciało-ureaza , przy czym sposób obejmuje (1) łączenie aktywowanego przeciwciała i ureazy w rozpuszczalniku, w którym aktywowane przeciwciało i ureaza zasadniczo nie reagują, tak jak nie więcej niż 10%, 5% lub 1% reakcji na godzinę, w wyniku czego tworzy się mieszanina reakcyjna, przy czym dystrybucja aktywowanego przeciwciała i ureazy w rozpuszczalniku jest równomierna, i (2) zmianę właściwości mieszaniny z (1), tak że aktywowane przeciwciało łatwo reaguje z ureazą, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza . W niektórych aspektach właściwością mieszaniny z (1) jest wartość pH. W niektórych aspektach zmiana właściwości mieszaniny z (1) obejmuje wzrost pH do wartości, w której aktywowane przeciwciało łatwo reaguje z ureazą, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza . W niektórych aspektach aktywowane przeciwciało łatwo, np. co najmniej 90% lub co najmniej 95% aktywowanego przeciwciała, reaguje z ureazą w (2) w tempie, w którym mieszanina jest zasadniczo wolna od niesprzężonej ureazy około 6 godzin, około 5 godzin, około 4 godzin, około 3 godzin, około 2 godzin lub około 1 godziny po zmianie właściwości mieszaniny.
W niektórych aspektach sposób obejmuje łączenie aktywowanego przeciwciała i ureazy w kwasowym wodnym buforze mającym pH około 6,0-7,0, tak jak około 6,5, doprowadzanie pH do zasadowego pH około 8,0-9,0, tak jak około 8,3, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , i oczyszczanie koniugatu przeciwciało-ureaza poprzez ultradiafiltrację, przy czym sposób nie obejmuje etapu oczyszczania chromatograficznego. W niektórych aspektach wodny bufor ma pH od około 5 do 8. W niektórych aspektach aktywowane przeciwciało i ureazę łączy się w kwasowym wodnym buforze. W niektórych aspektach stosunek aktywowanego przeciwciała i ureazy wynosi od około 3 do około 12. W niektórych aspektach koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 6-15 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 8-11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach środkiem regulującym pH jest środek buforujący lub roztwór buforu, w niektórych aspektach środek regulujący pH zawiera jeden lub większą liczbę spośród kwasu chlorowodorowego, kwasu siarkowego, kwasu azotowego, kwasu borowego, kwasu węglowego, kwasu wodorowęglanowego, kwasu glukonowego, wodorotlenku sodu, wodorotlenku potasu, wodnego amoniaku, kwasu cytrynowego, monoetanoloaminy, kwasu mlekowego, kwasu octowego, kwasu bursztynowego, kwasu fumarowego, kwasu maleinowego, kwasu fosforowego, kwasu metanosulfonowego, kwasu jabłkowego, kwasu propionowego, kwasu trifluorooctowego, ich soli lub ich kombinacji. W niektórych aspektach środek buforujący zawiera jeden lub większą liczbę spośród glicyny, kwasu octowego, kwasu cytrynowego, kwasu borowego, kwasu ftalowego, kwasu fosforowego, kwasu bursztynowego, kwasu mlekowego, kwasu winowego, kwasu węglowego, kwasu chlorowodorowego, wodorotlenku sodu, ich soli lub ich kombinacji. W niektórych aspektach roztwór buforu zawiera jeden lub większą liczbę spośród buforu chlorowodorku glicyny, buforu octanowego, buforu cytrynianowego, buforu mleczanowego, buforu fosforanowego, buforu kwas cytrynowy-fosforan, buforu fosforan-octan-boran, buforu ftalanowego lub ich kombinacji. W niektórych aspektach buforem nie jest bufor fosforanowy. W niektórych aspektach kwasowym buforem jest bufor octanu sodu. W niektórych aspektach pH doprowadza się do zasadowego pH z pomocą sposobu obejmującego dodawanie wodnego zasadowego roztworu, takiego jak roztwór boranu sodu (np. 0,1-5 M lub 1 M). Bez intencji wiązania się teorią bufor octanu sodu ma niską pojemność buforową i jest odpowiedni do doprowadzania pH do 8,3 przez 1 M bufor boranowy, pH 8,5. W niektórych aspektach do doprowadzenia mieszaniny do pH 8-9, np. 8.3, stosuje się bufor Tris-HCl (np. 1 M Tris-HCl).
W niektórych aspektach czas reakcji i stosunek przeciwciało/ureaza utrzymuje się na stałym poziomie. W niektórych aspektach stosunek molowy przeciwciało/ureaza w mieszaninie reakcyjnej wynosi około 25 lub około 21 lub od około 1,8 do 12 przeciwciało/ureaza. W niektórych aspektach stosunek molowy przeciwciało/ureaza doprowadza się do od 4 do 25. W niektórych aspektach stosunek molowy wynosi co najmniej 6.
PL 238 187 B1
W niektórych aspektach nie więcej niż 1% lub 2% nieprzereagowanego przeciwciała występuje w mieszaninie po oczyszczaniu takim jak ultradiafiltracja. W niektórych aspektach można stosować inne sposoby oczyszczania inne niż HPLC. Na przykład dla oczyszczania o niższej wydajności można stosować krystalizację /frakcjonowanie etanolem. W niektórych aspektach masa cząsteczkowa przeciwciała wynosi nie więcej niż 50 kDa, tak jak około 10-20 kDa, lub około 13 kDa, a oczyszczanie stanowi ultradiafiltracja. W niektórych aspektach sposób zapewnia koniugat przeciwciało-ureaza z wydajnością co najmniej około 60% całkowitego białka względem masy, około 70% całkowitego białka względem masy, około 80% całkowitego białka względem masy lub co najmniej 90% całkowitego białka względem masy. Całkowite białko oznacza łączną ilość (masowo) ureazy i przeciwciała AFAIKL2. W niektórych aspektach nie więcej niż 10-20% (względem masy całkowitego białka) niesprzężonego przeciwciała pozostaje w mieszaninie reakcyjnej przed oczyszczaniem.
Niniejsza technologia zapewnia stabilną kompozycję zawierającą aktywowane przeciwciało i ureazę w kwasowym wodnym rozpuszczalniku (jak opisano powyżej) i zasadniczo wolną od koniugatu przeciwciałoureaza , tak jak nie więcej niż około 5%, 4%, 3%, 2% lub 1% koniugatu przeciwciało-ureaza względem masy ureazy. Niniejsza technologia zapewnia stabilną kompozycję zawierającą koniugat przeciwciało-ureaza i zasadniczo wolną od niesprzężonej ureazy, tak jak nie więcej niż około 5%, 4%, 3%, 2% lub 1% ureazy względem masy koniugatu przeciwciało-ureaza w wodnym rozpuszczalniku, przy czym wodny rozpuszczalnik ma pH około 8-9, np. 8,3 (jak opisano powyżej). W niektórych aspektach kompozycja zawierająca koniugat przeciwciało-ureaza dalej zawiera nie więcej niż od około 40 do 60% niesprzężonego przeciwciała względem całkowitego przeciwciała (aktywowanego przeciwciała i nieprzereagowanego przeciwciała). W niektórych aspektach kompozycja zawierająca koniugat przeciwciało-ureaza dalej zawiera nie więcej niż od około 10 do 20% niesprzężonego przeciwciała względem całkowitego białka.
Ponieważ ureaza powoduje uwolnienie amoniaku in vivo, który ma ogólną toksyczność, i sama nie celuje w guzy, obecność niesprzężonej ureazy zwiększa ryzyko występowania ureazy i generowania toksyczności w prawidłowych tkankach. Jednak z powodu wielkości i innych właściwości ureazy koniugacja przeciwciał do ureazy nie skutkuje wystarczającą wielkością lub innymi cechami różnicowymi, by pozwolić na łatwe rozdzielenie koniugatu przeciwciało-ureaza od niesprzężonej ureazy z pomocą sposobów oczyszczania chromatograficznego, szczególnie na dużą skalę.
Niniejsza technologia nieoczekiwanie zapewnia zasadniczo całkowitą koniugację ureazy z przeciwciałami, tak że otrzymany produkt jest zasadniczo wolny od niesprzężonej ureazy bez jakiegokolwiek oczyszczania chromatograficznego. Będąc zasadniczo wolne od ureazy, kompozycje tu opisane dostarczają zasadniczo wszystkie ugrupowania ureazy w kompozycji do miejsca docelowego poprzez podanie ogólnoustrojowe. Docelowe dostarczanie ureazy do miejsca docelowego redukuje lub eliminuje ogólną toksyczność amoniaku wytworzonego przez ureazę i redukuje ilość ureazy, którą należy podać w celu wytworzenia terapeutycznego efektu. Niniejsza technologia jest szczególnie odpowiednia do otrzymywania na dużą skalę, tak jak co najmniej około 1 g, 10 g, 100 g lub 1 kg, koniugatu przeciwciałoureaza, który jest zasadniczo wolny od ureazy, do zastosowań klinicznych, w szczególności do leczenia guzów przerzutowych, które są trudne lub niepraktyczne do leczenia przez lokalne podawanie ureazy.
Niniejsza technologia zapewnia również sposób zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza obejmujący sprzęganie wielu cząsteczek przeciwciała do cząsteczki ureazy, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , przy czym koniugat ma powinowactwo wiązania do antygenu guza co najmniej około 100-krotnie, tak jak około 200-krotnie, około 300-krotnie, około 400-krotnie i około 500-krotnie, wyższe niż niesprzężone przeciwciało. W niektórych aspektach test kompetycyjnego wiązania pokazuje, że powinowactwo wiązania koniugatu przeciwciało-ureaza jest około 100-krotnie, około 200-krotnie, około 300-krotnie, około 400-krotnie i około 500-krotnie wyższe niż to dla natywnego przeciwciała jednodomenowego z powodu zwiększonej awidności. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący około 6 lub więcej ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 8, 9, 10 lub 11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 8, 9, 10 lub 11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy. W niektórych aspektach ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej. W niektórych aspektach przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie. W niektórych aspektach przeciwciałem jest prze
PL 238 187 B1 ciwciało jednodomenowe. W niektórych aspektach antygen guza jest wyrażany przez niedrobnokomórkowego raka płuc. W niektórych aspektach przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6. W niektórych aspektach przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M. W niektórych aspektach koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością Kd nie większą niż około 1 x 10-8 M. W niektórych aspektach koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością Kd nie większą niż około 1 x 10-10 M. W niektórych aspektach koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością IC50 nie większą niż około 5 nM. W niektórych aspektach wartość IC50 wynosi około 3,22 nM. W niektórych aspektach koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50 około 20 μg/ml. CEACAM6, znana również jako nieswoisty antygen reagujący krzyżowo (NCA) lub CD66c, jest dobrze scharakteryzowanym antygenem nowotworowym. Wykazuje wysoką homologię sekwencji z innymi ludzkimi antygenami rakowopłodowymi, takimi jak CEACAM1, CEACAM7 i CEACAM8. Jest białkiem powierzchniowym komórki związanym z glikozylofosfoinozytolem (GPI), ale bez znanej domeny cytoplazmatycznej. Ekspresja CEACAM6 jest istotnie podwyższona w tkankach nowotworu sutka, trzustki, jajnika, płuca i okrężnicy.
Formulacje kompozycji
Kompozycje według niniejszej technologii zawierają koniugat przeciwciało-ureaza zasadniczo wolny od ureazy i opcjonalnie wolny od niewodnych rozpuszczalników HPLC. W niektórych aspektach kompozycją jest farmaceutycznie dopuszczalna kompozycja. Kompozycja może dalej zawierać biokompatybilny farmaceutyczny nośnik, adiuwant lub substancję nośną. W niektórych aspektach kompozycja jest w postaci stałej. W niektórych aspektach kompozycja jest w wodnym roztworze zawierającym około 0,1-10 mg/ml, około 0,55 mg/ml, około 1-5 mg/ml lub około 1,5-2,0 mg/ml koniugatu. W niektórych aspektach wodny roztwór dalej zawiera rozczynnik, taki jak jeden lub większą liczbę spośród histydyny, sacharozy i EDTA. W niektórych aspektach wodny roztwór zawiera około 1-20 mM, tak jak 10 mM, histydynę, około 0,1-5 m/v%, tak jak 1 m/v%, sacharozę, około 0,1-0,5 mM, tak jak 0,2 mM, EDTA. W niektórych aspektach wodny roztwór ma pH od około 6,5 do 7, tak jak około 6,8. W niektórych aspektach wodny roztwór nie zawiera fosforanu. W niektórych aspektach kompozycja jest postacią stałą uzyskiwaną poprzez liofilizację wodnego roztworu. W niektórych aspektach postać stała nie zawiera fosforanu.
Kompozycja może również obejmować inne sekwencje nukleotydowe, polipeptydy, leki lub hormony zmieszane z rozczynnikiem(-ami) lub innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Kompozycje inne niż kompozycje farmaceutyczne opcjonalnie zawierają ciecz, tj. wodę lub ciecz na bazie wody.
Farmaceutycznie dopuszczalne rozczynniki do dodania do kompozycji farmaceutycznych również są dobrze znane znawcom dziedziny i są łatwo dostępne. Wybór rozczynnika będzie częściowo zależeć od określonego sposobu stosowanego do podawania produktu. Odpowiednio istnieje wiele różnych odpowiednich formulacji do stosowania w kontekście niniejszej technologii.
Techniki do formulacji i podawania kompozycji farmaceutycznych można znaleźć w Remington’s Pharmaceutical Sciences, wyd. 19-te, wyd. 19-te Williams & Wilkins, 1995, i są one dobrze znane znawcom dziedziny. Wybór rozczynnika będzie częściowo zależeć od określonego sposobu stosowanego do podawania produktu według niniejszej technologii. Odpowiednio istnieje wiele różnych odpowiednich formulacji do stosowania w kontekście niniejszej technologii. Poniższe sposoby i rozczynniki są wyłącznie przykładowe i w żaden sposób nie są ograniczające.
Kompozycje farmaceutyczne według niniejszej technologii można wytwarzać z zastosowaniem dowolnego konwencjonalnego sposobu, np. sposobów mieszania, rozpuszczania, granulowania, proszkowania, emulgowania, kapsułkowania, pułapkowania, przędzenia ze stopu, suszenia rozpryskowego lub liofilizowania. Jednak optymalna farmaceutyczna formulacja zostanie określona przez znawcę dziedziny w zależności od drogi podawania i pożądanego dawkowania. Takie formulacje mogą wpływać na stan fizyczny, stabilność, tempo uwalniania in vivo i tempo klirensu in vivo podanego środka.
Kompozycje farmaceutyczne formułuje się tak, by zawierały odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i mogą one opcjonalnie zawierać rozczynniki i środki pomocnicze, które wspomagają przetwarzanie związków aktywnych do preparatów, które można stosować farmaceutycznie. Sposób podawania na ogół będzie określać naturę nośnika. Na przykład formulacje do podawania pozajelitowego mogą zawierać wodne roztwory związków aktywnych w postaci rozpuszczalnej w wodzie. Nośniki odpowiednie do podawania pozajelitowego można wybierać spośród soli fizjologicznej, buforowanej soli fizjologicznej, dekstrozy, wody i innych fizjologicznie kompatybilnych roztworów. Korzystnymi nośnikami do podawania pozajelitowego są fizjologicznie kompatybilne bufory, takie jak roztwór Hanka, roztwory Ringera lub fizjologicznie buforowana sól fizjologiczna. Dla podawania tkankowego lub komórkowego w formulacji stosuje się penetranty właściwe dla określonej bariery do przejścia. Takie penetranty są ogólnie znane w dziedzinie. Dla preparatów zawierających białka formulacja może obejmować materiały
PL 238 187 B1 stabilizujące, takie jak poliole (np. sacharoza) i/lub surfaktanty (np. niejonowe surfaktanty) i tym podobne.
Alternatywnie formulacje do stosowania pozajelitowego mogą zawierać zawiesiny związków aktywnych otrzymanych jako właściwe olejowe zawiesiny do iniekcji. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub substancje nośne obejmują tłuszcze ciekłe, takie jak olej sezamowy, i syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, takie jak oleinian etylu lub triglicerydy, lub liposomy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny, takie jak karboksymetyloceluloza sodowa, sorbitol lub dekstran. Opcjonalnie zawiesina może również zawierać odpowiednie stabilizatory lub środki, które zwiększają rozpuszczalność związków, by umożliwić wytwarzanie wysoko stężonych roztworów. Można również stosować emulsje, np. dyspersje olej w wodzie i woda w oleju, opcjonalnie stabilizowane środkiem emulgującym lub środkiem dyspergującym (materiały powierzchniowo czynne; surfaktanty). Do podawania pozajelitowego można również wykorzystywać liposomy, jak opisano powyżej, zawierające środek aktywny.
Alternatywnie, stosując farmaceutycznie dopuszczalne nośniki znane w dziedzinie, można formułować kompozycje farmaceutyczne zawierające środek w dawkowaniach odpowiednich do podawania doustnego. Preparaty formułowane do podawania doustnego mogą być w postaci tabletek, pigułek, kapsułek, kapsułek z opłatka, pastylek, cieczy, żeli,syropów, papek, zawiesin lub proszków. Dla zilustrowania preparaty farmaceutyczne do zastosowania doustnego można uzyskiwać poprzez łączenie związków aktywnych ze stałym rozczynnikiem, opcjonalnie przez rozdrabnianie otrzymanej mieszaniny i przetwarzanie mieszaniny granulek po dodaniu odpowiednich środków pomocniczych, jeśli to pożądane, w wyniku czego uzyskuje się tabletki. W formulacjach doustnych można wykorzystywać ciekłe nośniki podobne pod względem rodzaju do tych opisanych dla zastosowania pozajelitowego, np. buforowane wodne roztwory, zawiesiny i tym podobne.
Preparaty te mogą zawierać jeden lub większą liczbę rozczynników, które obejmują, w sposób nieograniczający: a) rozcieńczalniki, takie jak cukry, w tym laktoza, dekstroza, sacharoza, mannitol lub sorbitol; b) spoiwa, takie jak krzemian magnezowo-glinowy, skrobia z kukurydzy, pszenica, ryż, ziemniaki itd.; c) materiały celulozowe, takie jak metyloceluloza, hydroksypropylometyloceluloza i karboksymetyloceluloza sodowa, poliwinylopirolidon, gumy, takie jak guma arabska i guma tragakantowa i białka, takie jak żelatyna i kolagen; d) środki rozsadzające lub zwiększające rozpuszczalność, takie jak usieciowany poliwinylopirolidon, skrobie, agar, kwas alginowy lub jego sól, taka jak alginian sodu; lub kompozycje musujące; e) środki poślizgowe, takie jak krzemionka, talk, kwas stearynowy lub jego sól magnezowa lub wapniowa i glikol polietylenowy; f) środki smakowe i słodziki; g) barwniki lub pigmenty, np. w celu identyfikacji produktu lub scharakteryzowania ilości (dawkowania) środka aktywnego; i h) inne składniki, takie jak środki konserwujące, stabilizatory, środki spęczniające, środki emulgujące, środki promujące roztwarzanie, sole do regulowania ciśnienia osmotycznego i bufory.
Kompozycję farmaceutyczną można zapewniać jako sól środka aktywnego, którą można otrzymywać z wieloma kwasami, wliczając, w sposób nieograniczający, chlorowodorowy, siarkowy, octowy, mlekowy, winowy, jabłkowy, bursztynowy itd. Sole są zwykle bardziej rozpuszczalne w wodnych lub innych protonowych rozpuszczalnikach niż odpowiadające postacie wolnych zasad.
Charakterystyka samego koniugatu i formulacji koniugatu może wpływać na stan fizyczny, stabilność, tempo uwalniania in vivo i tempo klirensu in vivo podanego koniugatu. Takie farmakokinetyczne i farmakodynamiczne informacje można zbierać z przedklinicznych badań in vitro i in vivo, później potwierdzonych na ludziach w trakcie przebiegu badań klinicznych. Wytyczne do przeprowadzania badań klinicznych na ludziach w oparciu o dane in vivo od zwierząt można uzyskiwać z wielu źródeł, w tym np. http://www.clinicaltrials.gov.
Zatem dla dowolnego związku stosowanego w sposobie opisanym w niniejszej technologii terapeutycznie skuteczną dawkę dla ssaków, szczególnie ludzi, można wstępnie oszacować z testów biochemicznych i/lub opartych na komórkach. Następnie dawkowanie można formułować w modelach zwierzęcych dla osiągnięcia pożądanego zakresu stężenia krążącego, który moduluje aktywność koniugatu. Po przeprowadzeniu badań na ludziach pojawią się dalsze informacje dotyczące właściwych poziomów dawkowania i trwania leczenia różnych chorób i stanów.
Toksyczność i skuteczność terapeutyczną koniugatu można oznaczać z pomocą standardowych procedur farmaceutycznych na hodowlach komórkowych lub zwierzętach doświadczalnych, np. w celu oznaczenia LD50 (dawki letalnej dla 50% populacji) i ED50 (dawki terapeutycznie skutecznej u 50% populacji).
PL 238 187 B1
Dodatkowe środki aktywne
W kompozycję według niniejszej technologii można również włączać dodatkowe środki aktywne. Dodatkowe środki aktywne, np. środek przeciwnowotworowy (środek aktywny przeciw proliferującym komórkom), można wykorzystywać w kompozycji przed, jednocześnie lub po kontaktowaniu komórek z pierwszym środkiem aktywnym. Na przykład po skierowaniu ureazy na komórki guza może ona mieć zdolność modulowania lub regulowania zewnętrznego środowiska guza, np. poprzez zmiany pH. Środki aktywne, takie jak środki przeciwnowotworowe, które sprzyjają środowisku zasadowemu będą zatem bardziej skuteczne.
W określonych aspektach substraty, które mogą być enzymatycznie przetwarzane przez ureazę, rozważa się do stosowania jako środki aktywne. W niektórych aspektach środkiem aktywnym jest substrat, który może być wykorzystany przez ureazę, w wyniku czego tworzą się jony amoniaku, np. mocznik.
Przykładowe środki przeciwnowotworowe obejmują cytokiny i inne ugrupowania, takie jak interleukiny (np. IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 i tym podobne), transformujący czynnik wzrostu beta, limfotoksynę, czynnik martwicy nowotworu, interferony (np. interferon gamma), czynniki stymulujące tworzenie kolonii (np. GM-CSF, M-CSF i tym podobne), czynnik przepuszczalności naczyń, promotory lektynowej odpowiedzi zapalnej (selektyny), takie jak L-selektyna, E-selektyna, P-selektyna, i ugrupowania pochodzenia białkowego, takie jak Clq i białko receptora NK. Dodatkowe odpowiednie środki przeciwnowotworowe obejmują związki, które hamują angiogenezę, a więc hamują przerzuty. Przykłady takich środków obejmują protaminę, medroksyprogesteron, polisiarczan pentozanu, suraminę, taksol, talidomid, angiostatynę, interferon-alfa, inhibitory metaloproteinaz, czynnik płytkowy 4, somatostatynę, tromobospondynę. Inne reprezentatywne i nieograniczające przykłady środków aktywnych przydatnych według niniejszej technologii obejmują winkrystynę, winblastynę, windezynę, busulfan, chlorambucyl, spiroplatynę, cisplatynę, karboplatynę, metotreksat, adriamycynę, mitomycynę, bleomycynę, arabinozyd cytozyny, arabinozyd adeniny, merkaptopurynę, mitotan, prokarbazynę, daktynomycynę (aktynomycynę D), daunorubicynę, chlorowodorek doksorubicyny, taksol, plikamycynę, aminoglutetymid, estramustynę, flutamid, leuprolid, octan megestrolu, tamoksyfen, testolakton, trilostan, amsakrynę (m-AMSA), asparaginazę (Lasparaginazy), etopozyd, produkty z krwi, takie jak hematoporfiryny lub pochodne powyższych. Inne przykłady środków aktywnych obejmują materiał genetyczny, taki jak kwasy nukleinowe, RNA i DNA pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, w tym rekombinowany RNA i DNA. DNA kodujący określone białka można stosować w leczeniu wielu różnych rodzajów chorób. Na przykład geny czynnika martwicy nowotworu lub interleukiny-2 można zapewniać do leczenia zaawansowanych nowotworów; geny kinazy tymidynowej można zapewniać do leczenia nowotworu jajnika lub guzów mózgu; a geny interleukiny-2 można zapewniać do leczenia nerwiaka, czerniaka złośliwego lub nowotworu nerki. Dodatkowe środki aktywne rozważane do stosowania w niniejszej technologii opisano w Patencie USA nr 6,261,537, który w całości włączono tu jako odniesienie. Przeglądu środków przeciwnowotworowych i sposobów badań przesiewowych do wykrywania takich środków dokonano w Monga, M. i Sausville, E.A. (2002) Leukemia 16(4):520-6.
W niektórych aspektach środkiem aktywnym jest słabo zasadowy związek przeciwnowotworowy, którego skuteczność jest redukowana przez gradient pH wyższego wewnątrzkomórkowo/niższego zewnątrzkomórkowo w guzie litym. Przykładowe słabo zasadowe związki przeciwnowotworowe obejmują doksorubicynę, daunorubicynę, mitoksantron, epirubicynę, mitomycynę, bleomycynę, alkaloidy barwinka, takie jak winblastyna i winkrystyna, środki alkilujące, takie jak cyklofosfamid i chlorowodorek mechloretaminy, i przeciwneoplastyczne pochodne purynowe i pirymidynowe.
W niektórych aspektach kompozycja obejmuje ureazę i zasadniczo nie ma żadnych cytokin, np. czynnika martwicy nowotworu i/lub interferonów. W tym aspekcie sama ureaza, lub ze środkami aktywnymi innymi niż cytokiny, w kombinacji z drobnocząsteczkowymi środkami przeciwnowotworowymi jest skuteczna w hamowaniu wzrostu komórek nowotworowych. Zatem w tym aspekcie kompozycja może, ale nie musi, działać wspólnie z endogennymi lub natywnymi cytokinami występującymi u leczonego osobnika, ale podawana kompozycja nie zawiera dodatkowych, egzogennych cytokin.
W niektórych aspektach dodatkowym środkiem aktywnym nie jest pemetreksed i/lub karboplatyna. W niektórych aspektach dodatkowym środkiem aktywnym nie jest antymetabolit folianu i/lub środek oparty o platynę.
PL 238 187 B1
Sposoby dostarczania i podawania
Kompozycję koniugatu przeciwciało-ureaza można dostarczać do komórek nowotworowych z pomocą kilku sposobów znanych w dziedzinie. W zastosowaniach terapeutycznych kompozycję podaje się pacjentowi mającemu komórki nowotworowe w ilości wystarczającej do hamowania wzrostu komórki(-ek) nowotworowej (-ych). Komórki nowotworowe można wystawiać na działanie kompozycji farmaceutycznych poprzez podawanie z pomocą kilku dróg, wliczając, w sposób nieograniczający, pozajelitową, dojelitową, przeznabłonkową, przezśluzówkową, przezskórną i/lub operacyjną.
Sposoby podawania pozajelitowego obejmują takie, w których kompozycję podaje się na przykład przez iniekcje dożylne, dotętnicze, dootrzewnowe, doszpikowe, domięśniowe, dostawowe, dooponowe i dokomorowe, igłowe iniekcje w bolusie podskórne, do gonad lub do guza, lub wydłużone ciągłe, pulsacyjne lub planowane perfuzje lub mikrowlewy z zastosowaniem właściwej technologii pompowania. Sposoby podawania dojelitowego obejmują na przykład podawanie doustne (w tym podpoliczkowe i podjęzykowe) i doodbytnicze. Sposoby podawania przeznabłonkowego obejmują na przykład podawanie przezśluzówkowe i podawanie przezskórne. Podawanie przezśluzówkowe obejmuje na przykład podawanie dojelitowe, jak również podawanie donosowe, inhalację i głębokie dopłucne, podawanie dopochwowe i podawanie doodbytnicze. Podawanie przezskórne obejmuje bierne lub aktywne sposoby przezskórne lub transdermalne, wliczając na przykład plastry i urządzenia do jontoforezy, jak również miejscową aplikację past, balsamów lub maści. Techniki operacyjnie obejmują wszczepienie depotu (rezerwuaru) kompozycji, pomp osmotycznych i tym podobnych.
Pojedyncze lub wielokrotne podawanie środka aktywnego można podawać w zależności od dawkowania i częstości wymaganej i tolerowanej przez osobnika. W każdym przypadku kompozycja powinna zapewniać wystarczającą ilość środka aktywnego, by skutecznie leczyć osobnika.
W niektórych aspektach w niniejszej technologii rozważa się zastosowanie substancji nośnych, takich jak liposomy i/lub nanokapsułki, jako jednostek chemicznych do dostarczenia kompozycji farmaceutycznej zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza do komórek nowotworowych. Takie formulacje mogą być korzystne do wprowadzania farmaceutycznie dopuszczalnych formulacji polipeptydów, środków farmaceutycznych i/lub przeciwciał tu ujawnionych. Otrzymywanie i stosowania liposomów jest na ogół znane znawcom dziedziny. (Patrz np. Backer, M.V., et al. (2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7). W korzystnym aspekcie ujawnioną kompozycję można zamykać w liposomie.
W nanokapsułkach na ogół można zamykać związki w sposób stabilny i powtarzalny (Whelan, J. (2001) Drug Discov Today 6(23): 1183-84). By uniknąć działań niepożądanych z powodu wewnątrzkomórkowego przeładowania polimerami, takie ultradrobne cząstki (o wielkości około 0,1 μm) można opracować z zastosowaniem polimerów zdolnych do ulegania degradacji in vivo. Do stosowania w niniejszej technologii rozważa się biodegradowalne nanocząstki poliizobutylocyjanoakrylanu i takie cząstki można łatwo wytwarzać, jak opisano np. w Lambert, G., et al. (2001) Int J Pharm 214(1-2): 13-6. Sposoby otrzymywania nanocząstek polialkilocyjanoakrylanu zawierających biologicznie aktywne substancje i ich zastosowanie opisano w Pat. USA nr 4,329,332, 4,489,055 i 4,913,908. Nanokapsułki są dostępne handlowo ze źródeł takich jak Capsulution, Inc. (www.capsulution.com).
Nanokapsułki zawierające kompozycje farmaceutyczne do dostarczania kompozycji opisano w Pat. USA nr 5,500,224, 5,620,708 i 6,514,481. W Pat. USA nr 5,500,224 opisano kompozycję farmaceutyczną w postaci koloidalnej zawiesiny nanokapsułek zawierającej fazę olejową, składającą się zasadniczo z oleju zawierającego rozpuszczony w nim surfaktant, i zawieszonych w niej wielu nanokapsułek mających średnicę poniżej 500 nanometrów. W Pat. USA nr 5,620,708 opisano kompozycje i sposoby podawania leków i innych środków aktywnych. Kompozycje zawierają cząstkę nośnika środka aktywnego przyłączoną do ugrupowania wiążącego, które wiąże się swoiście do cząsteczki docelowej występującej na powierzchni ssaczego enterocytu. Ugrupowanie wiążące wiąże się do cząsteczki docelowej z powinowactwem wiązania lub awidnością wystarczającą do inicjacji endocytozy lub fagocytozy nośnika środka aktywnego w postaci cząstek stałych, tak że nośnik zostanie zaabsorbowany przez enterocyt. Środek aktywny zostanie następnie uwolniony z nośnika do krążenia ustrojowego gospodarza. W ten sposób można w jelitach uniknąć degradacji leków wrażliwych na degradację, takich jak polipeptydy, przy jednoczesnym wzroście absorpcji białek i polipeptydów z przewodu pokarmowego. Alternatywnie w niniejszej technologii rozważa się uwalnianie środka aktywnego w środowisku otaczającym komórkę docelową. Na przykład w jednym z aspektów koniugaty przeciwciało-ureaza są uwalniane z nanokapsułki po związaniu się ugrupowania wiążącego do komórki docelowej, tak że ureaza jest uwalniana do mikrośrodowiska otaczającego komórkę docelową, np. komórkę guza. W Pat. USA
PL 238 187 B1 nr 6,379,683 i 6,303,150 opisano sposoby wytwarzania nanokapsułek i ich zastosowanie i włączono je tu jako odniesienie.
Stosowaną kompozycję farmaceutyczną podaje się osobnikowi w skutecznej ilości. Na ogół skuteczną ilością jest ilość skuteczna do (1) redukcji objawów choroby, którą chce się leczyć; lub (2) indukcji farmakologicznej zmiany istotnej w leczeniu choroby, którą chce się leczyć. W przypadku nowotworu skuteczna ilość może obejmować ilość skuteczną do: redukcji wielkości guza; spowolnienia wzrostu guza; zapobiegania lub hamowania przerzutów; lub zwiększenia długości życia u chorego osobnika. Kontaktowanie obejmuje dodawanie do komórek koniugatu zawierającego ugrupowanie kierujące i pierwszego tworzącego spiralę peptydu charakteryzującego się wybranym ładunkiem i zdolnością do oddziaływania z drugim, naładowanym przeciwnie tworzącym spiralę peptydem, w wyniku czego tworzy się stabilny α-helikalny dwuskrętny heterodimer. Następnie do komórek dodaje się liposom. Liposom zawiera zewnętrzną powierzchnię i wewnętrzny kompartment; środek aktywny, np. ureazę, umieszczony w obrębie wewnętrznego kompartmentu liposomu; i wiele drugich peptydów, przy czym każdy drugi peptyd jest połączony z zewnętrzną powierzchnią liposomu.
W niektórych aspektach kontaktowanie obejmuje dodawanie liposomów do komórek, przy czym liposomy mają środek aktywny, np. koniugaty przeciwciało-ureaza , w postaci zamkniętej, a zewnętrzne powierzchnie liposomu obejmują ugrupowanie kierujące do komórki skuteczne do swoistego wiązania powierzchni docelowej i hydrofilową powłokę polimerową skuteczną do ochrony ugrupowania kierującego przed oddziaływaniem z powierzchnią docelową. Hydrofilowa powłoka polimerowa może być wytworzona z łańcuchów polimerowych, które są kowalencyjnie przyłączone do powierzchniowych komponentów lipidowych w liposomach przez rozłączalne wiązania. W niektórych aspektach do komórek guza dodaje się środek rozłączający w ilości skutecznej do spowodowania rozłączenia zasadniczej porcji wiązań w dodanych liposomach, wystawiając w ten sposób powierzchnię docelową na działanie ugrupowania kierującego. Rozłączalnymi wiązaniami mogą być redukowalne wiązania chemiczne, takie jak wiązania disiarczkowe, estrowe i peptydowe.
W niektórych aspektach rozważa się sposób terapii opartej na liposomach dla ssaczych osobników. Sposób obejmuje ogólnoustrojowe podawanie osobnikowi, np. podawanie dożylne, liposomów mających ugrupowanie kierujące związane z powierzchnią i hydrofilową powłokę polimerową. Hydrofilowa powłoka polimerowa, składająca się z rozłączalnie przyłączonych łańcuchów polimerowych, jest skuteczna do ochrony ugrupowania kierującego przed oddziaływaniem z jego celem. Podanym liposomom umożliwia się krążenie ogólnoustrojowe, dopóki nie osiągnie się pożądanej biodystrybucji liposomów. Środek rozłączający podaje się osobnikowi w ilości skutecznej do spowodowania cięcia zasadniczej porcji, np. większej niż około 50%, korzystniej większej niż około 70%, a korzystniej większej niż około 90%, rozłączalnych wiązań w podanych liposomach. Po rozłączeniu hydrofilowego łańcucha polimerowego ugrupowanie kierujące jest wystawione na oddziaływanie ze swoim celem.
W niektórych aspektach liposomy stosuje się w leczeniu guza litego. Liposomy obejmują koniugat przeciwciało-ureaza i opcjonalnie dodatkowy środek aktywny, np. lek przeciwnowotworowy, w zamkniętej postaci i są kierujące w region guza poprzez ugrupowanie kierujące skuteczne w swoistym wiązaniu się do antygenu swoistego względem guza. W przykładowym sposobie liposomy są kierujące do komórek śródbłonka naczyń guza poprzez włączenie do liposomów liganda VEGF dla selektywnego przyłączenia do receptorów Flk-1,2 wyrażanych na proliferujących komórkach śródbłonka guza (Niederman, T.M., et al. (2002) Proc Natl Aced Sci 99(10):7009-14).
W niektórych aspektach liposomy mają wielkość między około 30-400 nm. Liposomy w tym zakresie wielkości wykazały zdolność do wnikania do guzów przez „przerwy” występujące w wyściółce komórek śródbłonka w naczyniowym systemie guza (Maruyama, K, et al. (1999) Adv Drug Deliv Rev 40(1-2):89-102).
Po podaniu liposomów, np. podaniu dożylnym, i po upływie wystarczającego czasu, by umożliwić liposomom dystrybucję u osobnika i wiązanie do guza, osobnikowi podaje się środek rozłączający w celu rozłączenia hydrofilowej powłoki powierzchniowej od liposomów. Rozłączenie powłoki powierzchniowej jest skuteczne w ekspozycji ugrupowania kierującego, by umożliwić wiązanie liposomów do komórek docelowych. W jednym z aspektów hydrofilowa powłoka powierzchniowa jest przyłączona do liposomów poprzez wiązania wrażliwe na pH. Wiązania są rozłączane po wiązaniu liposomów do guza.
Liposomy w dowolnym z aspektów opisanych powyżej mogą opcjonalnie obejmować jeden lub większą liczbę zamkniętych leków przeciwnowotworowych lub środków obrazujących lub obu. Liposomy
PL 238 187 B1 można dodawać i umożliwiać i dystrybucję, po której można podawać środek rozłączający w celu rozłączenia hydrofitowej powłoki powierzchniowej dla ekspozycji przyłączonego ugrupowania kierującego i inicjacji wiązania. Liposomy można otrzymywać i podawać, jak opisano w Patencie USA nr 6,043,094, który włączono tu jako odniesienie.
W niniejszej technologii można wykorzystywać dodatkowe środki dostarczania, takie jak małe liposomy jednowarstwowe (SUV), jak opisano w Patencie USA nr 6,180,114, który w całości włączono tu jako odniesienie.
Znawca dziedziny zrozumie, że występują określone regiony, które nie są silnie unaczynione lub które są chronione przez komórki złączone ścisłymi połączeniami i/lub mechanizmami transportu aktywnego, co redukuje lub zapobiega wniknięciu makrocząsteczek obecnych w krwiobiegu. Zatem na przykład podawanie ogólnoustrojowych środków terapeutycznych do leczenia glejaka lub innych nowotworów mózgu może być ograniczone barierą krew-mózg, która chroni przed wniknięciem makrocząsteczek do przestrzeni podpajęczynówkowej. W przypadku guzów tego rodzaju kompozycję terapeutyczną można korzystnie podawać bezpośrednio do miejsca guza. Zatem na przykład guzy mózgu można leczyć poprzez podawanie kompozycji terapeutycznej bezpośrednio do miejsca guza, np. przez iniekcję w bolusie, mikrowlew lub operacyjnie wszczepiony cewnik.
Dawkowanie
W ujawnionym sposobie można stosować dowolny skuteczny schemat podawania regulujący czas i sekwencję dawek. Przykładowe poziomy dawkowania dla osobnika ludzkiego będą zależeć od trybu podawania, zakresu (wielkości i dystrybucji) guza, rozmiaru pacjenta i reaktywności nowotworu na leczenie ureazą.
Gdy podaje się kompozycję koniugatu przeciwciało-ureaza , na przykład bezpośrednio wstrzykuje się do guza, przykładowa dawka wynosi od około 0,1 do 1,00010 μg/kg masy ciała, tak jak od około 0,2 do 5 μg/kg, lub od około 0,5 do 2 μg/kg. Umieszczeniem igły iniekcyjnej można kierować z pomocą konwencjonalnych technik naprowadzania z podglądem, np. fluoroskopii, tak że lekarz może widzieć pozycję igły względem tkanki docelowej. Takie narzędzia do naprowadzania mogą obejmować ultradźwięki, fluoroskopię, CT lub MRI.
W niektórych aspektach skuteczność lub dystrybucję podanej dawki koniugatów przeciwciałoureaza można monitorować podczas lub po podaniu koniugatu przeciwciało-ureaza do guza poprzez monitorowanie tkanki guza z pomocą narzędzia zdolnego do wykrywania zmian w pH w obrębie regionu tkanki nowotworowej u osobnika. Takie narzędzia mogą obejmować sondę pH, którą można wprowadzać bezpośrednio do guza, lub narzędzie do wizualizacji, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), tomografia komputerowa (CT) lub fluoroskopia. Badanie MRI można przeprowadzać przy braku dodatkowych środków obrazujących, po prostu w oparciu o różnice we właściwościach magnetycznych tkanki jako funkcji pH. CT lub obrazowanie fluoroskopowe mogą wymagać dodatkowego środka obrazującego wrażliwego na pH, którego nieprzeźroczystość zależy od pH środowiska tkanki. Takie środki są dobrze znane znawcom dziedziny.
Przed podaniem koniugatów przeciwciało-ureaza tkankę guza można wizualizować dzięki jej niskiemu pH względem otaczającej tkanki prawidłowej. Zatem tkanka prawidłowa może mieć prawidłowe pH wynoszące około 7,2, podczas gdy tkanka guza może mieć pH o 0,1 do 0,4 lub więcej jednostek niższe. Czyli przed wstrzyknięciem koniugatu przeciwciało-ureaza zakres tkanki guza można określać dzięki jej niższemu pH. Po podaniu ureazy pH regionu guza mającego ureazę zacznie wzrastać i może być identyfikowane poprzez porównanie otrzymanych obrazów ze wcześniejszymi obrazami przed dawkowaniem.
Badając w ten sposób tkankę, można monitorować stopień zmiany pH i zakres chorej tkanki. Na podstawie tego badania lekarz może podać dodatkową kompozycję w miejsce i/lub może podać kompozycję w dodatkowe obszary w obrębie miejsca guza. Procedurę tę można powtarzać, dopóki nie osiągnie się zmian pH w pożądanym stopniu, np. o 0,2 do 0,4 jednostki pH, w całym regionie guza litego.
Dawkowanie, takie jak bezpośrednia iniekcja, można powtarzać w odpowiednich odstępach, np. co tydzień lub dwa razy w tygodniu, dopóki nie zaobserwuje się pożądanego punktu końcowego, korzystnie zasadniczej lub całkowitej regresji masy guza. Skuteczność leczenia można monitorować, jak powyżej, dzięki wizualizacji zmian w pH leczonej tkanki podczas przebiegu leczenia. Zatem przed każdą dodatkową iniekcją pH tkanki można wizualizować w celu określenia bieżącego obecnego zakresu guza, po czym zmiany w pH tkanki można stosować do monitorowania podawania nowej dawki kompozycji przeciwciało-ureaza do tkanki.
PL 238 187 B1
Gdy kompozycję przeciwciało-ureaza podaje się pozajelitowo z pomocą sposobu innego niż bezpośrednia iniekcja, przykładowa dawka kompozycji przeciwciało-ureaza wynosi 100 100 000 jednostek międzynarodowych/kg aktywności ureazy/kg masy ciała osobnika. Jak tu podano, kompozycja przeciwciało-ureaza w tym sposobie obejmuje przeciwciało do kierowania ureazy do komórek nowotworowych, np. na miejsce guza litego, lub do maskowania ureazy, np. w postaci liposomalnej, selektywnie w miejscu guza.
Do monitorowania skuteczności podawanej dawki można stosować techniki obrazowania, które są wrażliwe na zmiany pH tkanki. Ponieważ takie kierowanie może trwać kilka godzin lub więcej, sposób może obejmować monitorowanie pH guza, jak powyżej, przed iniekcją kompozycji przeciwciało-ureaza i kilka godzin po dawkowaniu, np. 12-24 godziny, w celu potwierdzenia, że miejsce guza otrzymało właściwą dawkę, o czym świadczyłby wzrost pH w regionie guza. W zależności od wyników tego badania sposób może dyktować dodatkowe dawkowanie, dopóki nie zaobserwuje się wzrostu pH, np. o 0,20,4 jednostki pH. Po ustaleniu tej dawki pacjenta można leczyć podobną dawką kompozycji ureazy regularnie, np. raz lub dwa razy w tygodniu, dopóki nie osiągnie się zmiany w wielkości lub stanie guza.
Końcowy schemat dawkowania zostanie określony przez lekarza prowadzącego zgodnie z dobrą praktyką medyczną, biorąc pod uwagę różne czynniki, które modyfikują działanie leków, np. specyficzną aktywność środka, zaawansowanie stanu choroby, reaktywność pacjenta, wiek, stan, masę ciała, płeć i dietę pacjenta, zaawansowanie jakiejkolwiek infekcji i tym podobne. Dodatkowe czynniki, które można brać pod uwagę obejmują czas i częstość podawania, kombinację(-e) leków, objawy nadwrażliwości i tolerancję/odpowiedź na terapię. Dalsze udoskonalanie dawkowania właściwego w leczeniu obejmującym dowolną z formulacji tu wymienionych jest przeprowadzane rutynowo przez znawcę, szczególnie w świetle ujawnionych informacji o dawkowaniu i testach, jak również farmakokinetycznych danych obserwowanych w badaniach klinicznych. Właściwe dawkowania można sprawdzić przez zastosowanie ustalonych testów do oznaczania stężenia środka w płynie ustrojowym lub innej próbce razem z danymi odpowiedzi na dawkę.
Częstość dawkowania będzie zależeć od farmakokinetycznych parametrów środka i drogi podawania. Dawkowanie i podawanie dostosowuje się tak, by zapewniały wystarczające poziomy środka aktywnego lub utrzymywały pożądany efekt. Odpowiednio kompozycje farmaceutyczne można podawać w pojedynczej dawce, wielu osobnych dawkach, ciągłym wlewie, depotach o przedłużonym uwalnianiu lub ich kombinacjach, jak jest to wymagane do utrzymania pożądanego minimalnego poziomu środka.
Krótko działające kompozycje farmaceutyczne (tj. o krótkim okresie półtrwania) można podawać raz dziennie lub więcej niż raz dziennie (np. dwa, trzy lub cztery razy dziennie). Długo działające kompozycje farmaceutyczne można podawać do 3 do 4 dni, co tydzień lub raz na dwa tygodnie. Pompami do ciągłego wlewu są takie jak podskórna, dootrzewnowa lub podtwardówkowa.
Kompozycje zawierające koniugat w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku można otrzymywać, umieszczać we właściwym pojemniku i oznakować dla leczenia wskazanego stanu. Stany wskazane na etykiecie mogą obejmować, ale w sposób nieograniczający, leczenie różnych rodzajów nowotworów. Rozważa się również zestawy, jak opisano poniżej, przy czym zestaw zawiera postać dawkowania kompozycji farmaceutycznej i ulotkę dołączoną do opakowania zawierającą instrukcję stosowania kompozycji w leczeniu stanu medycznego.
Na ogół kompozycje koniugatu podaje się osobnikowi w skutecznej ilości. Na ogół skuteczną ilością jest ilość skuteczna do (1) redukcji objawów choroby, którą chce się leczyć; lub (2) indukcji farmakologicznej zmiany istotnej w leczeniu choroby, którą chce się leczyć. W przypadku nowotworu skuteczna ilość może obejmować ilość skuteczną do: redukcji wielkości guza; spowolnienia wzrostu guza; zapobiegania lub hamowania przerzutów; lub zwiększenia długości życia u dotkniętego osobnika.
Sposób leczenia
Niniejsza technologia zapewnia sposób leczenia nowotworu u osobnika obejmujący podawanie osobnikowi terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji tu zapewnionej, w wyniku czego leczy się nowotwór u osobnika. Nowotwory odpowiednie do leczenia z pomocą niniejszych sposobów obejmują ogólnie raki, białaczki, chłoniaki i mięsaki. Raki mogą dotyczyć odbytu, dróg żółciowych, pęcherza moczowego, sutka, okrężnicy, odbytnicy, płuca, części ustnej gardła, części krtaniowej gardła, przełyku, żołądka, trzustki, wątroby, nerki, pęcherzyka żółciowego i przewodów żółciowych, jelita cienkiego, dróg moczowych, jajnika, okrężnicy, niedrobnokomórkowego raka płuc, dróg płciowych, gruczołów endokrynnych, tarczycy i skóry. Inne odpowiednie nowotwory obejmują rakowiaki, guzy podścieliska przewodu
PL 238 187 B1 pokarmowego, guzy głowy i szyi, guzy pierwotne, naczyniaki, czerniaki, międzybłoniaka złośliwego, szpiczaka mnogiego i guzy mózgu, nerwów, oczu i opon mózgowych.
W niektórych aspektach nowotwory do leczenia tworzą guzy lite, tak jak raki, mięsaki, czerniaki i chłoniaki. W niektórych aspektach nowotworem jest jeden lub większa liczba spośród niedrobnokomórkowego raka płuc, nowotworu sutka, trzustki, jajnika, płuc, okrężnicy lub ich kombinacja. W niektórych aspektach nowotworem jest niedrobnokomórkowy rak płuc. W niektórych aspektach osobnikiem jest człowiek.
Terapeutycznie skuteczną dawkę można oszacować z pomocą sposobów dobrze znanych w dziedzinie. Zwierzęce modele nowotworów, takie jak immunokompetentne myszy z mysimi guzami lub myszy z upośledzoną odpornością (np. nagie myszy) z ksenograftami ludzkich guzów, są dobrze znane w dziedzinie i szeroko opisane w wielu odniesieniach włączonych tu jako odniesienie. Taką informację stosuje się w połączeniu z badaniami bezpieczeństwa na szczurach, psach i/lub naczelnych innych niż człowiek w celu oznaczenia bezpieczeństwa i potencjalnie przydatnych wstępnych dawek dla ludzi. Dodatkowe informacje dla oszacowania dawki dla organizmu mogą pochodzić z badań na rzeczywistym nowotworze ludzkim, przeprowadzonych badaniach klinicznych.
W niektórych aspektach sposób leczenia nowotworu w zamierzeniu obejmuje wyleczenie, jak również złagodzenie co najmniej jednego objawu nowotworu. Pacjenci nowotworowi są leczeni, gdy pacjent zostaje wyleczony z nowotworu, nowotwór ulega remisji, przeżycie wydłuża się w statystycznie istotny sposób, czas do progresji guza zwiększa się w statystycznie istotny sposób, występuje redukcja w limfocytarnym i hematopoetycznym obciążeniu guzem na podstawie standardowych kryteriów ustalonych dla każdego rodzaju złośliwej zmiany limfocytarnej i hematopoetycznej lub obciążenie guzem litym spada, jak zdefiniowano w kryteriach oceny odpowiedzi na leczenie w przypadku guzów litych (RECIST 1.0 lub RECIST 1.1, Therasse et al. J Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216, 2000 i Eisenhauer et al. Eur. J. Cancer 45:228-247, 2009). Jak się tu stosuje, „remisja” odnosi się do braku wzrostu komórek nowotworowych u pacjenta, u którego wcześniej stwierdzono nowotwór. Zatem pacjent nowotworowy w remisji jest wyleczony ze swojego nowotworu lub nowotwór jest obecny, ale nie jest łatwo wykrywalny. Zatem nowotwór może być w remisji, gdy guz nie może powiększać się lub przerzutować. Całkowita remisja, jak się tu stosuje, oznacza brak choroby, jak wskazuje się z pomocą sposobów diagnostycznych, takich jak obrazowanie, takich jak prześwietlenie rentgenowskie, MRI, CT i PET, badanie krwi lub biopsja szpiku kostnego. Gdy u pacjenta nowotworowego występuje remisja, może po niej nastąpić nawrót, kiedy nowotwór pojawia się ponownie.
W niektórych aspektach leczenie nie jest skojarzone z pemetreksedem i/lub karboplatyną. W niektórych aspektach leczenie nie jest skojarzone z antymetabolitem folianu i/lub środkiem opartym na platynie.
Zestawy
W niektórych aspektach niniejsza technologia zapewnia zestawy do hamowania wzrostu komórek guza z zastosowaniem sposobów tu opisanych. Zestawy obejmują pojemnik zawierający jeden lub większą liczbę środków aktywnych. Zestawy mogą dodatkowo obejmować dowolny z innych komponentów tu opisanych do praktykowania opisanych sposobów realizacji niniejszej technologii.
Zestawy mogą opcjonalnie obejmować materiały instruktażowe zawierające wskazówki (tj. protokoły) ujawniające zastosowanie środków aktywnych do hamowania wzrostu komórek guza. Zatem w jednym z aspektów zestaw obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą środek aktywny, korzystnie enzym ureazę, i materiały instruktażowe informujące o podawaniu kompozycji osobnikowi do leczenia nowotworu u osobnika. W jednym z aspektów materiały instruktażowe informują o podawaniu kompozycji ureazy osobnikowi w ilości, która zależy od wielkości guza i wynosi między 0,1 do 100 międzynarodowych jednostek aktywności ureazy na mm3 guza, gdy kompozycję podaje się przez bezpośrednią iniekcję do guza, i w ilości między 100-100 000 międzynarodowych jednostek aktywności ureazy/kg masy ciała osobnika, gdy kompozycję podaje się osobnikowi pozajelitowo inaczej niż przez bezpośrednią iniekcję do guza.
W kolejnym aspekcie materiały instruktażowe informują o podawaniu kompozycji ureazy osobnikowi, który również otrzymuje słabo zasadowy związek przeciwnowotworowy, którego skuteczność jest zredukowana przez gradient pH wyższego wewnątrzkomórkowo/niższego zewnątrzkomórkowo w guzie litym, w ilości ureazy skutecznej dla redukcji lub odwrócenia gradientu pH wyższego wewnątrzkomórkowo/niższego zewnątrzkomórkowo w guzie litym.
Alternatywnie materiały instruktażowe informują o podawaniu kompozycji ureazy osobnikowi mającemu guz lity, lub podejrzanemu o jego posiadanie, w warunkach skutecznych dla lokalizacji ureazy
PL 238 187 B1 w guzie litym u osobnika, badaniu osobnika z pomocą narzędzia diagnostycznego zdolnego do wykrywania zmian w zewnątrzkomórkowym pH w tkance osobnika i identyfikowaniu regionu tkanki u osobnika, która wykazuje wzrost zewnątrzkomórkowego pH po wymienionym podaniu.
Podczas gdy materiały instruktażowe zwykle zawierają materiały napisane lub wydrukowane, nie ograniczają się do nich. W niniejszej technologii rozważa się dowolny nośnik zdolny do przechowywania takich instrukcji i przekazywania ich użytkownikowi końcowemu. Takie nośniki obejmują, ale w sposób nieograniczający, elektroniczne nośniki pamięci (np. dyski magnetyczne, taśmy, kasety, chipy), nośniki optyczne (np. CD ROM) i tym podobne. Takie nośniki mogą również obejmować adresy do stron internetowych, które zapewniają takie materiały instruktażowe.
PRZYKŁADY
Poniższe przykłady podano w celu zilustrowania różnych aspektów ujawnienia. W zamierzeniu w żaden sposób nie ograniczają one ujawnienia. Znawca dziedziny doceni, że ujawnienie jest dobrze dostosowane do przeprowadzania celów i uzyskiwania wymienionych efektów końcowych i zalet, jak również jakichkolwiek celów, efektów końcowych i zalet tu włączonych. Niniejsze przykłady (razem ze sposobami tu opisanymi) są obecnie reprezentatywne dla korzystnych aspektów. Są one przykładowe i w zamierzeniu nie stanowią ograniczeń zakresu ujawnienia. Zmiany i inne zastosowania, które są objęte ideą ujawnienia, jak zdefiniowano w zakresie zastrzeżeń, będą oczywiste dla znawców dziedziny.
P r z y k ł a d 1: L-DOS47: Koniugat przeciwciało-ureaza kierujący (celowany) do guzów wyrażających CEACAM6
Mikrośrodowisko guzów często jest kwasowe względem tkanki prawidłowej. Bezpośrednią przyczyną wydaje się być akumulacja mleczanu z beztlenowej glikolizy w odpowiedzi na regionalne niedotlenienie przez nieprawidłowe unaczynienie (1, 2). Jednak komórki nowotworowe kontynuują beztlenowe metabolizowanie glukozy nawet w obecności tlenu (3). To sugeruje fenotyp o odwróconym metabolizmie i, skutkując kwasowym środowiskiem, może zapewniać korzyść dla wzrostu komórek nowotworowych (4).
Wykazano, że ureaza z kanawalii mieczokształtnej, która przekształca mocznik w amoniak i zwiększa pH roztworu, jest cytotoksyczna dla komórek nowotworowych (8). Iniekcja enzymu do guza u myszy z ludzkimi ksenograftami dla sutka i płuca również znacznie opóźniała wzrost guza (8). Jednak dostarczanie środków terapeutycznych przeciw nowotworom do guza w warunkach klinicznych stanowi trudną praktykę. U pacjentów z zaawansowaną i znacznie przerzutową chorobą iniekcja do guza nie jest wykonalną opcją. Bardziej praktycznym podejściem jest podawanie enzymu przez iniekcję dożylną. Jednak ureazie brakuje kierującej (ang. targeting) domeny i ogólnoustrojowe dostarczanie enzymu może powodować toksyczność poza celem. Do dostarczania ureazy do miejsc nowotworu stosuje się koniugat przeciwciało-enzym, który celuje swoiście w guzy. To przeciwciało stosowane w koniugacie rozpoznaje swoiście CEACAM6 u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc.
Fragment przeciwciała jednodomenowego wielbłądowatych (AFAIKL2, SEQ ID NO. 1), który rozpoznaje CEACAM6 na komórkach gruczolakoraka płuc (17) wybrano do koniugacji z ureazą z kanawalii mieczokształtnej (DOS47) w celu wytworzenia środka terapeutycznego przeciw nowotworom. W niniejszej technologii opisano niektóre ze stosownych badań przedklinicznych, które przeprowadzono na tym koniugacie anty-CEACAM6-ureaza (L-DOS47), który jest obecnie w fazie I badań klinicznych na ludziach.
Przeciwnowotworową aktywność ureazy z kanawalii mieczokształtnej połączono ze swoistością jednodomenowego przeciwciała anty-CEACAM6 w postaci koniugatu przeciwciało-ureaza (L-DOS47). L-DOS47 wiązał się swoiście do linii komórek nowotworowych wyrażających CEACAM6 i wywoływał silne efekty cytotoksyczne. Test kompetycyjnego wiązania wykazał, że powinowactwo wiązania LDOS47 było około 500-krotnie silniejsze niż to dla natywnego przeciwciała jednodomenowego z powodu zwiększonej awidności. Cytotoksyczność L-DOS47 zależy od dostępności mocznika in situ i podatności komórek docelowych na toksyczność amoniaku. Komórki BxPC-3 były chronione przed efektami LDOS47 przez wyłączenie genu CEACAM6, podczas gdy nadekspresja CEACAM6 powodowała u transfekowanych komórek H23 podatność na cytotoksyczność L-DOS47. Immunochemiczne barwienie ludzkich prawidłowych i nowotworowych tkanek wykazało, że L-DOS47 wiązał się preferencyjnie do gruczolakoraka płuc, jak również do gruczolakoraka okrężnicy i trzustki z dodatnim, ale słabszym wybarwieniem. Badanie przerzutów komórek gruczolakoraka płuc A549 u myszy również wykazało, że L-DOS47 był skuteczny w redukcji zliczeń komórek nowotworowych w płucu przy stężeniu 10 μg/ml.
PL 238 187 B1
Materiały. Ureazę z kanawalii mieczokształtnej (Canavalia ensiformis) uzyskano od BioVectra Inc. (PEI, Kanada) i dalej oczyszczano przez wytrącanie kwasem, frakcjonowanie alkoholem i chromatografię jonowymienną. Czystość enzymu wynosiła >97%, jak oznaczono z pomocą SDS-PAGE, HPLC i spektrometrii mas. Jedną jednostkę ureazy definiuje się jako wytworzenie 1 μmol/minutę amoniaku w 25°C i pH 7,6.
Do identyfikacji przeciwciała jednodomenowego (sdAb) zastosowano bibliotekę fagową pochodzącą z repertuaru łańcuchów ciężkich przeciwciał lamy poprzez panning względem niedrobnokomórkowego gruczolakoraka płuc A549. sdAb oznaczono jako AFAI (17). Sekwencję genu AFAI optymalizowano pod kątem koniugacji i zmieniono nazwę na AFAIKL2. Przeciwciało AFAIKL2 następnie klonowano i wyrażano w systemie E. coli BL21 (DE3) pT7-7. Przeciwciało oczyszczano z ciałek inkluzyjnych z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej. Koniugację przeciwciała do ureazy przeprowadzano z zastosowaniem heterobifunkcyjnego środka sieciującego N-sukcynoimidylo(4-jodoacetylo)aminobenzoesanu (SIAB). Przeciwciało AFAIKL2 najpierw aktywowano porcją estru NHS łącznika SIAB przez pierwszorzędowe grupy aminowe. Aktywowane przeciwciało wiązało się do ureazy przez grupę jodoacetylową środka sieciującego do grup sulfhydrylowych występujących na enzymie. Docelowy stosunek koniugacji (1:6 do 1:10, stosunek ureazy do przeciwciała) kontrolowano poprzez mieszanie ureazy o wysokiej czystości i aktywowanego przeciwciała w stosunku masowym 2:1. Koniugat przeciwciało-ureaza oczyszczano poprzez ultrafiltrację.
Mocznik, trypsynę (klasy do hodowli tkankowej), etosiarczan fenazyny (PES), nitroprusydek sodu, roztwór podchlorynu sodu, fenolu, NaCl, KH2PO4, MgSO4, NaHCOs i aldehyd glutarowy zakupiono od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium (MTS) i trypsynę (do stosowania we fragmentacji peptydów i analizie spektrometrii mas) zakupiono od Promega Corp. (Madison, WI). Nadtlenek wodoru (30%), SIAB, KCl, D-glukozę, HCl, Na2HPO4 i NaH2PO4 zakupiono od Fisher Scientific (Ottawa, ON). Frakcję albuminy surowicy bydlęcej V (BSA) zakupiono od Roche (Indianapolis, IN). Chlorek amonu (0,100 M) zakupiono od Ricca Chemical (Arlington, TX). Koniugat anty-AFAIKL2-peroksydaza zakupiono od Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Pożywkę do hodowli komórkowej (RPMI), płodową surowicę bydlęcą i antybiotyki uzyskano od Life Technologies (Burlington, ON). Samice CrTac:NCr-Foxn1nu nagich myszy zostały dostarczone przez Taconic (Hudson, NY). Modyfikowany bufor Krebsa-Ringera (KRB) stosowany w doświadczeniach zawierał NaCl (98,3 mM), KCl (4,73 mM), KH2P04 (1,19 mM), MgSO4 (1,19 mM), Dglukozę (11,7 mM), Na2HPO4 (11,1 mM) i NaH2PO4 (2,77 mM), pH 7,2.
Test z indofenolem
Ilość amoniaku wytworzonego na drodze reakcji enzymatycznej ureazy oznaczono z zastosowaniem modyfikowanego testu z indofenolem (18). W skrócie Roztwór A świeżo otrzymano poprzez rozpuszczenie 165 mg fenolu i 132 mg peletek NaOH w 10 ml wody, po czym nastąpiło dodanie 66 μl roztworu nitroprusydku sodu (10 mg/ml). Roztwór B otrzymano poprzez dodanie 40 μl podchlorynu sodu do 5 ml wody. Roztwory próbek (30 μl każda) z testu wiązania na całych komórkach (patrz poniżej) przeniesiono na nową 96-dołkową płytkę zawierającą 50 μl/dołek 5 N NaOH:H2O (3,3:46,7) i 20 μl/dołek wody. Dodano Roztwór A (50 μl/dołek) i Roztwór B (50 μl/dołek) i płytki przeniesiono następnie do czytnika mikropłytek na wywołanie koloru w 37°C przez 30 minut. OD mierzono przy 630 nm. Ilość amoniaku wytworzonego w dołkach obliczano z krzywej wzorcowej z zastosowaniem chlorku amonu jako wzorców (od 0 do 150 μM).
Test wiązania L-DOS47 na całych komórkach
Monowarstwy komórek otrzymano poprzez wysianie 100 μl/dołek komórek guza (4x104 komórek/dołek) w 96-dołkowych płytkach hodowlanych i inkubowanie przez noc w 37°C. Pożywkę usunięto z płytek, a monowarstwy komórek utrwalano 100 μl/dołek 0,05% aldehydu glutarowego (w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej, PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Płytki następnie przemyto PBS i dodano 120 μl/dołek roztworu glicyny (50 mM) i inkubowano w 37°C przez 20 minut. Po inkubacji płytki blokowano 120 μl/dołek 1% BSA/PBS w 37°C przez 30 minut. Następnie płytki przemywano 3-krotnie Buforem A (0,05% BSA w PBS) i dodano 80 μl/dołek rozcieńczonych roztworów LDOS47 lub DOS47 i inkubowano w 37°C przez 1,5 godziny. Sygnał wiązania był generowany z pomocą sposobu z mocznikiem lub przeciwciałem: (1) W podejściu z mocznikiem płytki przemywano 4-krotnie Buforem A i dodano 80 μl/dołek 20 mM mocznika (otrzymanego w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,6) i inkubowano w 37°C przez 30 minut. Po inkubacji dodano 40 μl/dołek 1 N HCl w celu zatrzymania reakcji. Ilość amoniaku wytworzonego w każdym dołku oznaczono z zastosowaniem testu z indofenolem. (2) W sposobie z przeciwciałem endogenną peroksydazę najpierw wygaszano 100 μl/dołek 0,3%
PL 238 187 B1 nadtlenku wodoru przez 30 minut przed etapem blokowania. Po inkubacji z przedmiotami badania płytki przemyto PBS i otrzymano rozcieńczony koniugat przeciwciała anty-AFAIKL2-peroksydaza (1:8000) w Buforze A zawierającym 0,05% Tween-20 i 0,1% sproszkowane mleko. Płytki przemywano 3-krotnie Buforem A i do płytek dodano 100 μl/dołek koniugatu przeciwciało-peroksydaza. Po inkubacji w 37°C przez 1 godzinę płytki 3-krotnie przemyto Buforem A. Substrat peroksydazy otrzymano jako 1 mM w buforze cytrynianu sodu zawierającym 0,03% H2O2 i dodano 100 μΙ/dołek roztworu substratu i inkubowano w RT przez 30 minut. Płytki przeniesiono do czytnika mikropłytek w celu pomiaru OD przy 405 nm.
Test cytotoksyczności L-DOS47
Monowarstwy komórek otrzymano poprzez wysianie 100 μl/dołek komórek nowotworowych (4x104 komórek/dołek) w 96-dołkowych płytkach hodowlanych i inkubowano przez noc w 37°C. Pożywkę usunięto z każdego dołka i dodano 80 μl/dołek L-DOS47 lub DOS47 i dalej inkubowano w 37°C przez 2 godziny. Po inkubacji płytki 3-krotnie przemywano Buforem A. Następnie do płytek dodano 100 μl/dołek mocznika (20 mM) w KRB i inkubowano je w 37°C przez noc. Pożywkę usunięto i zastąpiono 100 μl/dołek zwykłej pożywki. Żywotność komórek oznaczano z zastosowaniem testu żywotności komórek MTS, w którym otrzymano mieszaninę MTS/roztworu PES (20:1 obj./obj.; MTS, 2 mg/ml; PES, 1 mg/ml) i do płytek dodano 20 μl/dołek mieszaniny. Płytki następnie inkubowano w 37°C przez 1-2 godziny i OD mierzono przy 630 nm ze wzorcem przy 490 nm.
Test wiązania z zastosowaniem elektrochemiluminescencji (ECL) oparty na komórkach
L-DOS47, przeciwciało AFAIKL2 i DOS47 wyznakowano rutenem-estrem NHS (Sulfo-Tag, Meso Scale Discovery MSD; Rockville, MD) według instrukcji producenta. Te białka tagowane rutenem pozwoliły na bezpośredni pomiar wiązania L-DOS47 i AFAIKL2 do docelowego antygenu. Do testu bezpośredniego wiązania otrzymano monowarstwę komórek BxPC-3 na 96-dołkowej płytce SECTOR PR High-Bind (MSD). Po utrwaleniu i blokowaniu dodawano różne ilości L-DOS47-tag lub AFAIKL2-tag. Płytkę inkubowano w 37°C przez 1,5 godziny. Po inkubacji płytkę przemywano dwukrotnie i wypełniono Read Buffer (MSD). Sygnał ECL następnie natychmiast odczytano z zastosowaniem czytnika SECTOR PR-100 (MSD). W teście wiązania kompetycyjnego do hamowania wiązania L-DOS47-tag do komórek BxPC-3 stosowano L-DOS47 lub przeciwciało AFAIKL2. Do wiązania do komórek BxPC-3 zastosowano 1 μg/ml L-DOS47-tag. Do konkurowania z wiązaniem tagowanego L-DOS47 zastosowano różne stężenia kompetytorów (L-DOS47 lub AFAIKL2). Po inkubacji płytkę przemywano dwukrotnie i wypełniono Read Buffer. Płytkę następnie natychmiast odczytano z zastosowaniem czytnika SECTOR PR-100.
Wyciszenie genu CEACAM6 w komórkach BxPC-3
W celu potwierdzenia, że CEACAM6 jest swoistym antygenem rozpoznawanym przez L-DOS47 gen CEACAM6 w dodatniej linii komórek BxPC-3 wyłączono z zastosowaniem klonów ekspresyjnych o strukturze spinki do włosów HuSH-29 od OriGene (Rockville, MD). Plazmidy te transkrybują sekwencje krótkiego RNA o strukturze spinki do włosów (shRNA), który blokuje transkrypcję genu docelowego przez interferencję RNA. Komórkę BxPC transfekowano plazmidami HuSH i stabilnie transfekowane komórki selekcjonowano z zastosowaniem puromycyny. Uzyskano różne klony z transfekcji HuSH6 (AAGGCGAAAGAGTGGATGGCAACAGTCTA (SEQ ID NO: 5)), HuSH7 (AAGAAGCAACCGGACAGTTCCATGTATAC (SEQ ID NO: 6)) i plazmidem kontrolnym HuSH-TRS. Dwie dodatnie stabilne linie komórkowe (HUSH#6 i HUSH#7) i kontrolę uzyskano poprzez selekcję antybiotykową. Klony te następnie stosowano do sprawdzenia wiązania L-DOS47 z zastosowaniem testu wiązania na całych komórkach. Po inkubacji z L-DOS47 płytki przemyto 3-krotnie Buforem A i dodano 80 μl/dołek 20 mM mocznika (otrzymanego w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,6). Płytki inkubowano w 37°C przez 30 minut. Reakcję enzymatyczną zatrzymano poprzez dodanie 40 μl/dołek 1 N HCl. Ilość wytworzonego amoniaku oznaczono z zastosowaniem testu z indofenolem.
Transfekcja komórek H23 genem CEACAM6
Ssaczy wektor ekspresyjny zawierający marker selekcyjny G418 klonowano z PMP-GFP (białkiem błony komórkowej-białkiem zielonej fluorescencji) i genami CEACAM6. Do transfekcji komórek H23 wektorem ekspresyjnym zastosowano odczynnik Cellfectin (Life Technologies). W skrócie 2x106 komórek/dołek komórek H23 w 2 ml kompletnej pożywki RPMI (zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny) wysiano na 6-dołkową płytkę hodowlaną i inkubowano w 37°C przez noc. Odczynnik Cellfectin (10 μl) i DNA (1-2 μl) rozcieńczono odpowiednio w 100 μl pożywce RPMI wolnej od surowicy. Dwa rozcieńczone roztwory następnie połączono, delikatnie mieszano i inkubowano w RT przez 30 minut. Płytki przemyto dwukrotnie 1,5 ml pożywką RPMI wolną od surowicy. Połączony roztwór rozcieńczono w 0,8 ml pożywki RPMI wolnej od surowicy, delikatnie mieszano i dodano do komórek. Komórki inkubowano w 37°C w inkubatorze CO2 przez noc. Następnego
PL 238 187 B1 dnia pożywkę zastąpiono 2 ml kompletnej pożywki RPMI. Transfekowane komórki wyrażały GFP wspólnie z tego samego mRNA co CEACAM6. Transfekowane komórki selekcjonowano poprzez inkubację w pożywce zawierającej 400 μg/ml antybiotyku G418. Komórki sortowano bezpośrednio lub po inkubacji z L-DOS47 wyznakowanym cy5.5, co wskazuje na powierzchniową ekspresję CEACAM6.
Immunochemiczne barwienie ludzkich tkanek guza przez L-DOS47
Badaniu przesiewowemu poddano łącznie 400 próbek tkanek reprezentujących 42 nowotworowe i prawidłowe tkanki (Axel Wellmann, University Hospital Aachen, RWTH Aachen, Niemcy). Preparaty najpierw inkubowano w suchym piecu w 62°C przez 1 godzinę w pionowym ustawieniu w celu usunięcia parafiny. Następnie preparaty odwoskowywano w substytucie ksylenu przez 5x4 minuty. Preparaty odwadniano w 100%, 95% i 75% etanolu po 2x3 minuty każdy, a następnie zanurzono w wodzie wodociągowej na 5 minut. Endogenną peroksydazę wygaszano 0,3% H2O2 przez 30 minut. Do wykrywania wiązania L-DOS47 na preparatach zastosowano zestaw Vectastain Elite ABC Kit (Vector Labs, Burlington, ON). W skrócie po przemywaniu w PBS po 3x5 minut preparaty inkubowano w surowicy blokującej w 4°C przez noc. Preparaty następnie inkubowano w roztworze L-DOS47 (20 μg/ml w Buforze A) w 37°C przez 1,5 godziny. Po przemyciu PBS preparaty inkubowano z mysim przeciwciałem anty-ureaza (Sigma, 1:1500) w 37°C przez 1 godzinę. Po przemyciu PBS preparaty inkubowano z roztworem biotynylowanego drugorzędowego przeciwciała (Vector Labs) przez 30 minut. Po przemyciu PBS preparaty inkubowano z odczynnikiem Vectastain Elite ABC przez 30 minut. Po przemyciu PBS preparaty inkubowano w świeżym miksie roztworu substratu peroksydazy DAB (3,3’-diaminobenzydyny) (Vector Labs) w RT przez 2 minuty. Reakcję zatrzymano poprzez przemywanie w wodzie wodociągowej przez 5 minut. Preparaty następnie barwiono kontrastowo w hematoksylinie Mayera przez 10 s. Preparaty odwodniono w 75%, 80%, 95% i 100% etanolu. Po oczyszczaniu w ksylenie na preparaty nałożono Clarion Mounting Medium.
Badanie przerzutów A549
Komórki nowotworowe A549 (5x106) wysiano i hodowano na płytkach hodowlanych o niskim wiązaniu. Gdy uzyskano wystarczające ilości, komórki zbierano i ponownie zawieszano w pożywce hodowlanej w stężeniu 5x106 komórek/ml. Komórki następnie umieszczono na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych o niskim wiązaniu przy 1 ml/dołek. Następnie do każdego dołka dodano L-DOS47 (1 ml) w stężeniu końcowym 10 lub 15 μg/ml. Izotypową kontrolę traktowano 10 μg/ml koniugatu V21DOS47 (koniugatu przeciwciało-ureaza kierującego na receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)). Komórki inkubowano w 37°C przez 4 godziny. Po inkubacji komórki odwirowano i przemyto 3-krotnie sterylną PBS i ponownie zawieszono do 1x107 komórek/ml w sterylnej PBS. Każda mysz następnie otrzymała pojedynczą inokulację 1x106 traktowanych komórek. To badanie składało się z 4 grup samic myszy CrTac:NCr-Foxn1nu (nietraktowane, dla izotypu i L-DOS47 (10 i 15 μg/ml)). Łącznie czterdzieści myszy (10 na każdą grupę) inokulowano komórkami nowotworowymi A549 dożylnie przez żyłę ogonową.
Pięć zwierząt na grupę uśmiercono w Dniu 22 (3 tygodnie), podczas gdy pozostałe zwierzęta utrzymywano do Dnia 71 (10 tygodni). Po uśmierceniu zwierzętom wstrzykiwano dotchawicznie tusz (Calvert Labs; Olyphant, PA); następnie wycinano płuca i następnie utrwalano w roztworze Feketego (Calvert Labs). Wpływ przedmiotu badania na przerzuty guza oznaczano poprzez zliczanie liczby guzów przerzutowych (ognisk) w każdym płucu pod mikroskopem dysekcyjnym. Reprezentatywne płuca z każdej grupy sfotografowano.
Wiązanie L-DOS47 do różnych linii komórek nowotworowych
Różne profile wiązania L-DOS47 obserwowano w pięciu liniach komórek nowotworowych -BxPC3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T i MDA-MB231 (Fig. 1A). Wyniki pokazały, że L-DOS47 wiązał się dobrze do dwóch linii komórek trzustki (BxPC-3 i Capan-1) i sutka (ZR-75-30), wskazując na ekspresję antygenu CEACAM6 na powierzchni komórek. Umiarkowane wiązanie obserwowano również w linii komórek okrężnicy LS174T, ale żadnego wiązania nie stwierdzono w linii komórek sutka MDA-MB231 (kontrola negatywna). Przeciwciało AFAIKL2, gdy sprzężone z enzymem ureazą, zapewniało swoiste kierowanie do komórek wyrażających CEACAM6. Zostało to potwierdzone przez brak sygnału wiązania w komórkach traktowanych DOS47 (dane nieprzedstawione).
Cytotoksyczność L-DOS47
Figura 1B pokazuje, że zarówno BxPC-3, jak i ZR-75-30 są podatne na cytotoksyczność LDOS47. W tych dwóch liniach komórkowych traktowanych mniej niż 1 μg/ml L-DOS47 zaobserwowano nagły spadek przeżywalności komórek. Umiarkowane efekty zaobserwowano w komórkach Capan-1 i LS174T L-DOS47 nie ma żadnego wpływu na kontrolę negatywną, linię komórkową MDA-MB231. Listę
PL238 187 Β1 wyników wiązania i cytotoksyczności z większej liczby linii komórkowych przedstawiono w Tabeli 1. Cytotoksyczność L-DOS47 zależy bezpośrednio od aktywności wiązania L-DOS47 na odpowiadających liniach komórkowych. Słabsza odpowiedź cytotoksyczna A549 i Capan-1 jest spowodowana większą tolerancją tych dwóch linii komórkowych na toksyczność amoniaku (dane nieprzedstawione). Z drugiej strony komórki H23 są wysoce wrażliwe na amoniak (dane nieprzedstawione). Pomimo braku antygenu CEACAM6 na powierzchni komórkowej komórki H23 nadal wykazują pewną słabą odpowiedź cytotoksyczną na L-DOS47, prawdopodobnie z powodu obecności nieswoiście związanego L-DOS47 w dołkach.
T a b e I a 1. Podsumowanie wyników uzyskanych z różnych badań wiązania i cytotoksyczności L-DOS47 na dziewięciu ludzkich liniach komórek guzów
Linie komórkowe Test wiązania Test cytotoksyczności
MDA-MB231 Gruczolakorak sutka - -
MCF-7 Rak sutka - -
ZR-75-30 Rak przewodowy sutka 4-4-4- +4-+
LS174T Gruczolakorak okrężnicy +4- +4-
A549 Gruczolakorak płuc +4- +
H23 Gruczolakorak płuc - +
BxPC-3 Gruczolakorak trzustki +++ +++
Capan-1 Gruczolakorak trzustki +++ +4-
MIA PaCa-2 Rak trzustki + +
Gdzie: +, dodatni (liczba + wskazuje na siłę aktywności); -, ujemny
Pięć linii komórkowych (BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30, LS174T i A549) z czterech ludzkich tkanek wykazywało silne wiązanie L-DOS47 i dobrą podatność na cytotoksyczność L-DOS47 (poza A549), jak przedstawiono w Tabeli 1. Efekty cytotoksyczne L-DOS47 bardziej lub mniej zależą od względnej siły wiązania do komórek nowotworowych. Wyniki na wykresach reprezentują średnią (n=3) z reprezentatywnych doświadczeń. Odchylenie standardowe (SD) wynosiło poniżej 10% dla wszystkich wartości.
Wiązanie bezpośrednie i kompetycyjne L-DOS47 do komórek BxPC-3
Test wiązania z zastosowaniem elektrochemiluminescencji oparty na komórkach pozwala na bezpośrednie wykrywanie koniugatu przeciwciała wyznakowanego rutenem związanego z komórkami nowotworowymi. Na podstawie Figury 2A stwierdzono, że zarówno L-DOS47 tagowany rutenem, jak i przeciwciało AFAIKL2 wiąże się do komórek BxPC-3, natomiast DOS47 wyznakowana rutenem funkcjonowała jako kontrola negatywna. L-DOS47 wykazał znacznie większe powinowactwo wiązania niż przeciwciało AFAIKL2 z powodu większej awidności przeciwciał (6-10 przeciwciał) obecnych w LDOS47. Wynik dalej potwierdzono z zastosowaniem L-DOS47 i przeciwciała AFAIKL2 jako kompetytorów do hamowania wiązania L-DOS47 tagowanego rutenem do komórek BxPC-3 (Fig. 2B). Zarówno LDOS47, jak i przeciwciało AFAIKL2 hamowało wiązanie L-DOS47 tagowanego rutenem do BxPC-3 i, jak oczekiwano, L-DOS47 wykazywał lepsze powinowactwo wiązania, a zatem silniejsze hamowanie wiązania L-DOS47 tagowanego rutenem do komórek BxPC-3 niż przeciwciało AFAIKL2. Widoczne powinowactwa wiązania przeciwciała L-DOS47 i AFAIKL2 można porównać z pomocą IC50 (ilości kompetytora wymaganej do wywołania 50% spadku w wiązaniu) przedmiotów badania. IC50 L-DOS47 i przeciwciała AFAIKL2 oszacowano odpowiednio na 2 i 20 μg/ml; lub 3,22 nM dla L-DOS47 (MW=622k dla stosunku koniugacji 6 przeciwciał do 1 ureazy) i 1,55 μΜ dla AFAIKL2 (MW=12,9k). Wyniki sugerowały, że powinowactwo wiązania L-DOS47 stanowi około 500-krotność tego dla przeciwciała AFAIKL2.
PL238 187 Β1
Nadeskpresja w komórkach H23 transfekowanych genem CEACAM6
Po transfekcji genem CEACAM6 zidentyfikowano dodatni klon H23-CC6 #7. Klony z poziomem CEACAM6 bliższym do tego w komórkach A549 uzyskano poprzez ponowne sortowanie klonu H23CC6 #7 z L-DOS47-cy5.5. Dalsza inkubacja klonu z większą ilością antybiotyku G418 (800 μg/ml) pomogła w selekcji tego z wyższym poziomem ekspresji CEACAM6. Chociaż H23-CC6 #7wyrażał mniej CEACAM6 na powierzchni komórki niż komórki A549 i BxPC-3, ten transfekowany CEACAM6 klon był jeszcze bardziej podatny niż komórki BxPC-3 na cytotoksyczność L-DOS47 (Fig. 3B) z powodu jego wysokiej podatności na toksyczność amoniaku (dane nieprzedstawione).
Wyciszenie genu CEACAM6 w komórkach BxPC-3
Wiązanie L-DOS47 do dwóch klonów z wyciszonym CEACAM6 (HUSH#6 i HUSH #7) było znacznie zredukowane w porównaniu z tym w komórkach natywnych BxPC-3 i klonie kontrolnym (HUSH-TR3) (Fig. 3C). Doświadczenie wyraźnie pokazało, że obecność CEACAM6 na powierzchni komórkowej była istotna dla wiązania L-DOS47. Wyłączenie genu zasadniczo zredukowało wiązanie L-DOS47.
Immunochemiczne barwienie ludzkich tkanek guza z pomocą L-DOS47
Badanie przesiewowe prawidłowych i nowotworowych tkanek wykazało, że L-DOS47 rozpoznawał prawie wyłącznie podtyp gruczolakoraka (Tabela 2). Z ponad 400 przebadanych próbek tkankowych, które reprezentują 42 grupy składające się z różnych nowotworowych i dobranych prawidłowych tkanek, tkanki gruczolakoraka płuca wykazywało znaczące barwienie z ponad 80% rozpoznanych komórek. Odpowiadające dobrane względem wieku prawidłowe tkanki płuca były ujemne z odrobiną ogniskowego barwienia w kilku aktywowanych pneumocytach. Innymi tkankami, które wykazywały pewne dodatnie, chociaż słabe barwienie, były gruczolakorak okrężnicy i trzustki. Figura 4 przedstawia immunochemiczne barwienie gruczolakoraka okrężnicy i płuc z L-DOS47.
T a b e I a 2. Badanie przesiewowe ludzkich prawidłowych i nowotworowych tkanek pod kątem wiązania LDOS47
Próbki Tkanka guza Dobrana względem wieku tkanka prawidłowa
Dodatnie Ujemne Ujemne
Rak nerki 12/12 12/12
Gruczolak przytarczyc 1/1 nd.
Łożysko, pępowina, omocznia nd. 1/1
Guz miofibroblastyczny 1/1 nd.
Rak gruczołu krokowego 4/4 4/4
Rak tarczycy 2/2 2/2
Gruczolakorak trzustki 7/57 słabe 8/57 b. słabe 42/57 25/25
Guzy neuroendokrynne 9/9 nd.
Mózg, mięsień sercowy, jądro, śledziona nd. 30/30
Jądro - potwomiak i nasieniak 3/3 3/3
Guz ślinianki przyusznej 1/1 1/1
PL238 187 Β1
Rak płaskonabłonkowy szyj ki macicy 2/2 nd.
Grasiczak 2/2 nd.
Gruczolakorak okrężnicy 14/24 słabe 10/24 24/24
- przerzuty do węzłów chłonnych 3/3
Gruczolakorak sutka 13/13 13/13
- przerzuty do węzłów chłonnych 2/2
Mięśniak gładkokomórkowy przerzuty do płuca 1/1 nd.
Rak jajnika 4/4 nd.
Rak pęcherza 42/42 36/36
- przerzuty do węzłów chłonnych 1/1 silne
- przerzuty raka płaskonabłonkowego 2/2
Płuco - rak drobnokomórkowy 1/1 5/5
- gruczolakorak 5/5 silne
Gmczolakorak żołądka 3/3 3/3
Rak wątroby 4/4 4/4
Guzy tkanek miękkich 3/3 nd.
Czerniak 48/48 18/18
- przerzuty 18/18
Immunohistochemiczne barwienie gruczolakoraka ludzkiej okrężnicy i płuc z L-DOS47 jest, jak przedstawiono na Figurze 4.
Badanie przerzutów A549
W 3 tygodniu myszy otrzymujące komórki A549 traktowane 10 i 15 μg/ml L-DOS47 wykazywały spadek zliczeń guza płuca, wykazując istotny spadek (p < 0,05) w porównaniu z nietraktowaną grupą kontrolną (Tabela 3). Jednak w 10 tygodniu nie zauważono żadnych istotnych spadków w średniej liczbie zliczeń komórek guza. Chociaż statystycznie nieistotne, traktowanie 10 μg/ml L-DOS47 zarówno 3, jak i 10 tygodni po traktowaniu wykazało stały spadek w liczbie średniej komórek guza w porównaniu z nietraktowaną grupą kontrolną (Tabela 3). Co ciekawe kontrola izotypowa (V21-DOS47) również miała wpływ i redukowała liczbę zliczeń guza w płucu. Podsumowując, traktowanie komórek A549 L-DOS47 przy 10 μg/ml redukowało średnią liczbę guzów płuca 3 tygodnie po traktowaniu, ale efekt ten był przejściowy, ponieważ 10 tygodni po traktowaniu nie obserwowano żadnych istotnych spadków w średniej liczbie guzów.
T a b e I a 3. Średnia liczba zliczonych guzów płuca w badaniu przerzutów A549
Grupa Traktowanie komórek Stężenie końcowe (gg/ml) Średnia liczba guzów płuca* 3 tygodnie Średnia liczba guzów płuca* 10 tygodni
1 Nietraktowane - 103,8 ±30,0 110,6 ±50,0
2 Izotyp 10 44,6 ±5,1 60,4 ± 14,3
3 L-DOS47 10 28,0* ± 7,2 50,0 ± 17,7
4 L-DOS47 15 18,2* ±7,8 112,2 ± 52,5
^Średnia - SEM; *p < 0,05 w porównaniu z nietraktowaną grupą kontrolną.
Jak przedstawiono w Tabeli 3, ludzkie komórki gruczolakoraka płuc A549 traktowano L-DOS47 lub kontrolą izotypową (V21-DOS47) in vitro. Po inkubacji w 37°C przez 4 godziny komórki przemyto 3krotnie PBS i ponownie zawieszono w PBS przy 1x107 komórek/ml.
PL 238 187 B1
Każda mysz następnie otrzymała pojedynczą inokulację 1x106 traktowanych komórek. Pięć zwierząt na grupę uśmiercono 3 tygodnie i 10 tygodni po iniekcji. Wpływ przedmiotu badania na przerzuty guza oznaczano poprzez zliczanie liczby guzów przerzutowych w każdym płucu pod mikroskopem dysekcyjnym. Wzrost guza przerzutowego w grupie traktowanej L-DOS47 porównywano do nietraktowanej grupy kontrolnej testem t dla prób niezależnych. Jednoczesna iniekcja z L-DOS47 w 3. tygodniu po traktowaniu istotnie zredukowała liczbę zliczeń guza.
Przedstawiono zastosowanie ureazy jako potencjalnego środka terapeutycznego przeciw nowotworom opartego na wytwarzaniu amoniaku i lokalnym wzroście pH zależnym od enzymu (8). Jednak brak selektywności enzymu w stosunku do komórek nowotworowych, a nie komórek prawidłowych, ograniczył jego zastosowanie jako środka terapeutycznego przeciw nowotworom. Zastosowanie koniugatu przeciwciało-lek (ADC) lub bardziej szczegółowo terapii prolekiem enzymatycznym kierowanym przeciwciałem (ADEPT) według tej technologii może obejść to ograniczenie. W tym przykładzie swoistą postać koniugat przeciwciało-ureaza (L-DOS47) wytworzono poprzez sprzężenie jednodomenowego przeciwciała lamy swoistego względem CEACAM6 (AFAIKL2) z ureazą (DS47). Sprzężone przeciwciała AFAIKL2 zapewniają swoistość, a zatem zwiększają skuteczność enzymu ureazy względem guzów wyrażających CEACAM6. Swoistość L-DOS47 względem komórek nowotworowych wyrażających CEACAM6 na powierzchni komórek oceniano poprzez badania wiązania in vitro (Fig. 1 i 2). Wyniki tych badań wykazały, że L-DOS47 wiązał się do linii komórek wyrażających CEACAM6 (BxPC-3, Capan-1, ZR-75-30 i LS174T), ale nie do linii komórek niewyrażających (MDA-MB231). Dodatkowo funkcjonalną rolę CEACAM6 potwierdzono poprzez doświadczenia z wyciszeniem i nadekspresją CEACAM6 w komórkach nowotworowych (Fig. 3). Indukowano nadekspresję CEACAM6 poprzez transfekowanie komórek H23 plazmidem kodującym CEACAM6, natomiast wyciszenie przeprowadzono poprzez deplecję CEACAM6 w komórkach BxPC-3 zależną od krótkiego RNA o strukturze spinki do włosów. Badania nad wiązaniem wykazały, że L-DOS47 wiązał się do natywnych komórek BxPC-3 z dużym powinowactwem, ale nie do komórek BxPC-3 z wyciszonym genem CEACAM6 (Fig. 3C). Natomiast nadekspresja CEACAM6 w komórkach H23 powodowała podatność komórek na wiązanie L-DOS47 i cytotoksyczność (Fig. 3A i 3B). Wyniki te pokazały, że swoiste wiązanie L-DOS47 do antygenu CEACAM6 jest ważne, by koniugat przeciwciała indukował cytotoksyczność względem guza. Kolejną zaletą sprzęgania przeciwciał do ureazy w porównaniu z osobnym przeciwciałem jest ogólny wzrost awidności. Testy wiązania ECL wykazały, że L-DOS47 z molowym stosunkiem koniugacji 6-10 przeciwciał do 1 ureazy wiązał się do komórek BxPC-3 500-krotnie lepiej niż pojedyncze przeciwciało (Fig. 2B). Dalsze badania nad wiązaniem sugerowały, że stosunek koniugacji przeciwciała do enzymu wynoszący powyżej 6:1 stanowi optimum dla wiązania L-DOS47 do CEACAM6 (dane nieprzedstawione).
Mechanizm działania badano na drodze badań in vitro i in vivo. Ureaza stanowi aktywny komponent L-DOS47 i poprzednie badania wykazały, że ureaza jest cytotoksyczna względem ludzkich komórek guza in vitro (8). Podawanie ureazy do guza, do guzów A549 (płuco) i MCF-7 (sutek) u nagich myszy znacznie hamowało wzrost guza (8). Jednak cytotoksyczna skuteczność ureazy lub L-DOS47 również zależy od podatności linii komórek nowotworowych na amoniak. Na przykład, na Figurze 1 A, L-DOS47 wiązał się równie dobrze do BxPC-3, ZR- 75-30 i Capan-1, ale Capan-1 wykazywała umiarkowaną odpowiedź cytotoksyczną w porównaniu z pozostałymi dwiema liniami komórkowymi (Fig. 1B). Capan-1 jest mniej podatna na cytotoksyczny efekt amoniaku w porównaniu z BxPC-3 i ZR-75-30 (dane nieprzedstawione). Podobnie ludzkie komórki gruczolakoraka płuc H23 są wrażliwe na obecność amoniaku; po transfekowaniu genem CEACAM6 linia komórkowa stała się podatna na cytotoksyczność L-DOS47 (Fig. 3B), mimo tego, że mniej antygenów CEACAM6 występowało na powierzchni komórkowej w porównaniu z komórkami BxPC-3 (dane nieprzedstawione) i A549 (Fig. 3A). Podsumowując, dla wywołania cytotoksycznych efektów względem guza przez L-DOS47 ekspresja CEACAM6 na powierzchni komórkowej i podatność na amoniak stanowią dwa ważne wymogi.
Immunohistochemiczne przeszukiwanie ludzkich tkanek nowotworowych wykazało, że L-DOS47 był swoisty względem gruczolakoraka płuc, okrężnicy i trzustki (Tabela 2), ale nie względem odpowiadających tkanek prawidłowych. Koniugacja wielu przeciwciał na powierzchni ureazy znacząco zwiększyła swoistość względem antygenu CEACAM6 (Fig. 1A i 2) i zredukowała nieswoistą naturę wiązania enzymu (dane nieprzedstawione). Badania In vivo dalej potwierdziły skuteczność L-DOS47 przeciw ksenograftowi guza. Hamowanie wzrostu guza obserwowano przy podaniu IV L-DOS47 nagim myszom z ksenograftem guza (dane nieprzedstawione) i w badaniu przerzutów gruczolakoraka płuc A549 (Tabela 3). Istotną redukcję ognisk płucnych zaobserwowano w komórkach A549 traktowanych 10 lub 15 μg/ml L-DOS47 3 tygodniu po iniekcji (Tabela 3). Jednak nie stwierdzono żadnej istotnej różnicy po 10
PL 238 187 B1 tygodniach, prawdopodobnie z powodu klirensu L-DOS47 ze zwierzęcia. Kontrola izotypowa (V21DOS47, koniugat anty-VEGFR2-DOS47) również powodowała pewien stopień redukcji ognisk płucnych, pomimo tego, że komórki A549 nie wyrażają VEGFR2 w normalnych warunkach. Ohwada et al. (19) podali, że funkcjonalność VEGFR była indukowana w komórkach A549 po ekspozycji na 50 mM HCl. Poddaną supresji proliferację zaburzanych komórek A549 można było przywrócić poprzez podanie egzogennego VEGF, podczas gdy dodanie neutralizujących przeciwciał anty-VEGFR1 i anty-VEGFR2 ponownie poddawało proliferację komórek supresji. Jednak zarówno VEGF, jak i przeciwciała antyVEGFR nie miały żadnego wpływu na komórki kontrolne. Bez zamiaru wiązania się teorią, możliwe jest, że funkcjonalność VEGFR2 w komórkach A549 może być indukowana podczas sposobu przygotowywania komórek w tym badaniu przerzutów. To wyjaśnia, dlaczego obserwowano redukcję zliczeń komórek w grupie z kontrolą izotypową. Wyniki zarówno z badań in vitro, jak i in vivo pokazały, że koniugacja przeciwciała na ureazie umożliwia koniugatowi przeciwciała swoiste celowanie w guzy wyrażające CEACAM6 z dobrą selektywnością i skutecznością, co zapewnia weryfikację koncepcji dla badań klinicznych z L-DOS47.
P r z y k ł a d 2. Badanie z eskalacją dawki L-DOS47 w nawracającym lub przerzutowym niepłaskonabłonkowym NSCLC (niedrobnokomórkowym nowotworze płuc)
Głównym celem tego badania naukowego jest ocena, jak bezpieczny, jak dobrze tolerowany i jak skuteczny jest zakres dawek L-DOS47 w skojarzeniu ze standardową terapią podwójną pemetreksedem/karboplatyną u pacjentów z nawracającym lub przerzutowym niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym nowotworem płuc IV stopnia (TNM M1 a i M1b).
Główne parametry oceny klinicznej są następujące. Liczba pacjentów z działaniami niepożądanymi jako miarą bezpieczeństwa i tolerancji na L-DOS47 w leczeniu skojarzonym z pemetreksedem/karboplatyną, przy czym pacjenci będą monitorowani przez 12 tygodni. Jest to oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Okres sprawozdawczy AE zaczyna się w Cyklu 1 Dniu 1 do ostatniej wizyty badania. Drugorzędne parametry oceny klinicznej są następujące. Wskaźnik obiektywnej odpowiedzi pacjentów otrzymujących leczenie skojarzone według RECIST 1.1 jest do 12 tygodni i nie jest oznaczony jako problem bezpieczeństwa. Obiektywna odpowiedź guza będzie oceniana według RECIST wersji 1.1 u pacjentów, którzy ukończą co najmniej 2 cykle leczenia badawczego i którzy będą mieć co najmniej 1 ocenę choroby po leczeniu. Liczba pacjentów otrzymujących długotrwałą korzyść kliniczną jest monitorowana do 12 tygodni i nie jest oznaczona jako problem bezpieczeństwa. Zdefiniowana jako odsetek pacjentów, którzy osiągnęli pełną odpowiedź, częściową odpowiedź i stabilność choroby po leczeniu skojarzonym L-DOS47 + pemetreksedem/karboplatyną. Maksymalne obserwowane stężenie L-DOS47 w osoczu (Cmax) po dawkowaniu w leczeniu skojarzonym z pemetreksedem/karboplatyną jest do 12 tygodni i nie jest oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Czas do maksymalnego obserwowanego stężenia L-DOS47 w osoczu (Tmax) po dawkowaniu w leczeniu skojarzonym z pemetreksedem/karboplatyną jest do 12 tygodni i nie jest oznaczony jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Pole pod krzywą stężenia względem czasu (AUC) po dawkowaniu w leczeniu skojarzonym z pemetreksedem/karboplatyną jest do 12 tygodni i nie jest oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Okres półtrwania w końcowej fazie eliminacji L-DOS47 po dawkowaniu w leczeniu skojarzonym z pemetreksedem/karboplatyną jest do 12 tygodni i nie jest oznaczony jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Obecność przeciwciał anty-L-DOS47 u pacjentów, którym podano LDOS47 w leczeniu skojarzonym z pemetreksedem/karboplatyną jest do 12 tygodni i jest oznaczona jako problem bezpieczeństwa. Próbki surowicy zostaną pobrane i zanalizowane dla wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47.
Zostaną przeprowadzone doświadczenia obejmujące pemetreksed i karboplatynę plus L-DOS47. Pacjenci będą rekrutowani do kohort z narastającymi dawkami L-DOS47 z minimalnie 3 i maksymalnie 6 pacjentami na kohortę. Dawka początkowa L-DOS47 będzie wynosić 0,59 μg/kg; dalsze możliwe poziomy dawek, które można oceniać, wynoszą 0,78, 1,04, 1,38 i 1,84 μg/kg. Standardowe dawki leczenia odpowiednio pemetreksedem [500 mg/m2] i karboplatyną [AUC6] do podania w skojarzeniu z L-DOS47 pozostaną stałe we wszystkich kohortach. Cykl leczenia będzie wynosić 21 dni, przy czym pacjenci będą otrzymywać L-DOS47 w Dniach 1, 8 i 15 cyklu i pemetreksed/karboplatynę w Dniu 1 każdego
PL 238 187 B1 cyklu leczenia. Planuje się, że pacjenci będą otrzymywać 4 cykle leczenia skojarzonego L-DOS47 + pemetreksed/karboplatyna. Pacjenci, u których nie wystąpi progresja po 4 cyklach leczenia skojarzonego i którzy nie doświadczą niedopuszczalnej toksyczności będą mieć możliwość kontynuacji otrzymywania leczenia L-DOS47 tak długo, jak będzie występować kliniczna korzyść i będzie ono dobrze tolerowane, w opinii Badacza, dopóki nie wystąpi progresja choroby. Pacjenci, którzy nie będą mogli ukończyć 4 cykli leczenia skojarzonego L-DOS47 + pemetreksed/karboplatyna z powodu toksyczności + pemetreksedu/karboplatyny będą mieć możliwość kontynuacji otrzymywania leczenia L-DOS47 po odstawieniu pemetreksedu/karboplatyny tak długo, jak będzie występować kliniczna korzyść i będzie ono dobrze tolerowane, w opinii Badacza, dopóki nie wystąpi progresja choroby.
P r z y k ł a d 3. Faza I/II otwartego nierandomizowanego badania z eskalacją dawki immunokoniugatu L-DOS47 do leczenia niedrobnokomórkowego nowotworu płuc
Głównym celem tego badania naukowego jest ocena, jak bezpieczny, jak dobrze tolerowany i jak skuteczny jest zakres dawek L-DOS47 u pacjentów z niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym nowotworem płuc, gdy podawany jest jako monoterapia.
Główne parametry oceny klinicznej są następujące. Częstość występowania i zaawansowanie działań niepożądanych związanych z lekiem jako miara bezpieczeństwa i tolerancji na L-DOS47 są do 12 tygodni i są oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Ocenia się je podczas okresu sprawozdawczego AE zaczynającego się w Cyklu 1 Dniu 1 do ostatniej wizyty badania.
Drugorzędne parametry oceny klinicznej są następujące. Toksyczność związana z L-DOS47 podczas pierwszych 2 godzin po infuzji jest w czasie pierwszych 2 godzin po infuzji i jest oznaczona jako problem bezpieczeństwa. Ocenia się ją poprzez częstość występowania i zaawansowanie AE i SAE i zmiany w czynnościach życiowych. Częstość występowania i zaawansowanie wszystkich odnotowanych działań niepożądanych i poważnych działań niepożądanych podlegają pod Przedział czasu, w którym Uczestnicy będą monitorowani przez okres obserwacji 12 tygodni i 30 dni. Są one oznaczone jako problem bezpieczeństwa i ocenia się je podczas okresu sprawozdawczego AE zaczynającego się w Cyklu 1 Dniu 1 do ostatniej wizyty badania. Zmiany wartości wyjściowych dodatkowych parametrów bezpieczeństwa (kliniczne oceny laboratoryjne, czynności życiowe, waga, zapotrzebowanie na tlen i EKG 12-odprowadzeniowe) podlegają pod przedział czasu do 12 tygodni i są oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Parametry bezpieczeństwa obejmują kliniczne oceny laboratoryjne, wagę, zapotrzebowanie na tlen i EKG 12-odprowadzeniowe. Ocena przeciwciała anty-L-DOS47 w czasie jest do 12 tygodni i jest oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Próbki surowicy zostaną pobrane i zanalizowane dla wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47.
Inne parametry oceny klinicznej są następujące. Maksymalne obserwowane stężenie w osoczu (Cmax) L-DOS47 dla każdego poziomu dawki podlega pod przedział czasu do 12 tygodni i nie jest oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Czas do maksymalnego obserwowanego stężenia w osoczu (Tmax) L-DOS47 dla każdego poziomu dawki jest do 12 tygodni i nie jest oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla LDOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano LDOS47. Pole pod krzywą stężenia względem czasu (AUC) dla każdego poziomu dawki jest do 12 tygodni i nie jest oznaczone jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Okres półtrwania w końcowej fazie eliminacji L-DOS47 dla każdego poziomu dawki podlega pod przedział czasu do 12 tygodni i nie jest oznaczony jako problem bezpieczeństwa. Parametry farmakokinetyczne dla L-DOS47 zostaną oznaczone z próbek osocza pobranych od wszystkich pacjentów, którym podano L-DOS47. Pacjent będzie rekrutowany do kohort z narastającymi dawkami L-DOS47 z minimalnie 3 i maksymalnie 6 pacjentami na kohortę. Dawka początkowa L-DOS47 będzie wynosić 0,12 μg/kg; dalsze możliwe poziomy dawek obejmują 0,21, 0,33, 0,46, 0,59, 0,78, 1,04, 1,38, 1,84, 2,45, 3,26 i 4,33 μg/kg. Cykl leczenia będzie wynosić 21 dni, przy czym pacjenci będą otrzymywać L-DOS47 w Dniu 1 i 8 cyklu. Pacjenci będą rekrutowani do kohort z minimalnie trzema i maksymalnie sześcioma pacjentami na kohortę. Wszyscy pacjenci w danym poziomie dawki muszą ukończyć Cykl 1 (okres 3 tygodni) przed wprowadzeniem eskalacji u kolejnych pacjentów. Decyzja o eskalacji dawki do następnego poziomu dawki będzie podejmowana po rozpatrzeniu bezpieczeństwa i dostępnych danych farmakokinetycznych (PK) przez Komitet Kierujący Badaniem (TSC). Eskalacja L-DOS47 będzie kontynuowana, dopóki nie osiągnie się maksymalnej tolerowanej dawki (MTD). Po określeniu MTD L-DOS47 w Fazie I do 20 pacjentów będzie zakwalifikowanych (przeniesionych z Fazy I) do oceny wstępnej skuteczności
PL 238 187 B1
L-DOS47 (tj. wskaźnika odpowiedzi z zastosowaniem kryteriów oceny odpowiedzi na leczenie w przypadku guzów litych [RECIST] wersji 1.1, progresji choroby i przeżycia); monitorowanie będzie obejmowało ocenę radiologiczną co drugi cykl. Bezpieczeństwo i tolerancja na L-DOS47 również będą dalej oceniane. Będą zbierane informacje farmakokinetyczne, jak również istotne obserwacje związane z aktywnością L-DOS47.
Dla wszystkich pacjentów leczenie L-DOS47 będzie kontynuowane, dopóki u pacjenta nie wystąpi progresja choroby, niedopuszczalna toksyczność, pacjent nie wycofa zgody lub nie ukończy czterech cykli leczenia i nie wyrazi chęci na kontynuację z dodatkowymi cyklami, bez względu na to, co nastąpi jako pierwsze. Po czterech cyklach pacjenci mogą kontynuować otrzymywanie L-DOS47 tak długo, jak występuje długotrwała korzyść kliniczna i jest ono dobrze tolerowane w opinii Badacza.
P r z y k ł a d 4: Wytwarzanie i charakterystyka koniugatu przeciwciała jednodomenowego wielbłądowatych-enzymu ureazy do leczenia niedrobnokomórkowego nowotworu płuc (NSCLC)
Skuteczność najpowszechniej stosowanych leków chemoterapeutycznych przeciw nowotworom jest ograniczona przez ich wąskie wskaźniki terapeutyczne i brak selektywnych efektów na komórki guza. Terapia prolekiem enzymatycznym kierowanym przeciwciałem (ADEPT) polepsza selektywność poprzez dostarczanie koniugatów przeciwciało-enzym do miejsc guza, gdzie wiążą się one z antygenami związanymi z guzem, podczas gdy niesprzężone koniugaty są eliminowane z krwiobiegu [20]. Po akumulacji koniugatów przeciwciało-enzym podaje się prolek i jest on przekształcany w miejscu guza w swoją aktywną postać cytotoksyczną przez porcję enzymatyczną koniugatu przeciwciało-enzym, dzięki czemu osiąga się selektywną śmierć komórek guza. Odkąd koncept ADEPT został wprowadzony przez Bagshawe'a w 1987 [20-22], badacze wprowadzili zmiany do tej koncepcji w celu opracowania silniejszych i bardziej swoistych leków przeciw nowotworom. [22-24]. Opracowano różne generacje proleków galaktozydowych i koniugatów przeciwciało-galaktozydaza w celu redukcji ogólnoustrojowej toksyczności przy jednoczesnym wzroście cytotoksyczności aktywowanego leku [25]. Zmutowane postacie ludzkiej fosforylazy nukleozydu purynowego uzyskano sposobami inżynierii genetycznej dla zwiększenia swoistości względem proleków na bazie adenozyny jako substratu [26]. Dodatkowo opracowano różne rodzaje immunoenzymatycznych białek fuzyjnych w celu poprawy aktywności enzymatycznej i awidności przeciwciał [27-29].
Opisano wytwarzanie i charakterystykę L-DOS47, który jest chemicznym koniugatem jednodomenowego rekombinowanego przeciwciała i ureazy z kanawalii mieczokształtnej w stosunku koniugacji wynoszącym około 10 przeciwciał na natywną cząsteczkę ureazy. Immunokoniugat L-DOS47 wykorzystuje mocznik, który występuje naturalnie w dużych ilościach komórkach guza, jako prolek do wytwarzania amoniaku. Selektywne wiązanie przeciwciała AFAIKL2 do antygenu CEACAM6 związanego z guzem [33] na docelowych komórkach guza skutkuje akumulacją ureazy i w konsekwencji hydrolizą zewnątrzkomórkowego mocznika, w wyniku czego tworzy się amoniak, który jest cytotoksyczny i tworzy alkaliczne środowisko niesprzyjające komórkom nowotworowym [34]. Ze względu na złożoność i wielkość koniugatu, który może mieć masę cząsteczkową do 680 kDa, opracowano procesy chemiczne koniugacji, procedury reakcji i rozdzielania, by odnieść się do wyzwań w produkcji na dużą skalę. Ponieważ ureaza ma wiele potencjalnych miejsc koniugacji dla wyselekcjonowanego przeciwciała, stosunek koniugacji L-DOS47, który jest kluczowy dla siły leku, charakteryzowano z zastosowaniem mikrokanałowego systemu elektroforezy na żelu Experion SDS [31,32]. Czystość koniugatu L-DOS47 oznaczano z pomocą chromatografii wykluczenia sterycznego. Tożsamość chemiczną L-DOS47 charakteryzowano z pomocą mapowania peptydów spektrometrią mas i Western biot. Ponieważ pierwszorzędowa amina (K23) jest niesiona na regionie CDR3 jednodomenowego przeciwciała, dystrybucję miejsc koniugatu po stronie przeciwciała oznaczano z pomocą RP-HPLC i spektrometrii mas MALDI. Miejsca koniugacji zarówno po stronie przeciwciała, jak i ureazy również charakteryzowano z pomocą spektrometrii mas ESI. Wpływ stosunku koniugacji na powinowactwo wiązania L-DOS47 względem CEACAM6 oceniano z pomocą ELISA. W celu potwierdzenia wiązania L-DOS47 i jego zdolności do wywoływania cytotoksyczności w liniach komórek nowotworowych wyrażających CEACAM6 przeprowadzono badania in vitro.
Immunokoniugat (L-DOS47) opracowano i scharakteryzowano jako środek terapeutyczny na guzy wyrażające CEACAM6. Przeciwciało jednodomenowe AFAIKL2, które celuje w CEACAM6, było wyrażane w systemie E. coli BL21 (DE3) pT7-7. Ureazę o wysokiej czystości (HPU) wyekstrahowano i oczyszczono ze zmielonej kanawalii mieczokształtnej. AFAIKL2 aktywowano z zastosowaniem N-sukcynoimidylo[4-jodoacetylo]aminobenzoesanu (SIAB) jako środka sieciującego, wtedy sprzężonego z ureazą. Reakcje aktywacji i koniugacji kontrolowano poprzez zmianę pH. W tych warunkach, przy
PL 238 187 B1 stosunku materiałów, który osiągnął stosunki koniugacji wynoszące 8-11 przeciwciał na cząsteczkę ureazy, zawartość wolnej resztkowej ureazy była praktycznie pomijalna (< 2%) i można było wytworzyć koniugat L-DOS47 o wysokiej czystości (> 95%) z zastosowaniem wyłącznie ultradiafiltracji do usunięcia nieprzereagowanego przeciwciała i zhydrolizowanego środka sieciującego. L-DOS47 charakteryzowano z pomocą panelu technik analitycznych, wliczając SEC, IEC, Western blot, ELISA i mapowanie peptydów LC-MSE. Wraz ze wzrostem stosunku przeciwciało-ureaza w koniugacie obserwowano wyższy sygnał wiązania. Jednak efekt był mniej widoczny przy stosunkach koniugacji powyżej 6 przeciwciał na ureazę. Swoistość i cytotoksyczność L-DOS47 potwierdzono poprzez badanie przesiewowe w trzech liniach komórkowych (BxPC-3, A549 i MCF7). Stwierdzono, że BxPC-3, linia wyrażająca CEACAM6, jest najbardziej podatna na L-DOS47. L-DOS47 jest badany jako potencjalny środek terapeutyczny w Fazie I badań klinicznych na ludziach na niedrobnokomórkowy nowotwór płuc (NSCLC).
Wytworzenie półproduktu ureazy o wysokiej czystości. Ureazę (określaną tu dalej jako surowa ureaza lub DOS47) uzyskano od BioVectra Inc. (Charlottetown, PE, Kanada). Przed zastosowaniem w koniugacji surową ureazę oczyszczano w celu usunięcia zanieczyszczenia białkami macierzy z kanawalii mieczokształtnej, takimi jak kanawalina i konkanawalina A. Surową ureazę rozpuszczono w wodzie o wysokiej czystości i 10 mM kwasem octowym, 0,2 mM EDTA (buforem octan-EDTA) doprowadzono pH do 5,15, następnie filtrowano pod próżnią z zastosowaniem zawiesiny Celite 503. Placek przemyto 10 mM octanem sodu, 1 mM EDTA, pH 5,15, i osuszono pod próżnią. Filtrat zawierający ureazę ochłodzono do 0-4°C i frakcjonowano poprzez dodanie schłodzonego etanolu do stężenia końcowego 25% (v/v). Mieszaninę mieszano przez 15 minut, następnie filtrowano pod próżnią z zastosowaniem przemytego Celite 503. Placek przemyto buforem octan/EDTA zawierającym 25% (obj./obj.) etanolu, następnie osuszono pod próżnią.
Placki ponownie zawieszono w buforze octan-EDTA i zawiesinę przefiltrowano przez Celite pod próżnią, w celu zebrania filtratu. Otrzymany placek przemyto buforem octan-EDTA i osuszono pod próżnią. Płuczkę i wstępny filtrat filtrowano przez 0,65 μm kapsułę. Ten filtrat ureazy frakcjonowanej etanolem zatężono ~2X z zastosowaniem dwóch polieterosulfonowych membran Sartorius Sartocon 100000 Da MWCO, po czym nastąpiła wymiana buforu na bufor octan-EDTA.
Do tej ureazy o średniej czystości dodano imidazol i TCEP (chlorowodorek Tris(2-karboksyetylo)fosfiny) w stężeniu końcowym odpowiednio 20 mM i 1 mM i doprowadzono pH do 6,5. Roztwór białka załadowano na kolumnę DEAE-Sepharose Fast Flow wstępnie równoważoną 20 mM imidazolem, 1 mM TCEP, pH 6,5 (buforem imidazol-TCEP). Wszystkie etapy przeprowadzano przy tempie przepływu 500 ml/min. Kolumnę przemyto buforem imidazol-TCEP, a następnie buforem imidazol-TCEP zawierającym 80 mM NaCl w celu usunięcia niezwiązanych nieczystości. Ureazę eluowano buforem imidazol-TCEP zawierającym 180 mM NaCl. Frakcje o A280 >0,1 i czystości wg SEC > 90-97% łączono.
Połączone frakcje zatężono do stężenia białka docelowego 6-8 mg/ml z zastosowaniem dwóch membran Sartorious Sartocon 100 000 Da MWCO PESU, następnie diafiltrowano względem buforu octan-EDTA zawierającego 10 mM octan sodu, 1 mM EDTA, pH 6,5. Wydajność tego etapu zwykle wynosi > 55% wyjściowej aktywności. Ekspresja i oczyszczanie półproduktu leku AFAIKL2. Sekwencję aminokwasową przeciwciała AFAIKL2 przedstawiono na Figurze 5 (SEQ ID NO. 1).
Gen przeciwciała wyrażano w systemie E. coli BL21 (DE3) pT7-7. Jedną fiolkę macierzystego banku komórek aseptycznie inokulowano w trzech etapach wysiewania do 350 1 Luria HiVeg (20 g/l) uzupełnionej 50 mg/l kanamycyną, 1 g/l Cerelose, 0,02 g/l MgSO4 i 0,01% środkiem przeciwpieniącym Biospumex w 500 1 fermentorze. Proces kontrolowano, by utrzymać rozpuszczony tlen w >20%, temperaturę w 37°C ± 2°C, ciśnienie wsteczne między 5-20 psi, pH w 7,0 ± 0,2, OD600 między 0,5-40 i stężenie glukozy między 1-3 g/l. Po osiągnięciu przez hodowlę OD600 wynoszącej 7-10 ekspresję przeciwciał indukowano poprzez dodanie IPTG do stężenia końcowego 1 mM i pozostawiono w celu kontynuacji na 6-8 godzin. Komórki zbierano poprzez odwirowanie, przemywano i poddawano lizie w celu uwolnienia ciałek inkluzyjnych, następnie ponownie zawieszano w 10 objętościach 50 mM imidazolu, pH 6,8. Zawiesinę komórkową homogenizowano w partiach i homogenat przepuszczano najpierw przez 75-mikronowe sito sanitarne ze stali nierdzewnej, następnie przez mikrofluidyzator z minimalnym ciśnieniem 10000 psi dla wszystkich trzech przejść przy jednoczesnym utrzymaniu temperatury poniżej 10°C. Lizat komórek odwirowano, nierozpuszczalny materiał łączono i pelet ponownie zawieszono z homogenizacją w 10 objętościach 1% Tritonu X-100 z 5 mM DTT. Przemyty pelet zebrano poprzez odwirowanie. To przemycie powtórzono, po czym nastąpiły dwa przemycia 25 mM octanem sodu, pH 4,0, zawierającym 5 mM DTT w celu usunięcia resztkowego Tritonu X-100 i zbuforowania peletu do pH 4.
PL 238 187 B1
Pelet zawierający przemyte ciała inkluzyjne ponownie zawieszono w 8 M moczniku, 25 mM DTT, 125 mM octanie sodu, pH 4,0, następnie solubilizowano naprzemiennie z pomocą homogenizatora Ross, następnie górnego mieszalnika, dopóki nie było dalszych zmian w wyglądzie, a następnie mieszano z pomocą samego górnego mieszalnika przez łączny czas 3 godzin. Solubilizowane ciała inkluzyjne odwirowano i klarowany supernatant załadowano przy 550 ml/min na kolumnę SP-Sepharose XL, którą wstępnie równoważono 8 M mocznikiem w 125 mM octanie sodu, pH 4,0 (buforem do równoważenia SP). Po załadowaniu klarowanego supernatantu kolumnę przemywano buforem do równoważenia, dopóki A280 eluatu nie spadła poniżej 0,05, następnie 8 M mocznikiem w octanie sodu, pH 4,0, z 50 mM NaCl, dopóki A280 eluatu nie spadła poniżej 0,05. Prędkość pompy zmniejszono do 275 ml/min i w celu elucji AFAIKL2 na kolumnę nałożono 3 objętości kolumny 8 M mocznika zawierającego 25 mM octan sodu, 180 mM NaCl, pH 4,0. Frakcje z A280 > 0,4 i stosunkiem A280 /A260 >1,5 łączono i analizowano pod kątem czystości i zawartości białka. Procentowa wydajność z tego etapu zwykle wynosiła 35-45%. Połączony materiał rozcieńczono buforem do równoważenia SP do < 2,5 g/l, pH doprowadzono do 8,0 z 2 M Tris-Cl pH 8,0, dodano DTT do 2,5 mM i kondycjonowaną pulę mieszano przez 60 minut w celu całkowitej redukcji zdenaturowanego białka. Roztwór zdenaturowanego białka następnie rozcieńczono do końcowego stężenia białka wynoszącego poniżej 0,1 mg/ml w buforze do ponownego fałdowania zawierającym 25 mM Tris-Cl, pH 8,5. Ponowne fałdowanie przeprowadzano w 2-8°C i monitorowano z pomocą testu Ellmana i C18 HPLC w odwróconym układzie faz, dopóki poziom wolnego sulfhydrylu nie wynosił < 0,75 μM i nie wykrywano wyłącznie w pełni utlenionego białka.
Roztwór ponownie pofałdowanego białka załadowano na kolumnę Q-Sepharose XL wstępnie równoważoną 25 mM imidazolem, pH 6,8, i kolumnę przemywano buforem do równoważenia, dopóki A280 nie wynosiła < 0,05, następnie 25 mM imidazolem, pH 6,8, zawierającym 50 mM NaCl, dopóki A280 nie wynosiła < 0,01. Białko następnie eluowano 25 mM imidazolem, pH 6,8, zawierającym 150 mM NaCl i frakcje zbierano, dopóki A280 nie wynosiła < 0,3. Frakcje połączono, w wyniku czego uzyskano pulę o czystości nie mniejszej niż 97% i wydajność nie mniejszą niż 45%. Pulę następnie zatężono do 3-5 g/l z zastosowaniem systemu UF/DF z kasetami regenerowanej celulozy Hydrosart 5000 MWCO, po czym nastąpiła wymiana buforu na 10 mM bufor fosforanowy, pH 7,0, i liofilizacja.
Chemia koniugacji
Koniugację przeprowadzano w dwóch etapach (Figura 6). W pierwszym etapie grupy amin pierwszorzędowych na AFAIKL2 aktywowano na drodze reakcji z porcją estru NHS w SIAB. W drugim etapie aktywowane AFAIKL2 sprzęgano do grup tiolowych na ureazie przez jodoacetamidowy koniec SIAB. Jak przedstawiono na Figurze 6, synteza produktu koniugatu L-DOS47 jest reakcją dwuetapową. Etap 1 stanowi aktywację przeciwciała z zastosowaniem SIAB, a Etap 2 obejmuje koniugację aktywowanego przeciwciała z enzymem ureazy, w wyniku czego tworzy się biokoniugat L-DOS47.
Aktywacja przeciwciała AFAIKL2. Liofilizowane przeciwciało AFAIKL2 (25g) rozpuszczono w wodzie do iniekcji (WFI). SIAB (2,00 g) rozpuszczono w bezwodnym DMF i dodano do roztworu AFAIKL2 w trzech równych porcjach z 60 minutami mieszania po każdym dodaniu. Jedną godzinę po ostatnim dodaniu SIAB jakiekolwiek nieprzereagowane grupy NHS wygaszono poprzez dodanie 10x molowego nadmiaru glicyny względem pierwotnej dodanej ilości SIAB. W celu usunięcia hydrolizowanego i wygaszonego glicyną SIAB roztwór reakcyjny zatężono do 10 mg/ml AFAIKL2 z zastosowaniem Sartorious Sartocon 5000 Da MWCO, po czym nastąpiła wymiana buforu na 10 mM octan sodu, pH 6,5, 1 mM EDTA.
Koniugacja aktywowanego przeciwciała do ureazy. Ureazę o wysokiej czystości (50 g) zmieszano z aktywowanym AFAIKL2 w 10 mM octanie sodu, pH 6,5, 1 mM EDTA. Następnie pH doprowadzono do 8,3 poprzez dodanie 1 M boranu sodu, pH 8,5, co pozwala grupie jodoacetylowej na aktywowanym przeciwciele na przereagowanie z dostępnymi resztami cysteiny na ureazie. Reakcję pozostawiono, by zachodziła przez 90 minut z mieszaniem. Nieprzereagowane grupy jodoacetylowe następnie wygaszono poprzez dodanie 10x molowego nadmiaru cysteiny względem pierwotnej dodanej ilości SIAB i roztwór mieszano przez 60 minut. W celu usunięcia niesprzężonego AFAIKL2 L-DOS47 zatężono docelowo do 6 mg/ml z zastosowaniem 100 000 Da MWCO Sartorious Sartocon, po czym nastąpiła wymiana buforu na 10 mM L-histydynę, pH 6,8, 0,2 mM EDTA. Sacharozę dodano do stężenia końcowego 1% m/v i L-DOS47 rozcieńczono do docelowego stężenia 1,8 g/l z 10 mM L-histydyną, pH 6,8, 0,2 mM EDTA.
Chromatografia wykluczenia sterycznego (SEC) dla oceny czystości. System Waters 2695 HPLC z 996 PAD zastosowano z oprogramowaniem Empower 2 do gromadzenia i przetwarzania danych.
PL 238 187 B1
Chromatogramy rejestrowano przy 210-400 ± 4 nm z sygnałem przy 280 nm wydzielonym do przetwarzania. Rozdzielanie przeprowadzano na kolumnie Superose 6 100/300 GL (GE). Białka eluowano 10 mM fosforanem, 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, pH 7,2. Rozdzielanie przeprowadzano z izokratycznym przepływem przy 0,5 ml/min po iniekcji 100 μl czystej próbki. Z kolumny korzystano w temperaturze pokojowej, podczas gdy temperaturę próbki kontrolowano w 5 ± 2°C.
Chromatografia jonowymienna (IEC) dla resztkowej ureazy. Wykorzystano system Waters 2695 HPLC z 996 PAD i oprogramowaniem Empower. Chromatogramy uzyskiwano przy 210-400 ± 4 nm z sygnałem przy 280 nm wyekstrahowanym do przetwarzania. Z kolumny (Mono-Q 5/50 GL, GE) korzystano w temperaturze pokojowej, podczas gdy temperaturę próbki kontrolowano w 5 ± 2°C. Bufory do elucji zawierały 50 mM octan, 0,025% polisorbat 80 (superczysty, HX2, NOF Corporation, Tokio) z (Bufor B) lub bez (Bufor A) 0,70 M NaCl, pH 5,50. Kolumnę równoważono 15% Buforem B i 85% Buforem A przez 6 min przy tempie przepływu 1 ml/min (6 objętości kolumny) przed iniekcją próbek. Po cyklu przemywania (15% Buforem B przy 1,0 ml/min przez 6 min) białka eluowano gradientem 15-60% Buforu B w ciągu 20 minut przy tempie przepływu 0,5 ml/min. Po czyszczeniu 100% Buforem B przez 6 minut przy 1,0 ml/min kolumnę ponownie równoważono 15% Buforem B przed iniekcją kolejnej próbki. 800 μl czystych próbek domieszkowano wzorcem odniesienia dla ureazy HP do końcowych procentów 0-8% m/m i nastrzykiwano 50 μl/próbkę. Wysokość piku stosowano do obliczenia zawartości resztkowej ureazy z zastosowaniem dodatku wzorca jako sposobu kalibracji.
Do oznaczania stosunku koniugacji stosuje się mikrokanałową elektroforezę na żelu Experion SDS. Do analizy stosunków koniugacji L-DOS47 wykorzystano automatyczny system do elektroforezy BioRad Experion i zestaw do elektroforezy na żelu BioRad SDS (Pro260 Kit). Próbki rozcieńczano buforem Tris-HCl (10 mM, 0,2 mM EDTA, pH 7,0) do docelowego stężenia białka 0,5 mg/ml, następnie 4 μl rozcieńczonej próbki lub drabinki masy cząsteczkowej mieszano z 2 μ buforu do próbek i krótko wirowano. Próbki ogrzewano w 70°C przez 10 minut, następnie ładowano na mikrokanałowy chip po napełnieniu systemu i kanałów roztworem do barwienia żelu. Elektroforegramy rejestrowano automatycznie z pomocą oprogramowania Experion.
Western blot dla charakterystyki tożsamości. Badane próbki L-DOS47 i kontrole AFAIKL2/HPU rozdzielano z pomocą elektroforezy na żelu SDS-PAGE, następnie przenoszono na membranę nitrocelulozową z zastosowaniem systemu Invitrogen iBlot. Duplikaty blotów otrzymano z żeli puszczanych równolegle. Potwierdzenie tożsamości AFAIKL2 wymaga wykrywania z zastosowaniem króliczego pierwszorzędowego przeciwciała anty-AFAIKL2 IgG (Rockland) z drugorzędowym wykrywaniem z zastosowaniem koziego anty-królicze IgG sprzężonego z alkaliczną fosfatazą (AP) (Sigma). Potwierdzenie tożsamości ureazy wymaga wykrywania z zastosowaniem króliczego pierwszorzędowego przeciwciała IgG anty-ureaza (Rockland) z drugorzędowym wykrywaniem z zastosowaniem koziego anty-królicze IgG sprzężonego z AP (Sigma). Do wykrywania wykorzystującego anty-AFAIKL2 IgG próbki LDOS47 rozcieńczono do 0,002 mg/ml w 1xTBS zawierającym 0,1 mg/ml BSA, następnie mieszano 1:1 z buforem do ładowania białek na żel, ogrzewano do 70°C przez 10 minut i 0,01 μg L-DOS47 ładowano na ścieżkę. Do wykrywania wykorzystującego IgG anty-ureaza próbki L-DOS47 rozcieńczono do 0,02 mg/ml w 1xTBS zawierającym 0,1 mg/ml BSA, następnie mieszano 1:1 z buforem do ładowania białek na żel, ogrzewano do 70°C przez 10 minut i 0,1 μg L-DOS47 ładowano na ścieżkę. Końcowe wywołanie Western blotów przeprowadzono z buforem AP zawierającym NBT/BCIP.
ELISA L-DOS47 z różnymi stosunkami koniugacji
W celu zbadania wpływu stosunku koniugacji na powinowactwo wiązania L-DOS47 do jego docelowego antygenu CEACAM6 wytworzono koniugaty L-DOS47 z różnymi stosunkami koniugacji na skalę laboratoryjną poprzez dostosowywanie stosunków molowych AFAIKL2/HPU podczas koniugacji. Stosunki koniugacji otrzymanych koniugatów oznaczano z pomocą SDS-Experion i stężenia białek oznaczano z pomocą mikrotestu Lowry'ego z zastosowaniem Total Protein Kit (Sigma, TP0200). Płytki mikrotitracyjne powlekano 100 μl/dołek CEACAM6-A, domeną A pełnego antygenu CEACAM6 (2,5 μg/ml w PBS) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Płytki przemyto dwukrotnie Buforem A (0,05% BSA w PBS), blokowano 150 μl/dołek 3% BSA/PBS w 4°C przez noc, następnie przemyto dwukrotnie Buforem A. Wszystkie kolejne etapy były przeprowadzane w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem. Dodano L-DOS47 (100 μl/dołek) i inkubowano przez 2 godziny, płytki przemyto 3-krotnie Buforem A, następnie dodano 100 μl/dołek IgG anty-ureaza (1:12000, Rockland) i inkubowano przez 1 godzinę. Po trzech przemyciach Buforem A dodano 100 μl/dołek koziej anty-króliczej IgG-AP (1:6000, Sigma) i inkubowano przez 1 godzinę. Po trzech przemyciach Buforem A dodano 100 μl/dołek roztworu substratu AP i inkubowano przez 25 minut. Absorbancję oznaczano przy 405 nm.
PL 238 187 B1
Oznaczanie miejsc aktywności na przeciwciele AFAIKL2
W celu otrzymania cysteiny wyznakowanej fluoresceiną (Cys-FL) cysteinę przereagowano w nadmiarze z estrem NHS fluoresceiny (Pierce) w 1 M boranie, pH 8,0, 60 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór reakcyjny rozdzielano z pomocą RP-HPLC z kolumną C8. Frakcję piku Cys-FL identyfikowano z pomocą spektrometrii mas MALDI, a jej stężenie oznacza z pomocą spektrometrii według jej współczynnika ekstynkcji przy 493 nm i pH 7. Porcje z frakcji pików liofilizowano i przechowywano w ciemności w -20°C. Przeciwciało AFAIKL2 najpierw aktywowano środkiem sieciującym SIAB na skalę laboratoryjną i zhydrolizowany SIAB usuwano z pomocą kolumny odsalającej G25 przygotowanej na własny użytek. Aktywowane przeciwciało pozostawiono do przereagowania z cysteiną wyznakowaną fluoresceiną (Cys-FL) w 100 mM buforze boranu, pH 8,3, na 90 minut w temperaturze pokojowej. W roztworze reakcyjnym wymieniono bufor na 30 mM wodorowęglan amonu z pomocą kolumny odsalającej G25 i otrzymane AFAIKL2-Cys-FL rozcieńczono do 0,5-0,8 mg/ml w 30 mM wodorowęglanie amonu zawierającym 20% acetonitryl. Do końcowego białka dodano trypsynę (Promega) w stosunku trypsyny 20:1 i trawienie przeprowadzano w 37°C przez 36 godzin. Otrzymany produkt trawienia trypsyną zredukowano poprzez dodanie 0,1 M TCEP do stężenia końcowego 2 mM następnie rozdzielono z pomocą HPLC w odwróconym układzie faz (system Agilent 1100 z kolumną Zobax 300SB-C18, 5μm, 4,6x150 mm, gradient od 0 do 45% acetonitrylu, 0,025% TFA w 55 minut), a absorpcję rejestrowano przy 420 nm. Ponieważ aktywowana SIAB lizyna na AFAIKL2 była przyłączona do cysteiny wyznakowanej fluoresceiną, mało prawdopodobne jest, by była dostępna dla trypsyny i powinien utworzyć się peptyd (XnKXm)-Cys-FL. Frakcje piku zawierające peptydy modyfikowane fluoresceiną zebrano i zastosowano spektrometrię mas MALDI w trybie reflektronowym (Micromass Tof 2e). Pola pików HPLC odpowiadających peptydów zastosowano do obliczenia procentowej dystrybucji dla każdego miejsca aktywacji.
Mapowanie peptydów i identyfikację sprzężonych peptydów przeprowadzono z pomocą spektrometrii mas ESI. Wykorzystano spektrometr masowy Waters Xevo G2 QTOF i system Acquity UPLC klasy H z kolumną BEH300 C18 (1,7 μm, 2,1x150 mm). Każdą próbkę L-DOS47 (1,5-2,0 mg/ml, 50,0 μl) mieszano z 0,063 ± 0,003 g guanidyny-HCl. Po całkowitym rozpuszczeniu soli dodano 1,50 μl 0,7 M DTT, a roztwór inkubowano w 60°C przez 30 minut. Dodano 10,0 μl 0,20 M jodoacetamidu (IAA) i nasyconym roztworem Tris-zasada doprowadzono pH do 8,0-8,5. Próbkę inkubowano w 37°C przez 60 minut. 50,0 μl każdej alkilowanej próbki mieszano z 15,0 μl 0,1 M CaCl2 i 80,0 μl buforu Tris (50 mM Tris-HCl, pH 8,0), następnie dodano 3,00 μl 0,5 mg/ml roztworu trypsyny. Trawienie trypsyną przeprowadzano przez 20-24 godzin. Po trawieniu trypsyną 50,0 μl produktu trawienia mieszano z 0,50 μl czystego kwasu mrówkowego w celu analizy LC-MS. Temperaturę kolumny ustawiono na 60°C i do rozdzielnia UPLC zastosowano Rozpuszczalnik A (0,075% v/v kwasu mrówkowego w wodzie) i Rozpuszczalnik B (0,075% kwasu mrówkowego w acetonitrylu). UPLC przeprowadzono z tempem przepływu 0,15 ml/min z gradientem od 0 do 55% Rozpuszczalnika B w 80 minut.
Analizę LC-MS kontrolowano z pomocą oprogramowania Masslynx V4.1. Gromadzenie danych LC-MSE TIC (łączne zliczenia jonowe) przeprowadzano w zakresie M/Z 50-2000 Da w trybie rozdzielczości z tempem skanowania 0,3/s, napięciem na kapilarze 3,0 kV, napięcie próbki na stożku 25 V, napięcie ekstrakcyjne na stożku 4,0 kV. Gromadzenie danych TIC z fragmentacji indukowanej zderzeniami wysokoenergetycznymi przeprowadzono z energią zderzeń zwiększającą się od 20 do 40 V. Temperaturę źródła jonów ustawiono na 100°C, a temperaturę desolwatacji ustawiono na 300°C. Przepływ gazu desolwatacyjnego wynosił 600 l/godzinę. Zestaw surowych danych TIC dla masy referencyjnej w czasie rzeczywistym (skan/20 s) gromadzono z 100 fmol/μl Glu-Fib B przy tempie przepływu 3,0 μl/minutę.
Surowe dane ze spektrometrii mas przetwarzano z pomocą BioPharmalynx (vl.2) w trybie mapowania peptydów z rozdzielczością 20000. Masę referencyjną 785,8426 Da zastosowano do kalibracji masy punkt do punktu w czasie rzeczywistym. Próg intensywności niskoenergetycznych jonów MS ustawiono na 3000 zliczeń, a próg intensywności wysokoenergetycznych jonów MSE ustawiono na 300 zliczeń. Tolerancję dopasowania masy ustawiono na 15 ppm zarówno dla zestawów danych MS, jak i MSE. W celu dopasowania/identyfikacji peptydów sekwencje aminokwasowe AFAIKL2 i ureazy wprowadzono do biblioteki sekwencji. Do analizy mapowania peptydów zastosowano modyfikatory zmiennych, wliczając deamidację N, deamidację sukcynoimidu N, utlenienie M utlenienie 2xM, +K, +Na i stały modyfikator karbamidometyl C (dla alkilowanej cysteiny). W celu identyfikacji sprzężonych peptydów po stronie AFAIKL2 peptydy ureazy zawierające cysteinę plus sekcję wiązania środka sieciującego SIAB (C9H7O2N, 161,0477 Da) otrzymano jako modyfikatory zmiennych i włączono do biblioteki modyfikatorów zmiennych. W tym przypadku karbamidometyl C został włączony jako modyfikator zmiennej. W celu
PL 238 187 B1 identyfikacji sprzężonych peptydów po stronie ureazy peptydy z lizyną w środku XnKXm z AFAIKL2 i sekcję wiązania SIAB otrzymano jako modyfikatory zmiennych i włączono do biblioteki modyfikatorów zmiennych.
Test wiązania L-DOS47 na całych komórkach
Monowarstwy komórek otrzymano poprzez wysianie 100 μl/dołek komórek MCF-7, BxPC-3 i A549 (4x104 komórek/dołek) w 96-dołkowych płytkach hodowlanych i inkubowanie przez noc w 37°C. Pożywkę następnie usunięto z płytek, a monowarstwy komórek utrwalano 100 μΙ/dołek 0,05% aldehydu glutarowego w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Płytki następnie przemyto PBS i dodano 120 μl/dołek 50 mM glicyny. Po inkubacji w 37°C przez 20 min płytki blokowano 120 μl/dołek 1% BSA/PBS w 37°C przez 30 min. Następnie płytki przemywano 3-krotnie Buforem A (0,05% BSA w PBS) i dodano 80 μl/dołek rozcieńczonego L-DOS47 lub DOS47 i inkubowano w 37°C przez 1,5 godziny. Płytki przemywano 4-krotnie Buforem A i dodano 80 μl/dołek 20 mM mocznika w 0,1 M PBS, pH 7,6, i inkubowano w 37°C przez 30 min. Po inkubacji 40 μl/dołek dodano 1 N HCl w celu zatrzymania reakcji. Ilość amoniaku wytworzonego w każdym dołku oznaczono z zastosowaniem modyfikowanego testu z indofenolem. W skrócie Roztwór A świeżo otrzymano poprzez rozpuszczenie 165 mg fenolu w 132 mg NaOH w 10 ml wody, po czym nastąpiło dodanie 66 μl roztworu nitroprusydku sodu (10 mg/ml). Roztwór B otrzymano poprzez dodanie 40 μl podchlorynu sodu do 5 ml wody. Roztwory próbek (30 μl każda) z testu wiązania na całych komórkach przeniesiono na nową 96-dołkową płytkę zawierającą 50 μl/dołek 5 N NaOH:H2O (3,3:46,7) i 20 μl/dołek wody. Dodano Roztwór A (50 μl/dołek) i Roztwór B (50 μl/dołek) i płytki przeniesiono następnie do czytnika mikropłytek na wywołanie koloru w 37°C przez 30 minut. OD mierzono przy 630 nm. Ilość amoniaku wytworzonego w dołkach obliczano z krzywej wzorcowej z zastosowaniem od 0 do 150 μM chlorku amonu jako wzorców.
Test cytotoksyczności L-DOS47. Monowarstwy komórek otrzymano poprzez wysianie 100 μl/dołek komórek MCF-7, BxPC-3 i A549 (4x104 komórek/dołek) w 96-dołkowych płytkach hodowlanych i inkubowanie przez noc w 37°C. Pożywkę następnie usunięto z płytek i dodano 80 μl/dołek rozcieńczonego L-DOS47 lub DOS47 i dalej inkubowano w 37°C przez 2 godziny. Po inkubacji płytki przemyto 3-krotnie buforem KR-II/0,05% BSA i dodano 100 μl/dołek 20 mM roztworu mocznika. Płytki inkubowano w 37°C przez noc, następnie pożywkę usunięto i zastąpiono 100 μl/dołek zwykłej pożywki. Żywotność komórek oznaczano z zastosowaniem testu żywotności komórek MTS, w którym otrzymano roztwór 21:1 v/v MTS/PES (MTS, 2 mg/ml; PES, 1 mg/ml) i do płytek dodano 20 μl/dołek mieszaniny. Płytki następnie inkubowano w 37°C przez 1 godzinę i OD mierzono przy 630 nm ze wzorcem przy 490 nm.
Ureaza z kanawalii mieczokształtnej jest heksamerycznym enzymem składającym się z sześciu identycznych podjednostek mających w przybliżeniu 91 kDa każda z 15 niezwiązanymi resztami cysteiny na podjednostkę. Przeciwciało AFAIKL2 zawiera siedem pierwszorzędowych amin i wiązanie disiarczkowe. Pierwszorzędowe aminy na przeciwciele i reszty cysteiny na ureazie stanowią podstawę dla chemicznej koniugacji przez heterobifunkcyjny środek sieciujący. Jednak wielkość cząsteczkowa koniugatu i natura dwóch białek stworzyły wyzwania w produkcji na dużą skalę, oczyszczaniu i charakteryzowaniu produktu koniugatu. Immunokoniugat do stosowania jako lek pozajelitowy musi być rozpuszczalny i stabilny w wodnych ośrodkach o pH bliskim fizjologicznemu; w związku z tym punkt izoelektryczny (pl) rekombinowanego przeciwciała wymagał dokładnego opracowania sekwencji, ponieważ ureazę ekstrahuje się ze źródła roślinnego i nie można było zmienić jej pl (obserwowany pl 4,8-5,1). Optymalizacja w celu zapewnienia jednorodności reakcji i usunięcie resztkowych odczynników i produktów ubocznych były kluczowe w chemii koniugacji. Chociaż kilka środków sieciujących [24, 30] jest szeroko stosowanych w koniugacjach białek i były one sprawdzane podczas opracowywania, do wytworzenia koniugatu L-DOS47 wybrano N-sukcynoimidylo[4-jodoacetylo]aminobenzoesan (SIAB) ze względu na różnice w optymalnym pH dla dwóch reakcji sieciowania. Podczas wytwarzania przeciwciało jest aktywowane środkiem sieciującym przy pH 7,0, następnie wymienia się bufor do pH 6,5 i miesza się z ureazą. Przeciwciało następnie przyłącza się do ureazy na skutek wzrostu pH ośrodka reakcji do 8,3. Ponieważ szybkość reakcji przyłączania aktywowanego AFAIKL2 do ureazy jest bardzo niska przy pH 6,5, to jednorodność materiału w dużym naczyniu reakcyjnym zapewnia się poprzez wstępne mieszanie przy pH 6,5. W związku z tym dystrybucję wolnej resztkowej ureazy i podrodzajów ureaza-(Ab)x oznacza się wyłącznie z pomocą prawdopodobieństwa i stosunków molowych materiałów. Przy stosunkach koniugacji wynoszących 8-11 przeciwciał/ureazę zawartość resztkowej ureazy jest teoretycznie pomijalna i koniugat L-DOS47 można oczyszczać z zastosowaniem ultradiafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanego przeciwciała i zhydrolizowanego środka sieciującego. Chromatografię wykluczenia sterycznego koniugatu L-DOS47, wolnego AFAIKL2 i wolnej ureazy przedstawiono na Figurze 7.
PL 238 187 B1
Koniugat L-DOS47 eluuje się w ~24,6 minuty, dimer (prawdopodobnie przyłączony przez wiązanie disiarczkowe lub przez cząsteczkę AFAIKL2 aktywowaną dwoma SIAB) eluuje jako mały niewyodrębniony pik w 20,5 minuty, a polimer eluuje jako śladowy pik w czasie martwym (~15 minut). Śladowy pik w ~40 minucie reprezentuje komponenty bufora. Szerokość piku koniugatu L-DOS47 jest nieco większa niż ta dla wolnej ureazy, ale z nią porównywalna, co sugeruje równomierną dystrybucję reakcji koniugacji. Wolne przeciwciało eluuje w 37 minucie. Mały niewyodrębniony pik przed pikiem przeciwciała reprezentuje niekowalencyjny dimer. Zwykle w partiach produkcji obserwuje się wysoką czystość przeciwciała (> 95%), przy czym jego rodzaje o wysokiej masie cząsteczkowej, w tym dimery, nie przekraczają 5%. HPU zwykle eluuje z głównym pikiem w ~26,9 minuty, małym pikiem dimeru w 24 minucie i śladowym pikiem polimeru w 15 minucie. Oczyszczanie surowej ureazy do HPU skutkowało ~97% monomerem, podczas gdy suma dimeru i polimeru nie wynosi więcej niż 3%. Czystość L-DOS47 powyżej 95% zwykle osiąga się poprzez proste oczyszczanie z zastosowaniem wyłącznie ultradiafiltracji. Ponieważ SEC przeprowadza się w natywnych warunkach, można oznaczyć zmiany w efektywnych masach cząsteczkowych spowodowane degradacją i dysocjacją czwartorzędowych struktur białka; w związku z tym sposób ten stosuje się również jako test wskazujący na stabilność L-DOS47. Obecność wolnej resztkowej ureazy w L-DOS47 oceniano z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej (Figura 8).
Wolna resztkowa ureaza eluuje w 15,33 minuty, co jest bardzo blisko wybijającego się piku ureazy (15,42 minuty). Pik HPU jest dość dobrze wyodrębniony od dużego piku L-DOS47 (Rs 1,48). Jak przedstawiono na wstawce na Figurze 8, standardowy sposób dodawania (L-DOS47 z domieszką 2,4%, 4,8% i 7,2% m/m HPU) do oznaczania zawartości resztkowej ureazy wykazuje dobrą linearność (R2 0,9995). Wyliczona zawartość resztkowej ureazy w tej próbce wynosi 0,72% i resztkowa ureaza do tej pory nie przekroczyła 2% we wszystkich partiach produkcji, co pokazuje, że resztkowa ureaza jest praktycznie pomijalna w tych warunkach i sposób wytwarzania nie wymaga dodatkowego etapu rozdzielania koniugatu od niesprzężonej ureazy.
Podczas wytwarzania L-DOS47 każda z sześciu monomerycznych podjednostek ureazy może być sprzężona z zerem, jedną, dwiema, trzema lub czterema cząsteczkami AFAIKL2; w związku z tym w warunkach denaturujących SDS-Experion L-DOS47 generuje wzór kilku osobnych pików/prążków od ~90-155 kDa. Dodatkowo podczas reakcji aktywacji przeciwciała niewielka porcja przeciwciała może być losowo aktywowana dwoma SIAB na cząsteczkę przeciwciała (AFAIKL2-(SIAB)2), co skutkuje koniugacją każdej z tych cząsteczek przeciwciała z dwiema podjednostkami ureazy. Jedno przeciwciałodwie podjednostki w konsekwencji generuje mniejszy drugi zestaw słabo wyodrębnionych pików/prążków w zakresie od 200-260 kDa.
Figura 9 Panel 2 przedstawia wirtualny obraz żelu, a Panel 1 zawiera nałożenie elektroforegramów ze ścieżek 1 i 4. Próbki L-DOS47 na skalę laboratoryjną ze ścieżek 1-2 i 7-8 wytworzono z aktywowanym AFAIKL2, które wcześniej oczyszczono z pomocą chromatografii jonowymienną przed drugą reakcją koniugacji. Ponieważ rodzaj AFAIKL2-(SIAB)2 usunięto, otrzymany koniugat nie miał usieciowanych wzajemnie podjednostek i obserwowano wyłącznie pojedynczy zestaw pików/prążków. W próbce L-DOS47 ze ścieżek 3-6 AFAIKL2 stosowano bezpośrednio w koniugacji po etapie aktywacji bez dodatkowego oczyszczania i w konsekwencji występuje niewielki drugi zestaw pików/prążków. Ścieżki 9 i 10 przeładowano próbką HPU.
Pole pików (Figura 9, Panel 1) i intensywność prążków (Figura 9, Panel 2) zależą od względnej liczebności podjednostek ureazy połączonych z odpowiadającą liczbą cząsteczek przeciwciała. Pole pików jest całkowane przez oprogramowanie po korekcji względem wartości wyjściowych i stosunek koniugacji L-DOS47 (CR) wylicza się następująco (patrz Figura 10 reprezentująca ścieżkę 2 z żelu z Figury 9):
CR= 6*(PKi*0+PK2*1 +PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PKi+PK2+PK3+PK4+PK5)
Gdzie PKi (i= 1-5) oznacza pole piku podjednostki ureazy połączonej z i-1 cząsteczkami przeciwciała.
Ponieważ aktywowanego przeciwciała nie poddaje się chromatograficznemu oczyszczaniu jonowymiennemu podczas wytwarzania L-DOS47 na dużą skalę, na elektroforegramach tych próbek pojawia się drugi słabo wyodrębniony zestaw pików. Jednak oczekuje się, że dwa zestawy pików mają podobne wzory intensywności, ponieważ dystrybucję miejsc aktywacji oznacza się poprzez prawdopodobieństwo i poprzez stosunek molowy przeciwciała do SIAB. W związku z tym tego drugiego zestawu pików nie stosuje się do wyliczenia stosunku koniugacji, ponieważ prążki są słabo wyodrębnione i nakładają się na marker o masie cząsteczkowej 260 kDa. Podczas gdy związek AFAIKL2-(SIAB)2 mógłby
PL 238 187 B1 teoretycznie generować koniugaty dimerowe lub polimerowe poprzez przyłączanie się do dwóch podjednostek z różnych natywnych cząsteczek ureazy, minimalne poziomy (poniżej 3%) pola pików dla dimeru i polimeru łącznie obserwowane na chromatogramie wykluczenia sterycznego próbki L-DOS47 (Figura 7) sugerują, że większość związków AFAIKL2-(SIAB)2 przyczynia się do wiązania między podjednostkami w pojedynczej cząsteczce natywnej ureazy, w wyniku czego wytwarza się monomer L-DOS47, a nie do wiązań międzycząsteczkowych, w wyniku czego tworzą się koniugaty dimerowe i polimerowe. Dodatkowo obecność tych pików dla dimeru i polimeru w chromatogramach SEC logicznie można by było przypisać wiązaniom disiarczkowym, ponieważ podobne piki również pojawiają się na chromatogramach wykluczenia sterycznego ureazy HP. W związku z tym drugiego zestawu pików na elektroforegramach nie wykorzystuje się jako parametru do kontroli jakości.
Stosunek koniugacji L-DOS47 jest kluczowy dla jego powinowactwa do CEACAM6, antygenu guza celowanego przez przeciwciało. L-DOS47 z różnymi stosunkami koniugacji (1,8 do 12 AFAIK na ureazę) wytworzono poprzez dostosowanie stosunków molowych AFAIKL2/ureazy HP w celu oceny wpływu stosunku koniugacji na powinowactwo wiązania. Stwierdzono, że powinowactwo wiązania L-DOS47 do unieruchomionego CEACAM6-A jest wprost proporcjonalne do liczby przeciwciał sprzężonych z ureazą (Figura 11). Im więcej sprzężonych przeciwciał, tym wyższy sygnał wiązania obserwowano. Jednak efekt był mniej wyraźny przy stosunkach koniugacji wynoszących 6 lub więcej.
Analiza L-DOS47 przez podwójny Western blot (Figura 12) potwierdziła wzór prążkowania występujący w SDS-Experion. Wstawka pokazuje powiększenie obramowanego regionu z głównego blota, w którym wyznakowana jest ureaza i sprzężony związek (N1-N4 odpowiadają ureazie ze sprzężonym odpowiednio od 1 do 4 AFAIKL2). Przy sondowaniu przeciwciałem anty-ureaza, prążek ureazy 91 kDa jest najsilniej widoczny, a intensywność prążków o wyższej masie cząsteczkowej (odpowiadająca bardziej wysoce sprzężonym związkom) spada. Natomiast przy sondowaniu przeciwciałem anty-AFAIKL2, prążek 91 kDa jest ledwo widoczny, a kolejne dwa prążki o wyższej masie cząsteczkowej są najbardziej intensywne (N1 i N2). Jest to spowodowane faktem, że są one dominującymi prążkami w koniugacie. Zdolność L-DOS47 do bycia wizualizowanym zarówno przez przeciwciała anty-AFAIKL2, jak i antyureaza pokazuje obecność obu elementów w koniugacie, a swoistość przeciwciał jest potwierdzona przez fakt, że przeciwciało anty-AFAIKL2 nie wiąże się do ureazy i przeciwciało anty-ureaza nie wiąże się do AFAIKL2.
Ponieważ L-DOS47 jest chemicznym koniugatem AFAIKL2 i ureazy, peptydy tryptyczne, zarówno z przeciwciała, jak i enzymu ureazy, jak również kowalencyjnie usieciowane peptydy powinny być wykrywane w produktach trawienia koniugatu. Mapowanie peptydów ESI LC-MSE przeprowadzono w celu scharakteryzowania koniugatu. Jak przedstawiono w powiązanej treści, peptydy z AFAIKL2 pojawiały się w widmie L-DOS47, ale nie w widmie ureazy HP. W produktach trawienia trypsyną L-DOS47 pokrycie peptydów zarówno dla sekwencji aminokwasowej AFAIKL2, jak i ureazy wynosiło 100% z typowym błędem w masie poniżej 6 ppm i każdy z peptydów potwierdzono poprzez jego wysokoenergetyczną MS/MS b/y jonów fragmentacyjnych z błędami w masie ±15 ppm.
W celu identyfikacji miejsc aktywacji AFAIKL2 i oznaczenia dystrybucji każdego miejsca koniugacji AFAIKL2 aktywowano z zastosowaniem SIAB, następnie sprzęgano z cysteiną wyznakowaną fluoresceiną (Cys-FL). Po trawieniu trypsyną otrzymanego AFAIKL2-Cys-FL i rozdzieleniu z pomocą chromatografii RP-HPLC zebrano frakcje pików do MALDI-MS w celu identyfikacji tryptycznych peptydów przeciwciał połączonych z Cys-FL. Ponieważ tylko miejsca aktywowane SIAB mogą być przyłączone do Cys-fluoresceiny, dla której długość fali maksymalnej absorpcji w 0,025% TFA wynosi 420 nm, przy 420 nm powinno się wykrywać wyłącznie piki aktywowanych peptydów. Na przykład, jeśli lizyna #32 w AFAIKL2 jest aktywowana przez SIAB, powinna być przyłączona do Cys-FL i to miejsce trawienia trypsyną powinno zostać pominięte podczas trawienia trypsyną; w związku z tym powinno się obserwować pik o masie cząsteczkowej 2768,113 Da, który reprezentuje peptyd z lizyną w środku z przyłączoną Cys-FL (LSCAAHDPIFDK32NLMGWG)-Cys-FL (SEQ ID NO: 7), oznaczony jako L2K32-Cys-FL. Chromatogram RP-HPLC produktów trawienia trypsyną AFAIKL2-Cys-FL przedstawiono na Figurze 13.
Zidentyfikowane sprzężone peptydy o wykrytych wartościach masy są również oznaczone przy odpowiadających pikach HPLC na Figurze 13. Według sekwencji aminokwasowej przeciwciała, pierwszorzędowe aminy z sześciu reszt lizyny i N-końcowa amina teoretycznie są dostępne dla reakcji aktywacji. Jednak w praktyce tylko cztery z nich były zasadniczo aktywowane. Najprawdopodobniej wynika to z tego, że trzeciorzędowa struktura przeciwciała eksponuje te cztery pierwszorzędowe aminy na powierzchni, jednocześnie chowając pozostałe wewnątrz natywnej struktury. Dystrybucję każdego miejsca
PL238 187 Β1 aktywacji (Tabela 4) wyliczono według jego pola piku i sumy pola wszystkich zidentyfikowanych pików HPLC na Figurze 13.
T a b e I a 4. Pole pików HPLC i procentowa dystrybucja każdego miejsca aktywacji na AFAIKL2
Lys76(L2K?6) Lys44 (L2K44) Meti(L2Mi) Lysji (L2K32)
Pole % Pole % Pole % Pole %
185 35 107 20 140 26 97 18
Jak przedstawiono w Tabeli 4, najbardziej aktywnym miejscem w przeciwciele dla środka sieciującego jest L2K/6, następnie L2Mi i później L2K44. L2K32 jest podstawowe dla wiązania przeciwciała i jest również najmniej aktywnym miejscem, ale nadal zapewniało -18% łącznej reaktywności. W L-DOS47 AFAIKL2 aktywowane środkiem sieciującym było kowalencyjnie przyłączone do reszt cysteiny eksponowanych na powierzchni czwartorzędowej struktury ureazy. W związku z tym kowalencyjnie usieciowane peptydy powinny być wykrywane na widmie peptydów z trawienia trypsyną L-DOS47.
W celu identyfikacji tych kowalencyjnie usieciowanych peptydów surowe dane ESI LC-MSE z trawienia trypsyną próbek L-DOS47 były przetwarzane z pomocą BiopharmaLynx, ale wyszukiwane z pomocą bibliotek modyfikatorów zmiennych zawierającej zestaw modyfikatorów utworzonych przez użytkownika dla wszystkich 15 reszt cysteiny po stronie ureazy. Według dystrybucji aktywacji w Tabeli 4 tymi modyfikatorami utworzonymi przez użytkownika były trzy peptydy z lizyną w środku plus porcja wiązania SIAB (C9H5O2N, 159,0320 Da) (oznaczone jako L2K76, L2K44 i L2K32) i N-końcowa metionina plus wiązanie (oznaczone jako L2Mi). Wyniki (szczegóły w powiązanej treści) pokazały, że z 15 reszt cysteiny w każdej podjednostce ureazy tylko 6 było zasadniczo sprzężonych. Najbardziej dostępną cysteiną jest UC824, następnie kolejno UC663, UC59, UC207, UC329 i UC268. Reszta cysteiny Cys592, która jest kluczowa dla aktywności enzymu ureazy, nie była zasadniczo sprzężona. Względna dostępność czterech miejsc AFAIKL2 aktywowanych środkiem sieciującym dla każdej z sześciu reszt cysteiny po stronie ureazy także była różna. Na przykład UC329 była dostępna wyłącznie dla L2Mi. Te zasadnicze miejsca koniugacji potwierdzono również poprzez ich profile fragmentacyjne MS/MS. Przykładowo sprzężony peptyd L2K32UC663, który ma sekwencję (LSCAAHDPIFDKNLMGWGR (SEQ ID NO: 8))wiązanie-(CDSSDNDNFR (SEQ ID NO: 9)) i który ma masę peptydu 3517,4873, zidentyfikowano z błędem dopasowania masy 2,1 ppm poprzez szukanie go jako CDSSDNDNFR peptydu ureazy (SEQ ID NO: 9) modyfikowanego (LSCAAHDPIFDKNLMGWGR (SEQ ID NO: 8))-wiązanie (2346,0674 Da) ze strony AFAIKL2 jako modyfikatorem. Ten sam peptyd zidentyfikowano również z błędem dopasowania masy 2,1 ppm poprzez szukanie go jako LSCAAHDPIFDKNLMGWGR (SEQ ID NO: 8) peptydu AFAIKL2 modyfikowanego przez wiązanie-(CDSSDNDNFR (SEQ ID NO: 9)) (1330,4520 Da) ze strony ureazy jako modyfikatorem. Widmo MS/MS indukowane zderzeniami wysokoenergetycznymi tego sprzężonego peptydu było mapowane 9 b/y jonami fragmentacyjnymi ze strony ureazy poprzez szukanie go jako peptydu ureazy modyfikowanego modyfikatorem ze strony AFAIKL2. To samo widmo mapowano również 14 b/y jonami ze strony AFAIKL2 poprzez szukanie go jako peptydu AFAIKL2 z modyfikatorem ze strony ureazy.
W liniach komórkowych BxPC-3, A549 i MCF7 obserwowano różne profile wiązania L-DOS47 (Figura 14). Wyniki pokazały, że L-DOS47 wiązał się dobrze do linii komórek trzustki BxPC-3, wskazując na ekspresję antygenu CEACAM6 na powierzchni komórek. Umiarkowane wiązanie obserwowano w linii komórek płuca A549, ale żadnego wiązania nie stwierdzono w linii komórek sutka MCF7. Przeciwciało AFAIKL2, gdy sprzężone z enzymem ureazą (DOS47), zapewniało swoiste kierowanie do komórek wyrażających CEACAM6. Zostało to potwierdzone przez brak sygnału wiązania w trzech liniach komórkowych traktowanych kontrolą będącą niesprzężoną DOS47.
Komórki BxPC-3 były bardzo podatne na cytotoksyczność L-DOS47 (Figura 15), jak wykazano poprzez nagły spadek w przeżywalności komórek obserwowany, gdy komórki traktowano poniżej 1 μg/ml L-DOS47. Umiarkowaną cytotoksyczność obserwowano w komórkach A549, natomiast nie zaobserwowano żadnych efektów w MCF7, co jest zgodne z wynikami z badania wiązania. Dodatkowo kontrola negatywna DOS47 nie miała żadnego cytotoksycznego efektu na żadną z linii komórkowych.
Procedury opracowane do koniugacji i oczyszczania immunokoniugatu L-DOS47 z powodzeniem wykorzystano w produkcji na dużą skalę. Przy zastosowaniu ustalonej chemii koniugacji i warunków
PL 238 187 B1 reakcji osiągnięto dobrą jednorodność poprzez wstępne mieszanie przeciwciała aktywowanego środkiem sieciującym z półproduktem ureazy HP, następnie doprowadzanie pH w celu aktywacji reakcji koniugacji. Przy stosunkach koniugacji wynoszących 8-11 przeciwciał na cząsteczkę ureazy zawartość resztkowej ureazy była praktycznie pomijalna i koniugat L-DOS47 można było oczyszczać wyłącznie z zastosowaniem ultradiafiltracji w celu usunięcia nieprzereagowanego przeciwciała i zhydrolizowanego środka sieciującego i z pominięciem wymagającego etapu dla rozdzielenia resztkowej ureazy od końcowego immunokoniugatu. Procedura ta dała produkt L-DOS47 o wysokiej czystości (> 95%) z wolną ureazą poniżej 2%. Powinowactwo wiązania L-DOS47 do unieruchomionego CEACAM6-A, jak oceniono z pomocą ELISA, było wprost proporcjonalne do liczby przeciwciał sprzężonych z ureazą i pozostawało na stałym poziomie, gdy stosunek koniugacji wynosił powyżej 6. Stosunki koniugacji mieściły się w zakresie od 9 do 11 przeciwciał na cząsteczkę ureazy dla wszystkich partii na dużą skalę, pokazując, że w tych warunkach osiągnięto optimum koniugacji. Podwójny test przeciwciała Western blot potwierdził chemiczną tożsamość koniugatu. W analizie mapowania peptydów ESI LC-MSE osiągnięto 100% odzyskiwanie sekwencji zarówno dla przeciwciała, jak i ureazy z immunokoniugatu L-DOS47. Sekwencje peptydów z więcej niż 3 resztami aminokwasowymi, wliczając sekwencje C-końcowe i N-końcowe zarówno AFAIKL2, jak i ureazy, potwierdzono z pomocą map fragmentów MS/MS b/y odpowiadających peptydów. Skuteczne miejsca koniugacji (4 po stronie AFAIKL2 i 6 po stronie ureazy) zidentyfikowano z pomocą analizy mapowania peptydów ESI LC-MSE próbek L-DOS47. Te usieciowane peptydy potwierdzono z pomocą map fragmentów MS/MS b/y powiązanych peptydów zarówno ze strony przeciwciała, jak i ureazy.
Swoistość L-DOS47 względem dwóch linii komórek wyrażających CEACAM6 BxPC-3 i A549 zilustrowano poprzez brak wiązania i cytotoksycznej aktywności DOS47 w porównaniu z odpowiednikiem sprzężonym z przeciwciałem L-DOS47. Z tych trzech badanych linii komórkowych BxPC-3 wykazywała najsilniejszy sygnał wiązania, natomiast A549 wykazała tylko umiarkowane wiązanie. Sygnał wiązania BxPC-3 wynosił około pięciokrotności tego w A549. Wyniki były zgodne z tymi obserwowanymi w testach cytotoksyczności. L-DOS47 indukował znacznie wyższy cytotoksyczny efekt w B niż w A549. Żadnej cytotoksycznej odpowiedzi nie zaobserwowano w MCF-7 z powodu braku wiązania L-DOS47. L-DOS47 jest badany jako potencjalny środek terapeutyczny w Fazie I badań klinicznych na ludziach na niedrobnokomórkowy nowotwór płuc.
Należy zrozumieć, że podczas gdy niniejsze ujawnienie opisano w połączeniu z powyższymi aspektami, to powyższy opis i przykłady w zamierzeniu ilustrują i nie ograniczają zakresu niniejszego ujawnienia. Inne aspekty, zalety i modyfikacje w obrębie zakresu niniejszego ujawnienia będą oczywiste dla znawców dziedziny, której niniejsze ujawnienie dotyczy.
Niniejsze ujawnienie nie jest ograniczone w zakresie przez określone opisane aspekty, które w zamierzeniu są jako pojedyncze ilustracje indywidualnych aspektów niniejszego ujawnienia, i dowolne kompozycje lub sposoby, które są funkcjonalnie równoważne, mieszczą się w zakresie tego ujawnienia. Będzie to oczywiste dla znawców dziedziny, że różne modyfikacje i zmiany można wprowadzać do sposobów i kompozycji według niniejszego ujawnienia bez odchodzenia od idei lub zakresu ujawnienia. Zatem niniejsze ujawnienie w zamierzeniu pokrywa modyfikacje i zmiany tego ujawnienia, o ile mieszczą się one w zakresie załączonych zastrzeżeń i ich równoważników.
Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe wymienione w tym opisie są włączone tu jako odniesienie w tym samym zakresie, jakby każda pojedyncza publikacja lub zgłoszenie patentowe było szczególnie i osobno wskazane jako włączone przez odniesienie.

Claims (45)

1) łączenie aktywowanego przeciwciała i ureazy w rozpuszczalniku zawierającym kwasowy wodny bufor, w którym aktywowane przeciwciało i ureaza zasadniczo nie reagują, w wyniku czego tworzy się mieszanina reakcyjna, przy czym dystrybucja aktywowanego przeciwciała i ureazy w rozpuszczalniku jest równomierna, i
1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny wodny roztwór odpowiedni do dożylnej iniekcji i koniugat jednodomenowe przeciwciało-ureaza , przy czym koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań jednodomenowego przeciwciała na ugrupowanie ureazy, przy czym jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem antygenu CEACAM6, i przy czym kompozycja jest zasadniczo wolna od niesprzężonej ureazy.
2) zwiększanie pH mieszaniny z (1) buforem zasadowym, tak że aktywowane przeciwciało łatwo reaguje z ureazą, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , o stosunku koniugacji 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań jednodomenowego przeciwciała na ugrupowanie ureazy, i
2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że niesprzężona ureaza wynosi mniej niż 5% w/w.
3) oczyszczanie koniugatu przeciwciało-ureaza w etapie oczyszczania, przy czym sposób nie obejmuje etapu oczyszczania chromatograficznego.
3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że jest wolna od niewodnych rozpuszczalników HPLC.
4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1,2 lub 3, znamienna tym, że pH wynosi około 6,8.
5. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienna tym, że koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 ugrupowań jednodomenowych przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
6. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienna tym, że koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący 6 lub więcej ugrupowań jednodomenowych przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
7. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-5 znamienna tym, że koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący 8-11 ugrupowań jednodomenowych przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
8. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-7, znamienna tym, że ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej.
9. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. od 1-8, znamienna tym, że jednodomenowym przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie.
10. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienna tym, że jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem antygenu CEACAM6 wyrażanego przez niedrobnokomórkowego raka płuc.
11. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-10, znamienna tym, że jednodomenowe przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-8 M.
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 12, znamienna tym, że koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd nie większej niż około 1 x 10-10M.
PL 238 187 B1
14. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-13, znamienna tym, że koniugat ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości IC50 nie większej niż około 5 nM.
15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 14, znamienna tym, że wartość IC50 wynosi około 3,22 nM.
16. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-15, znamienna tym, że koniugat wiąże się z CEACAM6 z wartością IC50 wynoszącą około 20 ng/ml,
17. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-16, znamienna tym, że jednodomenowe przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO. 1.
18. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-16, znamienna tym, że jednodomenowe przeciwciało zawiera polipeptyd zawierający co najmniej jedną modyfikację w sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO. 1, przy czym wspomniana modyfikacja zachowuje właściwość funkcjonalną polipeptydu.
19. Kompozycja farmaceutyczna jak określona w zastrz. 1-18, do zastosowania jako lek do leczenia nowotworu wyrażającego antygen CEACAM6 u osobnika.
20. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 19, znamienna tym, że nowotworem jest jeden lub większa liczba spośród niedrobnokomórkowego raka płuc, nowotworu sutka, trzustki, jajnika, płuc, okrężnicy lub ich kombinacja.
21. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 20, znamienna tym, że nowotworem jest niedrobnokomórkowy rak płuc.
22. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 19-21, znamienna tym, że osobnikiem jest człowiek.
23. Sposób wytwarzania kompozycji zawierającej koniugat przeciwciało-ureaza i nie więcej niż około 5% w/w ureazy względem masy koniugatu przeciwciało-ureaza, przy czym sposób obejmuje:
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że etapem oczyszczania jest ultradiafiltracja.
25. Sposób według zastrz. 23 lub 24, znamienny tym, że koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 8-11 ugrupowań przeciwciał na ugrupowanie ureazy.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że kwasowy wodny bufor ma pH około 6,0-7,0, taki jak bufor octanu sodu.
27. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 23-26, znamienny tym, że zasadowym buforem jest roztwór boranu sodu, dla doprowadzenia pH do około 8-9.
28. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 23-27, znamienny tym, że kompozycja zawiera około 10-20% niesprzężonego jednodomenowego przeciwciała względem masy całkowitego białka przed etapem oczyszczania.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że kompozycja zawiera mniej niż około 1% niesprzężonego jednodomenowego przeciwciała względem masy całkowitego białka po etapie oczyszczania.
30. Sposób zwiększania powinowactwa wiązania przeciwciała do antygenu guza obejmujący: sprzęganie wielu cząsteczek jednodomenowego przeciwciała do cząsteczki ureazy, w wyniku czego tworzy się koniugat przeciwciało-ureaza , mający stosunek koniugacji 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub 12 cząsteczek jednodomenowego przeciwciała na cząsteczkę ureazy, przy czym jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6, przy czym koniugat przeciwciało-ureaza ma powinowactwo wiązania do wspomnianego CEACAM6 co najmniej około 100-krotnie wyższe niż niesprzężone przeciwciało.
PL 238 187 B1
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący 3, 4, 5, 6, cząsteczek jednodomenowych przeciwciał na cząsteczkę ureazy.
32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że koniugat przeciwciało-ureaza ma stosunek koniugacji wynoszący około 6 lub więcej cząsteczek jednodomenowego przeciwciała na cząsteczkę ureazy.
33. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że koniugat ma stosunek koniugacji wynoszący 8, 9, 10 lub 11 cząsteczek jednodomenowych przeciwciał na cząsteczkę ureazy.
34. Sposób według zastrz. 30, w którym koniugat ma średni stosunek koniugacji wynoszący około 8-11 cząsteczek jednodomenowych przeciwciał na cząsteczkę ureazy.
35. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-34, w którym ureazą jest ureaza z kanawalii mieczokształtnej.
36. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-35, w którym przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane lub inne niż ludzkie.
37. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-36, w którym antygen guza jest wyrażany przez niedrobnokomórkowego raka płuc.
38. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-37, w którym jednodomenowe przeciwciało ma swoistość względem CEACAM6.
39. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-38, w którym jednodomenowe przeciwciało ma powinowactwo wiązania do CEACAM6 o wartości Kd wyższej niż około 1 x 10-6 M.
40. Sposób według zastrz. 39, w którym koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością Kd nie większą niż około 1 x 10-8 M.
41. Sposób według zastrz. 40, w którym koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością Kd nie większą niż około 1 x 10-10 M.
42. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-41, w którym koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością IC50 nie większą niż około 5 nM.
43. Sposób według zastrzeżenia 42, w którym wartość IC50 wynosi około 3,22 nM.
44. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 30-43, w którym koniugat wiąże się do CEACAM6 z wartością IC50 wynoszącą około 20 μg/ml.
45. Zestaw zawierający kompozycję określoną w którymkolwiek z zastrz.1-18 i instrukcje stosowania kompozycji w terapii leczenia nowotworu u osobnika.
PL423259A 2015-01-23 2016-01-22 Koniugaty przeciwciało-ureaza dla celów terapeutycznych PL238187B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562107210P 2015-01-23 2015-01-23
US62/107,210 2015-01-23
PCT/IB2016/050342 WO2016116907A1 (en) 2015-01-23 2016-01-22 Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL423259A1 PL423259A1 (pl) 2018-03-26
PL238187B1 true PL238187B1 (pl) 2021-07-19

Family

ID=56416507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL423259A PL238187B1 (pl) 2015-01-23 2016-01-22 Koniugaty przeciwciało-ureaza dla celów terapeutycznych

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11931422B2 (pl)
EP (1) EP3261678B8 (pl)
JP (2) JP6876618B2 (pl)
KR (1) KR102318994B1 (pl)
CN (1) CN107206103A (pl)
AU (1) AU2016210551B2 (pl)
BR (1) BR112017015582A2 (pl)
CA (1) CA2973538C (pl)
ES (1) ES2852001T3 (pl)
IL (1) IL253549B (pl)
MX (1) MX2017009537A (pl)
NZ (1) NZ733669A (pl)
PL (1) PL238187B1 (pl)
RU (1) RU2689689C2 (pl)
SG (1) SG11201705982PA (pl)
UA (1) UA121881C2 (pl)
WO (1) WO2016116907A1 (pl)
ZA (1) ZA201704709B (pl)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206103A (zh) 2015-01-23 2017-09-26 赫利克斯生物药品公司 用于治疗目的的抗体‑脲酶缀合物
CN110022891A (zh) * 2016-09-24 2019-07-16 赫利克斯生物药品公司 恢复肿瘤酸化t细胞的功能
JP2020504761A (ja) * 2017-01-05 2020-02-13 へリックス バイオファーマ コープ． 抗ｖｅｇｆｒ−２ウレアーゼコンジュゲート
US20180244784A1 (en) * 2017-01-05 2018-08-30 Heman Lap Man CHAO Vegfr2 antibodies
JP6899560B2 (ja) * 2017-05-23 2021-07-07 株式会社島津製作所 質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラム
KR20210029158A (ko) 2018-06-03 2021-03-15 람카프 바이오 베타 엘티디. Ceacam5 및 cd47에 대한 이중특이성 항체
KR102260478B1 (ko) 2019-08-19 2021-06-02 연세대학교 산학협력단 일나트륨 요소화물 결정 용해용 조성물
WO2021053587A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Klaus Strein Bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4329332A (en) 1978-07-19 1982-05-11 Patrick Couvreur Biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and compositions containing them
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2523445A1 (fr) 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
IE62496B1 (en) * 1990-04-19 1995-02-08 Res Dev Foundation Antibody conjugates for treatment of neoplastic disease
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
WO1994018955A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
WO1995014093A1 (en) 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
CA2130072C (en) 1994-08-12 2003-02-18 John W. Cherwonogrodzky Method of detecting a pathogen using a virus
WO1997015316A1 (en) 1995-10-27 1997-05-01 Merck & Co., Inc. Conjugates of gonadotropin releasing hormone
EP0824019B1 (en) 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
WO1998016201A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
US6514481B1 (en) 1999-11-22 2003-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Magnetic nanoparticles for selective therapy
ES2443416T3 (es) 2002-07-18 2014-02-19 Helix Biopharma Corp. Uso de ureasa para inhibir el crecimiento de células cancerosas
CA2547034C (en) * 2003-11-28 2014-02-18 National Research Council Of Canada Anticarcinoma antibodies and uses thereof
JP2008513533A (ja) 2004-09-23 2008-05-01 ゲルベ Ｃｅｓｔイメージング用の造影剤封入システム
EP2336324A2 (en) 2005-03-25 2011-06-22 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
WO2009079793A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 National Research Council Of Canada Non-aggregating human vh domains
AU2010224824B2 (en) 2009-03-18 2014-02-20 Ac Immune S.A. Method for therapeutic use
KR20130124507A (ko) 2010-11-16 2013-11-14 옥타파마 아게 응고 인자 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 함유한 용액으로부터 ＦＸＩ 및 ＦＸＩａ를 감소시키고 및/또는 제거하는 방법
CN103619875B (zh) 2011-01-28 2017-03-08 加拿大国家研究委员会 免疫球蛋白结构域的工程改造
JP6430373B2 (ja) * 2012-06-12 2018-11-28 プロミス、ニューロサイエンシズ、インコーポレイテッドＰｒｏｍｉｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ミスフォールドプリオンタンパク質を標的とする抗体および複合体
AU2014252666B2 (en) * 2013-04-08 2017-02-02 Helix Biopharma Corp. Use of antibody-urease conjugates for diagnostic and therapeutic purposes
CN107206103A (zh) 2015-01-23 2017-09-26 赫利克斯生物药品公司 用于治疗目的的抗体‑脲酶缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020143084A (ja) 2020-09-10
EP3261678B8 (en) 2021-03-17
JP2018506581A (ja) 2018-03-08
EP3261678A1 (en) 2018-01-03
IL253549A (en) 2019-08-29
RU2017129729A3 (pl) 2019-02-25
ZA201704709B (en) 2019-11-27
PL423259A1 (pl) 2018-03-26
CN107206103A (zh) 2017-09-26
EP3261678A4 (en) 2018-12-05
AU2016210551A1 (en) 2017-07-27
CA2973538A1 (en) 2016-07-28
KR102318994B1 (ko) 2021-10-29
KR20170131365A (ko) 2017-11-29
US11931422B2 (en) 2024-03-19
BR112017015582A2 (pt) 2018-03-13
WO2016116907A1 (en) 2016-07-28
MX2017009537A (es) 2018-04-10
NZ733669A (en) 2019-03-29
ES2852001T3 (es) 2021-09-10
IL253549B (en) 2021-07-29
RU2017129729A (ru) 2019-02-25
CA2973538C (en) 2021-01-12
US20240277863A1 (en) 2024-08-22
SG11201705982PA (en) 2017-08-30
RU2689689C2 (ru) 2019-05-28
AU2016210551B2 (en) 2019-03-07
UA121881C2 (uk) 2020-08-10
US20180000963A1 (en) 2018-01-04
JP6876618B2 (ja) 2021-06-02
EP3261678B1 (en) 2020-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240277863A1 (en) Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes
CN105979971B (zh) 抗体-药物缀合物和免疫毒素
US8828925B2 (en) Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery
CN113613679A (zh) 基于甘氨酸的接头的转谷氨酰胺酶缀合方法
WO2015165413A1 (zh) 一种新型的稳定型抗体药物耦联物及其制备方法和用途
WO2016074093A1 (en) Conjugates including an antibody moiety, a polypeptide that traverses the blood-brain barrier, and a cytotoxin
US20210061916A1 (en) Anti-prlr antibody-drug conjugates (adc) and uses thereof
Zheng et al. In vivo therapeutic effects of small molecule-drug conjugates enhanced by Fc grafting
WO2020109625A1 (en) Combined treatment of primary central nervous system lymphoma
PL217626B1 (pl) Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu raka
JP2022540975A (ja) 胆道癌の治療のための、ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合構築物の使用方法
EP4201431A1 (en) Intermediate for preparing antibody-drug conjugate (adc), preparation method therefor, and use thereof
US20220213165A1 (en) Therapeutic peptides
TW201809013A (zh) 用於藥物遞送之抗體融合蛋白
US12076400B2 (en) Methods of using a bispecific antigen-binding construct targeting HER2 in combination with CDK4/6 inhibitors for the treatment of breast cancer
KR20230143955A (ko) 신규 종양 항원-표적 항암제
US20130029903A1 (en) Azuvirin Peptides