CN113613679A - 基于甘氨酸的接头的转谷氨酰胺酶缀合方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体‑有效负载物缀合物的方法。该方法包括经由N‑末端甘氨酸(Gly)残基的N末端伯胺将包含或具有肽结构(以N‑>C方向显示)Gly‑(Aax)m‑B‑(Aax)n的接头缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基的步骤。

Description

基于甘氨酸的接头的转谷氨酰胺酶缀合方法
技术领域
本发明涉及通过微生物转谷氨酰胺酶产生抗体-有效负载物缀合物的方法。本发明进一步提供接头、接头-有效负载物构建体和/或抗体-有效负载物构建体。
背景技术
对于靶向治疗癌症或炎症性疾病而言，将高效的有效负载物负载到抗体上引起了日益浓厚的兴趣。这样产生的构建体称为抗体-有效负载物缀合物，或抗体-药物缀合物(ADC)。
目前，七个ADC已获得FDA批准(Adcetris，Kadcyla，Besponsa，Mylotarg，Polivy，Padcev，Enhertu)，所有这些药物的有效负载物都以非位点特异性方式与抗体化学连接。因此，在抗体和有效负载物之间的化学计量关系(有效负载物-抗体比，或药物与抗体比，DAR)以及抗体上的缀合位点方面，所得产物是高度异质的。尽管在同一药物产品中，但是产生的每个物种可以具有不同的性质，而这些性质可能会导致各种不同的体内药代动力学性质和活性。
在之前的体内研究(Lhospice等人，2015)中，与FDA批准的ADC相比，位点特异性药物连接导致显著更高的肿瘤摄取(～2x)，在非靶向组织中的摄取减少，并且最大耐受剂量至少高出3倍。这些数据表明，与化学修饰的ADC相比，化学计量学上明确定义的ADC显示出改善的药代动力学和更好的治疗指标。
作为位点特异性技术，酶促缀合引起了极大的兴趣，因为这些缀合反应通常很快并且可以在生理条件下进行。在可用的酶中，来自茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)物种的微生物转谷氨酰胺酶(MTG)作为对功能性部分(包括抗体)的常规化学蛋白质缀合的有吸引力替代品，越来越受到关注。MTG在生理条件下催化蛋白质或肽的“反应性”谷氨酰胺与蛋白质或肽的“反应性”赖氨酸残基之间的转酰胺反应，而后者也可以是简单的低分子量伯胺，例如5-氨基戊基(Jeger等人，2010，Strop等人，2014)。
形成的键是异肽键，其是不形成相应多肽或蛋白质的肽键主链的一部分的酰胺键。它在含有酰基谷氨酰胺的氨基酸供体序列的谷氨酰残基的γ-甲酰胺与根据本发明的含有氨基供体的底物的伯(1°)胺之间形成。
根据本发明人和其他人的经验，似乎只有少数谷氨酰胺通常被MTG靶向，从而使MTG成为用于位点特异性和化学计量蛋白质修饰的有吸引力的工具。
以前，谷氨酰胺295(Q295)被鉴定为不同IgG类型重链上唯一被MTG通过低分子量伯胺底物特异性靶向的反应性谷氨酰胺(Jeger等人，2010)。
然而，仅在用PNGase F去除天冬酰胺残基297(N297)处的聚糖部分后，才可能与Q295进行定量缀合，而糖基化抗体无法有效缀合(缀合效率<20％)。Mindt等人(2008)和Jeger等人(2010)和Dickgiesser等人2020的研究也支持这一发现。
为了避免去糖基化，还可以在残基N297处插入点突变，导致被称为去糖基化的糖基化消融。
然而，这两种方法都有明显的缺点。在GMP方面，酶促去糖基化步骤是不期望的，因为必须确保从培养基中去除去糖基化酶(例如PNGase F)和裂解的聚糖，以确保高纯度产物。
N297被另一种氨基酸的取代也有不利影响，因为它可能会影响CH2结构域的整体稳定性，并因此影响整个缀合物的功效。此外，在N297处存在的聚糖具有重要的免疫调节作用，因为它会触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)等。这些免疫调节作用会在去糖基化或N297被另一种氨基酸取代后消失。
此外，用于有效负载物连接的抗体的基因工程可以具有缺点，因为序列插入可能增加免疫原性并降低抗体的整体稳定性。
因此，本发明的一个目的是提供一种基于转谷氨酰胺酶的抗体缀合方法，其不需要抗体的预先去糖基化，特别是N297的去糖基化。
本发明的另一个目的是提供一种基于转谷氨酰胺酶的抗体缀合方法，其不需要替换或修饰CH2结构域中的N297。
本发明的另一个目的是提供一种抗体缀合技术，该技术允许制造高度同质的缀合产物，无论是关于缀合的化学计量学或位点特异性。
根据本发明的独立权利要求的方法和手段可以满足这些和进一步的目的。从属权利要求涉及具体实施方案。
发明内容
本发明涉及通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-接头缀合物和/或抗体-有效负载物缀合物的方法和接头结构。下面将详细讨论本发明及其特征的一般优点。
附图说明
图1示出本发明的一个方面的图示。MTG＝微生物转谷氨酰胺酶。星形表示有效负载物或连接部分B。Gp是Gly残基，其位于肽的N末端，并且是MTG的底物。注意到，此过程允许在N297处保持糖基化。注意到，在B/星形是连接部分的情况下，实际有效负载物仍必须与该部分缀合。
如本文别处所讨论的，B/星形可以是或包含连接部分，例如生物正交基团(例如，叠氮化物/N3-基团)，其适用于对含有DBCO的有效负载物(例如毒素或荧光染料或金属螯合剂，如DOTA或NODA-GA)进行应变促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC)点击化学反应。这种基于点击化学的“两步化学酶促”方法将功能部分连接到抗体具有以下主要优点，即它可以在对抗体的低分子过量下被点击，通常例如每个缀合位点5eq或更低(Dennler等人，2014)。这允许以较好的成本效益生产ADC。此外，从荧光染料到金属螯合剂，几乎任何探针都可以用这种方法点击(参见Spycher等人，2017，Dennler等人，2015)。
B/星形也可以是实际的有效负载物，例如毒素。这样的实施方案允许在一个步骤中快速制造所得化合物，促进纯化和生产。
图2显示包含根据本发明的寡肽的接头肽的实例。顺序是GlyAlaArgLys(N3)(GARK1，其中K1＝Lys(N3))。Lys(N3)是Lys残基，其中伯胺已被叠氮化物基团(-N-N≡N或-N3)取代。根据本发明的命名法，Lys(N3)或单独的N3可被视为连接部分B(在该实施例中，N3适用于点击化学)。
该肽在Q295位置与天然IgG1抗体有效缀合(根据非优化条件下的LC-MS分析估计为约77.3％)。
重要的是理解，在本文所示的一些接头肽中，C末端的部分被简单地指定为N3。然而，这应当理解为Lys(N3)的缩写。例如，GAR(N3)对应于肽GlyAlaArgLys(N3)或GARK(N3)。也就是说，6-叠氮基-L-赖氨酸以三个字母代码可缩写为Lys(N3)或以单个字母代码可缩写为K(N3)或(N3)。因此应当理解，当肽的一部分总是与单个氨基酸残基Lys(N3)相关而不与二肽Lys-Lys(N3)相关时的K(N3)。另一方面，二肽Lys-Lys(N3)将以单个字母代码命名为KK(N3)。
此外，重要的是理解，在本文所示的不同接头肽中，C末端或侧链上的伯胺可能受到保护，也可能不受保护，即使另有说明。保护可以通过例如前者的酰胺化和/或后者的乙酰化来实现。在本发明的上下文中，包括受保护和未受保护的接头肽。
例如，GARK(N3)确实包含两个变体，其中C末端受保护或不受保护。下图显示C末端Lys(N3)残基，其中C末端受酰胺化保护：
Figure BDA0003269871400000041
图3显示针对天然IgG1抗体的小的给定肽文库的筛选结果。筛选含有MTG反应性N末端氨基酸残基或衍生物(β-丙氨酸)的不同肽。可以看出，单或双N末端甘氨酸最有效。LC-MS用于分析。
图4和5显示其中接头包含具有游离巯基的Cys残基的实施方案，适用于将包含马来酰亚胺的毒素接头构建体与其缀合。
图4显示缀合反应，并且图5显示一些潜在的接头构建体。
图6显示根据本发明的肽与抗体的Gln缀合(例如IgG的Q295或分子工程)的两步缀合过程(图6A)和一步缀合过程(图6B)。下表1阐明此处使用的两个术语：
表1：一步和两步缀合
Figure BDA0003269871400000042
Figure BDA0003269871400000051
在两步过程中，接头肽是Gly-(Aax)n-Cys连接部分。Gly残基经由微生物转谷氨酰胺酶缀合到抗体中的Gln残基，并且然后连接部分(在这种情况下是具有游离巯基的Cys残基)经由马来酰亚胺缀合到有效负载物(在这种情况下是携带MC/VC/PABDC接头结构的MMAE毒素)。
在一步过程中，接头肽Gly-(Aax)m已经与有效负载物缀合。Gly残基与抗体中的Gln残基缀合，并且有效负载物由携带VC/PABC结构的MMAE毒素组成。VC结构的缬氨酸残基通过肽键与接头肽的最后一个氨基酸缀合。
图7显示包括适用于双有效负载物连接的接头的接头的两个实例。
图7A显示第一连接部分是叠氮化物(N3)，而第二连接部分是四嗪(都是生物正交的)的肽。寡肽的结构是GlyAlaArgLys(N3)Lys(四嗪)(GARK1K2，其中K1＝Lys(N3)，K2＝Lys(四嗪))。
图7B显示携带叠氮化物(N3)和来自Cys部分的游离巯基的肽。寡肽的结构是GlyAlaArgLys(N3)Cys(GARK1C，其中K1＝Lys(N3))。
每个连接部分都是可以同时点击的生物正交相容的基团。
因此，这些接头允许将两种不同的有效负载物缀合到抗体CH2结构域的Q295。使用第二有效负载物可以开发一类全新的抗体-有效负载物缀合物，其在功效和效力方面超越当前的治疗方法。还设想新的应用领域，例如，用于成像和治疗或术中/术后手术的双型成像(参见Azhdarinia A.等人，Molec Imaging and Biology，2012)。例如，双重标记抗体包含用于术前正电子发射断层扫描(PET)的分子成像剂和用于引导划定手术切缘的近红外荧光(NIRF)染料，可以极大地增强癌症的诊断、分期和切除(参见Houghton JL.等人，PNAS2015)。PET和NIRF光学成像提供互补的临床应用，使无创全身成像能够分别在手术期间定位疾病和识别肿瘤边缘。然而，由于缺乏合适的位点特异性方法，迄今为止这种双重标记探针的生成一直很困难。由于探针的随机缀合，通过化学方法连接两个不同的探针导致几乎不可能的分析和再现性。此外，在Levengood M.等人(Angewandte Chemie，2016)的一项研究中，双重药标记抗体连接两种不同的瑞奥西汀毒素(具有不同的理化性质并发挥互补的抗癌活性)赋予细胞系和异种移植模型中的活性，这些模型对由单个瑞奥西汀组分组成的ADC无效。这表明双重标记ADC能够比单独的单一常规ADC更有效地解决癌症异质性和耐药性问题。由于对ADC的一种耐药机制包括从癌细胞中主动泵出细胞毒性部分，因此另一种双重药物应用可能包括额外和同时递送一种药物，该药物可特异性阻断细胞毒性药物的外排机制。因此，这种双重标记ADC可以比常规ADC更有效地帮助克服癌症对ADC的耐药性。
使用其中炔烃或四嗪/反式环辛烯作为接头的类似结构同样适用并涵盖在本发明的范围和要点内。
重要的是理解，在本文所示的一些接头肽中，C末端的部分被简单地指定为N3。然而，这应当理解为Lys(N3)的缩写。例如，GAR(N3)或GARK(N3)实际上表示GARK1，其中K1＝Lys(N3)，或GlyAlaArgLys(N3)。
此外，重要的是理解，在本文所示的不同接头肽中，C末端可能受到保护，也可能不受保护，即使另有说明。保护可以通过C末端的酰胺化来实现。由于接头与抗体的缀合经由接头的N-末端甘氨酸残基的伯胺实现，接头的N-末端优选是未保护的。在本发明的上下文中，包括受保护和未受保护的接头肽。例如，GARK(N3)确实包含两种变体，a)如上所述两个末端未受保护，或b)如上所述仅C末端受保护。
C末端是否被酰胺化的问题是实践问题，取决于缀合条件(缓冲剂、培养基、其他反应成分的反应性等)。
图8A和B分别显示具有两个叠氮化物接头部分的两种可能的接头结构。图8A显示GlyGlyAlaArgLys(N3)Lys(N3)(GGARK1K2，其中K1和K2＝Lys(N3))。图8B显示GlyGlyAlaArgLys(N3)ArgLys(N3)(GGARK1RK2；其中K1和K2＝Lys(N3))。以这种方式，可以实现抗体有效负载物比为4。带电Arg残基的存在有助于在溶液中保持疏水性有效负载物。
重要的是理解，在本文所示的一些接头肽中，C末端的部分被简单地指定为N3。然而，这应当理解为Lys(N3)的缩写。例如，GAR(N3)或GARK(N3)实际上表示GARK1，其中K1＝Lys(N3)或GlyAlaArgLys(N3)。
图9显示适合MTG介导的与天然抗体缀合的其他接头。这些接头结构包含适用于在第二步中基于点击化学连接功能有效负载物的连接部分(叠氮化物，N3)，或提供适用于连接到马来酰亚胺的硫醇基团的Cys残基。由于这些结构基于肽，因此其化学性质很好理解，并且由单个氨基酸的结构单元组装，因此可以快速轻松地合成和评估新的接头。下表2给出概览：
表2
Figure BDA0003269871400000071
图10显示IgG1抗体的轻链未被缀合修饰。显示的是IgG1轻链的解卷积LC-MS光谱。
图11A显示用N3-功能性接头GGARK(N3)选择性修饰的曲妥珠单抗天然IgG1重链的解卷积LC-MS光谱。从光谱中可以看出，重链仅用一个肽接头进行选择性和定量(>95％)修饰，因为观察到的质量差异对应于预期的肽质量偏移(Mw未修饰重链＝50595Da，预期Mw＝51091Da，测量的Mw＝51092Da)。
图11B显示用DBCO-PEG4-Ahx-DM1选择性点击到预安装在重链上的N3功能接头GGARK(N3)的曲妥珠单抗天然IgG1重链的解卷积LC-MS光谱。从光谱中可以看出，重链被选择性和定量(>95％)点击。
图11C显示在非优化缀合条件下用GGARK(N3)修饰的另一条IgG1重链的解卷积LC-MS。缀合率：83％。
图12A显示用GARK(N3)修饰的曲妥珠单抗重链的解卷积LC-MS。实现>95％的缀合效率。
图12B显示用GARK(N3)修饰的曲妥珠单抗重链的解卷积LC-MS，用DBCO-PEG4-Ahx-DM1点击，获得>95％的点击效率，产生具有DAR 2的ADC。
图13显示具有不同编号方案的Ig CH2结构域的概览。为了本发明的目的，使用EU编号。
图14显示转谷氨酰胺酶反应以将具有游离伯胺的N末端Gly残基的接头缀合到抗体的Q295残基的游离伯胺。
图15点击化学反应方案(应变促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC)以将接头GlyAlaArgLys(N3)(GARK1，其中K1＝Lys(N3))缀合到用有效负载物标记的二苯并环辛炔。
图16显示可以在本发明的上下文中使用的不同肽接头，每个都包含非天然氨基酸。
图17显示可以根据本文所述的方法缀合到抗体的不同接头毒素构建体。在所有情况下，Gly残基都携带用于转谷氨酰胺酶缀合的伯胺。
图17A该图显示不可切割的GGARR-Ahx-May肽-毒素缀合物，其具有两个精氨酸基团，用于增加疏水有效负载物美登素(Maytansine，May)的溶解度。N末端甘氨酸残基的伯胺用于经由MTG缀合到抗体。Ahx-间隔子用于将带正电荷的精氨酸与May分离，帮助后者更有效地缀合其靶标，因为接头不可切割。
图17B该图显示不可切割的GGARR-PEG4-May肽-毒素缀合物，具有两个精氨酸基团和一个PEG4间隔子，所有三个部分用于增加疏水有效负载物May的溶解度。N末端甘氨酸残基的伯胺用于经由MTG缀合到抗体。PEG4还有助于将带正电的精氨酸与May分离，帮助后者更有效地缀合其靶标，因为接头不可切割。
图17C该图显示具有两个精氨酸基团、PEG4-间隔子、PABC-基团和val-cit序列(VC)的可裂解GGARR-PEG4-VC-MMAE肽-毒素缀合物。N-末端甘氨酸残基的伯胺经由MTG、精氨酸基团和PEG4-间隔子缀合到抗体以增加溶解度，并且PABC-基团和val-cit序列有助于释放毒素。
图17D该图显示具有两个精氨酸基团和没有PEG-间隔子和val-cit序列的PABC-基团的可裂解GGARR-MMAE肽-毒素缀合物。由于GGARR-基团本质上可被肽酶降解，通过自毁PABC部分释放毒素可能不需要val-cit序列，并且由于两个精氨酸基团非常亲水，可能不需要PEG-间隔子，因此保持整个肽-毒素缀合物尽可能小以尽量减少在血液循环中与其他分子的不希望的相互作用。
图18显示根据实施例3进行的细胞毒性测定的结果。用根据本发明的方法生成的并且包含点击连接到每个接头的May部分的Her-GARK(N3)(P684)和Her-GGARK(N3)(P579)N末端甘氨酸ADC具有与Kadcyla类似的对SK-BR3细胞的效力。因此，通过新型接头技术提供的优势(易于制造、位点特异性、稳定的化学计量、无需将该抗体去糖基化)在细胞毒性方面没有任何劣势。
图19：βAla-Gly-Ala-Arg-Lys(N3)的结构。βAla表示β-丙氨酸，其结构与甘氨酸类似。然而，与具有N-末端甘氨酸的GGARK(N3)(参见实施例2)相比，所述接头具有较差的缀合效率。
具体实施方式
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于所描述的方法的特定组件或工艺步骤，因为此类设备和方法可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在进行限制。必须注意，除非上下文另有明确规定，否则在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和/或复数所指对象。此外应当理解，在给出由数值界定的参数范围的情况下，该范围被认为包括这些限制值。
还应当理解的是，本文公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单个实施方案。与一个实施方案讨论的特征也意在本文所示的其他实施方案中公开。如果在一种情况下，特定特征没有与一个实施方案一起公开，而是在另一个实施方案中公开，技术人员将理解这并不一定意味着所述特征未在所述另一实施方案中公开。本领域技术人员将理解，对于该另一实施方案，公开其特征也是本申请的主旨，未做此公开仅仅为了清楚的目的并且为了将说明书的篇幅保持在可管理的范围内。
此外，本文引用的文件的内容以引用方式并入。这尤其适用于公开标准或常规方法的文件。在这种情况下，通过引用并入的主要目的是提供足以实施的公开，并避免冗长的重复。
根据第一方面，提供一种通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-有效负载物缀合物或抗体-接头缀合物的方法，该方法包括经由N-末端甘氨酸(Gly)残基的N-末端伯胺将接头缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基的步骤，所述接头包含肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数，
·n是介于≥0和≤12之间的整数，
·m+n≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B是有效负载物或连接部分。
如本文所用，术语“伯胺”涉及被两个氢原子取代的具有通式R-NH2的胺。
在某些实施方案中，肽接头可以包含两个或更多个连接部分和/或有效负载物。也就是说，接头可以具有肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)
其中
·m、n和o是介于≥0和≤12之间的整数，
·m+n+o≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B1和B2是有效负载物和/或连接部分，其中B1和B2可以彼此相同或不同。
在其他实施方案中，肽接头可以包含三个连接部分和/或有效负载物。也就是说，接头可以具有肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o-B3-(Aax)p
其中
·m、n、o和p是介于≥0和≤12之间的整数，
·m+n+o+p≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B1、B2和B3是有效负载物和/或连接部分，其中B1、B2和B3可以彼此相同或不同。
应当理解，本发明还包括包含多于三个连接部分和/或有效负载物，例如4、5或6个连接部分和/或有效负载物的接头。在这种情况下，接头的肽结构遵循与上述包含2或3个连接部分和/或有效负载物的接头相同的模式。
在某些实施方案中，提供一种通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-有效负载物缀合物的方法，该方法包括经由N-末端甘氨酸(Gly)残基的N-末端伯胺将接头缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基的步骤，所述接头具有肽结构的接头(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数
·n是介于≥0和≤12之间的整数
·m+n≥0，
·Aax可以是任何天然或非天然存在的L-或D-氨基酸，或氨基酸衍生物或模拟物，并且
·B是有效负载物或连接部分。
在某些实施方案中，本发明涉及通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-有效负载物缀合物或抗体-接头缀合物的方法，该方法包括经由N-末端甘氨酸(Gly)残基的N-末端伯胺将具有以下肽结构的接头(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基的步骤。在这种情况下，应当理解部分B可以包含多于一个有效负载物和/或连接部分。例如，B可以代表(B’-(Aax)o-B”)，其中B’和B”是有效负载物和/或连接部分，并且其中o是介于≥0和≤12之间的整数。或者，B可以代表(B’-(Aax)o-B”-(Aax)p-B”’)，其中B’、B”和B’”是有效负载物和/或连接部分，其中o和p介于≥0和≤12之间的整数。
因此，在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中接头包含两个或更多个有效负载物和/或连接部分。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中两个或更多个有效负载物和/或连接部分B彼此不同。
也就是说，根据本发明的接头可以包含单个有效负载物或连接部分。在某些实施方案中，接头包含两个连接部分，其中两个连接部分是相同的。在其他实施方案中，接头包含两个连接部分，其中两个连接部分不同。在又一个实施方案中，接头包含两个相同或不同的有效负载物。本发明进一步包括包含一个或多个有效负载物和一个或多个连接部分的接头。
还应当理解，并非所有有效负载物或连接部分都可以用作链内有效负载物或连接部分，例如，因为它们不具有与第一个Aax部分的C末端羧基和第二个Aax部分的N末端氨基形成肽或酰胺键的官能团。在这种情况下，优选这样的有效负载物或连接部分位于接头的C末端，在那里它们优选连接到接头的C末端Aax部分的羧基。在其中有效负载物或连接部分位于接头的链内位置的情况下，优选有效负载物或连接部分是氨基酸、氨基酸衍生物或连接到具有通式-NH-CHR-CO-的分子。
在优选实施方案中，m和/或n是≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10或≥11。在其他优选实施方案中，m和/或n是≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5、≤4、≤3、≤2或≤1。在进一步优选实施方案中，m+n是≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10或≥11。在更进一步的优选实施方案中，m+n是≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5、≤4、≤3、≤2或≤1。
两个范围的成员可以与另一个组合以公开具有下限和上限的优选长度范围。
因此，在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中m+n，和任选的m+n+o和m+n+o+p，是≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5或≤4。
重要的是理解，在本文所示的不同接头肽中，C末端可能受到保护，也可能不受保护，即使另有说明。保护可以通过前者的酰胺化来实现。在本发明的上下文中，包括受保护和未受保护的接头肽。
发明人已经表明，该方法适用于非常成本有效且快速地生产位点特异性抗体-有效负载物缀合物(24-36小时，或任选地48小时)，因此允许生产此类分子的大型文库，和随后在高通量筛选系统中筛选它。
与此相反，Cys工程化过程需要至少约3-4周，在该Cys工程化过程中产生抗体有效负载物缀合物，其中有效负载物经由遗传(分子)工程化的Cys残基缀合到抗体。
通常，该方法允许将大量有效负载物缀合到抗体。对于每个有效负载物，可以从大型接头库中识别合适的肽接头结构以提供最佳的临床和非临床特征。这在其中接头结构固定的其他方法中是不可能的。此外，根据本发明的方法允许产生包含两种或更多种不同有效负载物的抗体-有效负载物缀合物，其中每个有效负载物以位点特异性方式缀合到抗体。因此，根据本发明的方法可用于产生具有新的和/或优越的治疗或诊断能力的抗体。
接头可以包含任何氨基酸，包括但不限于α-、β-、γ-、δ-和ε-氨基酸。在α-氨基酸的情况下，接头可以包含任何天然存在的L-或D-氨基酸。天然存在的L-或D-氨基酸包括可在自然界中发现的任何L-或D-氨基酸。也就是说，术语“天然存在的L-或D-氨基酸”涵盖在天然存在的蛋白质中用作结构单元的所有规范或蛋白质氨基酸。此外，术语“天然存在的L-或D-氨基酸”包括所有可以在自然界中发现的非规范L-或D-氨基酸，例如作为代谢中间体或降解产物或作为其他非-蛋白质大分子的结构单元。
此外，接头可以包含非天然存在的L-或D-氨基酸。非天然存在的L-或D-氨基酸包括以前在自然界中未发现的具有通式H2N—CHR—COOH的任何分子。
技术人员知道在确定L-或D-氨基酸是天然存在或非天然存在时要参考的资源和数据库。然而，在有疑问的情况下，应当理解术语“天然或非天然存在的L-或D-氨基酸”包括具有通式H2N—CHR—COOH结构的任何分子的L-和D-异构体，与所述分子的来源无关。
在某些实施方案中，本发明的接头还可以包含具有通式H2N—CR1R2—COOH的天然或非天然存在的非手性氨基酸。
此外，本发明的接头可以包含氨基酸衍生物。氨基酸衍生物是通过一种或多种化学反应(例如α-氨基、α-羧酸基团和/或氨基酸侧链的化学反应)衍生自天然或非天然存在的氨基酸的化合物。也就是说，术语氨基酸衍生物涵盖具有结构-NH-CHR-CO-的任何分子，其衍生自天然或非天然存在的L-或D-氨基酸。由于预想本发明的氨基酸衍生物是基于肽的接头的一部分，优选通过天然或非天然存在的L-或D-氨基酸的氨基酸侧链的一种或多种化学反应获得氨基酸衍生物，或在其中氨基酸衍生物位于肽的C末端的情况下，通过天然或非天然存在的L-或D-氨基酸的α-羧酸基团的一种或多种化学反应获得氨基酸衍生物。应注意天然和非天然存在的氨基酸可以是氨基酸衍生物，反之亦然。
可以包含在本发明的接头中的非常规氨基酸、非天然存在的氨基酸和氨基酸衍生物的实例包括但不限于α-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、胍丁胺、{S)-2-氨基-4-((2-氨基)嘧啶基)丁酸、α-氨基异丁酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、叔丁基甘氨酸、瓜氨酸、环己基丙氨酸、脱氨基酪氨酸、L-(4-胍基)苯基丙氨酸、高精氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、高赖氨酸、正甲酰基色氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、(S)-4-哌啶基-(N-脒基)甘氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、肌氨酸和2-噻吩丙氨酸。
除上述α-氨基酸外，本发明的接头还可以包含一种或多种β-、γ-、δ-或ε-氨基酸。因此，在某些实施方案中，接头可以是肽模拟物。肽模拟物可以不排他地包含在两个α-氨基酸之间形成的经典肽键，但也可以额外地或替代地包含在α氨基酸和β-、γ-、δ-或ε-氨基酸之间或两个β-、γ-、δ-或ε-氨基酸之间形成的一个或多个酰胺键。在图16(Gly-β-Ala-Arg-Lys(N3))中显示接头的实例，其为肽模拟物并且包含α-氨基酸和β-氨基酸之间的酰胺键。因此，在其中接头被描述为肽的本发明的任何情况下，应当理解接头也可以是肽模拟物并且因此不排他地由α-氨基酸组成，但也可以替代地包含一个或多个β-、γ-、δ-或ε-氨基酸或未归类为氨基酸的分子。可以包含在本发明的接头中的β-、γ-、δ-或ε-氨基酸的实例包括但不限于β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、6-氨基己酸和抑胃酶氨酸。
术语“D-氨基酸”被理解为包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸的D-对应物。
由于本发明的肽接头是基于肽的，一旦抗体-有效负载物缀合物被内化到目标细胞中，它们很可能被宿主细胞肽酶水解。因此，在某些实施方案中，接头不一定需要包含组织蛋白酶切割位点。因此，在一个实施方案中，包含或具有肽结构的接头不能被组织蛋白酶切割。这尤其包括组织蛋白酶B。在另一个实施方案中，包含或具有肽结构的接头不包含缬氨酸-丙氨酸基序或缬氨酸-瓜氨酸基序。然而，应当理解，本发明还包括包含有组织蛋白酶切割位点(例如缬氨酸-丙氨酸或缬氨酸-瓜氨酸)的接头。例如，包含非常规或D-氨基酸的接头可能无法被宿主细胞肽酶有效切割。在这种情况下，接头中的组织蛋白酶切割位点可以改善内化到宿主细胞后有效负载物的释放。如果需要，接头可以进一步包含允许有效负载物在靶细胞内有效释放的其他基序或自毁基团。
ADC接头中使用、但没有赖氨酸残基的一种典型的二肽结构是缬氨酸-瓜氨酸基序，例如在本妥昔单抗Vedotin中提供以及在Dubowchik和Firestone 2002中讨论的。该接头可以被组织蛋白酶B切割以在疾病部位释放毒素。这同样适用于例如在SGN-CD33A中提供的缬氨酸-丙氨酸基序。
在另一个实施方案中，接头不包含聚乙二醇或聚乙二醇衍生物。
聚乙二醇(PEG)是聚醚化合物，从工业制造到医药都有许多应用。PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)，具体取决于其分子量。PEG的结构通常表示为H-(O-CH2-CH2)n-OH。然而，应当理解，本发明的接头可以包含PEG或PEG-衍生物。
因此重要的是理解，因为B可以是有效负载物或连接部分，所以根据本发明的方法具有两个主要实施方案，如下表3所示：
表3
Figure BDA0003269871400000151
也就是说，在某些实施方案中，有效负载物通过化学合成缀合到接头。因此，接头可具有结构Gly-(Aax)m-有效负载物或Gly-(Aax)m-有效负载物-(Aax)n。例如，有效负载物可以通过化学合成与肽的C末端连接。因此，在某些实施方案中，接头可具有结构Gly-Ala-Arg-有效负载物、Gly-Ala-Arg-Arg-有效负载物、Gly-Gly-Ala-Arg-有效负载物、Gly-Gly-Ala-Arg-Arg-有效负载物或Gly-Gly-Gly-有效负载物。
根据本发明的又一个实施方案，所述抗体是选自由以下组成的组中的至少一种：
·IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY
·IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA，和/或
·保留目标结合性质并包含CH2结构域的片段或其重组变体
抗体优选地是单克隆抗体。
抗体可以来自人类，但同样来自小鼠、大鼠、山羊、驴、仓鼠或兔。在缀合物用于治疗的情况下，鼠或兔抗体可以任选地被嵌合或人源化。
包含CH2结构域的抗体的片段或重组变体例如是，
·仅包含重链结构域的抗体形式(鲨鱼抗体/IgNAR(VH-CH1-CH2-CH3-CH4-CH5)2或骆驼抗体/hcIgG(VH-CH2-CH3)2)
·scFv-Fc(VH-VL-CH2-CH3)2
·Fc融合肽，包含Fc结构域和一个或多个受体结构域。
抗体也可以是双特异性的(例如，DVD-IgG、crossMab、附加的IgG-HC融合体)或双互补位的。有关概述请参见Brinkmann和Kontermann(2017)。
因此，在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述抗体是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗体，或其片段或重组变体，其中所述其片段或其重组变体保留靶结合性质并包含CH2结构域。
在优选实施方案中，抗体是IgG抗体。也就是说，抗体可以是糖基化的IgG抗体，优选在残基N297处。或者，抗体可以是去糖基化抗体，优选其中残基N297处的聚糖已被酶PNGase F切割掉。此外，抗体可以是非糖基化抗体，优选其中残基N297已被非天冬酰胺残基取代。去糖基化抗体和产生去糖基化抗体的方法是本领域已知的。
如本文所讨论的，在残基N297处糖基化的IgG抗体与非糖基化抗体相比具有若干优势。此外，已经证明本发明的接头可以以出乎意料的高效率与在残基N297处糖基化的抗体缀合。因此，在甚至更优选实施方案中，抗体是在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中(a)包含有效负载物或连接部分B的接头缀合到Gln残基，该残基已通过分子工程引入到抗体的重或轻链中，或(b)包含有效负载物或连接部分B的接头与抗体的Fc结构域中的Gln残基缀合。
根据本发明的另一个实施方案，有效负载物或连接部分与通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链中的Gln残基缀合。
如本文所用，术语“分子工程”是指使用分子生物学方法来操作核酸序列。在本发明中，分子工程可用于将Gln残基引入抗体的重链或轻链。通常，在本发明内预想将Gln残基引入抗体的重链或轻链的两种不同策略。首先，抗体的重链或轻链的单个残基可以被Gln残基取代。其次，由两个或多个氨基酸残基组成的含Gln的肽标签可以整合到抗体的重链或轻链中。为此，肽标签可以整合到重链或轻链的内部位置，即重链或轻链的两个现有氨基酸残基之间或通过替换它们，或肽标签可以融合(附加)到抗体的重链或轻链的N或C末端。
在第一种情况下，抗体的重链或轻链的任何氨基残基可以被Gln残基取代，条件是所得抗体可以通过微生物转谷氨酰胺酶与本发明的接头缀合。在某些实施方案中，抗体是其中IgG抗体的CH2结构域的氨基酸残基N297(EU编号)被取代的抗体，特别是其中取代是N297Q取代。包含N297Q突变的抗体可以与抗体的每条重链多于一个接头缀合。例如，包含N297Q突变的抗体可以与四个接头缀合，其中一个接头与抗体的第一条重链的残基Q295缀合，一个接头与抗体的第一条重链的残基N297Q缀合，并且一个接头与抗体的第二条重链的残基Q295缀合，一个接头与抗体的第二条重链的残基N297Q缀合。技术人员知道用Gln残基替换IgG抗体的残基N297会产生非糖基化抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链的Gln残基包含在肽中，该肽已(a)整合到抗体的重链或轻链，或(b)与抗体的重链或轻链的N或C末端融合。
因此，替换取代抗体的单个氨基酸残基，可以将包含转谷氨酰胺酶可接近的Gln残基的肽标签引入到所述抗体的重链或轻链。此类肽标签可融合到抗体的重链或轻链的N或C末端。优选地，包含转谷氨酰胺酶可接近的Gln残基的肽标签融合到抗体的重链的C末端。甚至更优选地，包含转谷氨酰胺酶可接近的Gln残基的肽标签融合到IgG抗体的重链的C末端。在WO 2012/059882、WO 2016/144608、WO 2016/100735、WO 2016/096785中并且由Steffen等人(JBC，2017)和Malesevic等人(Chembiochem，2015)描述了几种可以融合到抗体的重链C末端并作为微生物转谷氨酰胺酶底物的肽标签。
可以引入抗体的重链或轻链中，特别是融合到抗体的重链C末端的示例性肽接头是LLQGG、LLQG、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG、LLQ、GSPLAQSHGG、GLLQGGG、GLLQGG、GLLQ、LLQLLQGA、LLQGA、LLQYQGA、LLQGSG、LLQYQG、LLQLLQG、SLLQG、LLQLQ、LLQLLQ、LLQGR、EEQYASTY、EEQYQSTY、EEQYNSTY、EEQYQS、EEQYQST、EQYQSTY、QYQS、QYQSTY、YRYRQ、DYALQ、FGLQRPY、EQKLISEEDL、LQR和YQR。
技术人员知道取代抗体的氨基酸残基或将肽标签引入抗体的方法，例如通过如Sambrook，Joseph.(2001).Molecular cloning：a laboratory manual.Cold SpringHarbor，N.Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述的分子克隆方法。
根据本发明的另一个实施方案，有效负载物或连接部分与抗体的Fc结构域中的Gln缀合。
也就是说，本发明的接头可以缀合到抗体的Fc结构域中可用作微生物转谷氨酰胺酶底物的任何Gln残基。
通常，如本文使用的术语Fc结构域是指IgA、Igg和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域(CH2和CH3)以及IgE、IgY和IgM的最后三个恒定区域(CH2、CH3和CH4)。也就是说，包含有效负载物或连接部分B的接头可以与抗体的CH2、CH3和在适用的情况下，CH4结构域缀合。
根据本发明的另一个实施方案，有效负载物或连接部分与抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)缀合。在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中抗体的Fc结构域中的Gln残基是IgG的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
重要的是理解Q295是IgG型抗体中极其保守的氨基酸残基。它在人IgG1、2、3、4以及兔和大鼠抗体等中是保守的。因此，能够使用Q295是制造治疗性抗体-有效负载物缀合物或诊断缀合物(其中抗体通常是非人类来源的)的一个相当大的优势。因此，根据本发明的方法确实提供极其通用和广泛适用的工具。尽管残基Q295在IgG型抗体中极为保守，但一些IgG型抗体不具有该残基，例如小鼠IgG2a或IgG2b。因此，应当理解，本发明的方法中使用的抗体优选为包含CH2结构域的残基Q295(EU编号)的IgG型抗体。
此外，已经表明使用Q295进行有效负载物连接的工程化缀合物表现出良好的药代动力学和功效(Lhospice等人，2015)，并且能够携带甚至易于降解的不稳定毒素(Dorywalska等人，2015)。因此，由于相同的残基被修饰，可以预期这种位点特异性方法将在糖基化抗体上看到类似的效果。糖基化可能会进一步促进ADC的整体稳定性，已证明用上述方法去除聚糖部分会导致稳定性较差的抗体(Zheng等人，2011)。
根据本发明的另一个实施方案，与有效负载物或连接部分缀合的抗体是糖基化的。
典型的IgG型抗体在CH2结构域的N297位(Asp-X-Ser/Thr-基序)处被N-糖基化。
因此，在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中抗体的Fc结构域中的Gln残基是CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
在讨论通过转谷氨酰胺酶将接头与CH2 Gln残基缀合的文献中，重点是小的、低分子量的底物。然而，在现有技术文献中，为了完成这样的缀合，总是被描述为必要在N297位进行去糖基化步骤或无糖基化抗体(WO 2015/015448；WO 2017/025179；WO 2013/092998)。
然而，出乎意料的是，与所有预期相反，通过使用上述寡肽结构，与糖基化抗体的Q295的位点特异性结合确实是有效的。
尽管Q295非常接近N297，N297在其天然状态下是糖基化的，但是根据本发明的方法，使用指定的接头，仍然允许接头或有效负载物与其缀合。
然而，如所示，根据本发明的方法不需要预先对Q295进行酶促去糖基化，也不需要使用无糖基化抗体，也不需要N297被另一种氨基酸取代，也不需要引入T299A突变来防止糖基化。
这两点在制造方面提供显著的优势。在GMP方面，酶促去糖基化步骤是不合乎需要的，因为它必须确保去糖基化酶(例如PNGase F)以及裂解的聚糖都必须从培养基中去除。
此外，不需要用于有效负载物连接的抗体基因工程，因此可以避免可能增加免疫原性和降低抗体整体稳定性的序列插入。
N297被另一种氨基酸取代也有不利影响，因为它可能会影响整个Fc结构域的整体稳定性(Subedi等人，2015)，和整个缀合物的功效，因此会导致抗体聚结增加和溶解度降低(Zheng等人，2011)，这对疏水性有效负载物(如PBD)尤为重要。此外，在N297处存在的聚糖具有重要的免疫调节作用，因为它会触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)等。这些免疫调节作用将在去糖基化或上文讨论的获得非糖基化抗体的任何其他方法中消失。此外，已建立的抗体的任何序列修饰也可能导致调节问题，其原因在于通常接受和临床验证的抗体被用作ADC缀合的起点。
因此，根据本发明的方法允许容易且没有缺点地制造具有位点特定有效负载物绑定的化学计量上明确定义的ADC。
综上所述，本发明的方法优选用于IgG抗体在抗体的CH2结构域的Q295残基(EU编号)处的缀合，其中该抗体在CH2结构域的N297残基处糖基化(EU编号)。然而，明确指出本发明的方法还包括去糖基化或非糖基化抗体在抗体的残基Q295或任何其他合适的Gln残基处的缀合，其中Gln残基可以是内源性Gln残基或具有由分子工程引入的Gln残基。
本发明还包括IgG抗体以外的其他同种型抗体的缀合，例如IgA、IgE、IgM、IgD或IgY抗体。这些抗体的缀合可以在内源性Gln残基，例如抗体的Fc结构域中的内源性Gln残基处，或在通过分子工程引入到抗体的Gln残基处发生。
通常，技术人员知道确定接头在抗体的哪个位置缀合的方法。例如，缀合位点可以通过抗体-有效负载物缀合物的蛋白水解消化和所得片段的LC-MS/MS分析来确定。例如，样品可以根据说明手册用GlyciNATOR(Genovis)去糖基化，然后分别用胰蛋白酶金(质谱级，Promega)消化。因此，1μg蛋白质可以与50ng胰蛋白酶在37℃下孵育过夜。LC-MS/MS分析可以使用与Synapt-G2质谱仪(Waters)耦合的nanoAcquity HPLC系统进行。为此，可以将100ng肽溶液加载到Acquity UPLC Symmetry C18捕集柱(Waters，部件号186006527)上，并以5μL/min的流速在1％缓冲剂A(水，0.1％甲酸)和99％缓冲剂B(乙腈，0.1％甲酸)下补集3分钟。然后可以在25分钟内用3％至65％缓冲剂B的线性梯度来洗脱肽。可以在分辨率模式下以正极性和50至2000m/z的质量范围采集数据。其他仪器设置可能如下：毛细管电压3,2kV、采样锥40V、提取锥4.0V、源温度130℃、气帘气流量(cone gas)35L/h、纳流气体0.1bar和吹扫气150L/h。质谱仪可以用[Glu1]-纤维蛋白肽校准。
此外，技术人员知道确定抗体-有效负载物构建体的药物与抗体比(DAR)或有效负载物与抗体比的方法。例如，DAR可以通过疏水相互作用色谱(HIC)或LC-MS确定。
对于疏水相互作用色谱(HIC)，可将样品调节为0.5M硫酸铵并经由MAB PAK HIC丁基色谱柱(5μm，4.6x 100mm，Thermo Scientific)使用A(1.5M硫酸铵，25mM Tris HCl，pH7.5)至B(20％异丙醇，25mM Tris HCl，pH 7.5)的梯度在20分钟内在1mL/min和30℃下评估。通常，可以使用40μg样品，并且可以在280nm处记录信号。相对HIC保留时间(HIC-RRT)可以通过将ADC DAR 2种类的绝对保留时间除以相应未缀合mAb的保留时间来计算。
对于LC-MS DAR测定，ADC可用NH4HCO3稀释至终浓度为0.025mg/mL。随后，40μL该溶液可以用1mL TCEP(500mM)在室温下还原5分钟，然后通过加入10mL氯乙酰胺(200mM)进行烷基化，然后在37℃下在黑暗中孵育过夜。对于反相色谱，可以使用与软件Chromeleon组合的Dionex U3000系统。该系统可配备加热至70℃的RP-1000色谱柱(
Figure BDA0003269871400000211
5μm，1.0×100mm，Sepax)和设置为214nm波长的UV检测器。溶剂A可由具有0.1％甲酸的水组成并且溶剂B可以包含具有0.1％甲酸的85％乙腈。可以将还原和烷基化的样品加载到色谱柱上并在14分钟内通过30-55％溶剂B的梯度进行分离。液相色谱系统可与Synapt-G2质谱仪耦合以鉴定DAR种类。质谱仪的毛细管电压可设置为3kV，采样锥为30V，并且提取锥可以加起来达到5V。源温度可设置为150℃，去溶剂化温度设置为500℃，气帘气流量设置为20 1/h，去溶剂化气体设置为6001/h，并且可以在600-5000Da的质量范围内在1s的扫描时间的情况下以正模式进行采集。仪器可以用碘化钠校准。光谱的解卷积可以用MassLynx的MaxEntl算法进行直到收敛。在将DAR种类分配给色谱峰后，可以根据反相色谱图的积分峰面积计算DAR。
根据本发明的另一个实施方案，接头的净电荷是中性的或带正电荷的。
肽的净电荷通常在中性pH(7.0)下计算。在最简单的方法中，净电荷通过将带正电的氨基酸残基(Arg和Lys以及可选的His)的数量和带负电的氨基酸残基(Asp和Glu)的数量相加来确定，并计算两组的差异。在其中接头包含非常规氨基酸的情况下，技术人员知道在中性pH下确定非常规氨基酸电荷的方法。
根据本发明的另一个实施方案，接头不包含带负电荷的氨基酸残基。
优选地，寡肽不包含带负电荷的氨基酸残基Glu和Asp或带负电荷的非规范氨基酸。
根据本发明的另一个实施方案，接头包含带正电荷的氨基酸残基。
根据本发明的一个实施方案，接头包含至少两个选自下组的氨基酸残基：
·赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物，
·精氨酸，和/或
·组氨酸。
在某些实施方案中，接头包含至少一个选自下组的氨基酸残基：
·赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物，
·精氨酸，和
·组氨酸。
在某些实施方案中，接头包含至少一个选自下组的氨基酸残基：
·赖氨酸，
·精氨酸，和
·组氨酸。
在某些实施方案中，接头包含至少一个选自下组的氨基酸残基：
·精氨酸，和
·组氨酸。
在某些实施方案中，接头包含至少一个精氨酸残基。
表8显示可用本发明的方法将具有负、中性和正净电荷的接头缀合到糖基化抗体。特别地，包含带正电荷的精氨酸残基的接头可以高效地缀合到糖基化抗体。
也就是说，在某些实施方案中，根据本发明的接头具有中性或正净电荷。在某些实施方案中，根据本发明的接头具有中性或正净电荷并且包含至少一个精氨酸和/或组氨酸残基。在某些实施方案中，根据本发明的接头具有中性或正净电荷并且包含至少一个精氨酸残基。在某些实施方案中，根据本发明的接头不包含赖氨酸残基。在某些实施方案中，根据本发明的接头具有中性或正净电荷并且不包含赖氨酸残基。
表8进一步显示具有氨基酸序列Gly-[Gly/Ala]-Arg-B的接头可以有效地缀合到糖基化抗体。因此，在某些实施方案中，根据本发明的接头具有序列Gly-[Gly/Ala]-Arg-B或Gly-[Gly/Ala]-Arg-B-(Aax)n。
在某些实施方案中，包含一个或多个连接部分B的接头选自：GDC、GRCD、GRDC、GGDC、GGCD、GGEC、GGK(N3)D、GGRCD、GGGDC、GC、GRC、GGRC、GRAC、GARC、GGHK(N3)、GGK(N3)RC、GARK(N3)和GGARK(N3)。在一个优选实施方案中，包含一个或多个连接部分B的接头选自：GGK(N3)D、GGRCD、GC、GRC、GGRC、GARC、GGK(N3)RC、GARK(N3)和GGARK(N3)。在更优选实施方案中，包含一个或多个连接部分B的接头选自：GGRCD、GC、GGRC、GARC、GGK(N3)RC、GARK(N3)和GGARK(N3)。在最优选实施方案中，包含一个或多个连接部分B的接头选自：GC、GGRC、GARC和GGARK(N3)。在某些实施方案中，包含一个或多个连接部分B的接头是GGGK(N3)。
根据本发明的另一个实施方案，抗体包含在抗体的CH2结构域中的Asn残基N297(EU编号)。
根据本发明的另一个实施方案，N297残基是糖基化的。
根据本发明的另一个实施方案，包含有效负载物或连接部分B的接头与Gln残基的酰胺侧链缀合。也就是说，抗体的Gln残基的酰胺侧链通过异肽键与接头的N末端氨基缀合。
根据本发明的另一个实施方案，微生物转谷氨酰胺酶源自链霉菌属物种，特别是源自茂原链霉菌，优选与天然酶具有80％的序列同一性。因此，MTG可以是天然酶或可以是天然酶的工程化变体。如图8所示，未针对糖基化抗体的缀合进行优化的天然MTG变体已获得高缀合效率。
一种这样的微生物转谷氨酰胺酶可从Zedira(德国)商购获得。它是在大肠杆菌中重组产生的。茂原链霉菌转谷氨酰胺酶具有如SEQ ID NO 48中公开的氨基酸序列。具有其他氨基酸序列的茂原链霉菌MTG变体已被报道并且也包括在本发明中(SEQ ID NO：28和49)。
在另一个实施方案中，使用微生物转谷氨酰胺酶拉达卡链霉菌(Streptomycesladakanum)(以前称为Streptoverticillium ladakanum)。拉达卡链霉菌转谷氨酰胺酶(美国专利号US 6,660,510 B2)具有如SEQ ID NO 27中公开的氨基酸序列。
上述两种转谷氨酰胺酶都可以进行序列修饰。在几个实施方案中，可以使用与SEQID NO 27、28、48和49具有80％或更多序列同一性的转谷氨酰胺酶。
另一种合适的微生物转谷氨酰胺酶购自Ajinomoto，称为ACTIVA TG。与来自Zedira的转谷氨酰胺酶相比，ACTIVA TG缺少4个N末端氨基酸，但具有类似的活性。
可用于本发明的上下文中的其他微生物转谷氨酰胺酶公开于Kieliszek和Misiewicz 2014、WO 2015/191883 A1、WO 2008/102007 A1和US 2010/0143970，其内容通过引用完全并入本文。
在某些实施方案中，微生物转谷氨酰胺酶的突变变体用于接头与抗体的缀合。也就是说，本发明的方法中使用的微生物转谷氨酰胺酶可以是如SEQ ID NO：27或29所示的茂原链霉菌转谷氨酰胺酶的变体。在某些实施方案中，如SEQ ID NO：29中所示的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶包含突变G250D。在某些实施方案中，如SEQ ID NO：29中所示的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶包含突变G250D和E300D。在某些实施方案中，如SEQ ID NO:29中所示的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶包含突变D4E和G250D。在某些实施方案中，如SEQ ID NO：29中所示的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶包含突变E120A和G250D。在某些实施方案中，如SEQ ID NO:29中所示的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶包含突变A212D和G250D。在某些实施方案中，如SEQ ID NO:29中所示的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶包含突变G250D和K327T。
微生物转谷氨酰胺酶可以以允许抗体与接头有效缀合的任何浓度添加到缀合反应中。在某些实施方案中，微生物转谷氨酰胺酶可以以小于100U/mL、90U/mL、80U/mL、70U/mL、60U/mL、50U/mL、40U/mL、30U/mL、20U/mL、10U/mL或7U/mL的浓度加入到缀合反应中。
根据本发明的方法包括使用微生物转谷氨酰胺酶。然而，应注意，等效反应可由非微生物来源的包含转谷氨酰胺酶活性的酶进行。因此，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物也可以用非微生物来源的包含转谷氨酰胺酶活性的酶产生。
为了获得有效的缀合，优选将接头以摩尔过量加到抗体中。也就是说，在某些实施方案中，抗体与相对于抗体过量至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100摩尔当量的肽接头混合。
根据本发明的方法优选在6至8.5的pH范围内进行。实施例1和2表明，缀合效率在pH 7.6下最高。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中接头与抗体的缀合在pH6至8.5的，更优选在pH7至8的下实现。在最优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中接头与抗体的缀合是在pH 7.6下实现的。
本发明的方法可以在适合用本发明的方法将接头或接头-有效负载物构建体缀合到抗体的任何缓冲剂中进行。适用于本发明的方法的缓冲剂包括但不限于Tris、MOPS、HEPES、PBS或BisTris。此外，缓冲剂可以包含适合实施本发明的方法的任何盐浓度。例如，在本发明的方法中使用的缓冲剂可以具有≤150mM、≤140mM、≤130mM、≤120mM、≤110mM、≤100mM、≤90mM、≤80mM、≤70mM、≤60mM、≤50mM、≤40mM、≤30mM、≤20mM、≤10mM或1mM的盐浓度。在某些实施方案中，缓冲剂可以是无盐的。
需要注意的是，最佳反应条件(例如pH、缓冲剂、盐浓度)可能因有效负载物而异并且在某种程度上取决于接头和/或有效负载物的物理化学性质。然而，技术人员不需要过多的实验来鉴定适合实施本发明的方法的反应条件。
根据本发明的又一个实施方案，连接部分B是选自由以下组成的组中的至少一个：
·生物正交标记基团，或
·用于交联的其他非生物正交实体
在本发明的某些实施方案中，连接部分B包含
·生物正交标记基团，或
·用于交联的非生物正交实体。
通过Sletten和Bertozzi(2011)建立术语“生物正交标记基团”以指定可导致生命系统内部发生化学反应而不干扰天然生化过程的反应基团。“用于交联的非生物正交实体”可以是包含第一官能团或由第一官能团组成的任何分子，其中第一官能团可以化学或酶促交联至包含相容的第二官能团的有效负载物。即使在其中交联反应是非生物正交反应的情况下，优选除了有效负载物与接头的交联外，该反应不会对抗体引入额外的修饰。综上所述，连接部分B可以由“生物正交标记基团”或“非生物正交实体”组成，或可以包含“生物正交标记基团”或“非生物正交实体”。例如，在连接部分Lys(N3)的情况下，整个Lys(N3)和单独的叠氮化物基团均可被视为本发明内的生物正交标记基团。
根据本发明的又一个实施方案，生物正交标记基团或非生物正交实体是选自由以下组成的组中的至少一种：
·–N-N≡N或–N3
·Lys(N3)
·四嗪
·炔烃
·DBCO
·BCN
·降冰片烯
·反式环辛烯
·-RCOH(醛)，
·酰基三氟硼酸盐，
·-SH，和
·半胱氨酸
例如，这些基团可以参与表4中所示的任何结合反应：
表4
Figure BDA0003269871400000261
Figure BDA0003269871400000271
在上表4中，所述连接部分可以是或包含其中所谓的“缀合配体1”或“缀合配体2”。
根据本发明的另一实施方案，连接部分B是具有游离巯基的Cys残基。
此类Cys残基(或衍生物)的游离巯基可用于将包含马来酰亚胺的接头毒素构建体与其缀合。有关缀合反应的更多细节和一些潜在的接头构建体，请参见图5。
包含马来酰亚胺接头的毒素经常被使用，并且也被医疗机构批准，如Adcetris。因此，包含MMAE毒素的药物与包含(i)对氨基苄基间隔子、(ii)二肽和(iii)马来酰亚胺己酰基接头的接头缀合，这使得构建体能够与抗体中的Cys残基的游离巯基缀合。
因此，在根据本发明的接头中提供半胱氨酸残基确实具有能够使用现成的毒素-马来酰亚胺构建体来产生抗体-有效负载物缀合物的优势，或更一般地，能够完全利用Cys-马来酰亚胺缀合化学的优势。同时，可以使用无需去糖基化的现成抗体。
在具体实施方案中，Cys残基在肽接头中的C末端或链内。
在另一个实施方案中，连接部分B包含叠氮基团。技术人员知道可并入根据本发明的接头中的包含叠氮基团的分子，例如6-叠氮基-赖氨酸(Lys(N3))或4-叠氮基-同型丙氨酸(Xaa(N3))。包含叠氮化物基团的连接部分可用作各种生物正交反应中的底物，例如应变促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、铜催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)或Staudinger连接。例如，在某些实施方案中，可以通过SPAAC将包含环辛烯衍生物(例如DBCO)的有效负载物缀合到包含叠氮化物基团的接头(参见图15)。
在又一个实施方案中，连接部分B包含四嗪。技术人员知道可并入根据本发明的接头中的含四嗪分子，优选包含四嗪基团的氨基酸衍生物(参见例如图7A)。包含四嗪的连接部分可用作生物正交四嗪连接中的底物。例如，在某些实施方案中，有效负载物包含环丙烯、降冰片烯或环辛炔基团，例如双环[6.1.0]壬炔(BCN)，可以与包含四嗪基团的接头缀合。
本发明还包括包含两个不同生物正交标记基团和/或非生物正交实体的接头。例如，根据本发明的接头可以包含含叠氮化物的连接部分，例如Lys(N3)或Xaa(N3)，和含巯基的连接部分，例如半胱氨酸。在某些实施方案中，根据本发明的接头可以包含含叠氮化物的连接部分，例如Lys(N3)或Xaa(N3)，和含四嗪的连接部分，例如四嗪修饰的氨基酸。在某些实施方案中，根据本发明的接头可以包含含巯基的连接部分，例如半胱氨酸，和含四嗪的连接部分，例如四嗪修饰的氨基酸。包含两个不同生物正交标记物组和/或非生物正交实体的接头具有以下优点：它们可以接受两种不同的有效负载物并因此产生包含多于一种有效负载物的抗体-有效负载物缀合物。
根据本发明的另一个实施方案，规定在B是连接部分的情况下，进行将实际有效负载物连接到连接部分的另一步骤。已经开发了许多满足生物正交性要求的化学连接策略，包括叠氮化物和环辛炔之间的1,3-偶极环加成(也称为无铜点击化学，Baskin等(2007))、硝酮和环辛炔之间的1,3-偶极环加成(Ning等人(2010))、来自醛和酮的肟/腙形成(Yarema等人(1998))、四嗪连接(Blackman等人(2008))、基于异腈的点击反应(
Figure BDA0003269871400000281
等人)(2011))，和最近的四环烷连接(Sletten&Bertozzi(JACS，2011))、铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC、Kolb&Sharpless(2003))、应变促进的叠氮-炔环加成(SPAAC，Agard等人(2004))，或应变促进的炔-硝酮环加成(SPANC，MacKenzie等人(2014))。
所有这些文件均通过引用并入本文以提供充分的可行公开，并避免冗长的重复。
应当理解，在所述接头已经通过微生物转谷氨酰胺酶缀合到抗体的Gln残基之后，有效负载物优选与根据本发明的接头的生物正交标记基团或非生物正交实体缀合。然而，本发明还包括抗体-有效负载物缀合物，其中在第一步中有效负载物已缀合到包含连接部分的接头，并且其中在第二步中所得接头-有效负载物构建体通过微生物转谷氨酰胺酶缀合到抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中有效负载物通过点击反应例如上述点击反应中的任一种与抗体-接头缀合物的连接部分B连接。在一个优选实施方案中，点击反应是SPAAC。
根据本发明的另一个实施方案，有效负载物B是选自由以下组成的组中的至少一种：
·毒素
·细胞因子
·生长因子
·放射性核素
·激素
·抗病毒剂
·抗菌剂
·荧光染料
·免疫调节/免疫刺激剂
·增加半衰期的部分
·增加溶解度的部分
·聚合物-毒素缀合物
·核酸
·生物素或链霉亲和素部分
·维生素
·靶结合部分，和
·抗炎剂。
例如，增加半衰期的部分是PEG部分(聚乙二醇部分；PEG化)、其他聚合物部分、PAS部分(包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的寡肽；PAS化)或血清白蛋白结合剂。增加溶解度的部分是例如PEG-部分(PEG化)或PAS部分(PAS化)。
聚合物-毒素缀合物是能够携带许多有效负载物分子的聚合物。这种缀合物有时也称为弹性体，例如由Mersana therapeutics销售。
核酸有效负载物的一个实例是MCT-485，它是一种具有溶瘤和免疫激活性质的非常小的非编码双链RNA，由MultiCell Technologies，Inc.开发。
抗炎剂是例如抗炎细胞因子，当其与靶特异性抗体缀合时，可以改善例如由自身免疫疾病引起的炎症。
如本文所用，术语“荧光染料”是指吸收第一波长的光并发射比第一波长更长的第二波长的染料。在某些实施方案中，荧光染料是近红外荧光染料，其发射波长在650nm和900nm之间的光。在该区域，组织自发荧光较低，而荧光消光较少，可增强深层组织穿透，同时背景干扰最小。因此，近红外荧光成像可用于使被本发明的抗体-有效负载物缀合物结合的组织在手术期间可见。“近红外荧光染料”是本领域已知的并且可商购获得。在某些实施方案中，近红外荧光染料可以是IRDye 800CW、Cy7、Cy7.5、NIR CF750/770/790、DyLight800或Alexa Fluor 750。
如本文所用，术语“放射性核素”涉及医学上有用的放射性核素，包括例如带正电荷的放射性金属离子，例如Y、In、Tb、Ac、Cu、Lu、Tc、Re、Co、Fe等，例如90Y、111In、67Cu、77Lu、99Tc、161Tb、225Ac等。放射性核素可以包含在螯合剂中。此外，放射性核素可以是治疗性放射性核素或可在如下讨论的成像技术中用作造影剂的放射性核素。放射性核素或包含放射性核素的分子是本领域已知的并且可商购获得。
如本文所用，术语“毒素”涉及对细胞或生物体有毒的任何化合物。因此，毒素可以是例如小分子、核酸、肽或蛋白质。具体实例是神经毒素、坏死毒素、血液毒素和细胞毒素。根据本发明的又一个实施方案，毒素是选自由以下组成的组中的至少一种：
·吡咯并苯二氮卓类(PBD)
·瑞奥西汀(Auristatins)(例如，MMAE、MMAF)
·美登木素生物碱(美登素、DM1、DM4、DM21)
·倍癌霉素
·微管溶素
·埃尼蒂恩(Enediyenes)(例如卡奇霉素(Calicheamicin))
·PNU、阿霉素
·基于吡咯的纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂
·卡奇霉素(Calicheamicins)
·鹅膏毒环肽(例如α-鹅膏毒环肽)，和/或
·喜树碱(例如依喜替康、德鲁替康(deruxtecans))
在某些实施方案中，有效负载物是瑞奥西汀。如本文所用，术语“瑞奥西汀”是指抗有丝分裂剂家族。耳施德丁衍生物也包括在术语“耳施德丁”的定义内。耳施德丁的实例包括但不限于耳施德丁E(AE)、单甲基耳施德丁E(MMAE)、单甲基耳施德丁F(MMAF)和多拉司施德丁(dolastatin)的合成类似物。
在某些实施方案中，有效负载物是美登木素生物碱。在本发明的上下文中，术语“美登木素生物碱”是指最初从非洲灌木美登木(Maytenus ovatus)分离的一类高细胞毒性药物以及美登木素生物碱醇(Maytansinol)和天然美登木素生物碱醇的C-3酯(美国专利号4,151,042)中)；合成美登木素生物碱醇的C-3酯类似物(Kupchan等人，J.Med.Chem.21：31-37，1978；Higashide等人，Nature 270：721-722，1977；Kawai等人，Chem.Farm.Bull.32：3441-3451；和美国专利号5,416,064)；简单羧酸的C-3酯(US Pat.4,248,870；4,265,814；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,317,821；4,322,348；和4,331,598)；和具有N-甲基-L-丙氨酸衍生物的C-3酯(美国专利号4,137,230；4,260,608；and Kawai等人，Chem.PharmBull.12：3441，1984)。可用于本发明的方法或可以包含在本发明的抗体-有效负载物缀合物中的示例性美登木素生物碱是DM1、DM3、DM4和/或DM21。
在某些实施方案中，毒性有效负载物分子是倍癌霉素。合适的双癌霉素可以是例如倍癌霉素A、倍癌霉素Bl、倍癌霉素B2、倍癌霉素CI、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素MA和CC-1065。术语“倍癌霉素”应当理解为也指倍癌霉素的合成类似物，例如阿多来新、比折来新、卡折来新、KW-2189和CBI-TMI。
在本发明的意义上，毒素也可以是药物流出转运蛋白的抑制剂。包含毒素和药物流出转运蛋白抑制剂的抗体-有效负载物缀合物的优点在于，当内化到细胞中时，药物流出转运蛋白抑制剂阻止毒素流出细胞。在本发明中，药物流出转运蛋白可以是P-糖蛋白。P-糖蛋白的一些常见的药理抑制剂包括：胺碘酮、克拉霉素、环孢菌素、秋水仙碱、地尔硫卓、红霉素、非洛地平、酮康唑、兰索拉唑、奥美拉唑和其他质子泵抑制剂、硝苯地平、帕罗西汀、利血平、沙奎那韦、舍曲林、奎尼丁、它莫西芬、维拉帕米和度洛西汀。Elacridar和CP 100356是其他常见的P-gp抑制剂。Zosuquidar和tariquidar的开发也考虑到了这一点。最后，valspodar和reversan是此类试剂的其他实例。
维生素可选自叶酸，包括叶酸、叶酸和维生素B9。
靶结合部分可以是能够特异性结合到蛋白质或非蛋白质靶的蛋白质或小分子。在一个实施方案中，此类靶结合部分是scFv形抗体、Fab片段、F(ab)2片段、纳米抗体、亲和抗体、双抗体、VHH形抗体或抗体模拟物，包括DARP IN。
应当理解，有效负载物可以通过任何合适的反应例如点击反应与接头的连接部分缀合，或可以通过化学合成与接头连接。
根据本发明的又一个实施方案，接头具有两个或更多个连接部分B。
在这样的实施方案中，可以产生抗体-有效负载物缀合物，例如抗体与有效负载物比为4，其中两个有效负载物缀合到每个Q295残基。
根据本发明的另一个实施方案，两个或更多个连接部分B彼此不同。
在这样的实施方案中，第一连接部分可以例如是或包含叠氮化物(N3)，而第二连接部分可以是或包含四嗪。因此，这样的寡肽接头允许将两种不同的有效负载物缀合到抗体的两个Gln残基，即抗体的两个CH2结构域的Q295残基。
这样，可以获得2+2的抗体有效负载物比。使用第二有效负载物允许开发一类全新的抗体有效负载物缀合物，其在功效和效力方面超越当前的治疗方法。
此类实施方案尤其允许靶向细胞中的两种不同结构，例如DNA和微管。由于某些癌症可能对一种药物例如微针毒素具有抗药性，DNA毒素仍然可以杀死癌细胞。
根据另一个实施方案，可以使用两种药物，它们只有在同时在同一组织中释放时才具有完全效力。如果抗体在健康组织中部分降解或一种药物过早丢失，这可能会导致脱靶毒性降低。
此外，双标记探针可用于非侵入性成像和治疗或术中/术后成像/手术。在这样的实施方案中，可以通过非侵入性成像来选择肿瘤患者。然后，可以使用其他显像剂(例如荧光染料)通过手术切除肿瘤，这有助于外科医生或机器人识别所有癌组织。
根据本发明的另一方面，提供抗体-有效负载物缀合物，其已经用根据前述步骤中任一个的方法产生。
根据本发明的另一方面，提供一种接头，所述接头包含肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中Gly包含N-端伯胺，并且其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数
·n是介于≥0和≤12之间的整数
·m+n≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B是有效负载物或连接部分，
并且其中所述接头可以通过微生物转谷氨酰胺酶经由接头的N-末端Gly的N-末端伯胺缀合到抗体。
所述接头适用于通过转谷氨酰胺酶经由N-末端甘氨酸(Gly)残基的N-末端伯胺缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基。
通常，根据本发明的方法的上述优点和实施方案也适用于该方面，即作为物质组合物的接头。因此，那些实施方案也应被视为与作为物质组合物的接头一起公开。
重要的是理解，在本文所示的不同接头肽中，C末端可能受到保护，也可能不受保护，即使另有说明。保护可以通过酰胺化来实现。在本发明的上下文中，包括在C末端受保护和不受保护的接头肽。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的接头，其中该接头包含两个或更多个有效负载物和/或连接部分B。
在某些实施方案中，接头可以包含两个或更多个连接部分和/或有效负载物。即接头可以具有肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o
其中
·m、n和o是介于≥0和≤12之间的整数，
·m+n+o≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B1和B2是有效负载物和/或连接部分，其中B1和B2可以彼此相同或不同，
并且其中所述接头可以通过微生物转谷氨酰胺酶经由接头的N-末端Gly的N-末端伯胺缀合到抗体。
在其他实施方案中，接头可以包含三个连接部分和/或有效负载物。即接头可以具有肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B1-(Aax)n-B2-(Aax)o-B3-(Aax)p
其中
·m、n、o和p是介于≥0和≤12之间的整数，
·m+n+o+p≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B1、B2和B3是有效负载物和/或连接部分，其中B1、B2和B3可以彼此相同或不同，
并且其中接头可以通过微生物转谷氨酰胺酶经由接头的N-末端Gly的N-末端伯胺缀合到抗体。
应当理解，本发明还包括包含多于三个连接部分和/或有效负载物，例如4、5或6个连接部分和/或有效负载物的接头。在这种情况下，接头的肽结构遵循与上述包含2或3个连接部分和/或有效负载物的接头相同的模式。
在某些实施方案中，本发明涉及一种接头，所述太街头具有肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数
·n是介于≥0和≤12之间的整数
·m+n≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B是有效负载物或连接部分，
并且其中的接头可以通过微生物转谷氨酰胺酶经由接头的N末端Gly的N末端伯胺缀合到抗体。
在这种情况下，应当理解部分B可以包含多于一个有效负载物和/或连接部分。例如，B可以代表(B’-(Aax)o-B”)，其中B’和B”是有效负载物和/或连接部分，并且其中o是介于≥0和≤12之间的整数。或者，B可以代表(B’-(Aax)o-B”-(Aax)p-B”’)，其中B’、B”和B’”是有效负载物和/或连接部分，并且其中o和p是介于≥0和≤12之间的整数。
在优选实施方案中，m和/或n≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10或≥11。在其他优选实施方案中，m和/或n≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5、≤4、≤3、≤2或≤1。在进一步优选实施方案中，m+n是≥1、≥2、≥3、≥4、≥5、≥6、≥7、≥8、≥9、≥10或≥11。在更进一步的优选实施方案中，m+n≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5、≤4、≤3、≤2或≤1。
两个范围的要素可以与另一个组合以公开具有下限和上限的优选长度范围。
因此，在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的接头，其中m+n≤12、≤11、≤10、≤9、≤8、≤7、≤6、≤5或≤4。
在其他实施方案中，接头不可被组织蛋白酶B切割，和/或接头不包含缬氨酸-丙氨酸基序或缬氨酸-瓜氨酸基序，和/或接头不包含聚乙二醇或聚乙二醇衍生物。
根据一个实施方案，连接部分B是选自由以下组成的组中的至少一种：
·生物正交标记基团
·用于交联的其他非生物正交实体。
在某些实施方案中，接头的至少一个连接部分B包含或由以下组成
·生物正交标记基团；或
·用于交联的非生物正交实体。
根据一个实施方案，生物正交标记基团或非生物正交实体是选自由以下组成的组中的至少一种：
·–N-N≡N或–N3
·Lys(N3)
·四嗪
·炔烃
·DBCO
·BCN
·降冰片烯
·反式环辛烯
·-RCOH(醛)，
·酰基三氟硼酸盐，
·-SH，和
·半胱氨酸。
在其他实施方案中，接头的净电荷为中性或正电荷，和/或接头不包含带负电荷的氨基酸残基，和/或接头包含带正电荷的氨基酸残基，和/或接头包含至少两个选自下组的氨基酸残基：
·赖氨酸，
·精氨酸，和/或
·组氨酸。
在某些实施方案中，接头包含至少一个选自下组的氨基酸残基：
·赖氨酸，
·精氨酸，和
·组氨酸。
在某些实施方案中，接头包含至少一个选自下组的氨基酸残基：
·精氨酸，和
·组氨酸。
也就是说，在某些实施方案中，根据本发明的接头具有中性或正净电荷。在某些实施方案中，根据本发明的接头具有中性或正净电荷并且包含至少一个精氨酸和/或组氨酸残基。在某些实施方案中，根据本发明的接头不包含赖氨酸残基。在某些实施方案中，接头具有中性或正净电荷并且不包含赖氨酸残基。
根据一个实施方案，伯胺基团适合用作微生物转谷氨酰胺酶(MTG)的底物。
根据另一个实施方案，接头适合于通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-有效负载物缀合物。
根据另一个实施方案，接头选自
a)如表5所示的列表和/或
b)SEQ ID NO 1-25中的任何一个
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的接头，其中该接头选自如表5所示的列表。
根据本发明的又一方面，提供一种接头-有效负载物构建体，其至少包含
a)根据上文描述的接头，和
b)一种或多种有效负载物，
其中在所述构建体中，接头和/或有效负载物在结合期间任选地被化学修饰以允许共价或非共价结合，以形成所述构建体。
在某些实施方案中，提供接头-有效负载物构建体，其至少包含
a)根据上文描述的接头，和
b)一种或多种有效负载物，
其中一种或多种有效负载物与接头共价或非共价结合。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的接头-有效负载物构建体，其中在所述构建体中，一个或多个有效负载物已经通过点击反应共价结合到接头的连接部分B。也就是说，一个或多个有效负载物可以通过以上讨论的任何点击反应连接到连接部分B，例如但不限于SPAAC、四嗪连接或硫醇-马来酰亚胺缀合。
除了接头中的连接部分与有效负载物之间的点击反应外，有效负载物可以通过本领域已知的任何酶促或非酶促反应共价结合到接头。为此，有效负载物可以结合到接头的C末端或结合到接头的氨基酸侧链。
在某些实施方案中，有效负载物通过化学合成与接头连接。技术人员知道通过化学合成将有效负载物连接到肽接头的方法。例如，含胺的有效负载物或含硫醇的有效负载物(例如美登素类似物)或含羟基的有效负载物(例如SN-38类似物)可以通过化学合成连接到肽接头的C末端以获得例如图17中所示的接头。然而，技术人员知道可用于通过化学合成将有效负载物连接到氨基酸或氨基酸衍生物的C末端或侧链的进一步反应和反应性基团。可用于通过化学合成将有效负载物连接到肽接头的典型反应包括但不限于：肽连接、活化酯连接(NHS酯、PFP酯)、点击反应(CuAAC、SPAAC)、迈克尔加成(硫醇马来酰亚胺缀合)。有效负载物与肽的连接在现有技术中例如由Costoplus等人(ACS Med Chem，2019)、Sonzini等人(Bioconj Chem，2019)、Bodero等人(Belstein，2018)、Nunes等人(RSC Adv，2017)、Doronina等人(Bioconj Chem，2006)、Nakada等人(Bioorg Med Chem，2016)和Dickgiesser等人(Bioconj Chem，2020)广泛地描述。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的接头-有效负载物构建体，其中在所述构建体中，接头和/或有效负载物在结合期间任选地被化学修饰以允许共价或非共价结合，以形成所述构建体。
如果使用两个或多个有效负载物，后者可以彼此相同或不同。
在一个实施方案中，有效负载物是选自由以下组成的组中的至少一个：
·毒素
·细胞因子
·生长因子
·放射性核素
·激素
·抗病毒剂
·抗菌剂
·荧光染料
·免疫调节/免疫刺激剂
·增加半衰期的部分
·增加溶解度的部分
·聚合物-毒素缀合物
·核酸
·生物素或链霉亲和素部分
·维生素
·靶结合部分，和
·抗炎剂。
·蛋白质降解剂(PROTAC)
在另一个实施方案中，毒素是选自由以下组成的组中的至少一种：
·吡咯并苯二氮卓类(PBD)
·瑞奥西汀(例如，MMAE、MMAF)
·美登木素生物碱(美登素、DM1、DM4、DM21)
·倍癌霉素
·微管溶素
·埃尼蒂恩(例如卡奇霉素)
·PNU、阿霉素
·基于吡咯的纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂
·卡奇霉素
·鹅膏毒环肽(例如α-鹅膏毒环肽)，和/或
·喜树碱(例如依喜替康、德鲁替康)。
根据本发明的另一方面，提供一种抗体-有效负载物缀合物，其包含
a)一个或多个根据上文描述的接头-有效负载物构建体，和
b)在重链或轻链中包含至少一个Gln残基的抗体，
其中，在所述缀合物中，接头-有效负载物构建体和/或抗体在缀合以期间任选地被化学修饰允许共价或非共价缀合，以形成所述缀合物。
在具体实施方案中，本发明涉及一种抗体有效负载物缀合物，其包含
a)一个或多个根据上文描述的接头-有效负载物构建体，和
b)在重链或轻链中包含至少一个Gln残基的抗体，
其中，接头-有效负载物构建体通过接头-有效负载物构建体中包含的N-末端甘氨酸残基的N-末端伯胺缀合到抗体的重链或轻链中Gln残基的酰胺侧链。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中已经用微生物转谷氨酰胺酶(MTG)实现缀合。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中在接头-有效负载物构建体形成之前或之后实现缀合。也就是说，本发明包括抗体-有效负载物缀合物，其中在第二步骤中将一个或多个有效负载物缀合到接头的连接部分之前，接头已在第一步中缀合到抗体。然而，本发明还包括抗体-有效负载物缀合物，其中在第一步中将一个或多个有效负载物缀合到接头的连接部分，然后在第二步中将所得接头-有效负载物构建体缀合到抗体。此外，可通过化学合成将一种或多种有效负载物连接到肽接头，然后可以一步反应将所得接头-有效负载物构建体缀合到抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗体，或其片段或重组变体，其中所述片段或其重组变体保留靶结合性质并包含CH2结构域。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是IgG抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是糖基化抗体、去糖基化抗体或无糖基化抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中糖基化抗体是在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体，或其中糖基化抗体是在与IgG抗体CH2结构域的残基N297(EU编号)同源的残基处糖基化的不同同种型的抗体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中(a)接头-有效负载物构建体缀合到已通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链的Gln残基或(b)接头-有效负载物构建体与抗体的Fc结构域中的Gln残基缀合。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中抗体的Fc结构域中的Gln残基是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)或不同同种型抗体的同源Gln残基。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中抗体的Fc结构域中的Gln残基是在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
本方法的抗体或本发明的抗体-有效负载物缀合物可以是任何抗体，优选任何IgG型抗体。例如，抗体可以是但不限于本妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、Inotuzumab、Avelumab、西妥昔单抗、利妥昔单抗、达雷木单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、Ocrelizumab、托珠单抗、优特克单抗、戈利木单抗、奥比妥珠单抗、Polatuzumab或Enfortumab。
也就是说，在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是本妥昔单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是曲妥珠单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是吉妥珠单抗。在其他实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是Inotuzumab。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是Avelumab。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是西妥昔单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是利妥昔单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是Daratumumbab。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是帕妥珠单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是维多珠单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是Ocrelizumab。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是托珠单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是优特克单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是戈利木单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是奥比妥珠单抗。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是Polatuzumab。在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是Enfortumab。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链的Gln残基是无糖基化IgG抗体的CH2结构域的N297Q(EU编号)。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链的Gln残基包含在肽中，所述肽已经(a)整合到抗体的重链或轻链中，或(b)融合到抗体的重链或轻链的N末端或C末端。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中包含Gln残基的肽已融合到抗体的重链的C末端。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中包含Gln残基的肽选自：LLQGG、LLQG、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG、LLQ、GSPLAQSHGG、GLLQGGG、GLLQGG、GLLQ、LLQLLQGA、LLQGA、LLQYQGA、LLQGSG、LLQYQG、LLQLLQG、SLLQG、LLQLQ、LLQLLQ、LLQGR、EEQYASTY、EEQYQSTY、EEQYNSTY、EEQYQS、EEQYQST、EQYQSTY、QYQS、QYQSTY、YRYRQ、DYALQ、FGLQRPY、EQKLISEEDL、LQR和YQR。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中该抗体-有效负载物缀合物至少包含一种毒素。
也就是说，本发明的抗体-有效负载物缀合物包含与至少一个接头缀合的抗体，其中该一个接头包含至少一种毒素。在某些实施方案中，抗体-有效负载物缀合物包含两个接头，其中抗体的每条重链分别与一个接头缀合。在某些实施方案中，抗体-有效负载物缀合物包含四个接头，其中抗体的每条重链分别与两个接头缀合。在这种情况下，每个接头可能包含一个或多个有效负载物，例如毒素。
在某些实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含两个接头，其中每个接头包含一个有效负载物，例如毒素。在其他实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含两个接头，其中每个接头包含两个有效负载物，例如一种毒素和一种其他有效负载物或两种相同或不同的毒素。在其中抗体-有效负载物缀合物包含两个接头的实施方案中，优选地将接头缀合到IgG抗体的两条重链的残基Q295。甚至更优选地，抗体是在残基N297处糖基化的IgG抗体。
在某些实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含四个接头，其中每个接头包含一个有效负载物，例如毒素。在其他实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含四个接头，其中每个接头包含两个有效负载物，例如一种毒素和一种其他有效负载物或两种相同或不同的毒素。在其中抗体有效负载物缀合物包含四个接头的实施方案中，优选接头缀合到IgG抗体的两条重链的残基Q295和N297Q。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的毒素。
在某些实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的毒素。也就是说，在某些实施方案中，抗体-有效负载物缀合物可以包含两个接头，其中每个接头包含两种不同的毒素。包含两种不同毒素的抗体-有效负载物缀合物的优势在于它们可以具有增加的细胞毒活性。这种增加的细胞毒活性可以通过组合靶向两种不同细胞机制的两种毒素来实现。例如，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物可以包含抑制细胞分裂的第一毒素，并且第二毒素是干扰DNA复制和/或转录的毒素。
因此，在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中第一毒素是抑制细胞分裂的毒素，而第二毒素是干扰DNA复制和/或转录的毒素。
抑制细胞分裂的毒素，例如抗有丝分裂剂或纺锤体毒物，是具有抑制或阻止细胞有丝分裂的潜力的试剂。纺锤体毒物是通过影响连接染色体着丝粒区域的蛋白质线(称为纺锤体)来破坏细胞分裂的毒物。纺锤体毒物通过在纺锤体组装检查点(SAC)处中断细胞分裂的有丝分裂阶段，有效地停止新细胞的产生。有丝分裂纺锤体由辅助调节蛋白的微管(聚合微管蛋白)组成；彼此在适当分离复制的染色体的活动中。某些影响有丝分裂纺锤体的化合物已被证明对实体瘤和血液系统恶性肿瘤非常有效。
两种特定的抗有丝分裂剂家族，长春花生物碱和紫杉烷，通过微管动力学的搅动来中断细胞的分裂。长春花生物碱的作用是抑制微管蛋白聚合成微管，导致细胞周期内的G2/M停滞并最终导致细胞死亡。相比之下，紫杉烷通过稳定微管防止解聚来阻止有丝分裂细胞周期。尽管许多其他纺锤体蛋白可能是新型化疗药物的靶点，微管蛋白结合剂是临床使用的唯一类型。影响运动蛋白驱动蛋白的药物开始进入临床试验。另一种类型，紫杉醇，通过连接在现有微管内的微管蛋白上起作用。本发明中优选的抑制细胞分裂的毒素是瑞奥西汀，例如MMAE和MMAF，和美登木素生物碱，例如DM1、DM3、DM4和/或DM21。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中至少一种毒素是瑞奥西汀或美登木素生物碱。
阻止DNA分子正确复制和/或转录并已被证明适用于癌症治疗的几种试剂是本领域技术人员已知的。例如，错误掺入新形成的DNA和/或RNA分子中的抗代谢物如核苷酸或核苷类似物是本领域已知的，并且已由Tsesmetzis等人，Cancers(Basel)，2018，10(7)：240总结。已知会干扰DNA复制和/或转录的其他毒素是双霉素(duoromycins)。
因此，在某些实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的毒素，其中第一毒素是双霉素并且其中第二有效负载物是瑞奥西汀或美登木素生物碱。
在某些实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的瑞奥西汀。
包含两种不同毒素的抗体-有效负载物缀合物的一个主要优点是抗体-有效负载物缀合物仍可作用于已逃脱其中一种毒素作用机制的靶细胞和/或抗体-有效负载物缀合物可以具有对异质性肿瘤的更高疗效。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含毒素和药物流出转运蛋白的抑制剂。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含毒素和增加溶解度的部分。
也就是说，抗体-有效负载物缀合物可以包含两个有效负载物，其中第一有效负载物是毒素并且第二有效负载物是增加溶解度的部分。图9中的结构5显示包含与赖氨酸侧链连接的溶解度增加部分的肽接头。因此，包含毒素和溶解度增加部分的抗体-有效负载物缀合物可以通过将毒素点击到图9中结构5所示的接头的叠氮基团上来获得。或者，抗体-接头缀合物可通过将毒素点击到接头的含叠氮化物的连接部分并通过将包含马来酰亚胺的溶解度增加部分点击到同一接头的半胱氨酸侧链来获得。或者，毒素和/或溶解度增加部分可以通过化学合成连接到接头上。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中抗体-有效负载物缀合物包含毒素和免疫刺激剂。
如本文所用且取决于上下文，术语“免疫刺激剂”包括增加受试者对抗原的免疫反应的化合物。免疫刺激剂的实例包括免疫刺激剂和免疫细胞活化化合物。本发明的抗体-有效负载物缀合物可以包含免疫刺激剂，其帮助安排免疫细胞识别配体并增强抗原呈递。免疫细胞活化化合物包括Toll样受体(TLR)激动剂。此类激动剂包括病原体相关分子模式(PAMP)，例如感染模拟组合物，例如细菌衍生的免疫调节剂(又名危险信号)和损伤相关分子模式(DAMP)，例如模拟受压或受损细胞的组合物。TLR激动剂包括核酸或脂质组合物(例如，单磷磷酰基脂质A(MPLA))。在一个实例中，TLR激动剂包括TLR9激动剂例如胞嘧啶-鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、聚(乙烯亚胺)(PEI)-缩合寡核苷酸(ODN)例如PEI-CpG-ODN，或双链脱氧核糖核酸酸(DNA)。在另一个实例中，TLR激动剂包括TLR3激动剂，例如聚肌苷-聚胞苷酸(poly(I:C))、PEI-poly(I:C)、聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly(A:U))、PEI-poly(A:U)或双链核糖核酸(RNA)。其他示例性疫苗免疫刺激化合物包括脂多糖(LPS)、趋化因子/细胞因子、真菌β-葡聚糖(例如香菇多糖)、咪喹莫特、CRX-527和OM-174。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的免疫刺激剂。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中至少一种免疫刺激剂是TLR激动剂。
如本文所用，术语“TLR激动剂”是指能够通过TLR信号通路引起信号反应的分子，作为直接配体或间接通过产生内源性或外源性。TLR受体的激动配体是(i)实际TLR受体的天然配体，或其功能等效的变体，其保留与TLR受体结合并在其上诱导共刺激信号的能力，或(ii)针对TLR受体的激动剂抗体受体或其功能等效变体，其能够特异性结合到TLR受体，更具体地结合到所述受体的胞外结构域，并诱导由该受体和相关蛋白控制的一些免疫信号。结合特异性可以针对人TLR受体或针对与人类同源的不同物种之一的TLR受体。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含放射性核素和荧光染料。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物，其中放射性核素是适用于断层扫描，特别是单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或正电子发射断层扫描(PET)的放射性核素，并且其中荧光染料是近红外荧光染料。
本文使用的术语“放射性核素”与放射性核素、放射性同位素或放射性同位素具有相同的含义。
放射性核素优选可通过核医学分子成像技术，例如正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、SPECT和/或PET的混合或它们的组合检测。本文的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)包括平面闪烁扫描(PS)。
SPECT和/或PET的混合体是例如SPECT/CT、PET/CT、PET/IRM或SPECT/IRM。
SPECT和PET获取有关引入受试者体内的放射性核素浓度(或摄取)的信息。PET通过检测由正电子发射放射性核素间接发射的成对伽马射线来生成图像。PET分析会生成一系列针对感兴趣区域(例如，大脑、乳房、肝脏等)的身体薄片图像。这些薄片图像可以组合成检查区域的三维表示。SPECT与PET类似，但SPECT中使用的放射性物质比PET中使用的放射性物质具有更长的衰变时间，并且发射单伽马射线而不是双伽马射线。尽管SPECT图像的灵敏度和细节不如PET图像，但SPECT技术比PET便宜得多，并且具有不需要靠近粒子加速器的优势。实际临床PET比SPECT具有更高的灵敏度和更好的空间分辨率，并且由于光子能量高而具有精确衰减校正的优点；因此PET提供比SPECT更准确的定量数据。平面闪烁扫描(PS)与SPECT类似，因为它使用相同的放射性核素。然而，PS仅生成二维信息。
SPECT生成计算机生成的局部放射性示踪剂摄取图像，而CT生成人体X射线密度的3D解剖图像。组合SPECT/CT成像可依次提供来自SPECT的功能信息和来自CT的解剖信息，这些信息是在单次检查期间获得的。CT数据还用于对单光子发射数据进行快速和优化的衰减校正。通过精确定位异常和/或生理示踪剂摄取的区域，SPECT/CT改进灵敏度和特异性，但也有助于实现准确的剂量估计以及指导介入程序或更好地定义外部束放射治疗的目标体积。使用单光子发射放射性示踪剂的伽马相机成像代表大多数程序。
放射性核素可选自锝99m(99mTc)、镓67(67Ga)、镓68(68Ga)钇90(90Y)、铟111(111In)、铼186(186Re)、氟18(18F)、铜64(64Cu)、铽149(149Tb)或铊201(201TI)。放射性核素可以包含在分子中或与螯合剂结合。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，该组合物包含根据上文描述的接头、根据上文描述的接头-有效负载物构建体和/或根据上文描述的抗体-有效负载物缀合物。
根据本发明的另一方面，提供一种药物产品，该产品包含根据上文描述的抗体-有效负载物缀合物或根据上文描述的药物组合物，和至少一种其他药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所述的抗体-有效负载物缀合物的药物制剂通过将具有所需纯度的此类缀合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Flemington's Pharmaceutical Sciences16th edition，Oslo，A.Ed.(1980))混合以冻干制剂或水溶液的形式来制备。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者通常是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子，如钠；金属络合物(例如锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003269871400000471
Baxter International，Inc.)。美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述某些示例性sHASEGPs和使用方法，包括rHuPH20。一方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物、根据本发明的药物组合物或根据本发明的药物产品用于治疗和/或诊断。
也就是说，本发明的抗体-有效负载物缀合物可用于治疗受试者或诊断受试者的疾病或病症。个体或受试者是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物例如猕猴)、兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
根据本发明的另一方面，提供根据以上描述的药物组合物或根据以上描述的产品(用于制造药物)用于治疗患者，所述患者：
·患有
·有发展以下疾病的风险，和/或
·诊断有
肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染病，或预防或预防此类病症。
优选地，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物、根据本发明的药物组合物或根据本发明的药物产品用于治疗患有肿瘤疾病的患者。
如本文所用，术语“肿瘤疾病”是指特征在于细胞不受控制的异常生长的病症。肿瘤疾病包括癌症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌、膀胱癌、肝癌、结直肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、皮肤癌、黑色素瘤、脑癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、骨髓瘤、各类头部和颈部癌症、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、尤文肉瘤和周围神经上皮瘤。优选的癌症包括肝癌、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、尤文肉瘤和外周神经上皮瘤。
也就是说，本发明的抗体-有效负载物缀合物优选用于治疗癌症。因此，在某些实施方案中，抗体-有效负载物缀合物包含特异性结合到存在于肿瘤细胞上的抗原的抗体。在某些实施方案中，抗原是肿瘤细胞表面上的抗原。在某些实施方案中，在抗体-有效负载物缀合物与抗原结合后，肿瘤细胞表面上的抗原与抗体-有效负载物缀合物一起被内化到细胞中。
如果抗体-有效负载物缀合物用于治疗癌症，优选抗体-有效负载物缀合物包含至少一种有效负载物，其具有杀死或抑制抗体-药物缀合物与其结合的肿瘤细胞增殖的潜力。在某些实施方案中，在抗体-有效负载物缀合物已被内化到肿瘤细胞中后，至少一种有效负载物表现出其细胞毒活性。在某些实施方案中，至少一种有效负载物是毒素。
根据本发明的另一方面，提供一种治疗或预防肿瘤疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据上文描述的抗体-有效负载物缀合物、根据上文描述的药物组合物，或根据上文描述的产品。
炎性疾病可以是自身免疫性疾病。传染病可以是细菌感染或病毒感染。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物、根据本发明的药物组合物或根据本发明的药物产品用于术前、术中和/或术后成像。
也就是说，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物可用于成像。为此，可以在结合到特定目标分子、细胞或组织的同时观察抗体-有效负载物缀合物。本领域中已知不同的技术用来可视化特定的有效负载物。例如，如果有效负载物是放射性核素，则抗体-有效负载物缀合物所结合的分子、细胞或组织可以通过PET或SPECT进行可视化。如果有效负载物是荧光染料，则抗体-有效负载物缀合物所结合的分子、细胞或组织可以通过荧光成像进行可视化。在某些实施方案中，根据本发明的抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的有效负载物，例如放射性核素和荧光染料。在这种情况下，抗体-有效负载物缀合物所结合的分子、细胞或组织可以使用两种不同和/或互补的成像技术，例如PET/SPECT和荧光成像来可视化。
抗体-有效负载物缀合物可用于术前和/或术后成像。
术前成像包括可以在手术前进行的所有成像技术，以使特定目标分子、细胞或组织在诊断某种疾病或病症时可见，并且可选地为手术提供指导。术前成像可以包括在进行手术前通过使用包含抗体的抗体-有效负载物缀合物使肿瘤通过PET或SPECT可见的步骤，所述抗体特异性结合到肿瘤上的抗原，并与包含放射性核素的有效负载物缀合。
术中成像包括可以在手术期间进行的所有成像技术，以使特定目标分子、细胞或组织可见，从而为手术提供指导。在某些实施方案中，包含近红外荧光染料的抗体-有效负载物缀合物可用于在手术期间通过近红外荧光成像使肿瘤可视化。术中成像允许外科医生在手术期间识别特定组织，例如肿瘤组织，从而可以完全去除肿瘤组织。
术后成像包括可以在手术后进行的所有成像技术，以使特定目标分子、细胞或组织可见并评估手术结果。术后成像可以与术前手术类似地进行。
在某些实施方案中，本发明涉及包含两种或更多种不同有效负载物的抗体-有效负载物缀合物。例如，抗体-有效负载物缀合物可以包含放射性核素和近红外荧光染料。这种抗体-有效负载物缀合物可用于通过PET/SPECT和近红外荧光成像进行成像。这种抗体的优点在于它可用于通过PET或SPECT在手术前后可视化目标组织，例如肿瘤。同时，可以在手术过程中通过近荧光红外成像观察肿瘤。
在具体实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体-有效负载物缀合物、根据本发明的药物组合物或根据本发明的药物产品用于术中成像引导的癌症手术。
如上所述，本发明的抗体-有效负载物缀合物可用于使目标分子、细胞或组织可视化并在手术期间指导外科医生或机器人。也就是说，抗体-有效负载物缀合物可用于在手术期间观察肿瘤组织，例如通过近红外成像，并允许完全去除肿瘤组织。
所述缀合物或产物以有效治疗疾病的一定量或剂量施用。或者，提供相应的治疗方法。
本发明的抗体-有效负载物缀合物可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，则在病灶内、子宫内或膀胱内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。施用可以通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是慢性的。本文考虑了各种投配方案，包括但不限于在不同时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的抗体-有效负载物缀合物将以与本发明一致的方式配制、投配和施用，将以与良好医学实践一致的方式配制、投配和施用。在这方面考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的原因、试剂的递送部位、施用方法、施用时间安排，和医生已知的其他因素。抗体-有效负载物缀合物不是必需而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的病症的试剂一起配制。此类其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体-有效负载物缀合物的量、病症或治疗的类型以及上述其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或本文所述剂量的约1至99％，或以经验/临床确定合适的任何剂量和任何途径使用。
对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体-有效负载物缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体-有效负载物缀合物的类型、疾病的严重性和病程、抗体-有效负载物缀合物是以预防还是治疗目的施用、既往治疗、患者的临床病史和对抗体-有效负载物缀合物的反应，和主治医生的判断。将抗体-有效负载物缀合物适当地一次或在一系列治疗中施用到患者。
下表5显示可用于本发明上下文中的不同接头，和它们的SEQ ID号。为免生疑问，如果与电子WIPO ST 25序列表存在差异，则以下表5中的序列将被视为正确序列。
重要的是理解在本文所示的一些接头肽中，C末端的部分被简单地指定为N3。然而，这应当理解为Lys(N3)的缩写。例如，GARK(N3)或GlyAlaArgLys(N3)实际上表示GARK1(其中K1＝Lys(N3))。
此外，重要的是理解，在本文所示的不同接头肽中，C末端可能受到保护，也可能不受保护，即使另有说明。
保护可以通过前者的酰胺化来实现。在本发明的上下文中，包括受保护和未受保护的接头肽。
例如，GARK(N3)确实包含两个变体，其中C末端受保护或不受保护。另一方面，例如GARK(N3)-COOH明确指定未受保护的肽，即其中C末端未受保护。
下表5显示在本发明的上下文中包含并适合使用的一些接头：
表5
Figure BDA0003269871400000511
Figure BDA0003269871400000521
实施例
虽然已经在附图和前述描述中详细说明和描述本发明，但是这样的说明和描述被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施例。所公开实施方案的其他变化可以通过本领域技术人员通过研究附图、公开内容和所附权利要求来实践要求保护的发明理解和实现。在权利要求中，“包括”一词不排除其他要素或步骤，不定冠词“一个”或“一”不排除多个。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施的仅仅事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。
本文公开的所有氨基酸序列以N-末端到C末端显示；本文公开的所有核酸序列均以5’->3’显示。
实施例1：缀合效率
按照制造商的说明使用获得的肽并以合适的储备浓度(例如25mM)溶解，制备等分试样并储存在-20℃。IgG亚类的两种抗体(抗体1：抗Her2 IgG1，抗体2：抗CD38 IgG1)修改如下：1mg/mL非去糖基化抗体(～6.67mM)与80摩尔当量的肽接头(即～533μM)、6U/mL MTG和缓冲剂混合。将反应混合物在37℃下孵育20小时，然后在还原条件下进行LC-MS分析。
下表6显示根据本发明的接头(用(*)标记)与其他接头的缀合效率：
表6
Figure BDA0003269871400000522
Figure BDA0003269871400000531
很明显，包含N末端Gly残基的肽，除N末端伯胺外没有其他伯胺，具有迄今为止最好的与糖基化抗体中的Q295残基的缀合效率，即使其他肽同样包含N末端伯胺，但不包含在Gly残基中。
实施例2：缀合效率
按照制造商的说明使用获得的肽并以合适的储备浓度(例如25mM)溶解，制备等分试样并储存在-20℃。IgG亚类的两种抗体(抗体1：抗Her2 IgG1，抗体2：抗CD38 IgG1)修改如下：1mg/mL非去糖基化抗体(～6.67mM)与80摩尔当量的肽接头(即～533mM)、6U/mL MTG和缓冲剂混合。将反应混合物在37℃下孵育20小时，然后在还原条件下进行LC-MS分析。
下表7显示根据本发明的接头(用(*)标记)与图19中显示的另一个接头βAGARK(N3)的缀合效率(注意βA表示β-丙氨酸)。
表7
Figure BDA0003269871400000532
很明显，与具有N末端β-Ala残基的结构类似的接头相比，包含N末端Gly残基，除N末端伯胺外没有其他伯胺的肽具有更好的与糖基化抗体中的Q295残基的缀合效率。
实施例3：细胞毒性测定
细胞系和培养：MDA-MB-231和SK-BR-3从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，并按照标准细胞培养方案在RPMI-1640中培养。
SK-BR-3是乳腺癌细胞系，由Memorial Sloan–Kettering Cancer Center于1970分离，用于治疗研究，特别是在HER2靶向的背景下。MDA-MB-231细胞来源于“基底”型人乳腺腺癌，并且是三阴性(ER、PR和HER2阴性)。Adcetris(Brentuximab Vedotin)是一种市售的靶向CD30的抗体药物缀合物，因此预计对不表达CD30的细胞(例如MDA-MB-231和SK-BR-3)没有活性。Kadcyla(Trastuzumab emtansine)是一种市售的靶向Her2的抗体药物缀合物，因此预期对表达Her2的细胞(例如SK-BR-3)有活性，而对不表达Her2的细胞(例如，MDA-MB-231)没有活性。p684和p579是用本文指定的接头技术产生的抗体药物缀合物，其中接头具有N-末端甘氨酸(GARK(N3)(P684)和GGARK(N3)(P579))。为了生成抗体-有效负载物缀合物，将与DBCO基团(见下文)连接的May(美登素)分子与接头的叠氮基团点击。两种缀合物均使用非去糖基化抗体，并且靶向Her2，药物抗体比为2，因此携带两个May(美登素)分子。赫赛汀是一种非去糖基化、未缀合的抗体，靶向Her2。
Figure BDA0003269871400000541
细胞毒性测定：将细胞以每孔10,000个细胞的密度接种到96孔板(白壁、透明平底板)中，并在37℃和5％CO2下孵育过夜。单克隆抗体(mAb)和抗体-药物缀合物(ADC)在培养基中在10μg/mL(66.7nM)的起始浓度下以1:4的比率进行系列稀释。从细胞中去除培养基，并加入mAb/ADC稀释剂。用培养基处理的细胞仅作为100％活力的参考。细胞与抗体在37℃和5％CO2下孵育三天。
细胞活力通过Cell
Figure BDA0003269871400000543
(Promega)按照制造商的说明进行评估，并在此处简要概述。将板平衡至室温30分钟。Cell
Figure BDA0003269871400000544
试剂通过向底物中加入Cell Titer-Glo缓冲剂制成。每孔加入50μL Cell
Figure BDA0003269871400000545
试剂并在室温下振荡孵育2分钟，然后在室温下再孵育30分钟。在Perkin Elmer 2030Multilabel Reader VictorTM X3读板器上使用1秒的积分时间检测发光。
数据处理如下：仅用培养基处理的孔的发光值取平均值并用作100％活力的参考。使用以下等式计算mAh/ADC处理孔的活力百分比：
Figure BDA0003269871400000542
将标准化百分比活力与mAb/ADC浓度的对数作图并使用GraphPad Prism 7.00拟合数据。
从图18中可以看出，P684和P579具有与Kadcyla相同的针对SK-BR3细胞的效力。因此，通过新型接头技术提供的优势(易于制造、位点特异性、稳定的化学计量、无需将该抗体去糖基化)在细胞毒性方面没有任何劣势。这一点更为重要，因为P684和P579的DAR为2，而Kadcyla的平均DAR为3.53±0.05，因此能够向靶细胞输送更多毒素。下表显示效力(IC50)：
Her-P684-May 1.4nM
Her-P579-May 0.50nM
Kadcyla 0.33nM
实施例4：缀合效率
按照制造商的说明使用获得的肽并以合适的储备浓度(例如25mM)溶解，制备等分试样并储存在-20℃。抗Her2 IgGl抗体(曲妥珠单抗)修饰如下：1mg/mL非去糖基化抗体(～6.67μM)与80摩尔当量的肽接头(即～533μM)、6U/mL MTG和缓冲剂混合。将反应混合物在37℃下孵育20小时，然后在还原条件下进行LC-MS分析。
下表8显示落入本发明范围内的各种接头的缀合效率(以％计的CE)。
Figure BDA0003269871400000551
Figure BDA0003269871400000561
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免责声明
重要的是理解在本文所示的一些接头肽中，C末端的部分被简单地指定为N3。然而，这应当理解为Lys(N3)的缩写。例如，GAR(N3)实际上表示GARK1，其中K1＝Lys(N3)或GlyAlaArgLys(N3)。
此外，重要的是理解，在本文所示的不同接头肽中，C末端可能受到保护，也可能不受保护，即使另有说明。保护可以通过酰胺化来实现。在本发明的上下文中，包括受保护和未受保护的接头肽。例如，GARK(N3)确实包含两个变体，其中C末端受保护或不受保护。
序列表
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<400> 1
Gly Ala Arg Xaa
1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是Lys(四嗪)
<400> 2
Gly Ala Arg Xaa Xaa
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 3
Gly Ala Arg Xaa Cys
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6..6
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 4
Gly Gly Ala Arg Xaa Xaa
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7..7
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 5
Gly Gly Ala Arg Xaa Arg Xaa
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是4-叠氮基-L-同型半胱氨酸
<400> 6
Gly Ala Arg Xaa
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 7
Gly Ala Arg Cys
1
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2..2
<223> Xaa = ß-丙氨酸
<400> 8
Gly Xaa Arg Lys
1
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3..3
<223> Xaa = 高精氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 9
Gly Ala Xaa Xaa
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2..2
<223> Xaa = ß-丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3..3
<223> Xaa = 高精氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 10
Gly Xaa Xaa Xaa
1
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 11
Gly Gly Ala Arg Arg
1 5
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 12
Gly Arg Ala Xaa
1
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 13
Gly Arg Ala Cys
1
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 14
Gly Gly Arg Xaa
1
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3..3
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 15
Gly Arg Xaa
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 16
Gly Gly Arg Xaa Arg
1 5
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3..3
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 17
Gly Gly Xaa Arg Cys
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 18
Gly Gly Arg Arg Xaa
1 5
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 19
Gly Gly Arg Xaa Arg
1 5
<210> 20
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 20
Gly Ala His Xaa
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 21
Gly Gly His Xaa
1
<210> 22
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 22
Gly Cys
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 23
Gly Gly Arg Cys
1
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 24
Gly Arg Cys
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 25
Gly Gly Arg Xaa
1
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 26
Gly Gly Ala Lys Xaa
1 5
<210> 27
<211> 395
<212> PRT
<213> 拉达卡链霉菌 (Streptoverticillium ladakanum)
<400> 27
Met His Arg Arg Ile His Ala Val Gly Gln Ala Arg Pro Pro Pro Thr
1 5 10 15
Met Ala Arg Gly Lys Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu
20 25 30
Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp
50 55 60
Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr
65 70 75 80
Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg
85 90 95
Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met
100 105 110
Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr
115 120 125
Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser
130 135 140
Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg
145 150 155 160
Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser
165 170 175
Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val
180 185 190
Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp
195 200 205
Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu
210 215 220
Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe
225 230 235 240
Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val
245 250 255
Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala
260 265 270
Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Ser Ala Pro Gly
275 280 285
Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro
290 295 300
Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly
305 310 315 320
Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn
325 330 335
His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Cys His Ala Cys Leu Thr
340 345 350
Arg Ala Ser Ser Ala Thr Gly Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg
355 360 365
Gly Glu Pro Tyr Val Val Ser Pro Ser Pro Ser Pro Arg Met Leu Glu
370 375 380
His Arg Pro Arg Gln Gly Lys Ala Gly Leu Ala
385 390 395
<210> 28
<211> 335
<212> PRT
<213> 茂原链霉菌 (Streptomyces mobaraensis)
<400> 28
Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu
20 25 30
Thr Ile Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His
35 40 45
Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu
50 55 60
Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro
65 70 75 80
Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn
85 90 95
Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe
100 105 110
Glu Gly Arg Val Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln
115 120 125
Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala
130 135 140
His Asp Glu Gly Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn
145 150 155 160
Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser
165 170 175
Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His
180 185 190
Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser
195 200 205
Gly Gln Asp Arg Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro
210 215 220
Glu Ala Phe Arg Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg
225 230 235 240
Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val
245 250 255
Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp
260 265 270
Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp
290 295 300
Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro
305 310 315 320
Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro
325 330 335
<210> 29
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是[PEG]3N3
<400> 29
Gly Ala Arg Xaa
1
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是Lys(PEG)n
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7..7
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 30
Gly Gly Ala Arg Xaa Arg Xaa
1 5
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 31
Gly Gly Ala Arg Xaa
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1..1
<223> Xaa是β-丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5..5
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 32
Xaa Gly Ala Arg Xaa
1 5
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 33
Gly Ala Arg
1
<210> 34
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 34
Gly Ala Arg Arg
1
<210> 35
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 35
Gly Gly Ala Arg
1
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 36
Gly Gly Ala Arg Arg
1 5
<210> 37
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 37
Gly Gly Gly
1
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 38
Gly Asp Cys
1
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 39
Gly Arg Cys Asp
1
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 40
Gly Arg Asp Cys
1
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 41
Gly Gly Asp Cys
1
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 42
Gly Gly Cys Asp
1
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 43
Gly Gly Glu Cys
1
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3..3
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 44
Gly Gly Xaa Asp
1
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 45
Gly Gly Arg Cys Asp
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 46
Gly Gly Gly Asp Cys
1 5
<210> 47
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4..4
<223> Xaa是6-叠氮基-L-赖氨酸 (Lys(N3))
<400> 47
Gly Gly Gly Xaa
1
<210> 48
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 茂原链霉菌 MTG Zedira
<400> 48
Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu
20 25 30
Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His
35 40 45
Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu
50 55 60
Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro
65 70 75 80
Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn
85 90 95
Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe
100 105 110
Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln
115 120 125
Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala
130 135 140
His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn
145 150 155 160
Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser
165 170 175
Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His
180 185 190
Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser
195 200 205
Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro
210 215 220
Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg
225 230 235 240
Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val
245 250 255
Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp
260 265 270
Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu
290 295 300
Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro
305 310 315 320
Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro
325 330 335
<210> 49
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 茂原链霉菌 MTG P81453
<400> 49
Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp
20 25 30
Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu
35 40 45
Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp
65 70 75 80
Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr
85 90 95
Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg
100 105 110
Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met
115 120 125
Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr
130 135 140
Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser
145 150 155 160
Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg
165 170 175
Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser
180 185 190
Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val
195 200 205
Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp
210 215 220
Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu
225 230 235 240
Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe
245 250 255
Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val
260 265 270
Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala
275 280 285
Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly
290 295 300
Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro
305 310 315 320
Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly
325 330 335
Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn
340 345 350
His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu
355 360 365
Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly
370 375 380
Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp
385 390 395 400
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Tyr Gln Arg
1

Claims (84)

1.一种通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-接头缀合物的方法，所述方法包括经由N-末端甘氨酸(Gly)残基的N-末端伯胺将接头缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基的步骤，所述接头包含肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数
·n是介于≥0和≤12之间的整数
·m+n≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B是连接部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接头包含两个或更多个连接部分B。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述两个或更多个连接部分B彼此不同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个连接部分B中的至少一个包含
·生物正交标记基团，或
·用于交联的非生物正交实体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物正交标记基团或所述非生物正交实体为选自由以下组成的组中的至少一种：
·–N-N≡N或–N3
·Lys(N3)
·四嗪
·炔烃
·DBCO
·BCN
·降冰片烯
·反式环辛烯
·-RCOH(醛)，
·酰基三氟硼酸盐，
·-SH，和
·半胱氨酸。
6.一种产生抗体-有效负载物缀合物的方法，所述方法包括以下步骤
a)产生根据权利要求1至5中任一项所述的抗体-接头缀合物，和
b)将有效负载物连接到所述抗体-接头缀合物的一个或多个连接部分B。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述有效负载物经由点击反应连接到所述抗体-接头缀合物的连接部分B。
8.一种用于通过微生物转谷氨酰胺酶(MTG)产生抗体-有效负载物缀合物的方法，所述方法包括经由N-末端甘氨酸(Gly)残基的N-末端伯胺将接头缀合到包含在抗体的重链或轻链中的谷氨酰胺(Gln)残基的步骤，所述接头包含肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数
·n是介于≥0和≤12之间的整数
·m+n≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B是有效负载物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述接头包含两个或多个有效负载物B。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述两个或更多个有效负载物B彼此不同。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中所述一个或多个有效负载物选自由以下组成的组：
·毒素
·细胞因子
·生长因子
·放射性核素
·激素
·抗病毒剂
·抗菌剂
·荧光染料
·免疫调节剂/免疫刺激剂
·增加半衰期的部分
·增加溶解度的部分
·聚合物-毒素缀合物
·核酸
·生物素或链霉亲和素部分
·维生素
·靶结合部分，和
·抗炎剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述毒素是选自由以下组成的组中的至少一种：
·吡咯并苯二氮卓类(PBD)
·瑞奥西汀(例如，MMAE、MMAF)
·美登木素生物碱(美登素、DM1、DM4、DM21)
·倍癌霉素
·微管溶素
·埃尼蒂恩(例如卡奇霉素)
·PNU、阿霉素
·基于吡咯的纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂
·卡奇霉素
·鹅膏毒环肽(例如α-鹅膏毒环肽)，和
·喜树碱(例如依喜替康、德鲁替康)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述接头不能被组织蛋白酶切割。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述接头不包含缬氨酸-丙氨酸基序或缬氨酸-瓜氨酸基序。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述抗体是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗体，或其片段或重组变体，其中所述其片段或重组变体保留靶结合性质并且包含CH2结构域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体是IgG抗体。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述抗体是糖基化抗体、去糖基化抗体或无糖基化抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述糖基化抗体是在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中(a)包含所述有效负载物或连接部分B的接头缀合到已通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链中的Gln残基或(b)包含所述有效负载物或连接部分B的接头缀合到抗体的Fc结构域中的Gln残基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗体的Fc结构域中的Gln残基为IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
21.根据权利要求19所述的方法，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链的Gln残基为非糖基化IgG抗体的CH2结构域的N297Q(EU编号)。
22.根据权利要求19所述的方法，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链中的Gln残基包含在肽中，所述肽已经(a)整合到所述抗体的重链或轻链中或(b)融合到所述抗体的重链或轻链的N末端或C末端。
23.根据权利要求22所述的方法，其中包含Gln残基的肽已经融合到所述抗体的重链的C末端。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述包含Gln残基的肽选自由以下组成的组：
·LLQGG，
·LLQG，
·LSLSQG，
·GGGLLQGG，
·GLLQG，
·LLQ，
·GSPLAQSHGG，
·GLLQGGG，
·GLLQGG，
·GLLQ，
·LLQLLQGA，
·LLQGA，
·LLQYQGA，
·LLQGSG，
·LLQYQG，
·LLQLLQG，
·SLLQG，
·LLQLQ，
·LLQLLQ，
·LLQGR,
·EEQYASTY，
·EEQYQSTY，
·EEQYNSTY，
·EEQYQS，
·EEQYQST，
·EQYQSTY，
·QYQS,
·QYQSTY,
·YRYRQ，
·DYALQ，
·FGLQRPY，
·EQKLISEEDL，
·LQR，和
·YQR。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中m+n≤12、11、10、9、8、7、6、5或4。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述接头的净电荷为中性或正电荷。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述接头不包含带负电荷的氨基酸残基。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述接头包含至少一个带正电荷的氨基酸残基。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述接头包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基：
·赖氨酸，
·精氨酸，和
·组氨酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述包含至少一个有效负载物或连接部分B的接头缀合到Gln残基的酰胺侧链。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述微生物转谷氨酰胺酶源自链霉菌属物种，特别是茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)。
32.一种抗体-有效负载物缀合物，其已用根据权利要求6至31中任一项所述的方法产生。
33.一种接头，所述接头包含肽结构(以N->C方向显示)
Gly-(Aax)m-B-(Aax)n
其中Gly包含N末端伯胺，并且其中
·m是介于≥0和≤12之间的整数
·n是介于≥0和≤12之间的整数
·m+n≥0，
·Aax是氨基酸或氨基酸衍生物，并且
·B是有效负载物或连接部分，
其中所述接头可以通过微生物转谷氨酰胺酶经由所述接头的N末端Gly的N末端伯胺缀合到抗体。
34.根据权利要求33所述的接头，其中所述接头包含两个或更多个有效负载物和/或连接部分B。
35.根据权利要求33或34所述的接头，其中所述一个或多个连接部分B中的至少一个包含
·生物正交标记基团，或
·用于交联的非生物正交实体。
36.根据权利要求35所述的接头，其中所述生物正交标记基团或非生物正交实体为选自由以下组成的组中的至少一种：
·–N-N≡N或–N3
·Lys(N3)
·四嗪
·炔烃
·DBCO
·BCN
·降冰片烯
·反式环辛烯
·-RCOH(醛)，
·酰基三氟硼酸盐，
·-SH，和
·半胱氨酸。
37.根据权利要求33或34所述的接头，其中所述一个或多个有效负载物选自由以下组成的组：
·毒素
·细胞因子
·生长因子
·放射性核素
·激素
·抗病毒剂
·抗菌剂
·荧光染料
·免疫调节/免疫刺激剂
·增加半衰期的部分
·增加溶解度的部分
·聚合物-毒素缀合物
·核酸
·生物素或链霉亲和素部分
·维生素
·靶结合部分，和
·抗炎剂。
38.根据权利要求37所述的接头，其中所述毒素是选自由以下组成的组中的至少一种：
·吡咯并苯二氮卓类(PBD)
·瑞奥西汀(例如，MMAE、MMAF)
·美登木素生物碱(美登素、DM1、DM4、DM21)
·倍癌霉素
·微管溶素
·埃尼蒂恩(例如卡奇霉素)
·PNU、阿霉素
·基于吡咯的纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂
·卡奇霉素
·鹅膏毒环肽(例如α-鹅膏毒环肽)，和
·喜树碱(例如依喜替康、德鲁替康)。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的接头，其中所述接头不能被组织蛋白酶切割。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的接头，其中所述接头不包含缬氨酸-丙氨酸基序或缬氨酸-瓜氨酸基序。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的接头，其中m+n≤12、11、10、9、8、7、6、5或4。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的接头，其中所述接头的净电荷为中性或正电荷。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的接头，其中所述接头不包含带负电荷的氨基酸残基。
44.根据权利要求33至43中任一项所述的接头，其中所述接头包含至少一个带正电荷的氨基酸残基。
45.根据权利要求33至44中任一项所述的接头，其中所述接头包含至少一个选自由以下组成的组的氨基酸残基：
·赖氨酸，
·精氨酸，和
·组氨酸。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的接头，其中所述接头选自如表5所示的列表。
47.一种接头-有效负载物构建体，其至少包含
a)根据权利要求33至46中任一项所述的接头，和
b)一种或多种有效负载物，
其中所述一种或多种有效负载物与所述接头共价或非共价结合。
48.根据权利要求47所述的接头-有效负载物构建体，其中在所述构建体中，所述一个或多个有效负载物已经通过点击反应共价结合到所述接头的连接部分B。
49.根据权利要求47所述的接头-有效负载物构建体，其中所述接头-有效负载物构建体通过化学合成获得。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的接头-有效负载物构建体，其中在所述构建体中，所述接头和/或所述一个或多个有效负载物在结合期间已被化学修饰以允许共价或非共价结合，以形成所述构建体。
51.一种抗体-有效负载物缀合物，包含
a)一种或多种根据权利要求47至50中任一项所述的接头-有效负载物构建体，和
b)在所述重链或轻链中包含至少一个Gln残基的抗体，
其中所述接头-有效负载物构建体经由包含在所述接头-有效负载物构建体中的N-末端甘氨酸残基的N末端伯胺缀合到所述抗体的重链或轻链中的Gln残基的酰胺侧链。
52.根据权利要求51所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述缀合用微生物转谷氨酰胺酶(MTG)实现。
53.根据权利要求51或52所述的抗体-有效负载物缀合物，其中在形成所述接头-有效负载物构建体之前或之后实现缀合。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中在所述缀合物中，所述接头-有效负载物构建体和/或所述抗体在缀合期间任选地被化学修饰以允许共价缀合，以形成所述缀合物。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗体，或其片段或重组变体，其中所述其片段或重组变体保留靶标缀合性质并包含CH2结构域。
56.根据权利要求55所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是IgG抗体。
57.根据权利要求55或56所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体是糖基化抗体、去糖基化抗体或无糖基化抗体。
58.根据权利要求57所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述糖基化抗体是在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中(a)所述接头-有效负载物构建体缀合到已通过分子工程引入所述抗体的重链或轻链中的Gln残基或(b)所述接头-有效负载物构建体缀合到抗体的Fc结构域中的Gln残基。
60.根据权利要求59所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体的Fc结构域中的G1n残基是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
61.根据权利要求59所述的抗体-有效负载物缀合物，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链的Gln残基为非糖基化抗体的CH2结构域的N297Q(EU编号)。
62.根据权利要求59所述的抗体-有效负载物缀合物，其中通过分子工程引入到所述抗体的重链或轻链中的Gln残基包含在肽中，所述肽已经(a)整合到所述抗体的重链或轻链中或(b)融合到所述抗体的重链或轻链的N末端或C末端。
63.根据权利要求62所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述包含Gln残基的肽已经融合到所述抗体的重链的C末端。
64.根据权利要求62或63所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述包含Gln残基的肽选自：
·LLQGG，
·LLQG，
·LSLSQG，
·GGGLLQGG，
·GLLQG，
·LLQ，
·GSPLAQSHGG，
·GLLQGGG，
·GLLQGG，
·GLLQ，
·LLQLLQGA，
·LLQGA，
·LLQYQGA，
·LLQGSG，
·LLQYQG，
·LLQLLQG，
·SLLQG，
·LLQLQ，
·LLQLLQ，
·LLQGR,
·EEQYASTY，
·EEQYQSTY，
·EEQYNSTY，
·EEQYQS，
·EEQYQST，
·EQYQSTY，
·QYQS，
·QYQSTY,
·YRYRQ，
·DYALQ，
·FGLQRPY，
·EQKLISEEDL，
·LQR，和
·YQR。
65.根据权利要求51至64中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含至少一种毒素。
66.根据权利要求65所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含毒素和药物流出转运蛋白的抑制剂。
67.根据权利要求65所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含毒素和增加溶解度的部分。
68.根据权利要求65所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含毒素和免疫刺激剂。
69.根据权利要求65所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含两种不同的毒素。
70.根据权利要求69所述的抗体-有效负载物缀合物，其中第一毒素是抑制细胞分裂的毒素，且第二毒素是干扰DNA复制和/或转录的毒素。
71.根据权利要求65至70中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中至少一种毒素是瑞奥西汀或美登木素生物碱。
72.根据权利要求51至64中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含两种免疫刺激剂。
73.根据权利要求68至72所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述至少一种免疫刺激剂是TLR激动剂。
74.根据权利要求51至64中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述抗体-有效负载物缀合物包含放射性核素和荧光染料。
75.根据权利要求74所述的抗体-有效负载物缀合物，其中所述放射性核素是适用于断层摄影术，特别是单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)或正电子发射断层摄影术(PET)的放射性核素，并且其中所述荧光染料是近红外荧光染料。
76.一种药物组合物，其包含根据权利要求33-46中任一项所述的接头、根据权利要求47至50中任一项所述的接头-有效负载物构建体和/或根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物。
77.一种药物产品，其包含根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物或根据权利要求76所述的药物组合物和至少一种其他药学上可接受的成分。
78.根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品用于治疗和/或诊断。
79.根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品用于治疗患者，所述患者
·患有
·有发展以下疾病的风险，和/或
·被诊断为
肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染病。
80.根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品用于治疗患有肿瘤疾病的患者。
81.根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品在制备用于治疗患者的药物中的用途，所述患者
·患有，
·有发展以下疾病的风险，和/或
·被诊断为
肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染病。
82.一种治疗或预防肿瘤疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品。
83.根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品用于术前、术中或术后成像。
84.根据权利要求51至75中任一项所述的抗体-有效负载物缀合物、根据权利要求76所述的药物组合物或根据权利要求77所述的药物产品用于术中成像引导的癌症手术。
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