CN106456798A - 具有高药物负载的抗体‑药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有高药物‑抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶‑介导的抗体‑药物缀合物，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶(例如，具有改变的底物特异性)而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)包括胺供体单元、接头和试剂部分的胺供体试剂，其中所述DAR是至少约5。本发明还提供了这种较高药物负载的抗体‑药物缀合物的制备方法和使用方法。

Description

具有高药物负载的抗体-药物缀合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年4月25日提交的61/984,645号、于2014年7月24日提交的62/028,731号、于2015年1月25日提交的62/103,999号，和于2015年4月14日提交的62/147,293号美国临时申请的权益，所有申请均以其整体通过引用并入本文。
参考的序列表
本申请通过EFS-Web电子提交，并且包括以.TXT格式电子提交的序列表。所述TXT文件包含于2015年4月9日生成的标题为“PC7207805SEQLISTING_ST25.txt”并且具有9KB大小的序列表。包含在这个.TXT文件中的序列表是本申请说明书的一部分，并且在此以其整体通过引用并入本文。
技术领域
本发明主要涉及具有高药物-抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶-介导的抗体-药物缀合物，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶(例如，具有改变的底物特异性)而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)胺供体试剂，包括胺供体单元、接头和试剂部分。本发明还涉及此类抗体-药物缀合物的制备方法和使用方法。
背景技术
抗体治疗在具有各种病变(例如癌症和免疫疾病)的患者中提供靶向的治疗处理，并且因此在生物研究中具有重要作用。现已开发出不同方法的靶向抗体治疗，包括抗体-药物缀合物(ADC)。参见例如Doronina等人，Bioconj.Chem.19:1960-1963(2008)；和Junutula等人，Nat.Biotechnol.26:925-932(2008)。
在抗体-药物缀合物(即免疫缀合物)的情况下，通常将细胞毒性的小分子(药物)连接或缀合至抗体，以将药物部分靶向地局部递送至肿瘤。用于ADC的常规缀合方法包括经赖氨酸侧链胺或经通过还原链内二硫键而活化的半胱氨酸巯基基团的化学修饰。(布妥昔单抗vedotin)和(ado-曲妥珠单抗emtansine)是使用这些常规方法的ADC的两个实例。参见例如Tanaka等人，FEBS Letters 579:2092-2096(2005)；和Strop,Bioconj.Chem.,(in press)(2014)。传统的ADV缀合方法倾向于产生在非特异位点连接不同数量的药物，具有不同的安全特征、功效和清除率的异质混合物。参见例如Wang等人，Protein Sci.14:2436-2446(2005)；和Firer and Gellerman,J.of Hematology&Oncology,5:70(2012)。现已报道每个抗体具有2-4个药物的ADC通常在体内功效；可容许性和药代动力学方面比负载更多(例如每个抗体多于4个药物)的缀合物更好，产生更高的治疗指数。参见例如Hamblett等人，Clinical Cancer Research,10:7063-7070(2004)。
近期还开发出使用转谷氨酰胺酶以制备抗体-药物缀合物的酶促方法。转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13；蛋白质-谷氨酰胺：γ-谷氨酰转移酶；蛋白质-谷氨酰胺：胺γ-谷氨酰转移酶；CAS 80146-85-6)属于向伯胺添加酰基的酶家族，其中肽结合的γ-谷氨酰残基的γ-氨甲酰基团是酰基供体，并且所述伯胺是酰基受体和胺供体。使用转谷氨酰胺酶的抗体和药物缀合提供了高选择性、简化的反应程序和温和的反应条件的优点。参见例如Strop等人，Chemistry&Biology,20:161-167(2013)；和Farias等人，Bioconj.Chem.25(2):240-250(2014)。US20130230543和US2013/0122020描述了转谷氨酰胺酶-介导的位点特异性的抗体和小分子的缀合。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以其整体通过引用并入本文，对所有目的均达到如同特别且单独地指出每篇单独的出版物、专利和专利申请以如此通过引入并入相同的程度。在一篇或多篇并入的文献或相似材料与本申请不同或矛盾的情况下，包括但不限于限定的术语、术语使用或描述的技术等，以本申请为准。
发明内容
本发明主要涉及具有高药物-抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶-介导的位点特异性的抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺(即未经工程化的天然谷氨酰胺，例如在可变结构域、CDR中的谷氨酰胺等)，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶(例如，具有改变的底物特异性)而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)胺供体试剂，包括胺供体单元、接头和试剂部分。本发明人意外地发现与利用马来酰亚胺连接的常规较高负载的ADC相比，这些较高负载的位点特异性ADC(例如，至少5或更高的DAR)具有更高的体内功效和更少的非特异性体外细胞毒性。本发明人已进一步发现这些较高负载的位点特异性ADC：1)在小鼠中具有与未缀合的野生型抗体相似的药代动力学特征并且在大鼠中具有改进的药代动力学特征；并且2)保持与相似负载的常规ADC相当的安全性特征。
一方面，本发明提供了具有下式的ADC：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c，其中：T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1-6的整数；b是1-6的整数；c是1-20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5。
在一些实施方式中，抗体-(T-(X-Y-Za)b)c的T包含至少1个内源谷氨酰胺(例如，天然或反应性的内源谷氨酰胺)。在一些实施方式中，所述反应性的内源谷氨酰胺是通过去糖基化(例如，酶促去糖基化)或通过抗体中另一种氨基酸的氨基酸修饰(例如，在297位的氨基酸取代，例如N297Q或N297A(EU编号方案))而成为反应性的。
在一些实施方式中，本发明中ADC(例如，转谷氨酰胺酶-介导的较高负载的ADC)的抗体进一步包含在K222、K340和/或K370位的第二氨基酸修饰(例如，K222R、K340R和/或K370R)。
在一些实施方式中，所述ADC的胺供体试剂(X-Y-Z)位点特异性地缀合至在选自以下的至少一个或多个位点的含谷氨酰胺的标签：1)任一轻链、重链或轻链和重链二者的羧基末端；2)任一轻链、重链或轻链和重链二者的氨基末端；和3)S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和/或G385(例如，如在表1中列出)，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到抗体中，或代替抗体中一个或多个内源氨基酸。
在一些实施方式中，本发明的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中胺供体试剂(X-Y-Z)位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；和b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签，并且其中药物-抗体比例是约5-7。在一些实施方式中，所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至在选自以下的一个或多个位点的含谷氨酰胺的标签：S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和G385(例如，如在表1中列出)，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到抗体中，或代替抗体中一个或多个内源氨基酸，并且其中药物-抗体比例是至少约6。例如，在一些实施方式中，所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至插入在抗体重链中氨基酸位点T135之后的含谷氨酰胺的标签，并且其中药物-抗体比例是约6-9。在其他实施方式中，所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至在抗体轻链中氨基酸位置G200-S202的含谷氨酰胺的标签，其中内源氨基酸残基被所述含谷氨酰胺的标签替换，并且其中药物-抗体比例是约6-11。
在一些实施方式中，本发明的ADC包含胺供体试剂，其位点特异性地缀合至位于以下的含谷氨酰胺的标签：a)抗体轻链的羧基末端；b)在抗体重链中氨基酸位点T135之后；和c)在抗体轻链中氨基酸位点G200-S202，其中内源氨基酸残基被所述含谷氨酰胺的标签代替，并且其中药物-抗体比例是约5-7。
在一些实施方式中，胺供体试剂(X-Y-Z)选自：Alexa 488尸胺、5-FITC尸胺、Alexa647尸胺、Alexa 350尸胺、5-TAMRA尸胺、5-FAM尸胺、SR101尸胺、5,6-TAMRA尸胺、5-FAM赖氨酸、Ac-Lys-Gly(乙酰-赖氨酸-甘氨酸)-MMAD、氨基-PEG3-C2-MMAD、氨基-PEG6-C2-MMAD、氨基-PEG3-C2-氨基-壬酰-MMAD、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAD、氨基-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-Val-Cit-PABC(乙酰-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基)-MMAD、氨基己酰-MMAD、Ac-Lys-β-Ala-MMAD、氨基-PEG2-C2-MMAE、氨基己酰-MMAE、氨基-PEG3-C2-MMAE、氨基己酰-MMAF、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAE、氨基-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAE、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAF、氨基-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAF、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101、腐胺基-格尔德霉素、Ac-Lys-腐胺基-格尔德霉素、氨基己酰-3377、氨基-PEG6-C2-3377、氨基己酰-0131、氨基-PEG6-C2-0131、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-MMAD、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-MMAE、2-氨基乙氧基-PEG6-NODAGA，和N-2-乙酰基-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰}肼基)羰基]氧代}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺。在一些实施方式中，所述胺供体试剂是包含反应性胺和试剂部分的生物相容性聚合物。
在一些实施方式中，所述胺供体单元-接头(X-Y)是线性或分支的。在一些实施方式中，X-Y选自：Ac-Lys-Gly、氨基己酸、Ac-Lys-β-Ala、氨基-PEG2-C2、氨基-PEG3-C2、氨基-PEG6-C2、Ac-Lys-Val-Cit-PABC、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC、氨基己酰-Val-Cit-PABC、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC、[(3S,5S)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二]双-Val-Cit-PABC、腐胺和Ac-Lys-腐胺。
在一些实施方式中，试剂部分(Z)是选自以下的细胞毒性剂：蒽环霉素(anthracycline)、奥瑞他汀(auristatin)、喜树碱(camptothecin)、考布他汀(combretastain)、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、烯二炔(enediyne)、格尔德霉素(geldanamycin)、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体(indolino-benzodiazepine dimer)、美登素(maytansine)、嘌呤霉素(puromycin)、吡咯并苯二氮杂卓二聚体(pyrrolobenzodiazepinedimer)、紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vincaalkaloid)、特吡莱辛(tubulysin)、哈米特林(hemiasterlin)、斯考他汀(spliceostatin)、普拉地内酯(pladienolide)及其立体异构体，电子等排物，类似物或衍生物。
另一方面，本发明提供了包含多个如本文所述的较高负载的ADC的药物组合物，其中平均药物-抗体比例是至少约5.0。在一个变式中，提供的是包含多个ADC的药物组合物，其中至少一种ADC是如本文所述的较高负载的ADC，并且其中平均药物-抗体比例是至少约4.1。在另一个变式中，本发明提供了包含如本文所述的较高负载的ADC和药学可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了制备如本文所述的ADC的方法，其包括以下步骤：a)提供包含抗体和含谷氨酰胺的标签的抗体-T分子；具有内源谷氨酰胺的抗体；和/或具有反应性内源谷氨酰胺的抗体；b)使所述抗体-T分子在转谷氨酰胺酶的存在下接触包含胺供体单元、接头和试剂部分的胺供体试剂(X-Y-Z)；和c)允许所述抗体-T分子共价连接至所述胺供体试剂以形成所述抗体-药物缀合物。在一些实施方式中，所述缀合物具有至少约51％的缀合效率。
在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括纯化步骤，其中通过色谱步骤纯化ADC。
在一些实施方式中，所述转谷氨酰胺酶是微生物的、纯化的或工程化的转谷氨酰胺酶。
另一方面，本发明提供了治疗有此需要的对象中的癌症的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的药物组合物。
另一方面，本发明提供了抑制有此需要的对象中的肿瘤生长或进展的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的药物组合物。
另一方面，本发明提供了诊断疑似患有癌症的对象中的癌症的方法，包括a)使所述对象的样品与本文所述的ADC在导致所述ADC与癌症相关蛋白结合的条件下接触，和b)测定所述ADC与癌症相关蛋白的结合。
在一些抗体中，如本文所述的ADC中的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体(minibody)，双抗体(diabody)或抗体片段。
在一些实施方式中，如本文所述的ADC中的含谷氨酰胺的标签包含选自以下的氨基酸序列：Q、LQG、LLQGG(SEQ ID NO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:4)、GLLQG(SEQ ID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ ID NO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ IDNO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGPGK(SEQ ID NO:25)、LLQGPG(SEQID NO:26)、LLQGP(SEQ ID NO:27)、LLQP(SEQ ID NO:28)、LLQPGK(SEQ ID NO:29)、LLQAPGK(SEQ ID NO:30)、LLQGAPG(SEQ ID NO:31)、LLQGAP(SEQ ID NO:32)，和LLQLQG(SEQ ID NO:36)。
附图说明
图1显示了与具有DAR 7.2的常规缀合的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有高靶标表达的BxPC3细胞中的细胞毒性。m7E6是抗Trop2(滋养层细胞-表面抗原2，也称作M1S1、GA733-1、EGP-1或TACSTD2)抗体，H7c、L11b、TG6和LCQ04表示含谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶标签和这类标签在抗体中的定位(参见表1)；N297Q表示在Trop2抗体297位从N至Q的氨基酸取代；并且K222R表示在Trop2抗体222位从K至R的氨基酸取代；马来酰亚胺表示通过半胱氨酸缀合的常规缀合方法。这些缩写应用于本文所述的所有其他附图。
图2显示与具有DAR 7.2的常规缀合的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有中度靶标表达的Colo205细胞中的细胞毒性。
图3显示与具有DAR 7.2的常规缀合的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有低靶标表达的CF-PAC1细胞中的细胞毒性。
图4显示与具有DAR 7.2的常规缀合的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在无靶标表达的SW620细胞中的非特异性细胞毒性。
图5显示与具有相似DAR的常规缀合的ADC相比，本发明负载较高的位点特异性ADC在具有中度靶标表达的Colo205细胞中的细胞毒性。
图6显示与具有DAR 7.2的常规缀合的ADC相比，本发明的负载较高的位点特异性ADC在Colo205异种移植模型中的功效。
图7显示与具有相似DAR的常规缀合的ADC相比，本发明的负载较高的位点特异性ADC在Colo205异种移植模型中诱导长效肿瘤停滞的功效。
图8(a)-8(h)显示与未缀合的野生型抗体和具有相似DAR的常规ADC相比，本发明的负载较高的位点特异性ADC在小鼠和大鼠中的PK特征。
图9(a)-9(b)显示在不同的缀合位点组合具有DAR 7.76和7.7的本发明的负载较高的位点特异性ADC在大鼠中的PK特征。
图10(a)-10(d)显示负载教导的ADC在C57B1/6小鼠中的毒理学。图10(a)显示以200mg/kg给药的具有DAR 7.8的常规缀合的ADC和具有DAR7.76的位点特异性ADC的ADC毒物代谢动力学。图10(b)显示使用具有DAR5.85和DAR 7.71的高负载的位点特异性ADC，以及具有DAR 7.8的常规缀合的ADC，以200mg/kg给药的小鼠的体重增加。图10(c)和10(d)显示在第14天，从使用高负载的位点特异性(SS)ADC"DAR6"(m7E6N297Q/K222R/LCQ04基-PEG6-C2-MMAD；DAR 5.85)和SS"DAR8"(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD；DAR7.76)，和常规ADC"Cys DAR8"(m7E6马来酰亚胺PEG6-C2-MMAD；DAR 7.8)以200mg/kg给药的小鼠获得的样品的肝酶活性和临床病理学参数。AP、AST和ALT分别表示天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶。
图11显示在各种ADC中靶标/IgG相互作用的动力学分析，包括WT(m7E6-未缀合的)、SS DAR2(LC)(位点特异性m7E6 LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)、SS DAR4(m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD)、SS DAR6(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)、SSDAR8(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)，和Cys DAR8(m7E6马来酰亚胺PEG6-C2-MMAD)。各图表示在1.2、3.7、11、33和100nM的靶标(人Trop2)浓度下，给定IgG的全局分析。黑线表示测量数据，且红线表示全局拟合；残基显示在各重叠图下。
图12(a)-12(c)显示通过质谱，对来自小鼠体内样品的接头和/或有效负载稳定性分析。此附图比较了具有DAR 8的常规缀合的ADC与具有DAR 6和DAR 8的高负载的位点特异性ADC之间的接头稳定性(图12(a))、药物稳定性(图12(b)；缀合的MMAD C-末端稳定性)和合并的接头-药物稳定性(图12(c))。"Cys DAR8"表示m7E6马来酰亚胺PEG6-C2-MMAD；"SSDAR6"表示m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD；并且SS"DAR8_1"表示m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD。
图13(a)-13(b)显示在不同抗体浓度下以及在不同时间点测量的常规缀合的ADC(“Cys DAR8”：m7E6马来酰亚胺PEG6-C2-MMAD)和高负载的位点特异性ADC DAR6(m7E6N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)和DAR8_1(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)的毒物代谢动力学。
图14显示与具有较低DAR(例如1.96和3.9)的位点特异性的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有高靶标表达的BxPC3细胞中的细胞毒性。
图15显示与具有较低DAR(例如1.96和3.9)的位点特异性的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有中度靶标表达的Colo205细胞中的细胞毒性。
图16显示与具有较低DAR(例如1.96和3.9)的位点特异性的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有低靶标表达的CF-PAC1细胞中的细胞毒性。
图17还显示与具有较低DAR(例如1.96和3.9)的位点特异性的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在无靶标表达的SW620细胞中不存在非特异性细胞毒性。
图18A和18B显示与具有较低DAR(例如1.9和3.7)的位点特异性的ADC相比，具有升高的DAR的位点特异性ADC在具有低和中度靶标表达的L363和MM1.S细胞中的体外功效。
具体实施方式
本发明主要涉及具有高药物-抗体比例(DAR)的转谷氨酰胺酶-介导的位点特异性的抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺(即未经工程化的天然谷氨酰胺，例如在可变结构域、CDR中的谷氨酰胺等)，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；和2)胺供体试剂，包括胺供体单元、接头和试剂部分，其中DAR是至少约5。此前已发现利用常规的马来酰亚胺连接的具有2-4的DAR的抗体-药物缀合物在体内功效、可容许性和药代动力学方面比其负载更高的对应物更好，产生更高的治疗指数。本文描述了与常规较高负载的ADC相比，具有更高的体内功效和更少的非特异性体外细胞毒性的较高负载的位点特异性ADC(例如，至少5或更高的DAR)。在长效肿瘤生长停滞方面，单一剂量的本文公开的较高负载的位点特异性ADC明显优于具有相似DAR的常规ADC。此外，这些较高负载的位点特异性ADC在小鼠中具有与未缀合的野生型抗体相似的药代动力学特征并且在大鼠中具有超过常规的较高负载ADC的改进的PK特征。这些较高负载的位点特异性ADC还保持与具有等效药物负载的常规ADC相当的安全性特征。
因此，提供了较高负载的位点特异性ADC，各ADC包含下式：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c，其中：T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1-6的整数；b是1-6的整数；c是1-20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5。还提供了有此需要的对照中治疗癌症、抑制肿瘤生长或进展、抑制癌细胞或肿瘤转移，或诱导肿瘤消退的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的药物组合物。
还提供了用于制备如本文所述的ADC的方法，其包括以下步骤：a)提供包含抗体和含谷氨酰胺的标签的抗体-T分子；和/或具有内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的抗体；b)使所述抗体-T分子在转谷氨酰胺酶的存在下接触胺供体试剂；和c)允许所述抗体-T分子共价连接至所述胺供体试剂以形成ADC。在一些实施方式中，所述转谷氨酰胺酶是工程化的转谷氨酰胺酶。
通用技术和定义
除非本文另有定义，相关于本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非文中另有需要，单数术语应包括复数，及复数术语应包括单数。通常，相关于本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学以及杂交使用的术语和技术是本领域技术人员熟知且常用的。
除非另有指出，本发明的方法和技术通常根据常规方法进行，其是本领域熟知的且在本说明书全文中引用且论述的各种一般和更特定的参考文献所述。参见例如SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人，Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人，Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。如在本领域中常规实现或如本文所述的，根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术。相关于本文描述的分子生物学、生物化学、免疫、分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的术语和实验室方案和技术是本领域熟知和常用的那些。在本说明书和权利要求书中，术语“包含”("comprise")或变体("comprises"或"comprising")将理解为意指包含所述的实体或实体的组，但不排除任何其他实体或实体的组。
如本文使用的术语“含谷氨酰胺的标签”、“谷氨酰胺标签”、“含Q标签”、“Q-标签”或“转谷氨酰胺酶标签”是指包含在转谷氨酰胺酶反应中充当胺受体或酰基供体的一个或多个Gln残基的多肽或蛋白质。
如本文使用的术语“胺供体试剂”或“酰基受体”是指包含一个或多个反应性胺(例如伯胺)的试剂。例如，所述胺供体试剂可包含胺供体单元(例如，伯胺NH2)、接头(例如，连接至胺供体单元且包含用于连接至有效负载(例如小分子、多肽或生物相容性聚合物)的额外官能度的分子)，和试剂部分(例如，有效负载，例如小分子)。所述胺供体试剂也可以是包含一个或多个反应性赖氨酸、N-末端或反应性胺的多肽(例如抗体)或生物相容性聚合物。
如本文使用的术语“位点特异性”、“位点特异性地缀合”或“位点特异性地交联”是指胺供体试剂通过含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺，在特异性位点(例如，在表1中列出的各种位点)特异性缀合或交联至抗体。可通过各种技术测量位点特异性，包括但不限于：质谱法(例如，基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)、电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)、串联质谱法(MS-MS)和飞行时间质谱法(TOF-MS))、疏水相互作用色谱、离子交换色谱、定点诱变、荧光标记、尺寸排阻色谱和X射线晶体学。
如本文使用的术语“变成反应性的内源谷氨酰胺(Q)”是指在转谷氨酰胺酶的存在下，通过抗体工程化(例如，酶促去糖基化和/或氨基酸修饰)或通过工程化的转谷氨酰胺酶，已变成对胺供体试剂易感、暴露或反应性的内源谷氨酰胺。
如本文使用的术语“生物相容性聚合物”是指适合用于受体(例如人)中的治疗或医疗处理，而不在所述受体中激发任何不期望的局部或全身性作用的聚合物(例如，重复的单体或结构单元)。生物相容性聚合物(合成、重组或天然的)可以是水溶性或水不溶性的聚合物。生物相容性聚合物也可以是线性或分支的聚合物。
如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。除非本文另有说明，期望如本文所用该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)和结构域抗体(包括鲨鱼和骆驼抗体)，和包含抗体部分的融合蛋白、多价抗体(例如COVX-BODYTM)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要其展示期望的生物活性)和如本文所述的抗体片段，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰结构。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或者其亚类)，并且抗体不需要是任何特定类别。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可被指定为不同类别。免疫球蛋白有五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可进一步分为亚类(同种型(isotype))，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。一方面，所述免疫球蛋白是人、鼠、猴或兔免疫球蛋白。
如本文使用的术语“含Fab的多肽”是指包含Fab片段、Fab'片段，或“(Fab')2片段”的多肽。含Fab的多肽可以包含部分或全部的野生型铰链序列(通常在所述多肽的Fab部分的羧基末端)。含Fab的多肽可以得自或源自任何适合的免疫球蛋白，例如来自各种IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的至少一种，或来自IgA、IgE、IgD或IgM。含Fab的多肽可以是含Fab的融合多肽，其中一种或多种多肽连接至含Fab的多肽。Fab融合物将免疫球蛋白的Fab多肽与融合伴侣组合，其通常可以是任何蛋白、多肽或小分子。实质上任何蛋白或小分子都可以连接至Fab多肽，以产生含Fab的融合多肽。含Fab的融合伴侣可以包括但不限于：受体的靶结合区，粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其他蛋白或蛋白结构域。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。
“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的包含VH结构域和CH1结构域并且还包含在CH1和CH2结构域之间的区域的部分，这样在两个Fab'片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，从而形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含两条轻链和包含CH1和CH2结构域之间的恒定区域的部分的两条重链，这样在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键结合在一起的两个Fab’片段构成。
如本文使用的“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留至少一种，优选大部分或所有通常与存在于完整抗体中时的该部分相关的功能。
“多特异性抗体”是靶向多于一种抗原或表位的抗体。“双特异性”、“双重-特异性”或“双功能”抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体是多特异性抗体的种类，并且可以各种方法生产，包括但不限于融合杂交瘤、连接Fab'片段或在抗体铰链和CH3结构域中的突变。参见例如Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148:1547-1553(1992)；Strop等人，J.Mol.Biol.420(3):204-219(2012)。双特异性抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，其存在于相同或不同的蛋白靶标上。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指获自实质上均质的抗体群体的抗体，即构成所述群体的个体抗体除可存在少量的可能天然发生的突变外均相同。单克隆抗体针对单一抗原具高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。
在某些实施方式中，本文的单克隆抗体可以特别包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的一部分与源自具体物种或属于具体抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其他部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生物活性(美国专利4,816,567号；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是包含最低限度的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高可变区的残基被具有期望特异性、亲和力和能力的来自非人物种，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供体抗体)的高可变区的残基代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外，人源化抗体可包含未见于受体抗体中或供体抗体中的残基。可进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本全部的至少一个且通常为两个可变结构域，其中全部或基本全部的高可变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。任选地，人源化抗体还可包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的那些。关于进一步的细节，参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见以下综述文章及其引用的文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“人抗体”是指所具有的氨基酸序列对应于人类产生的抗体的序列和/或已使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术制得的抗体。人抗体的这个定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文使用的“铰链区”、“铰链序列”及其变式包括本领域中已知的含义，其由例如Janeway等人，ImmunoBiology:the immune system in health and disease,(ElsevierScience Ltd.,NY)(4thed.,1999)；Bloom等人，Protein Science(1997),6:407-415；Humphreys等人，J.Immunol.Methods(1997),209:193-202说明。
如本文使用的术语“含Fc的多肽”是指包含免疫球蛋白重链的羧基末端多肽序列的多肽(例如抗体或免疫粘附素)。含Fc的多肽可以包含天然或变体Fc区(即，序列)。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，且任选地包含CH4结构域。含Fc的多肽可以包含部分或全部的野生型铰链序列(通常在所述含Fc的多肽的氨基末端)。含Fc的多肽也可以是二聚体。含Fc的多肽可以得自或源自任何适合的免疫球蛋白，例如来自各种IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的至少一种，或来自IgA、IgE、IgD或IgM。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以改变，但例如人IgG重链Fc区通常定义为从Glu216或从Ala231位的氨基酸残基至其羧基末端的区段。Fc区中的残基编号是如在Kabat中的EU索引的编号。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。
含Fc的多肽可以是含Fc的融合多肽，其中一种或多种多肽连接至含Fc的多肽。Fc融合物将免疫球蛋白的Fc多肽与融合伴侣组合，所述融合伴侣通常可以是任何蛋白、多肽或小分子。实质上任何蛋白或小分子都可以连接至Fc区，以产生含Fc的融合多肽。含Fc的融合伴侣可以包括但不限于：受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其他蛋白或蛋白结构域。
如本文使用的术语“免疫粘附素”是指抗体样或免疫球蛋白样的分子，其将异源蛋白(“粘附素”，例如受体、配体或酶)的“结合结构域”与免疫球蛋白恒定结构域(即，Fc结构域)的效应子组分组合。在结构上，免疫粘附素包含具有期望的结合特异性的粘附素氨基酸序列(其不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原组合位点))(即，为“异源的”)和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合物。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以得自任何免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度、优选相对较短(例如10-100个氨基酸)的氨基酸链。所述链可为线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，和/或可间杂有非氨基酸。所述术语还涵盖已天然或通过介入(intervention)来修饰的氨基酸链；例如形成二硫键、糖基化作用、脂化作用、乙酰化作用、磷酸化作用，或任何其他操纵或修饰，如使用标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有氨基酸的一或多种类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其他修饰的多肽。应理解，所述多肽可以作为单链或结合链出现。
如本文使用的术语“野生型氨基酸”、“野生型IgG”或“野生型mAb”是指在某些群体(例如人、小鼠、大鼠、细胞等)内天然出现的氨基酸或核酸的序列。
如本文使用的术语“缀合效率”或“交联效率”是指经试验测量的本文所述的ADC的量除以最大预期ADC量之间的比例。缀合效率或交联效率可以通过本领域技术人员熟知的各种技术测量，例如疏水作用色谱。缀合效率也可以在不同温度下测量，例如在室温或37℃。
术语“效应功能”是指可归因于抗体Fc区的生物活性。抗体效应功能的实例包括但不限于：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、Fc受体结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、吞噬作用、C1q结合及细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调。参见例如美国专利6,737,056号。此类效应功能一般需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合且可使用本领域中已知用于评估此类抗体效应功能的各种测定来评估。效应功能的例示性测量是经由Fcγ3和/或C1q结合。
如本文使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并且随后导致靶细胞的裂解。目标分子的ADCC活性可以使用体外ADCC测定评估，例如美国专利5,500,362或5,821,337号中所述。对此类测定有用的效应细胞包括效应外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。可选地或额外地，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，如在Clynes等人1998,PNAS(USA),95:652-656中公开的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下的裂解靶标。补体活化途径是通过补体系统的第一组分(C1q)与复合至同源抗原的分子(例如抗体)的结合启动的。为了评估补体活化，可以进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述。
如本文使用的“Fc受体”和“FcR”描述了结合至抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的那种(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要差别在其胞质结构域的相似氨基酸序列。FcR综述在Ravetch and Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9:457-92；Capel等人，1994,Immunomethods,4:25-34；deHaas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41；Nimmerjahn et al.,2005,Immunity 23:2-4。“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117:587；和Kim等人，1994,J.Immunol.,24:249)。
如本文使用的“治疗”是获得有益或期望临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于以下的一种或多种：减少(或破坏)肿瘤或癌细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的转移，收缩或减小肿瘤的大小，癌症缓解，减少癌症症状，提高患癌症者的生活质量，减少治疗癌症所需的其它药物的剂量，延迟癌症的进展，治愈癌症和/或延长癌症患者的存活。
如本文所用的药物、化合物或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是指足以实现任一种或多种有益或期望结果的量。出于预防性用途，有益或期望的结果包括消除或降低疾病风险、减轻其严重性或延缓其开始，包括病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症及在病症发展期间呈现的中间病理学表达型。出于治疗性用途，有益或期望的结果包括临床结果，例如降低各种癌症相关的疾病或病症(例如胃癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌)的一或多种症状发生率或改善其一种或多种症状、减少治疗疾病所需的其他药剂的剂量、增强另一药剂的作用和/或延缓癌症在患者中的进展。有效剂量可以在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是指足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如在临床背景下所理解的，连同另一药物、化合物或药物组合物，可实现或不可实现药物、化合物或药物组合物的有效剂量。因此，“有效剂量”可在施用一种或多种治疗剂的背景下考虑，并且如果连同一种或多种其他试剂，可以达到或达到了期望的结果，则可认为单一试剂以有效量给予。
使用术语“纯化”及其语法变式是指从包含ADC和一种或多种杂质的混合物完全或部分地除去至少一种杂质，从而改进ADC在组合物中的纯度水平(即，通过降低组合物中一种或多种杂质的量(ppm))。
本文中对“约”一值或参数的提及包括(及描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括界定所述范围的数字。
“个体”或“对象”是哺乳动物，更优选人。哺乳动物还包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
可理解，本文中各处以“包含”表述描述的实施方式，也在他处提供了以“由……组成”和/或“基本由……组成”的方式描述的类似实施方式。
在本发明的方面或实施方式以马库什组或其他可选方案的组的方式描述的情况下，本发明不仅涵盖作为整体列出的完整的组，还涵盖单独的组的每个成员以及主要组的所有可能的子组，并且还涵盖缺少一个或多个组成员的主要组。本发明还涉及要求保护的发明的一个或多个任何组成员的明确排除。
本申请中的残基命名是基于恒定结构域的EU编号方案(Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63(1):78-85(1969)。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一位普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管本文描述了示例性的方法和材料，但与本文所述那些相似或等效的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。本文中提及的所有出版物和其他文献均通过引用以其整体并入。在出现矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。尽管本文引用多篇文件，但这种引用并不构成对这些文件中的任一者形成本领域中公知常识的一部分的认可。在本说明书和权利要求书中，术语“包含”("comprise")或变体("comprises"或"comprising")将理解为意指包含所述的实体或实体的组，但不包括任何其他实体或实体的组。除非上下文另有需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。材料、方法及实例仅为说明性的且无意限制。
具有高药物负载的抗体-药物缀合物
本文的抗体-药物缀合物包含通过工程化的含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺(即，未经工程化的天然谷氨酰胺，例如在可变结构域、CDR中的谷氨酰胺等)和/或反应性内源谷氨酰胺位点特异性地缀合至胺供体试剂(例如，与具有胺供体单元偶联的小分子)，其中药物-抗体比例(DAR)是至少约5(例如，每个抗体至少5个药物/有效负载)。所述内源谷氨酰胺可以通过修饰抗体中的一个或多个氨基酸(例如，氨基酸删除、插入、取代或突变)，通过酶促去糖基化，或通过与工程化转谷氨酰胺酶反应而成为反应性的(即，在胺和转谷氨酰胺酶的存在下与酰基供体形成共价键的能力)。因此，一方面，提供了具有下式的抗体-药物缀合物(ADC)：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c，其中：T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1-6的整数；b是1-6的整数；c是1-20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5。本文所述的抗体上的含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性谷氨酰胺，和胺供体试剂(X-Y-Z)都是转谷氨酰胺酶的底物，并且所述含谷氨酰胺的标签和/或内源/反应性谷氨酰胺与所述胺供体试剂之间的连接是式CH2-CH2-CO-NH-，其中NH-连接到接头和试剂部分。
转谷氨酰胺酶是蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶(EC 2.3.2.13)，其通常催化谷氨酰胺残基与赖氨酸残基的pH依赖性的转酰氨基作用。在本文描述的发明中使用的转谷氨酰胺酶可以从各种来源获得或制得，或经工程化以催化一个或多个内源谷氨酰胺残基与一个或多个赖氨酸残基或包含一个或多个反应性胺的胺供体试剂的转酰氨基作用。在一些实施方式中，所述转谷氨酰胺酶是钙依赖的转谷氨酰胺酶，其需要钙以诱导酶构象变化并允许酶活性。例如，转谷氨酰胺酶可以源自豚鼠肝并且通过商购来源获得(例如Sigma-Aldrich(St Louis,MO)和MP Biomedicals(Irvine,CA))。在一些实施方式中，mTGase多肽源自真菌蛋白(例如，卵菌(Oomycetes)、放线菌(Actinomycetes)、酵母(Saccharomyces)、念珠菌(Candida)、隐球菌(Cryptococcus)、红曲霉(Monascus)或根霉(Rhizopus)转谷氨酰胺酶)。在一些实施方式中，mTGase多肽源自粘菌霉(例如，多头绒泡菌(Physarumpolycephalum)转谷氨酰胺酶)。在一些实施方式中，mTGase多肽源自细菌蛋白，例如，来自链轮丝菌属(Streptoverticillium sp.)或链霉菌属(Streptomyces sp.)(例如茂原链霉菌(Streptomyces mobarensis)或茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobarensis))的转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，mTGase多肽源自细菌蛋白，例如来自但不限于茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobarensis)、灰肉色链轮丝菌(Streptoverticilliumgriseocarneum)、拉达克链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)、茂原链霉菌(Streptomyces mobarensis)、绿色链霉菌(Streptomyces viridis)、拉达克链霉菌(Streptomyces ladakanum)、生暗灰链霉菌(Streptomyces caniferus)、扁平链霉菌(Streptomyces platensis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopius)、纺锤链霉菌(Streptomyces netropsis)、费氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、玫瑰轮丝链霉菌(Streptomyces roseovertivillatus)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamaoneous)、灰肉链霉菌(Streptomyces griseocarneum)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、盐屋链霉菌(Streptomyces sioyansis)、马杜拉放线菌(Actinomadura sp.)、芽孢杆菌(Bacillus)(例如环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、梭菌(Clostridium)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、微球菌(Micrococcus)、普罗威登斯菌(Providencia sp.)，或其分离物的转谷氨酰胺酶。在一些实施方式中，所述转谷氨酰胺酶是不依赖钙的转谷氨酰胺酶，其不需要钙以诱导酶构象变化并允许酶活性。在一些实施方式中，mTGase多肽源自茂原链霉菌(S.mobarensis)。商购可得的不依赖钙的转谷氨酰胺酶，例如ACTIVATM(Ajinomoto,Japan)也适合于本发明。
在一些实施方式中，在本文所述的发明中使用的转谷氨酰胺酶是工程化的转谷氨酰胺酶，其催化抗体中的一个或多个内源谷氨酰胺残基与胺供体试剂中的一个或多个赖氨酸残基或反应性胺的转酰氨基作用。例如，可以删除，或使用另一种氨基酸残基替代或取代天然出现的转谷氨酰胺酶中的一个或多个野生型氨基酸，以制备工程化的转谷氨酰胺酶。
在一个实施方式中，在本文所述的发明中使用的转谷氨酰胺酶也可以是使用本领域技术人员已知的重组技术产生的重组蛋白。在一些实施方式中，在本文所述的发明中使用的转谷氨酰胺酶可以是纯化的蛋白。例如，纯化的转谷氨酰胺酶是至少约50％纯的。如本文使用的，“纯”或“纯化”蛋白是指不含其他蛋白污染物的蛋白(例如，转谷氨酰胺酶)。在一些实施方式中，纯化的转谷氨酰胺酶是至少约55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-98％或99％纯的任一种。在一些实施方式中，纯化的转谷氨酰胺酶是约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的任一种。
在一些实施方式中，如本文所述的ADC的含谷氨酰胺的标签不与抗体中的反应性Lys在空间上相邻。例如，所述含谷氨酰胺的标签不与多肽的羧基末端、氨基末端，或羧基和氨基末端二者中的反应性Lys在空间上相邻。
在一些实施方式中，本发明的ADC包含通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶的转酰氨基反应而成为反应性的至少1个内源谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述抗体工程化是抗体上的抗体去糖基化(例如，酶促去糖基化)；或氨基酸修饰，例如氨基酸删除、插入、取代、突变，或任何组合。例如，使用氨基酸Ala(A)取代或代替在抗体297位的野生型氨基酸Asn(N)，导致297位的去糖基化和295位的反应性内源谷氨酰胺(Q)。在另一实例中，抗体中的氨基酸修饰是在转谷氨酰胺酶的存在下，在297位从N至Q的氨基酸取代，导致297位的去糖基化、在295位的反应性内源Q，和以及在这两个位点处N297Q和Q295与一种或多种胺供体试剂之间的位点特异性缀合。
在一些实施方式中，本发明的ADC包含在至少一个或多个位点工程化的含谷氨酰胺的标签，所述位点包括但不限于：1)任一轻链、重链或轻链和重链二者的羧基末端；2)任一轻链、重链或轻链和重链二者的氨基末端；和3)S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和/或G385位，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到所述抗体中，或代替所述抗体中一个或多个内源氨基酸，其中药物-抗体比例是至少约5。特异性含谷氨酰胺的标签和对应的工程化位点的实例提供在表1。因此，在一些实施方式中，本发明的ADC包括至少约5的DAR(例如，每个抗体5个药物/有效负载)和在表1中列出的任一个或多个位点工程化的含谷氨酰胺的标签。
表1
在一些实施方式中，相对于野生型抗体的相同位点，本发明的ADC的抗体进一步包括在222、340和或370位(EU编号)的第二氨基酸修饰。在一些实施方式中，所述修饰是氨基酸删除、插入、取代、突变或其任意组合。在一些实施方式中，所述取代包括使用另一氨基酸(例如非野生型氨基酸)代替野生型氨基酸。在一些实施方式中，所述其他(例如非野生型)氨基酸是Arg(例如K222R、K340R或K370R)。在一些实施方式中，所述其他(例如非野生型)氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。
因此，在一些实施方式中，本发明的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；和b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签；并且其中药物-抗体比例(DRA)是约5-7。在一些实施方式中，在抗体轻链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方式中，本发明的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签；和c)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至在选自抗体的以下一个或多个位点的含谷氨酰胺的标签：S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和G385，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到所述抗体中，或代替所述抗体中的一个或多个内源氨基酸，并且其中药物-抗体比例是至少约6。例如，在一些实施方式中，本发明的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签；c)一个或多个谷氨酰胺标签，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至抗体重链羧基末端的含谷氨酰胺的标签并且其中药物-抗体比例(DAR)是约6-9。在一些实施方式中，在抗体轻链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)；并且在抗体重链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是LLQGA(SEQ ID NO:11)或LLQGPP(SEQ ID NO:20)。
在一个变式中，本发明的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签；c)一个或多个谷氨酰胺标签，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至插入在抗体重链中的氨基酸位点T135之后的含谷氨酰胺的标签；并且其中药物-抗体比例(DAR)是约6-9。在一些实施方式中，在抗体轻链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)；并且插入在抗体重链中的T135之后的含谷氨酰胺的标签是LLQG(SEQ ID NO:2)。
在另一变式中，本发明的ADC包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签；c)一个或多个谷氨酰胺标签，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至抗体重链中的氨基酸位点G200-S202的含谷氨酰胺的标签；并且其中药物-抗体比例(DAR)是约6-9。在一些实施方式中，在抗体轻链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)；并且在抗体轻链中的氨基酸位点G200-S202的含谷氨酰胺的标签是LLQG(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中，本发明的ADC还包括：a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体轻链羧基末端的含谷氨酰胺的标签；c)一个或多个谷氨酰胺标签，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至抗体轻链中的氨基酸位点G200-S202的含谷氨酰胺的标签；(d)一个或多个谷氨酰胺标签，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至插入在抗体重链中的氨基酸位点T135之后的含谷氨酰胺的标签；并且其中药物-抗体比例(DAR)是约9-11。在一些实施方式中，在抗体轻链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)；在抗体轻链中的氨基酸位点G200-S202的含谷氨酰胺的标签是LLQG(SEQ ID NO:2)；并且插入在抗体重链中的T135之后的含谷氨酰胺的标签也是LLQG(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中，本发明的ADC还包含胺供体试剂，其位点特异性地缀合至位于以下的含谷氨酰胺的标签：a)抗体轻链的羧基末端；b)在抗体重链中的氨基酸位点T135之后；和c)在抗体轻链中的氨基酸位点G200-S202，其中内源氨基酸残基被所述含谷氨酰胺的标签代替，并且其中药物-抗体比例是约5-7。在一些实施方式中，在抗体轻链的羧基末端的含谷氨酰胺的标签是GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)；在抗体轻链中的氨基酸位点G200-S202的含谷氨酰胺的标签是LLQG(SEQ ID NO:2；并且插入在抗体重链中的T135之后的含谷氨酰胺的标签也是LLQG(SEQ ID NO:2)。
本发明的ADC的药物-抗体比例(DAR)是约5至约720。在一些实施方式中，DAR是至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700和710的任一种。
在一些实施方式中，本文所述的ADC的含谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列XXQX(SEQ ID NO:37)，其中X可以是常规或非常规氨基酸，如本文所述。例如，在一些实施方式中，X是L(Leu)、A(Ala)、G(Gly)、S(Ser)、V(Val)、F(Phe)、Y(Tyr)、H(His)、R(Arg)、N(Asn)、E(Glu)、D(Asp)、C(Cys)、Q(Gln)、I(Ile)、M(Met)、P(Pro)、T(Thr)、K(Lys)或W(Trp)。在一些实施方式中，所述含谷氨酰胺的标签包含选自以下的氨基酸序列：Q、LQG、LLQGG(SEQ IDNO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:4)、GLLQG(SEQID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ ID NO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQYQGA(SEQID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ ID NO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGPGK(SEQ ID NO:25)、LLQGPG(SEQ ID NO:26)、LLQGP(SEQ ID NO:27)、LLQP(SEQ ID NO:28)、LLQPGK(SEQ ID NO:29)、LLQAPGK(SEQ ID NO:30)、LLQGAPG(SEQID NO:31)、LLQGAP(SEQ ID NO:32)和LLQLQG(SEQ ID NO:36)。在一些实施方式中，所述含谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQGA(SEQ ID NO:11)、LQG、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)、LLQGSG(SEQID NO:13)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LLQYQG(SEQ ID NO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、LLQLQG(SEQ ID NO:36)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、SLLQG(SEQ ID NO:16)或LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)。在一些实施方式中，酰基供体含谷氨酰胺的标签不包含选自以下的氨基酸序列：LGGQGGG(SEQ ID NO:38)、GGGQGGL(SEQ ID NO:39)、GXGQGGG(SEQ ID NO:40)、GGXQGGG(SEQ ID NO:41)、GGGQXGG(SEQ ID NO:42)和GGGQGXG(SEQ ID NO:43)，其中X是G、A、S、L、V、F、Y、R、N或E。其他示例性的标签描述于，例如US20130230543和US2013/0122020中。
在一些实施方式中，相对于野生型抗体的相同位点，本文所述的ADC的抗体包含在羧基末端最后的氨基酸位点的氨基酸修饰。在一些实施方式中，所述修饰是氨基酸删除、插入、取代、突变或其任意组合。在一些实施方式中，所述取代包括使用另一氨基酸(例如非野生型氨基酸)代替野生型氨基酸。在一些实施方式中，所述插入包括插入一个或多个氨基酸(例如插入一个、两个、三个或更多的氨基酸)。在一些实施方式中，所述其他(例如非野生型)或插入的氨基酸是Arg。在一些实施方式中，所述其他(例如非野生型)氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。例如，在一些实施方式中，在抗体(例如抗体重链)羧基末端最后的氨基酸可被删除，并且工程化至多肽C-末端的含谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQGA(SEQ ID NO:11)或LLQGPP(SEQ IDNO:20)。
在一些实施方式中，相对于野生型抗体的相同位点，所述抗体包含在氨基末端中首个氨基酸位点的氨基酸修饰。在一些实施方式中，所述修饰是氨基酸删除、插入、取代、突变或其任意组合。在一些实施方式中，所述取代包括使用另一氨基酸(例如非野生型氨基酸)代替野生型氨基酸。在一些实施方式中，所述插入包括插入氨基酸。在一些实施方式中，所述非野生型或插入的氨基酸是Arg。在一些实施方式中，所述其他(例如非野生型或插入的)氨基酸是Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val。
在一些实施方式中，本文所述的ADC包含全长抗体重链和抗体轻链。在一些抗体中，本文所述的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体，双抗体或抗体片段。
在一些实施方式中，所述抗体是IgG。在一些实施方式中，所述IgG选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施方式中，所述抗体是IgA、IgE、IgD或IgM。
在一些实施方式中，本文所述的ADC的效应功能(例如，通过Fcγ3和/或C1q结合所测量的)相对于野生型抗体降低不超过约1倍、2倍、3倍、4倍或5倍中的任一种。在一些实施方式中，所述ADC的抗体是IgG，其中IgG的效应功能相对于野生型IgG降低不超过约2倍。在其他实施方式中，IgG的效应功能相对于野生型IgG降低约2倍。在其他实施方式中，IgG的效应功能相对于野生型IgG降低大于约2倍。在一些实施方式中，所述ADC的抗体是IgG，其中IgG的效应功能相对于野生型IgG降低不超过约1倍。在其他实施方式中，IgG的效应功能相对于野生型IgG降低约1倍。在一些实施方式中，IgG的效应功能相对于野生型抗体降低大于约1倍、3倍、4倍或5倍中的任一种。
在一些实施方式中，本文所述的ADC的效应功能(例如，通过Fcγ3和/或C1q结合所测量的)相对于野生型抗体增加至少约1倍至3000倍。在一些实施方式中，ADC的效应功能相对于野生型抗体增加至少约1-至5-倍、6-至10-倍、11-至15-倍、16-至20-倍、21-至25-倍、26-至30-倍、31-至35-倍、36-至40-倍、41-至45-倍、46-至50-倍、51-至55-倍、56-至60-倍、61-至65-倍、66-至70-倍、71-至75-倍、76-至80-倍、81-至85-倍、86-至90-倍、91-至95-倍、96-至100-倍、101-至200-倍、201-至300-倍、301-至500-倍、501-至1000-倍、1001-至1500-倍、1501-至2000-倍、2001-至2500-倍、2501-至3000-倍。在一些实施方式中，所述ADC的抗体是IgG，其中IgG的效应功能相对于野生型IgG增加约1倍至300倍。在一些实施方式中，IgG的效应功能相对于野生型IgG增加约2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、10-倍、15-倍、20-倍、40-倍、60-倍、80-倍、100-倍、150-倍、200-倍、250-倍、300-倍、400-倍、500-倍、600-倍、700-倍、800-倍、900-倍、1000-倍、1500-倍、2000-倍、2500-倍或3000-倍中的任一种。
在一些实施方式中，所述胺供体试剂具有下式：X-Y-Z，其中X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分。
可缀合至抗体的胺供体试剂的数量取决于：1)连接/插入至抗体的含谷氨酰胺的标签的数量，以及在所述含谷氨酰胺的标签上的谷氨酰胺的数量；和/或2)抗体上的内源谷氨酰胺(即未经工程化的天然谷氨酰胺，例如可变结构域、CDR中的谷氨酰胺等)的数量；和/或3)通过如本文所述的抗体工程化或工程化转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺的数量。例如，可将两个胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体的两条轻链的羧基末端，并且可将四个胺供体试剂位点特异性地缀合至抗体的Q295和N297Q。在一些实施方式中，在各缀合位点所述胺供体试剂可以是相同或不同的。
本发明的胺供体单元是伯胺(NH2)，其提供转谷氨酰胺酶的底物，以允许试剂部分通过含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺缀合至抗体。因此，所述含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺；和所述胺供体单元之间的连接是式CH2-CH2-CO-NH-，其中一个NH-连接到一个接头和一个或多个试剂部分。
本发明的接头可以是可裂解或不可裂解的接头。例如，可以从所述抗体释放所述接头(和胺供体单元)或胺供体试剂。在一些实施方式中，所述接头可以是肽接头(例如，一个或多个常规和/或非常规氨基酸)和/或非肽接头。非肽接头的实例包括烷基接头和PEG(聚乙二醇)接头。
在一些实施方式中，所述胺供体单元-接头(X-Y)是包含试剂部分的线性单元。在其他实施方式中，所述胺供体单元-接头是包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多试剂部分的分支单元(例如，至少2个单元)。在一个变式中，在分支接头上的试剂部分可以是相同或不同的试剂部分。
示例性的胺供体单元-接头包括但不限于：Ac-Lys-Gly、氨基己酸、Ac-Lys-β-Ala、氨基-PEG2-C2、氨基-PEG3-C2、氨基-PEG6-C2、Ac-Lys-Val-Cit(瓜氨酸)-PABC(p-氨基苄氧基羰基)、氨基-PEG3-C2-Val-Cit-PABC、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC、氨基己酰基-Val-Cit-PABC、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC、[(3S,5S)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-、Ac-Lys-腐胺或2-氨基乙氧基。
本发明的工程化的肽的试剂部分包括小分子、蛋白质或多肽和生物相容性聚合物。
在一些实施方式中，小分子是细胞毒性剂、免疫抑制剂或显像剂(例如荧光团)。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂是化疗剂。
细胞毒性剂的实例包括但不限于：蒽环霉素、奥瑞他汀、多拉司他汀、考布他汀、多卡米星、吡咯并苯二氮杂卓二聚体、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体、烯二炔、格尔德霉素、美登素、嘌呤霉素、紫杉烷、长春花生物碱、特吡莱辛、哈米特林、斯考他汀、普拉地内酯及其立体异构体，电子等排物，类似物或衍生物。
蒽环霉素来源于细菌链霉菌属(Strepomyces)且已用于治疗各种癌症，诸如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌及肺癌。示性蒽环霉素包括但不限于柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(即阿霉素(adriamycin))、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。
多拉司他汀及其肽类似物和衍生物奥瑞他汀为高度有效的抗有丝分裂剂，其已展示具有抗癌及抗真菌活性。参见例如美国专利5,663,149号及Pettit等人,Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965,1998。例示性多拉司他汀及奥瑞他汀包括但不限于多拉司他汀10、奥瑞他汀E、奥瑞他汀EB(AEB)、奥瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基奥瑞他汀D或单甲基多拉司他汀10)、MMAF(单甲基奥瑞他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基奥瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸-海兔脯氨酸-去甲麻黄碱)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)及其他新颖奥瑞他汀(诸如美国公开2013/0129753号中所述的奥瑞他汀)。在一些实施方式中，奥瑞他汀为具有以下结构的0101(2-甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-{[(1S)-2-苯基-1-(1,3-噻唑-2-基)乙基]氨基}丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
在一些实施方式中，奥瑞他汀为具有以下结构的3377(N,2-二甲基丙氨酰基-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基}-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
在一些实施方式中，奥瑞他汀为具有以下结构的3377-OMe(N,2-二甲基丙氨酰基-N-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-3-{[(2S)-1-苯基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
在一些实施方式中，奥瑞他汀为具有以下结构的0131(2-甲基-L-脯胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-羧基-2-苯乙基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
在一些实施方式中，奥瑞他汀为具有以下结构的0121(2-甲基-L-脯胺酰基-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)：
喜树碱为抑制酶拓扑异构酶I的细胞毒性喹啉生物碱。喜树碱及其衍生物的实例包括但不限于托泊替康(topotecan)及伊立替康(irinotecan)及其代谢物，诸如SN-38。
考布他汀(Combretastatin)为在肿瘤中具有脉管破坏特性的天然苯酚。例示性考布他汀及其衍生物包括但不限于考布他汀A-4(CA-4)及奥瑞布林(ombrabulin)。
多卡米星和CC-1065为具有细胞毒性效能的DNA烷基化剂。参见Boger及Johnson,PNAS 92:3642-3649(1995)。例示性多卡米星和CC-1065包括但不限于(+)-多卡米星A和(+)-多卡米星SA、(+)-CC-1065，以及在国际申请PCT/IB2015/050280中公开的化合物，包括但不限于具有以下结构的N～2～-乙酰-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨基甲酰-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(氯甲基)-3-[(5-{[(1S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰基氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基]羰基}噻吩-2-基)羰基]-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨基甲酰]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺：
具有以下结构的N～2～-乙酰-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨基甲酰-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(氯甲基)-6-[(3-{[(1S)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦酰基氧基)-1,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2H)-基]羰基}双环[1.1.1]戊-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨基甲酰]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺：
具有以下结构的N～2～-乙酰-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N～5～-氨基甲酰-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(氯甲基)-6-[(4-{[(1S)-1-(氯甲基)-8-甲基-5-(膦酰基氧基)-1,6-二氢吡咯并[3,2-e]吲哚-3(2H)-基]羰基}戊环[4.2.0.0～2,5～.0～3,8～.0～4,7～]辛-1-基)羰基]-1-甲基-3,6,7,8-四氢吡咯并[3,2-e]吲哚-4-基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙基)(甲基)氨基甲酰]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺：
烯二炔为特征在于九元及十元环或存在具有共轭的三-双-三键的环状系统的一类抗肿瘤细菌产品。例示性烯二炔包括但不限于卡奇霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperamicin)、uncialamicin、达米辛(dynemicin)及其衍生物。
格尔德霉素为结合Hsp90(热休克蛋白90)且已用作抗肿瘤药物的苯醌安沙霉素(ansamycin)抗生素。例示性格尔德霉素包括但不限于17-AAG(17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)及17-DMAG(17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。
哈米特林及其类似物(例如HTI-286)结合微管蛋白，破坏正常微管动力学，并且在化学计量上解聚微管。
美登素或其衍生物类美登素通过抑制微管蛋白聚合，抑制有丝分裂期间微管形成，来抑制细胞增殖。参见Remillard等人,Science189:1002-1005(1975)。例示性美登素及类美登素包括但不限于美他素(mertansine)(DM1)及其衍生物以及安丝菌素(ansamitocin)。
吡咯并苯二氮杂卓二聚体(PBD)及引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体(IGN)为含有一或多个结合双螺旋DNA的亚胺(immine)官能团或其等同物的抗肿瘤剂。PBD及IGN分子基于天然产物氨曲霉素(athramycin)，且与DNA以序列选择性方式相互作用，优选嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列。例示性PBD及其类似物包括但不限于SJG-136。
斯考他汀及普拉地内酯为抑制剪接且与剪接体SF3b相互作用的抗肿瘤化合物。斯考他汀的实例包括但不限于斯考他汀A、FR901464，和具有以下结构的(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯：
普拉地内酯的实例包括但不限于普拉地内酯B、普拉地内酯D及E7107。
紫杉烷为充当抗微管蛋白剂或有丝分裂抑制剂的二萜。例示性紫杉烷包括但不限于紫杉醇(paclitaxel)(例如)及多西紫杉醇(docetaxel)
微管溶素(tubulysins)是从已经显示解聚微管并诱导有丝分裂停滞的粘细菌菌株分离的天然产物。示例性的微管溶素包括但不限于微管溶素A、微管溶素B和微管溶素D。
长春花生物碱也是抗微管蛋白剂。例示性长春花生物碱包括但不限于长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine)。
在一些实施方式中，所述试剂部分是免疫抑制剂。免疫抑制剂的实例包括(但不限于)更昔洛韦(gancyclovier)、依那西普(etanercept)、他罗利姆(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、伏环孢素(voclosporin)、环孢灵(cyclosporine)、雷帕霉素(rapamycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolgatemofetil)、甲氨蝶呤(methotrextrate)、糖皮质激素及其类似物和衍生物。
在一些实施方式中，所述试剂部分为显像剂(例如荧光团或螯合剂)，诸如荧光素、若丹明、镧系元素磷光体及其衍生物，或与螯合剂结合的放射性同位素。荧光团的实例包括但不限于荧光异硫氰酸盐(FITC)(例如5-FITC)、荧光素酰胺(FAM)(例如5-FAM)、曙红、羧基荧光素、赤藓红、(例如Alexa 350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700或750)、羧基四甲基若丹明(TAMRA)(例如5,-TAMRA)、四甲基若丹明(TMR)及磺酰罗丹明(SR)(例如SR101)。螯合剂的实例包括但不限于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N”,N”'-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷、1-戊二酸-4,7-乙酸(去铁胺)、二乙撑三胺五乙酸(DTPA)及1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸)(BAPTA)。
在一些实施方式中，所述试剂部分是多肽。在一些实施方式中，所述多肽是抗体，例如人源化、人、嵌合或鼠单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述试剂部分是毒素多肽(毒素蛋白)。毒素多肽的实例包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、例如莫迪素A链、α-帚曲菌素、油桐蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆蛋白质(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、gelonin、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、霉菌毒素(tricothecene)、抑制剂胱胺酸结头(ICK)肽(例如赛拉毒素(ceratotoxin))及芋螺毒素(conotoxin)(例如KIIIA或SmIIIa)。
在一些实施方式中，可将放射性同位素或其他标记整合入试剂部分(例如通过结合螯合剂)，用于抗体至载有螯合剂的胺供体试剂的缀合。放射性同位素或其他标记的实例包括但不限于3H、14C、15N、35S、18F、32P、33P、64Cu、68Ga、89Zr、90Y、99Tc、123I、124I、125I、131I、111In、131In、153Sm、186Re、188Re、211At、212Bi和153Pb。
在一些实施方式中，所述试剂部分为生物相容性聚合物。所述抗体可通过含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺缀合至所述生物相容性聚合物以改进所述抗体的生物特征，例如增加血清半衰期及生物活性，和/或延长体内半衰期。生物相容性聚合物的实例包括水溶性聚合物，如聚乙二醇(PEG)或其衍生物，及含有两性离子的生物相容性聚合物(例如含有磷酸胆碱的聚合物)。
在一些实施方式中，所述胺供体试剂(X-Y-Z)是：
或者
其中X是NH2(即，由此与谷氨酰胺形成作为CH2-CH2-CO-NH-的共价键)，m是0至20，n是1至8，p是0至3，q是0或1，氨基酸是任何常规或非常规氨基酸，且Z是细胞毒性剂或显像剂。
基于常见的侧链性质，将常规或天然出现的氨基酸分为几组：(1)非极性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)极性不带电：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(带负电)：Asp、Glu；(4)碱性(带正电)：Lys、Arg；和(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。常规氨基酸包括L或D立体化学。
非常规氨基酸是非天然出现的氨基酸。非常规氨基酸的实例包括但不限于氨基己二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、氨基丁酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基异丁酸、氨基庚二酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、锁链素(desmosine)、二氨基庚二酸、二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟基赖氨酸、异羟基赖氨酸、羟脯氨酸、异锁链素、异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和氨基酸衍生物(例如，4-羟基脯氨酸)。
在一些实施方式中，所述胺供体试剂是包含反应性胺和试剂部分的生物相容性聚合物。
在一些实施方式中，所述胺供体试剂(X-Y-Z)选自：Alexa 488尸胺、5-FITC尸胺、Alexa 647尸胺、Alexa 350尸胺、5-TAMRA尸胺、5-FAM尸胺、SR101尸胺、5,6-TAMRA尸胺、5-FAM赖氨酸、Ac-Lys-Gly-MMAD、氨基-PEG3-C2-MMAD、氨基-PEG6-C2-MMAD、氨基-PEG3-C2-氨基-壬酰-MMAD、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-β-Ala-MMAD、氨基己酰-MMAD、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101、氨基-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101、氨基己酰-MMAE、氨基-PEG3-C2-MMAE、氨基-PEG2-C2-MMAE、氨基己酰-MMAF、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAE、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAF、氨基-PEG2-C2-MMAF、氨基-PEG3-C2-MMAF、腐胺基-格尔德霉素、Ac-Lys-腐胺基-格尔德霉素、氨基己酰-3377、氨基己酰-0131、氨基-PEG6-C2-0131、氨基-PEG6-C2-3377、氨基己酰-0121、氨基-PEG6-C2-0121、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-MMAD、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-MMAE、2-氨基乙氧基-PEG6-NODAGA(或2,2'-(7-(1-氨基-28-羧基-25-氧代-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂-24-氮杂二十八烷-28-基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸)和N-2-乙酰基-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰}肼基)羰基]氧代}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺。在一些实施方式中，所述胺供体试剂是Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101或氨基-PEG6-C2-MMAD。在一些实施方式中，所述酰基供体含谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列GGLLQGA(SEQ ID NO:23)或GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)，并且和LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)或LLQG(SEQ IDNO:2)，并且所述胺供体试剂是Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101和/或氨基-PEG6-C2-MMAD。所述胺供体试剂的示例性的结构列出在表2中。
表2
制备较高负载的抗体-药物缀合物的方法
还提供了用于制备本文所述的ADC的方法。一方面，本发明提供了制备具有下式：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c的ADC的方法，其中，T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；a是1-6的整数；b是1-6的整数；c是1-20的整数；并且其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5；所述方法包括以下步骤：a)提供包含所述抗体和所述含谷氨酰胺的标签的抗体-T分子；和/或具有内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的抗体；b)使所述抗体-T分子在转谷氨酰胺酶(例如，工程化的转谷氨酰胺酶或纯化的转谷氨酰胺酶)的存在下接触胺供体试剂；和c)允许所述抗体-T分子共价连接至所述胺供体试剂以形成所述抗体-药物缀合物。在一些实施方式中，所述抗体-T分子在CHO细胞中表达。
在一些实施方式中，使用本文所述方法制备的ADC具有至少约51％的缀合效率。在一些实施方式中，所述ADC具有至少约51％-60％、61％-70％、71％-80％、81％-90％或91％-100％中至少一种的缀合效率。在一些实施方式中，所述ADC具有至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％中至少一种的缀合效率。
在一些实施方式中，所接触的胺供体试剂和所接触的抗体-T分子之间的摩尔浓度比例是约4:1至约10000:1。例如，胺供体试剂(例如细胞毒性剂)和负载或用于转谷氨酰胺酶-催化的缀合反应的抗体(例如，连接至含谷氨酰胺的标签或包含天然/反应性谷氨酰胺)之间的摩尔比例可以是约20:1。在一些实施方式中，所接触的胺供体试剂和所接触的抗体-T分子之间的摩尔浓度比例是约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1、7000:1、8000:1、9000:1或10000:1中的任一种。
在一些实施方式中，当抗体通过在特异位点的含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺和/或反应性的内源谷氨酰胺与胺供体试剂缀合时，ADC更为稳定(即，ADC体内半衰期更长)和/或具有更高的暴露。例如，如本文所述，包含N297Q和K222R的氨基修饰；在抗体的轻链和/或重链的羧基末端，和/或抗体轻链或重链中的一个或多个位置(例如，参见表1)的一个或多个含谷氨酰胺的标签的ADC比具有马来酰亚胺连接的常规ADC更稳定。
在一些实施方式中，本文提供的方法进一步包括纯化步骤。本文所述的ADC可以使用各种纯化方法纯化，例如，如羟磷灰石色谱；透析；亲和色谱；疏水作用色谱(HIC)(例如，在HIC上的分级)；硫酸铵沉淀；聚乙二醇或聚乙二醇衍生物沉淀、阴离子或阳离子交换色谱；反相HPLC；二氧化硅上的色谱；色谱聚焦；SDS-PAGE、凝胶过滤、尺寸排阻色谱和弱分配色谱。
在一些实施方式中，至少一个纯化步骤包括亲和色谱法的步骤。可使用蛋白A配体(合成、重组或天然)以亲和纯化本文所述的工程化的含Fc的多肽缀合物。合成或重组的蛋白A可商购自GE Healthcare(Piscataway,NJ)、Pierce(Rockford,IL)、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)或Applied Biosystems(Foster City,CA)，并且天然蛋白A配体(例如MABSELECTTM、PROSEPTM Va和PROSEPTM Ultra Plus)可商购自GE Healthcare(Piscataway,NJ)或Millipore(Billerica,MA)。
在一些实施方式中，由所述纯化步骤产生的如本文所述纯化的ADC是高度纯，即至少约70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-98％或99％纯的中任一种。例如，纯化的ADC是约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯的中任一种。
使用具有高药物复杂的抗体-药物缀合物的方法
本发明的ADC可用于各种应用，包括但不限于治疗处理方法和诊断处理方法。
一方面，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法。因此，在一些实施方式中，提供了治疗有此需要的对象中的癌症的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的组合物(例如药物组合物)。如本文使用的癌症包括但不限于实体癌(例如膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、食道癌、胃癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和皮肤癌)；和液体癌(例如急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大颗粒淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)(包括滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))和成人T细胞白血病)。
在一些实施方式中，提供了抑制有此需要的对象中的肿瘤生长或进展的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的组合物。在其他实施方式中，提供了抑制有此需要的对象中的癌细胞或肿瘤(例如实体或液体瘤)的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的组合物。在其他实施方式中，提供了诱导有此需要的对象中的肿瘤消退的方法，包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的ADC的组合物。
另一方面，提供了在体内或体外检测、诊断和/或监测与癌相关蛋白(例如Trop-2、BRCA1、BRCA2、HER2、VEGF、CD20、CD25、EFGR、5T4、CD22等)相关的病症的方法。因此，在一些实施方式中，提供了诊断疑似患有癌症的对象中的癌症的方法，包括a)使所述对象的样品与本文所述的ADC在导致所述ADC与癌症相关蛋白结合的条件下接触，和b)测定所述ADC与癌症相关蛋白的结合。
本文所述的ADC中的试剂部分可以是可检测的部分，例如显像剂和酶-底物标记。本文所述的ADC也可以用于体内诊断测定，例如体内成像(例如PET或SPECT)或染色试剂。
在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括使用其他形式的疗法治疗对象的步骤。在一些实施方式中，所述其他形式的疗法是其他的抗癌疗法，包括但不限于化疗、放疗、手术、激素疗法和/或其他免疫疗法。
在一些实施方式中，所述其他形式的疗法包括施用如本文所述的ADC之外的一种或多种治疗剂。所述治疗剂包括但不限于第二ADC(例如，常规ADC，例如布妥昔单抗vedotin和ado-曲妥珠单抗emtansine)、抗体(例如，抗-VEGF抗体、抗-HER2抗体、抗-CD25抗体和/或抗-CD20 antibody)、血管生成抑制剂、细胞毒性剂(例如，多西他赛、顺铂、多柔比星、丝裂霉素、他莫昔芬或氟尿嘧啶)和抗炎剂(例如泼尼松和孕酮)。
药物组合物
本发明还提供了在药学可接受的赋形剂或载体中包含如本文所述的较高负载的ADC的药物组合物。所述ADC可以单独施用或与本发明的一种或多种其他ADC组合或与一种或多种其他药物(或作为其任意组合)施用。例如，本发明的ADC可以与常规ADC(例如1-4的DAR)或使用如本文所述的转谷氨酰胺酶-介导的缀合技术具有1-4的DAR的位点特异性ADC组合施用。因此，本发明的方法和用途还涵盖与其他活性剂组合(共施用)的技术方案，如下文详述。
如本文使用的术语“共施用”、“共施用的”或“与……组合”旨在表示并确实是指：(i)将本文公开的ADC和一种或多种治疗剂的组合同时施用给需要治疗的患者，此时，将此类组分一起配制在单一剂型中，所述剂型将所述组分基本同时释放至所述患者；(ii)将本文公开的ADC和一种或多种治疗剂的此类组合顺序同时施用给需要治疗的患者，此时，将此类组分彼此分离地配制在独立的剂型中，所述患者顺序同时服用所述剂型，由此，所述组分基本同时释放至所述患者；(iii)将本文公开的ADC和一种或多种治疗剂的此类组合顺序施用给需要治疗的患者，此时，将此类组分彼此分离地配制在独立的剂型中，所述患者以各次服用之间显著的时间间隔在连续时间服用所述剂型，所述组分在明显不同的时间释放至所述患者；和(iv)将本文公开的ADC和一种或多种治疗剂的此类组合顺序施用给需要治疗的患者，此时，将此类组分一起配制在以受控的方式释放所述组分的单一剂型中，由此，将所述组分在相同和/或不同的时间同时，连续和/或重叠地释放至所述患者。
通常，本文公开的ADC适合作为与一种或多种药学可接受的赋形剂结合的制剂施用。本文使用的术语“赋形剂”以描述本发明的化合物之外的任何成分。赋形剂的选择在很大程度上取决于如下因素，例如具体的施用模式，赋形剂对溶解性和稳定性的影响，以及剂型的性质。如本文使用的“药学可接受的赋形剂”包括任何和所有的生理相容的溶剂、分散介质，包衣，抗菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的赋形剂的一些实例为水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在一些实施方式中，所述药物组合物中包含但不限于糖类、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。药学可接受的物质的其他实例包括但不限于：润湿剂或少量的辅助物质，例如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强抗体的货架期或有效性。
本发明还提供了包含多种本文所述的本发明的较高负载的ADC的药物组合物，其中平均药物-抗体比例(DAR)是约5.0至约720.0。在一些实施方式中，平均DAR是至少约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0、110.0、120.0、130.0、140.0、150.0、200.0、250.0、300.0、350.0、400.0、450.0、500.0、550.0、600.0、650.0或700.0。
在一个变式中，本发明进一步提供了包含多个ADC的药物组合物，其中至少一种ADC是如本文所述的较高负载的ADC，并且其中平均药物-抗体比例是至少约4.1至约720.0。在一些实施方式中，平均DAR是至少约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100.0、110.0、120.0、130.0、140.0、150.0、200.0、250.0、300.0、350.0、400.0、450.0、500.0、550.0、600.0、650.0或700.0。例如，所述药物组合物可包含一种或多种如本文所述具有至少约5的DAR的位点特异性ADC，和一种或多种具有1、2、3或4的DAR的位点特异性ADC(使用如本文所述的转谷氨酰胺酶介导的缀合技术)。作为另一实例，所述药物组合可包含：1)一种或多种如本文所述具有至少约5的DAR的位点特异性ADC，2)一种或多种具有1、2、3或4的DAR的位点特异性ADC(使用如本文所述的转谷氨酰胺酶介导的缀合技术)，和3)一种或多种具有1、2、3或4的DAR的使用马来酰亚胺连接的常规ADC。
在一些实施方式中，可以使用已知的技术，例如描述于如PCT公开WO98/52976和WO00/34317中的那些，使本文所述的ADC脱免疫化(deimmunized)以降低在向对象施用后的免疫原性。
本发明的药物组合物及其制备方法是本领域技术人员容易明白的。此类组合物及其制备方法可见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,22nd Edition(MackPublishing Company,2012)。药物组合物优选在GMP条件下制造。
本发明的药物组合物可作为单一单位剂量，或作为多个单一单位剂量，批量制备、包装或销售。如本文使用的“单位剂量”是包含指定量的活性成分的药物组合物的离散量(discrete amount)。活性成分的量通常等于将施用给对象的有效成分的剂量，或此类剂量的实用分数(convenient fraction)，例如此类剂量的一半或三分之一。可适合地采用本领域中接受的用于施用肽、蛋白或抗体的任何方法，用于本文公开的工程化的肽缀合物。
本发明的药物组合物通常适合胃肠外施用。药物组合物的胃肠外施用包括通过对象组织的物理缺口以及通过组织中的缺口施用药物组合物，由此通常导致直接施用至血流、肌肉或内部器官而表征的任何施用途径。例如，胃肠外施用包括但不限于通过组合物的注射施用药物组合物，通过外科切口应用组合物，通过组织渗透性非外科创口应用组合物等。具体地，预期胃肠外施用包括但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内，滑膜内注射或输注；和肾透析输注技术。在一些实施方式中，胃肠外施用是静脉内或皮下途径。
适合用于胃肠外施用的药物组合物的制剂通常一般包含与药学可接受的载体，例如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。此类制剂可以适合用于推注施用或连续施用的形式的制备、包装或销售。可注射的制剂可在单位剂型，例如在安瓿中，或在包含防腐剂的多剂量容器中制备、包装或销售。胃肠外施用的制剂包括但不限于悬浮剂、溶液、含油或含水的媒介物中的乳剂、膏剂等。此类制剂可进一步包含一种或多种其他成分，包括但不限于悬浮、稳定或分散剂。在胃肠外施用的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用在胃肠外施用复原的组合物之前，使用适合的媒介物(例如无菌无热原水)复原。胃肠外制剂还包括含水溶液，其可包含某些赋形剂，例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选3-9的pH)，但对于一些应用，它们可以更适合地配制为无菌的非水溶液或干燥形式，以连同适合的媒介物，例如无菌物热源水使用。示例性的胃肠外施用形式包括在无菌水溶液中的溶液或悬浮液，例如聚乙二醇或葡萄糖水溶液。如果需要，此类剂型可适当地缓冲。可使用的其他胃肠外施用制剂包括包含微晶形式或在脂质体制剂中的活性成分的那些。用于胃肠外施用的制剂可经配制以立即和/或修饰的释放。修饰释放的制剂包括控释、延释、缓释、脉冲、靶向和程序化释放的制剂。例如，一方面，可通过将工程化的含Fc多肽，例如抗体-药物缀合物或双特异性抗体，以所需的量引入到具有以上列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中，如果需要随后通过过滤灭菌，来制备无菌的可注射溶液。通常，通过将活性化合物引入到包含基本分散介质和所需的来自上文列出的那些的其他成分的无菌媒介物中而制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自此前其无菌过滤溶液的任何其他期望成分的粉末。可保持溶液的适当的流动相，例如，通过使用例如卵磷脂的包衣，在分散体的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂。可通过在组合物中包含延长吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，带来可注射组合物的延长吸收。
可调整剂量方案以提供最佳的期望响应。例如，可使用单一推注，可以随时间施用多个分剂量，或可根据治疗情况的危急性所示，适当地降低或提高剂量。配制剂量单位形式的胃肠外组合物，以利于剂量的施用和一致性是特别有利的。如本文使用的剂量单位形式是指适合用于待治疗的患者/对象的单一剂量的物理离散单元；各单元包含与所需的药物载体相结合的经计算产生期望的治疗作用的指定量的活性化合物。本发明的剂量单元形式的规格通常由以下规定并取决于：(a)试剂部分(例如小分子，如细胞毒性剂)的独特特征以及待达到的具体治疗或预防作用，和(b)对于在个体中治疗的敏感性，本领域中复合此类活性化合物的固有限制。
因此，基于本文提供的公开，技术人员可理解，根据治疗领域中熟知的方法调整剂量和给药方案。也即，可以容易地确定最大耐受剂量，也可测定向患者提供可检测的治疗益处的有效量，同样可以测量施用每种试剂以向患者提供可检测的治疗益处的时间需要。因此，尽管本文解释了某些剂量和施用方案，但在本发明的实施中，这些实例不以任何方式限定可提供给患者的剂量和施用方案。
应注意剂量值可随着待缓解的病症的类型和严重性而改变，并且可包括单个或多个剂量。可进一步理解，对于任何具体对象，应根据个体需要以及施用组合物或管理组合物施用的人的专业判断随时间调整具体剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的并且不用于限制要求保护的组合物的范围或实施。进一步地，使用本发明组合物的剂量方案可基于各种因素，包括疾病的类型、患者的年龄、体重、性别、医疗情况，病症的严重性、施用途径和采用的具体抗体。因此，剂量方案可宽泛地改变，但可使用标准方法常规测定。例如，剂量可基于药代动力学或药效学参数进行调整，包括临床作用，例如毒性作用和/或实验室值。因此，本发明涵盖如技术人员测定的患者本身(intra-patient)剂量递增。测定适当的剂量和方案是相关领域中熟知的，并且可被理解为一旦提供本文公开的教导，即由技术人员所获得的。
位于向人类对象的施用，本文公开的总月剂量通常在每位患者约0.01mg至约1200mg的范围，当然依赖于施用模式。例如，静脉内月剂量可需要约1至约1000mg/患者。总月剂量可在单一或分剂量中施用，并且根据医师的判断，可在本文给出的典型范围之外。
例如，对于本文公开的ADC的治疗或预防有效量的非限定性范围是约0.01至约1000mg/患者/月。在某些实施方式中，所述ADC可以约1至约200或约1至约150mg/患者/月施用。在一些实施方式中，所述患者是人。
试剂盒
本发明还提供用于上述疾病治疗的试剂盒(或制造物品)。本发明的试剂盒包括一或多个包含如纯化的ADC的容器和施用所述缀合物治疗疾病的说明书。例如，所述说明书包括用于治疗疾病，例如癌症(例如实体或液体癌)的ADC的施用说明。所述试剂盒可进一步包含基于个体是否具有疾病和疾病的阶段，选择适合于治疗的个体的说明。
涉及ADC的使用的说明书一般包括涉及用于预期治疗的剂量、给药时间表及施用途径的信息。容器可为单位剂量、散装(例如多剂量包装)或次单位剂量。本发明的试剂盒中所提供的说明书通常为书写于标签或药品说明书(例如试剂盒中包括的纸单)上的说明，但机器可读说明(例如磁性或光学储存碟片上所载有的说明)也可接受。
本发明的试剂盒位于适合包装中。适合包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、柔韧的包装(例如密封Mylar或塑胶袋)等。还涵盖用于与特定装置(诸如吸入器、经鼻施用装置(例如雾化器)或输注装置(诸如迷你泵))组合的包装。试剂盒可具有无菌进入孔(例如所述容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。容器还可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为本文所述的较高负载的ADC。所述容器可进一步包含第二医药活性剂。
试剂盒可任选提供诸如缓冲剂的其他组分及解释信息。通常，试剂盒包含容器及在容器上或与容器相联的标签或药品说明书。
实施例
可理解本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且据此的各种改进或变化是对本领域技术人员表明的并且将包含在本申请的精神和范围之内。
实施例1：在具有高靶标表达的细胞(BxPC3，Trop2+++)中，负载逐渐升高的位点特 异性缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在高靶标表达的BxPC3细胞中，较高负载的ADC(位点特异性的和常规的)的体外细胞毒性。
抗体-药物缀合
a.转谷氨酰胺酶-介导的抗体-药物缀合
嵌合的小鼠抗Trop-2抗体作为人IgG1亚型表达，其使用含谷氨酰胺的转谷氨酰胺酶(“Q”)标签在多个氨基酸位点(例如TG6、LCQ04、H7c、L11b，参见表1)工程化，并与多种接头和有效负载(例如，氨基己酰-vc-PABC-MMAD(氨基己酰-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基-MMAD)；氨基-PEG6-C2-MMAD)缀合。在一个实例中，在抗体的轻链和重链二者的C末端，以及人IgG的297位(EU编码方案)进行转谷氨酰胺酶标签的工程化(例如，使用谷氨酰胺取代在Trop-2抗体的297位的野生型氨基酸天冬酰胺(N297Q))。在抗体的轻链和重链二者，或重链或轻链内的多个位点工程化的标签组合对每个抗体携带多个缀合位点(例如，4-10的DAR)。随后，通过在特异性位点(例如，抗体的重链或轻链的羧基末端和/或氨基末端、297位，和/或其他位点)携带含谷氨酰胺的标签的抗-Trop-2抗体与连接至有效负载(例如MMAD)的含氨基接头之间的微生物转谷氨酰胺酶催化的转酰氨基反应，实现对有效负载(例如MMAD)的抗-Trop-2抗体缀合。在一些实例中，使用氨基酸精氨酸替代在抗体的222位(EU编号方案)的野生型氨基酸赖氨酸(“K222R”)。例如，发现K222R具有意外的作用，导致更均匀的抗体和有效负载缀合物组合物，和/或显著降低与抗体轻链的C末端上的谷氨酰胺标签的链内交联。在转酰氨基反应中，抗体上的谷氨酰胺充当酰基供体，而含氨基化合物则充当酰基受体(胺供体)。在150mM氯化钠或硫酸钠中的1-3％(w/v)摩擦链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)转谷氨酰胺酶(ACTIVATM,Ajinomoto,Japan)，和25mMMES、HEPES[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸]或pH范围6.2-9.2的TrisHCl缓冲剂的存在下，将浓度为33μM的纯化抗Trop-2抗体与10-100M过量，范围在33-3300μM之间的酰基受体一起温育。调整用于各个酰基受体衍生物的反应条件，并且通常对于150mM NaCl，25mMTris HCl，pH 8.5中的33μM抗体、660μM衍生物和2％(w/v)转谷氨酰胺酶观察到最佳的效率和特异性。在37℃温育16-20小时后，使用本领域技术人员已知的标准色谱方法，例如商业亲和色谱和来自GE Healthcare的疏水相互作用色谱，在MabSelect SuReTM树脂或ButylSepharoseTM High Performance(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上纯化抗体。
b.常规的抗体-药物缀合
为了通过常规马来酰亚胺连接产生与PEG6-C2-MMAD缀合，平均药物负载为4(例如，每个抗体分子4MMAD)的抗体(例如嵌合的小鼠抗Trop-2抗体(m7E6))，首先将5mg/mL的抗体用含25mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl的缓冲剂中的7.5摩尔当量的TCEP(三(2-羧乙基)膦)在37℃还原2小时。在室温下(约22℃)，将7.5摩尔过量的马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD添加至还原的抗体，并温育1小时。在4℃下，将反应混合物对PBS(磷酸缓冲盐水)透析，并通过0.2μm滤器无菌过滤。为了产生具有马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD对药物负载为8的m7E6，使用如上所述且包含50mM EDTA(乙二胺四乙酸)的反应缓冲液中10摩尔过量的TCEP还原抗体。向还原的抗体和如上处理的材料添加12摩尔过量的马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD。为了产生具有马来酰亚胺-PEG6MMAD对药物负载为6的m7E6，使用在如用于DAR 8还原的缓冲液中的8倍摩尔过量的TCEP还原抗体，随后添加8倍摩尔过量的马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD。为了纯化DAR 6物质，将反应混合物稀释以获得0.75M硫酸铵、25mM磷酸钾，pH 7(缓冲液A)的缓冲组合物。将所述材料应用至串联的2x1ml Butyl HP Hi Trap(GE Healthcare)，使用2CV(柱体积)缓冲液A清洗，并使用20CV线性梯度洗脱至25mM磷酸钾，pH 7，和20％异丙醇中。汇集含DAR 6的级分，对PBS透析，使用10kDa Amicon超离心滤器单元(Millipore Corporation)浓缩。
体外研究
使用表达靶标的BxPC3细胞进行嵌合抗Trop2抗体：m7E6 H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.99，位点特异性的)、m7E6 LCQ04/K222R氨基PEG6-C2-MMAD(DAR 1.97，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.83，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.85，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.71，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR7.76，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.80，位点特异性的)和m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.20，常规的)的体外细胞毒性研究。本文所述的这个实施例和其他实施例中的DAR数是指每个抗体分子的有效负载的比例。所使用的接头是PEG6，并且所使用的有效负载是MMAD。BxPc3是具有高靶标表达水平(Trop-2+++)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPadPrism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(即，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。细胞毒性测定的结果在图1中显示并总结在表3中，具有DAR 7.71(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD)、7.76(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)和7.80(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD)的三种位点特异性分子与具有DAR 7.20的常规缀合ADC(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)同样有效。
这些结果显示，尽管所有ADC都对高靶标表达的BxPC3细胞实现近乎完全的细胞杀死，而与其有效负载的负载无关，但较高负载的缀合物与较低负载的缀合物相比，更为有效。
表3
实施例2：在具有中度靶标表达的细胞(Colo205,Trop2+)中，负载逐渐升高的位点 特异性缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在中度靶标表达的Colo205细胞中，较高负载的ADC(位点特异性的和常规的)的体外细胞毒性。
使用表达靶标的Colo205细胞进行嵌合抗Trop2抗体：m7E6H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.99，位点特异性的)、m7E6 LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.97，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.83，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.85，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.71，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR7.76，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.80，位点特异性的)，和m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.20，常规的)的体外细胞毒性研究；Colo205是具有中度靶标表达水平(Trop-2+)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPad Prism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(即，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。细胞毒性测定的结果在图2中显示并总结在表4中。具有5.85和以上DAR的ADC实现了完全的细胞杀死。具有DAR 7.71(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD)、7.76(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)和7.80(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD)的三种位点特异性分子与具有DAR 7.20的常规缀合ADC(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)同样有效。
这些结果显示对中度靶标表达的Colo205细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关。
只有较高负载的分子(例如，5.85或以上的DAR)可实现完全的细胞杀死。
表4
实施例3：在具有低靶标表达的细胞(CF-PAC1,Trop2(+))中，负载逐渐升高的位点 特异性缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在低靶标表达的CF-PAC1细胞中，较高负载的位点特异性ADC的体外细胞毒性。
使用表达靶标的CF-PAC1细胞进行嵌合抗Trop2抗体：m7E6H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.99，位点特异性的)、m7E6 LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.97，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.83，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.85，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.71，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR7.76，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.80，位点特异性的)，和m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.20，常规的)的体外细胞毒性研究；CF-PAC1是具有低靶标表达水平(Trop-2(+))的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPad Prism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(例如，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。表5和图3显示对低靶标表达的CF-PAC1细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关，例如有效负载的负载越高，细胞杀灭活性越高。具有DAR 7.71(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD)、7.76(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)和7.80(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD)的三种位点特异性分子与具有DAR 7.20的常规缀合ADC(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)同样有效。
这些结果还证实对低靶标表达的CF-PAC1细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关。
表5
实施例4：在无靶标表达的细胞(SW620,Trop2-)中，负载逐渐升高的位点特异性缀 合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在无靶标表达的SW620细胞中，较高负载的位点特异性ADC的体外非特异性细胞毒性。
使用无表达靶标的SW620细胞进行嵌合抗-Trop2抗体：m7E6 TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.99，位点特异性的)、m7E6 LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.88，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.92，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.85，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.71，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.76，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.80，位点特异性的)和m7E6马来酰亚胺PEG6-C2-MMAD(DAR 7.20，常规的)的体外细胞毒性研究；SW620是没有靶标表达(Trop-2-)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPadPrism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(即，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。在这个实施例中，与其他体外实施例相比ADC的起始浓度提高超过13倍，从266nM至3500nM，以测定是否存在ADC的非靶标依赖性细胞毒性作用。细胞毒性测定的结果在图4中显示并总结在表6中。具有DAR 7.71(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD)、7.76(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)和7.80(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b氨基-PEG6-C2-MMAD)的三种位点特异性分子的非特异性细胞毒性显著低于具有DAR 7.20的常规缀合ADC。
这些结果显示在较高的ADC浓度下，观察到非靶标依赖性细胞毒性，并且相对于常规缀合物，位点特异性ADC中的这种细胞毒性较低。
表6
实施例5：在具有中度靶标表达的细胞(Colo205,Trop2+)中，负载逐渐升高的位点 特异性缀合的，与常规缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性的并排比较
这个实施例说明了在中度靶标表达的Colo205细胞中，较高负载的位点特异性ADC的升高的体外细胞毒性和功效。
在具有靶标表达的Colo205细胞中进行嵌合抗-Trop2抗体：m7E6马来酰亚胺-PEG65-C2-MMAD(DAR 4.13，常规的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.86，位点特异性的)、m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 6.09，常规的)、m7E6 N297Q/LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.86，位点特异性的)、m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR7.80，常规的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.77，位点特异性的)和对照IgG N297Q/LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.84，位点特异性的)的体外细胞毒性研究；Colo205是具有中度靶标表达水平(Trop-2+)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPad Prism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(例如，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。细胞毒性测定的结果在图5中显示并总结在表7中。具有DAR 3.86(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD)、5.86(m7E6 N297Q/LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD)和7.77(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)的三种位点特异性分子分别与具有DAR 4.13的(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)、6.09(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)和7.80(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)的常规缀合的ADC同样有效。
这些结果显示对中度靶标表达的Colo205细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关(例如，分子的负载越高，功效越高)。
表7
实施例6：具有7.76的药物抗体比例的抗Trop-2 7E6位点特异性澳瑞他汀缀合物 在Colo205异种移植模型中诱导长期的肿瘤停滞
这个实施例说明了在Colo205异种移植模型中，较高负载的位点特异性ADC的功效。
在具有靶标表达的Colo205异种移植模型中进行m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.76，位点特异性的)、m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.20)，常规的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.92,，位点特异性的)和对照IgGN297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.68，位点特异性的)的体内功效研究；Colo205是具有中度靶标表达水平(Trop-2+)的癌细胞系。将3百万个Colo205癌细胞皮下植入到5-8周龄nu/nu小鼠，直到肿瘤大小达到约250mm3。根据肿瘤大小对动物进行随机化，并且通过推注尾静脉注射完成给药。通过推注尾静脉注射施用6mg/kg的mAb，总共1剂。每周两次通过Caliper设备测量，并使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度x宽度2)/2。如果其肿瘤体积达到2000mm3或损失超过其体重的20％，则对动物进行安乐死。图6显示单一剂量的位点特异性的DAR 7.76缀合物产生长期的肿瘤停滞，显著超越常规的DAR7.2缀合物。
进一步地，位点特异性与常规的高DAR缀合物之间的功效差异不是由于ADC的差异靶标结合，因为所有的ADC显示了类似的结合动力学性质。图11和表8。如图11和表8中所示的靶标/IgG相互作用的结合动力学是通过使用Biacore T200表面等离子体共振生物传感器(GE Lifesciences,Piscataway NJ)测定的。
表8
缀合物 ka(1/Ms) kd(1/s) t1/2(min) KD(nM)
WT 2.2E+05 7.0E-03 1.6 33
SS DAR2(LC) 2.1E+05 6.5E-03 1.8 31
SS DAR4 2.2E+05 7.0E-03 1.7 31
SS DAR6 2.1E+05 6.8E-03 1.7 32
SS DAR8 2.1E+05 6.3E-03 1.8 31
Cys DAR8 1.9E+05 6.5E-03 1.8 34
WT(m7E6-非缀合的)、SS DAR2(LC)((位点特异性的)m7E6 LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)、SS DAR4(m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD)、SS DAR6(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)、SS DAR8(m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)和Cys DAR8(m7E6马来酰亚胺PEG6-C2-MMAD)
综上，这个实施例证实了本发明的ADC(例如在DAR 7.76)在诱导长期肿瘤停滞方面比具有相似或更高DAR的常规ADC更为有效，并且具有低于5的DAR的ADC在这个模型中基本无效。
实施例7：具有5.86和7.77的药物抗体比例的抗Trop-2 7E6位点特异性澳瑞他汀 缀合物比对应的常规缀合物更为有效，且在Colo205异种移植模型中诱导长期的肿瘤停滞
这个实施例也说明了在Colo205异种移植模型中，较高负载的位点特异性ADC的功效。
使用具有靶标表达的Colo205异种移植模型进行m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 4.13，常规的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.86，位点特异性的)、m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 6.09，常规的)、m7E6 N297Q/LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.86，位点特异性的)、m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.80，常规的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.77，位点特异性的)和对照IgGN297Q/LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.84，位点特异性的)的体内功效研究；Colo205是具有中度靶标表达水平(Trop-2+)的癌细胞系。将3百万个Colo205癌细胞皮下植入到5-8周龄nu/nu小鼠，直到肿瘤大小达到约200mm3。根据肿瘤大小对动物进行随机化，并且通过推注尾静脉注射完成给药。通过推注尾静脉注射施用6mg/kg的mAb，总共1剂。每周两次通过Caliper设备测量，并使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度x宽度2)/2。如果其肿瘤体积达到2000mm3或损失超过其体重的20％，则对动物进行安乐死。图7显示单一剂量的位点特异性DAR 5.86(m7E6 N297Q/LCQ04/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD)和位点特异性DAR7.77(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)缀合物导致长期肿瘤生长停滞，显著超越常规的DAR 6.09(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)和DAR 7.80(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)缀合物。如实施例6中讨论的，功效的差异不是由于ADC的差异靶标结合，因为所有的ADC显示了类似的结合动力学性质。
因此，这个实施例也证实了本发明的ADC(例如，位点特异性的DAR 5.86和7.77)在诱导长期肿瘤停滞方面比具有相似DAR的常规ADC更为有效。
实施例8：具有高药物抗体比例的抗Trop-2 7E6位点特异性澳瑞他汀缀合物与常 规ADC相比，显示更好的药代动力学(PK)特征
这个实施例说明了在小鼠和大鼠二者中，与常规的较高负载的ADC相比，较高负载的位点特异性ADC的PK特征。
在小鼠和大鼠二者中进行本发明的ADC的药代动力学研究，并使用ELISA(酶联免疫吸附测定)分析，且通过LC/MS(液相色谱-质谱)分析DAR。
总抗体PK测定
以1ug/mL使用100uL的1xPBS(Cell Gro)中的Fc特异性的山羊抗人IgG抗体(Pierce,Rockford,IL)包被96孔微滴定板(NUNC)的每个孔。将平板在4-8℃温育过夜。所有清洗步骤使用Biotek ELx405平板清洗器和1x PBS/0.05％Tween进行。清洗3次后，使用200uL的测定缓冲液(1x PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨醇酯20)封闭平板，并在室温和温和振荡下温育1-2小时。将平板清洗3次，并向相应的孔添加100uL的在测定缓冲液中以1：100稀释的标准品、对照和样品。在室温和温和振荡下温育2小时后，将平板清洗6次，随后配入100uL的在测定缓冲液中稀释至250ng/mL的检测抗体(抗人IgG，Fab特异性，HRP-标记的，来自Sigma(St Louis,MO))。将平板在室温和温和振荡下温育另一小时，随后清洗6次。随后，将100uL的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)(KPL,Gaithersburg,MD)添加至每个孔。允许显色约5分钟，随后使用100uL的1M磷酸终止反应。以650nm为参照，在SpectraMax 340平板读数仪(Molecular Devices)上测量450nm的吸光度。使用SoftMax Pro 5.2软件以四参数回归拟合标准曲线，并计算样品浓度。
ADC PK测定
以2ug/mL使用100uL的1xPBS(Cell Gro)中的山羊抗人IgG抗体包被96孔微滴定板(NUNC)的每个孔。将平板在4-8℃温育过夜。在Biotek ELx405平板清洗器上，使用1x PBS/0.05％Tween进行所有清洗步骤。清洗3次后，使用200uL/孔的测定缓冲液(1x PBS/0.5％BSA/0.05％聚山梨醇酯20)封闭平板，并在室温和温和振荡下温育1-2小时。将平板清洗3次，并向相应的孔添加100uL的在测定缓冲液中以1：100稀释的标准品、对照和样品，一式两份。在室温和温和振荡下温育2小时后，将平板清洗6次，随后配入100uL的在测定缓冲液中稀释至4ug/mL的检测抗体(生物素化的抗MMAD单克隆抗体)。将平板在室温和温和振荡下温育1.5小时，随后清洗6次。将Avidin-HRP(Vector Labs,Burlingame,CA)在测定缓冲液中稀释至0.5ug/mL并将100uL分配至每个孔中。将平板温育另一小时，随后清洗6次。随后，将100uL的TMB(KPL,Gaithersburg,MD)添加至每个孔。允许显色约5分钟，随后使用100uL的1M磷酸终止反应。以650nm为参照，在SpectraMax 340平板读数仪(Molecular Devices)上测量450nm的吸光度。使用SoftMax Pro 5.2软件以四参数回归拟合标准曲线，并计算样品浓度。
ADC的LC/MS完整质量分析和DAR计算
在LC/MS分析之前，在37℃非变性条件下，使用PNGase F(New England BiolabsInc.,Ipswich,MA)对ADC(位点特异性DAR6和DAR8，以及常规DAR8)进行去糖基化过夜。向填充聚合材料(Michrom-Bruker,Fremont,CA)的反相柱装载ADC(1μg)。使用偶联至使用电喷雾离子源的Orbitrap Velos Pro(Thermo Fisher Scientific,Somerset,NJ)质谱仪的Agilent 1100系列HPLC系统进行LC/MS分析，所述系统包含双重HPLC泵、脱气器、温控自动进样器、柱加热器和二极管阵列检测器(DAD)。移动相包含溶剂A(水，0.1％甲酸)和溶剂B(乙腈，0.1％甲酸)。使用梯度提高的溶剂B，经30分钟运行进行HPLC，其由以下组成：3％溶剂B的等梯度流10分钟，随后经1分钟梯度提高至97％溶剂B，在97％溶剂B保持2分钟，并且随后为最后的3％溶剂B的平衡步骤，进行17分钟。使用ProMass软件(Thermo FisherScientific,Somerset,NJ)对所得质谱进行解卷积。对于位点特异性ADC，使用ADC的完整质量计算DAR；对于常规ADC，由重链和轻链的解卷积谱计算DAR，因为在反相条件下，常规ADC缺少分子内二硫键，且链分离。DAR计算是基于所观察到的DAR种类的相对强度。
体内研究
在小鼠中，在Colo205异种移植模型中测试单剂量(6mg/kg)的所有ADC。在这些条件下，作为(1)m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.85，位点特异性)；和2)m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.76，位点特异性)的缀合至PEG6MMAD的抗体m7E6显示与未缀合的野生型抗体m7E6相似的药代动力学特征。总mAb和ADC信号的比较显示：较高负载的ADCs(mAb或ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.85，位点特异性)；或mAb或ADC m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.76，位点特异性)经两周时期显示非常少的有效负载损失。参见图8(c)和8(d)。所述数据表明氨基-PEG6-C2-MMAD的转谷氨酰胺酶介导的连接产生稳定的缀合物。与之相比，使用常规方法缀合至马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD的抗体m7E6(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.8)显示相对于总mAb和未缀合抗体二者较低的ADC暴露，表明有效负载的损失。参见图8(b)。此前已描述了基于马来酰亚胺的缀合物的有效负载的损失(参见例如Alley等人，Bioconj.Chem.19(3):759-765(2008)；和Shen等人，Nat.Biotechnol.30(2):184-189(2012))，并且被认为经由逆迈克尔加成机制而发生。具有DAR 8的常规缀合物和本发明的ADC缀合物之间的ADC暴露差异很可能是常规ADC缀合物在体内较差的活性的原因。
在ELISA测定中对常规ADC所见的暴露降低可能由在这些试验中使用的ADC测定低估了抗体的有效负载损失的可能性而强化。更具体地，ADC ELISA不仅显示了对DAR 8的信号，而且还显示了在体内产生的具有较低负载的所有其他种类的信号。这种效应对于较高负载的种类，例如使用常规缀合方法的具有DAR 8的ADC，更为显著，可有高至7种药物损失，而没有ELISA信号的显著变化。进一步地，对于不可裂解的常规缀合物，例如m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 8)，药物损失可能是低体内功效的主要原因。与之相比，本发明的不可裂解的ADC缀合物(例如DAR 6或DAR 8)没有受损于马来酰亚胺不稳定性，并且能够在中度靶标表达的Colo205异种移植模型中显著地抑制肿瘤生长。
也在大鼠中进行了较高负载的ADC的PK研究，以与小鼠进行比较。基于常规缀合方法的ADC(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.8))仍具有最低的循环ADC水平。参见图8(e)。本发明具有DAR 8(例如，m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.76，位点特异性))的ADC显示中度的循环ADC水平，并且本发明具有DAR 6(例如，m7E6N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD(DAR 5.85，位点特异性))的ADC显示与未缀合的m7E6抗体相当的最高循环ADC水平。参见图8(e)。具有DAR 7.8的常规ADC显示与未缀合抗体的最大差别，其中总抗体和ADC二者都具有与未缀合的抗体水平相比降低很多的暴露。参见图8(f)。在m7E6N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD(DAR 5.85，位点特异性)的情况下，总mAb水平和ADC水平与未缀合的抗体水平几乎相等。参见图8(g)。m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c PEG6MMAD的总mAb和ADC水平相对于未缀合抗体降低。图8(h)。这与来自小鼠的PK结果不同，在小鼠中，本发明的DAR8ADC显示与未缀合抗体相似的PK。这些结果表明将独自展示野生型PK的缀合位点组合能够导致降低的暴露。
小鼠体内样品的质谱分析进一步揭示，常规ADC(例如m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD)具有约28％的接头-有效负载损失，而转谷氨酰胺酶接头在位点特异性缀合物DAR6(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD)和DAR8_1(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)二者中保持完整。参见图12(a)。质谱研究还揭示了药物MMAD的C-末端降解，其在位点特异性DAR6、SS DAR8_1和常规DAR8缀合物中具有相似的水平(图12(b))。缀合物的组合的接头-有效负载稳定性显示在图12(c)中。
综上，这个实施例证实了本发明的较高负载的ADC在小鼠中具有与未缀合的野生型抗体相似的PK特征，并且在大鼠中具有比常规的较高负载ADC更好的PK特征。
实施例9：将各自展示野生型药代动力学特征的ADC缀合位点组合会导致在大鼠中 的暴露降低
这个实施例说明了具有不同缀合位点组合的较高负载的位点特异性ADC在大鼠中的PK特征。
也在大鼠中进行了具有不同缀合位点组合的较高负载的ADC的PK研究。通过将具有DAR 1.99的位点特异性ADC(m7E6 H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)与具有DAR 5.85的位点特异性ADC(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)组合，产生具有DAR 7.76的位点特异性ADC(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD)。具有DAR 5.85和1.99的位点特异性ADC独自在大鼠中显示野生型的PK特征，但在作为具有DAR7.76的位点特异性ADC组合在一起时，显示降低的暴露。参见图9(a)。作为比较，当具有DAR 5.85的位点特异性ADC(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD)与具有DAR 1.96的不同位点特异性ADC(m7E6 TG6氨基-PEG6-C2-MMAD；缀合位点在抗体重链的C-末端，其远离m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD的缀合位点)组合时，所得的ADC(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.7，位点特异性))显示没有额外的暴露降低(例如，没有大于m7E6 TG6氨基-PEG6-C2-MMAD的降低)。参见图9(b)。
所述数据表明在近距离内过多的疏水有效负载(例如MMAD)会降低ADC在大鼠中的PK特征。所述数据还表明，对于彼此远离的缀合位点，组合位点在大鼠中的PK特征类似于最短的单个PK特征。
实施例10：与常规ADC相比，位点特异性缀合的抗Trop-2 7E6澳瑞他汀缀合物在小 鼠中的安全性和耐受性
这个实施例说明了较高负载的位点特异性ADC在C57B1/6小鼠中的安全性和耐受性。
给予C57B1/6小鼠单一剂量的75、125或200mg/kg的常规缀合的ADC(m7E6马来酰亚胺-PEG6-C2-MMAD“DAR8”)或与PEG6-C2-MMAD不可裂解的有效负载缀合的位点特异性ADC(m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(“DAR6”)和m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6氨基-PEG6-C2-MMAD(“DAR8_1”)。评估临床观察结果、体重、药代动力学和临床病理参数。更具体地，即刻且在注射后2小时观察动物，随后在给药后2周每天观察。在0、2、5、7、9、12和14天记录体重。在给药后5分钟、7天和14天采集血液样品用于药物动力学，并且在14天采集血液样品用于临床化学和血液学分析。
常规和位点特异性缀合物二者都耐受高至200mg/kg的非常高的剂量。没有表明毒性的临床观察结果或体重的有意义的变化。图10(b)。在研究结束时(14天)评价所有三种缀合物(常规ADC“DAR8”和两种位点特异性ADC“DAR8_1”和“DAR6”)的临床病理参数，并且没有观察到在毒性方面有意义或显著的变化。图10(c)和10(d)。例如，肝脏酶(天冬氨酸氨基转移酶[AST]、丙氨酸转氨酶[ALT]和碱性磷酸酶[ALP])和关键血液参数(嗜中性粒细胞，网状细胞和血小板)中没有显著变化。
综上，所述结果表明在200mg/kg的高剂量，具有DAR 8和PEG6-C2-MMAD的位点特异性和常规缀合物二者在小鼠中都得到良好耐受。进一步地，相对于常规DAR8缀合物，位点特异性DAR8_1缀合物达到大约55％更高的暴露。图10(a)。进一步地，在高剂量下，具有DAR8的常规缀合物还显示低于预期的抗体浓度。图13(a)。对于位点特异性ADC DAR8_1没有观察到这种现象，即便在200mg/kg的最高测试剂量下，其也显示了预期的暴露增加。图13(b)。
综上，位点特异性缀合物显示了良好的安全性特征，以及与常规缀合物相比更高的ADC暴露。
实施例11：在具有高靶标表达的细胞(BxPC3，Trop2+++)中，负载逐渐升高的位点 特异性缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在高靶标表达的BxPC3细胞中，较高负载的ADC(例如，DAR5.95-9.4(位点特异性缀合))的体外细胞毒性。
在具有靶标表达的BxPC3细胞中进行嵌合抗-Trop2抗体：m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.9，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.95，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.6，位点特异性的)，和N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR9.4，位点特异性的)的体外细胞毒性研究。BxPc3是具有高靶标表达水平(Trop-2+++)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPad Prism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(即，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。细胞毒性测定的结果显示在图14中并总结在表9中。这些结果显示，尽管所有ADC都对高靶标表达的BxPC3细胞实现近乎完全的细胞杀死，而与其有效负载的负载无关，但较高负载的缀合物与较低负载的缀合物相比，更为有效。
表9
实施例12：在具有中度靶标表达的细胞(Colo205,Trop2+)中，负载逐渐升高的位 点特异性缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在中度靶标表达的Colo205细胞中，较高负载的ADC(例如，DAR5.95-9.4(位点特异性缀合))的体外细胞毒性。
在具有靶标表达的Colo205细胞中进行嵌合抗-Trop2抗体：m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.9，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.95，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.6，位点特异性的)，和N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR9.4，位点特异性的)的体外细胞毒性研究；Colo205是具有中度靶标表达水平(Trop-2+)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPadPrism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(即，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。细胞毒性测定的结果显示在图15中并总结在表10中。这些结果显示对中度靶标表达的Colo205细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关。仅较高负载的分子(例如，5.95或以上的DAR)可实现完全的细胞杀死。
这个实施例还证实使用缀合物N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD将DAR提高至9.4，产生提高的功效，高于具有DAR 7.6的缀合物m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD。
表10
实施例13：在具有低靶标表达的细胞(CF-PAC1,Trop2(+))中，负载逐渐升高的位 点特异性缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在低靶标表达的CF-PAC1细胞中，较高负载的ADC(例如，DAR5.95-9.4(位点特异性缀合))的体外细胞毒性。
在具有靶标表达的CF-PAC1细胞中进行嵌合抗-Trop2抗体：m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.9，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.95，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.6，位点特异性的)，和N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR9.4，位点特异性的)的体外细胞毒性研究；CF-PAC1是具有低靶标表达水平(Trop-2+)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPad Prism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(例如，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。表11和图16显示对低靶标表达的CF-PAC1细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关，例如有效负载的负载越高，细胞杀灭活性越高。具有DAR 9.4的缀合物N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD稍稍提高了最大细胞杀灭活性。
这些结果还证实对细胞，例如低靶标表达的CF-PAC1细胞，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关。
表11
实施例14：在无靶标表达的细胞(SW620,Trop2-)中，负载逐渐升高的位点特异性 缀合的抗Trop-2-ADC的细胞毒性
这个实施例说明了在无靶标表达的SW620细胞中，较高负载的ADC(例如，DAR5.959.40(位点特异性缀合))的体外细胞毒性。
在无靶标表达的SW620细胞中进行嵌合抗-Trop2抗体：m7E6 L11b氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 1.96，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 3.9，位点特异性的)、m7E6 N297Q/K222R/LCQ04氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 5.95，位点特异性的)、m7E6N297Q/K222R/LCQ04/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR 7.6，位点特异性的)，和N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD(DAR9.4，位点特异性的)的体外细胞毒性研究；SW620是无靶标表达(Trop-2-)的癌细胞系。在处理前，将细胞以2000个细胞/孔接种在白壁透明底平板上，进行24小时。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过GraphPad Prism 5软件计算发生50％细胞杀死的IC50和ADC浓度(即，细胞毒性)，并将其以浓度表示(nM)，在所测试的最高ADC浓度下观察到最大的细胞杀死作为未经处理的对照的百分比表示。细胞毒性测定的结果在图17中显示并总结在表12中。在所测试的浓度范围内，所有缀合物都显示最小的非特异性细胞毒性活性。
这个实施例还证实使用缀合物N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c氨基-PEG6-C2-MMAD将DAR提高至9.4，没有导致非特异性活性相比于具有较低DAR的缀合物提高。
表12
实施例15：在具有BCMA靶标的低表达和高表达的细胞中，负载逐渐升高的位点特 异性缀合的抗BCMA ADC的细胞毒性
这个实施例说明了分别在低和中度靶标表达的L363和MM1.S细胞中，较高负载的ADC(例如，DAR 5.95(位点特异性缀合))的体外细胞毒性。
使用表达靶标的L363(具有低靶标表达水平的癌细胞系(BCMA(+))和MM1.S(具有中度靶标表达水平的癌细胞系(BCMA(++))进行与接头-有效负载缀合的人抗-BCMA(B-细胞成熟抗原)抗体(Ab1)，包括Ab1-LCQ05/K222R-splicostatin((2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯)(DAR 1.9，位点特异性的)、Ab1-LCQ04/K222R-splicostatin(DAR1.9，位点特异性的)、Ab1-N297Q/K222R-splicostatin(DAR 3.7，位点特异性的)，和Ab1-N297Q/K222R/LCQ05-splicostatin(DAR 5.95，位点特异性的)的体外细胞毒性研究。将细胞以3000个细胞/孔接种在透明底平板上。使用4倍连续稀释的抗体-药物缀合物处理细胞，一式三份。在处理后96小时，通过发光细胞活力测定96(Promega,Madison,WI)测定细胞活力。相对细胞活力作为未经处理对照的百分比测定。通过Prism软件计算EC50。图18A和18B显示提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的低(例如1.9和3.7)对比高(例如5.9)的有效负载的负载正相关。
因此，这个实施例还证实对于细胞，例如低靶标表达的L363和高靶标表达的MM1.S，提高的细胞杀灭活性和功效与ADC的有效负载的负载正相关。
尽管已经参考各种申请、方法和组合物描述了所公开的教导，但可理解可进行各种改变和修改而不脱离本文的教导和后文要求保护的发明。所提供的上述实施例用以更好地说明所公开的教导，并且不限制本文提供的教导的范围。尽管已就这些示例性实施方式描述了本发明的教导，但技术人员可容易地理解这些示例性实施方式的多种变式和修改是可能性的，而无需额外的实验工作。所有这些变式和修改都在本文教导的范围之内。
本文引用的所有文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等以及其中引用的文献，均以其整体通过引用并入本文，达到它们还没有的程度。在一篇或多篇并入的文献或相似材料与本申请不同或矛盾的情况下，包括但不限于限定的术语、术语使用或描述的技术等，以本申请为准。
上述说明书和实施例详细描述了本发明的某些具体实施方式并且描述了本发明人预期的最佳方式。然而，可理解无论上文在文本方面看起来有多详细，本发明可以通过很多方式实施，并且本发明应根据后附的权利要求书及其任何等同方案解释。
序列表
<110> 辉瑞公司
瑞纳神经科学公司
P·施特罗普
K·A·德拉里亚
M·多里沃尔斯卡
D·L·福莱蒂
R·G·杜申
D·L·谢尔顿
A·拉吉帕尔
<120> 具有高药物负载的抗体-药物缀合物
<130> PC72078A
<150> 61/984,645
<151> 2014-04-25
<150> 62/028,731
<151> 2014-07-24
<150> 62/103,999
<151> 2015-01-15
<150> 62/147,293
<151> 2015-04-14
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
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Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp
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<400> 43
Gly Gly Gly Gln Gly Xaa Gly
1 5
12

Claims (32)

1.一种具有下式的抗体-药物缀合物：抗体-(T-(X-Y-Za)b)c，其中：
T是1)在特异位点工程化的含谷氨酰胺的标签，2)内源谷氨酰胺，和/或3)通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶而成为反应性的内源谷氨酰胺；
X是胺供体单元；Y是接头；且Z是试剂部分；
X-Y-Z是位点特异性地缀合至所述含谷氨酰胺的标签、所述内源谷氨酰胺和/或所述反应性内源谷氨酰胺的胺供体试剂；
a是1-6的整数；
b是1-6的整数；
c是1-20的整数；并且
其中a、b和c的乘积(药物-抗体比例)是至少约5。
2.权利要求1的缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微型抗体，双抗体或抗体片段。
3.权利要求1或2的缀合物，其中T包含至少1个内源谷氨酰胺或反应性内源谷氨酰胺。
4.权利要求1-3中任一项的缀合物，其中所述反应性内源谷氨酰胺是通过所述抗体中的去糖基化或通过另一种氨基酸的氨基酸修饰而成为反应性的。
5.权利要求4的缀合物，其中所述另一种氨基酸修饰是在297位(EU编号方案)的取代。
6.权利要求5的缀合物，其中所述取代是在297位从天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)或从N至丙氨酸(A)。
7.权利要求5的缀合物，其中所述抗体进一步包含在K222、K340和/或K370位的第二氨基酸修饰。
8.权利要求7的缀合物，其中所述第二氨基酸修饰是赖氨酸至精氨酸的取代。
9.权利要求1-8中任一项的缀合物，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至在所述抗体的选自以下的至少一个或多个位点的所述含谷氨酰胺的标签：1)任一轻链、重链，或轻链和重链二者的羧基末端；2)任一轻链、重链或轻链和重链二者的氨基末端；和3)S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和/或G385位，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到所述抗体中，或代替所述抗体中一个或多个内源氨基酸。
10.权利要求8的缀合物，其包含：
a)在N297Q和K222R位的氨基酸取代，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至295位的内源谷氨酰胺和在297位取代的谷氨酰胺；和
b)一个或多个含谷氨酰胺的标签，其中所述胺供体试剂位点特异性地缀合至所述抗体的轻链羧基末端的所述含谷氨酰胺的标签，
其中所述药物-抗体比例是约5-7。
11.权利要求10的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至在选自以下的一个或多个位点的所述含谷氨酰胺的标签：S60-R61、R108、T135、S160、S168、S190-S192、P189-S192、G200-S202、K222-T225、K222-T223、T223、L251-S254、M252-I253、E294-N297、E293-N297、N297和G385，其中所述含谷氨酰胺的标签插入到所述抗体中，或代替所述抗体中一个或多个内源氨基酸，并且其中所述药物-抗体比例是至少约6。
12.权利要求10的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至位于所述抗体的重链羧基末端的所述含谷氨酰胺的标签，并且其中所述药物-抗体比例是约6-9。
13.权利要求10的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至插入到所述抗体重链中氨基酸位点T135之后的所述含谷氨酰胺的标签，并且其中所述药物-抗体比例是约6-9。
14.权利要求10或13的缀合物，其中所述胺供体试剂进一步位点特异性地缀合至在抗体轻链中氨基酸位置G200-S202的所述含谷氨酰胺的标签，其中所述内源氨基酸残基被所述含谷氨酰胺的标签代替，并且其中所述药物-抗体比例是6-11。
15.权利要求8的缀合物，其包含所述胺供体试剂，其位点特异性地缀合至位于以下的所述含谷氨酰胺的标签：
a)所述抗体轻链的羧基末端；
b)所述抗体重链中氨基酸位点T135之后；和
c)所述抗体轻链中氨基酸位点G200-S202，其中所述内源氨基酸残基被所述含谷氨酰胺的标签代替，
其中所述药物-抗体比例是约5-7。
16.权利要求1-15中任一项的缀合物，其中所述含谷氨酰胺的标签包含选自以下的氨基酸序列：Q、LQG、LLQGG(SEQ ID NO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ ID NO:4)、GLLQG(SEQ ID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ ID NO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ IDNO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、GGLLQGPP(SEQ ID NO:22)、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGPGK(SEQ ID NO:25)、LLQGPG(SEQID NO:26)、LLQGP(SEQ ID NO:27)、LLQP(SEQ ID NO:28)、LLQPGK(SEQ ID NO:29)、LLQAPGK(SEQ ID NO:30)、LLQGAPG(SEQ ID NO:31)、LLQGAP(SEQ ID NO:32)，和LLQLQG(SEQ ID NO:36)。
17.权利要求16的缀合物，其中所述含谷氨酰胺的标签是LLQGA(SEQ ID NO:11)、LQG、GGLLQGA(SEQ ID NO:23)、LLQGPA(SEQ ID NO:21)、LLQGPP(SEQ ID NO:20)、GGLLQGPP(SEQID NO:22)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LLQYQG(SEQ ID NO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、LLQLQG(SEQ ID NO:36)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、SLLQG(SEQ ID NO:16)或LLQLLQGA(SEQID NO:10)。
18.权利要求1的缀合物，其中所述胺供体单元-接头(X-Y)是线性或分支的。
19.权利要求18的缀合物，其中所述胺供体单元-接头(X-Y)选自：Ac-Lys-Gly(乙酰-赖氨酸-甘氨酸)、氨基己酸、Ac-Lys-β-Ala(乙酰-赖氨酸-β-丙氨酸)、氨基-PEG2(聚乙二醇)-C2、氨基-PEG3-C2、氨基-PEG6-C2、Ac-Lys-Val-Cit-PABC(乙酰-赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基)、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC、氨基-PEG3-C2-Val-Cit-PABC、氨基己酰-Val-Cit-PABC、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC、[(3S,5S)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二]双-Val-Cit-PABC、腐胺和Ac-Lys-腐胺。
20.权利要求1的缀合物，其中所述试剂部分是细胞毒性剂。
21.权利要求20的缀合物，其中所述细胞毒性剂选自蒽环霉素、奥瑞他汀、喜树碱、考布他汀、多拉司他汀、多卡米星、烯二炔、格尔德霉素、引哚琳并-苯二氮杂卓二聚体、美登素、嘌呤霉素、吡咯并苯二氮杂卓二聚体、紫杉烷、长春花生物碱、特吡莱辛、哈米特林、斯考他汀、普拉地内酯及其立体异构体，电子等排物，类似物或衍生物。
22.权利要求1-18中任一项的缀合物，其中所述胺供体试剂选自：Alexa 488尸胺、5-FITC尸胺、Alexa 647尸胺、Alexa 350尸胺、5-TAMRA尸胺、5-FAM尸胺、SR101尸胺、5,6-TAMRA尸胺、5-FAM赖氨酸、Ac-Lys-Gly-MMAD、氨基-PEG3-C2-MMAD、氨基-PEG6-C2-MMAD、氨基-PEG3-C2-氨基-壬酰-MMAD、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAD、氨基-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD、氨基己酰-MMAD、Ac-Lys-β-Ala-MMAD、氨基-PEG2-C2-MMAE、氨基己酰-MMAE、氨基-PEG3-C2-MMAE、氨基己酰-MMAF、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAE、氨基-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAE、氨基己酰-Val-Cit-PABC-MMAF、氨基-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAF、氨基-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101、Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101、腐胺基-格尔德霉素、Ac-Lys-腐胺基-格尔德霉素、氨基己酰-3377、氨基-PEG6-C2-3377、氨基己酰-0131、氨基-PEG6-C2-0131、氨基己酰-0121、氨基-PEG6-C2-0121、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-MMAD、[(3R,5R)-1-{3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酰基}哌啶-3,5-二基]双-Val-Cit-PABC-MMAE、2-氨基乙氧基-PEG6-NODAGA，和N-2-乙酰基-L-赖氨酰-L-缬氨酰-N～5～-氨基甲酰-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰}肼基)羰基]氧代}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-22中任一项的缀合物，和药学可接受的赋形剂。
24.一种药物组合物，其包含多个权利要求1-22中任一项的缀合物，其中平均药物-抗体比例是至少约5.0。
25.一种药物组合物，其包含多个抗体-药物缀合物，其中至少一种抗体-药物缀合物是权利要求1-22中任一项的缀合物，并且其中平均药物-抗体比例是至少约4.1。
26.一种治疗有此需要的对象中的癌症的方法，包括向所述对象施用有效量的权利要求23-25中任一项的药物组合物。
27.一种抑制有此需要的对象中的肿瘤生长或进展的方法，包括向所述对象施用有效量的权利要求23-25中任一项的药物组合物。
28.一种诊断疑似患有癌症的对象中的癌症的方法，包括a)使所述对象的样品与权利要求1的缀合物在导致所述缀合物与癌症相关蛋白结合的条件下接触，和b)测定所述缀合物与所述癌症相关蛋白的结合。
29.一种用于制备权利要求1的缀合物的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含抗体和含谷氨酰胺的标签的抗体-T分子；和/或具有内源谷氨酰胺和/或反应性内源谷氨酰胺的抗体；
b)使所述抗体-T分子在转谷氨酰胺酶的存在下接触胺供体试剂；和
c)允许所述抗体-T分子共价连接至所述胺供体试剂以形成抗体-药物缀合物。
30.权利要求29的方法，其中所述缀合物具有至少约51％的缀合效率。
31.权利要求29的方法，所述转谷氨酰胺酶是微生物的、纯化的或工程化的转谷氨酰胺酶。
32.权利要求29的方法，其进一步包括纯化步骤，其中通过色谱步骤纯化所述缀合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113613679A (zh) * 2019-03-19 2021-11-05 保罗·谢勒学院 基于甘氨酸的接头的转谷氨酰胺酶缀合方法

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6666336B2 (ja) 2014-06-12 2020-03-13 シー・エス・ピー・シー ドフェン コーポレーションＣｓｐｃ Ｄｏｐｈｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 酵素的方法による均一抗体薬物コンジュゲート
ES2785551T3 (es) 2014-06-30 2020-10-07 Glykos Finland Oy Derivado de sacárido de una carga útil tóxica y sus conjugados con anticuerpos
KR102051503B1 (ko) * 2014-08-28 2019-12-03 화이자 인코포레이티드 항체 약물 접합체에 사용하기 위한 안정성-조정 링커
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
AU2016363013B2 (en) 2015-12-04 2022-03-10 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
BR112018012388A2 (pt) * 2015-12-18 2018-12-04 Eisai R&D Management Co., Ltd. imunoglobulinas conjugadas de lisina terminal-c
CN105622924B (zh) * 2016-02-03 2017-11-24 华东师范大学 一种组织蛋白酶b可裂解的嵌段聚合物及其制备方法和应用
EP3419670A2 (en) 2016-02-26 2019-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized transglutaminase site-specific antibody conjugation
WO2017151892A2 (en) * 2016-03-02 2017-09-08 Waters Technologies Corporation Identification and quantification of conjugated peptides in antibody drug conjugates by mass spectrometry
AU2017235571B2 (en) * 2016-03-18 2024-05-16 Georgetown University Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to anti-matriptase antibodies by in vivo cleavable linking moieties
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US11753438B2 (en) 2016-05-11 2023-09-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
KR102538866B1 (ko) 2016-06-10 2023-06-02 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 리신 접합된 이뮤노글로불린
EP3272864A1 (en) 2016-07-20 2018-01-24 Paul Scherrer Institut Solid-phase immobilization of microbial transglutaminase mtg on microbeads for protein conjugation
EP3493853A1 (en) 2016-08-03 2019-06-12 Pfizer Inc Heteroaryl sulfone-based conjugation handles, methods for their preparation, and their use in synthesizing antibody drug conjugates
MX2019004434A (es) * 2016-10-17 2019-09-26 Pfizer Anticuerpos anti-edb y conjugados anticuerpo-fármaco.
CN106589126A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 中国药科大学 一种抗人cd24抗体突变体的设计及其应用
EP3580234A1 (en) * 2017-02-08 2019-12-18 Pfizer Inc. Large scale production process for capped and un-capped antibody cysteines and their use in therapeutic protein conjugation
US10093741B1 (en) 2017-05-05 2018-10-09 Fusion Pharmaceuticals Inc. IGF-1R monoclonal antibodies and uses thereof
KR20200004861A (ko) 2017-05-05 2020-01-14 퓨전 파마슈티칼즈 인크. Igf-1r 모노클로날 항체 및 그의 용도
JP2020518673A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 フュージョン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二官能性キレートの薬物動態増強及びその使用
US11939385B2 (en) 2017-05-16 2024-03-26 ALX Oncology Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
CN108452321B (zh) * 2017-06-19 2021-11-26 四川百利药业有限责任公司 一种带酸性自稳定接头的抗体-药物偶联物
WO2019051127A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 Cue Biopharma, Inc. MULTIMER MODULATOR POLYPEPTIDE OF LYMPHOCYTE T HAVING CONJUGATION SITES AND METHODS OF USE THEREOF
CN111163809A (zh) * 2017-09-19 2020-05-15 保罗·谢勒学院 转谷氨酰胺酶缀合方法和接头
CA3074688A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Ph Pharma Co., Ltd. Thailanstatin analogs
CA3205442A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Pfizer, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates specific for cd123 and uses thereof
AU2018368520A1 (en) * 2017-11-14 2020-05-14 Debiopharm Research & Manufacturing S.A. Ligand-drug-conjugates as substrates for selective cleavage by the exopeptidase activity of Cathepsin B
MX2021005377A (es) * 2018-11-09 2021-09-14 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Terapias dirigidas a cdcp1.
PE20211286A1 (es) * 2018-12-03 2021-07-19 Fusion Pharmaceuticals Inc Terapia de combinacion de radioinmunoconjugados con inhibidor del punto de control
CA3176248A1 (en) * 2020-04-10 2021-10-14 Seagen Inc. Charge variant linkers
WO2024017923A1 (en) 2022-07-20 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Linkers for site-specific antibody conjugation

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130122020A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies specific for trop-2 and their uses
US20130230543A1 (en) * 2010-11-05 2013-09-05 Jaume Pons Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US6407213B1 (en) 1991-06-14 2002-06-18 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0725145A4 (en) 1994-08-23 1997-06-11 Drug Delivery System Inst Ltd PROTEIN MODIFICATION PROCESS
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6919076B1 (en) 1998-01-20 2005-07-19 Pericor Science, Inc. Conjugates of agents and transglutaminase substrate linking molecules
WO2000034317A2 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1151299A4 (en) 1999-01-22 2003-06-04 Smithkline Beecham Corp PROCESS OF LOCATION-SPECIFIC MARKING OF PROTEINS AND APPLICATIONS
WO2004042068A2 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Northwestern University Injectable and bioadhesive polymeric hydrogels as well as related methods of enzymatic preparation
JP2007537986A (ja) 2003-05-30 2007-12-27 セントカー・インコーポレーテツド トランスグルタミナーゼを用いる新規なエリトロポエチン複合体の形成
US20070184537A1 (en) 2003-06-03 2007-08-09 Paul Scherrer Institut Method for the linkage of bifunctional chelating agents and (radioactive) transition metal complexes to proteins and peptides
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
US20060019258A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for detection of small interfering RNA and micro-RNA
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
NZ566982A (en) 2005-09-26 2011-06-30 Medarex Inc Duocarmycin drug conjugates
US9127130B2 (en) 2006-08-11 2015-09-08 Starpharma Pty Ltd. Polylysine dendrimer contrast agent
EP2214700A4 (en) 2007-11-02 2012-08-22 Janssen Biotech Inc HALF-SYNTHETIC GLP-1 PEPTIDE FUSION CONSTRUCTS, METHOD AND USES
JPWO2010002042A1 (ja) 2008-07-04 2011-12-22 国立大学法人九州大学 タンパク質ラベル化用酵素基質
WO2010011096A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
EP2350013A4 (en) 2008-10-13 2012-10-17 San Diego State University Res Foundation AUTOPHAGOSOME MARKING AND IDENTIFICATION COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND USING SAME
US10865233B2 (en) 2008-12-18 2020-12-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. NKG2D-fc for immunotherapy
BR112012013502A2 (pt) 2009-12-06 2017-01-10 Biogen Idec Hemophilia Inc "polipeptídeos quiméricos e híbridos de fator viii-fc, e métodos de uso dos mesmos".
EP2525787B1 (en) 2010-01-19 2017-03-15 Hanmi Science Co., Ltd. Liquid formulations for long-acting g-csf conjugate
MX2012008453A (es) 2010-01-19 2012-11-21 Hanmi Science Co Ltd Formulaciones liquiddas para un conjugado de eritropoientina de accion prolongada.
AR081755A1 (es) 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
CU23923B1 (es) * 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
PT3327027T (pt) 2011-11-17 2021-02-15 Pfizer Péptidos citotóxicos e seus conjugados de anticorpos e fármacos
US9717803B2 (en) 2011-12-23 2017-08-01 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
KR20160042871A (ko) * 2013-06-21 2016-04-20 이나뜨 파르마, 에스.아. 폴리펩티드의 효소적 콘쥬게이션
JP6521959B2 (ja) * 2013-07-31 2019-05-29 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション 操作されたポリペプチドコンジュゲート

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130230543A1 (en) * 2010-11-05 2013-09-05 Jaume Pons Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
US20130122020A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies specific for trop-2 and their uses

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JURGEN GRUNBERG ET AL.: ""DOTA-Functionalized Polylysine: A High Number of DOTA Chelates Positively Influences the Biodistribution of Enzymatic Conjugated Anti-Tumor Antibody chCE7agl"", 《PLOS ONE》 *
SIMONE JEGER ET AL.: ""Site-Specific and Stoichiometric Modification of Antibodies by Bacterial Transglutaminase"", 《ANGEWANDTE CHEMI E INTERNATIONAL EDITION》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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